Artykuł metodologiczny

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63685

⸱

9 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Virology Section, Department of Life Sciences, Shiv Nadar University, 2Gastroenterology, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Streszczenie

Brak wygodnej metody do iteracyjnego generowania różnorodnych, pełnowymiarowych wariantów wirusa utrudnił badania nad ukierunkowaną ewolucją wirusów RNA. Integrując podatną na błędy PCR w pełnym genomie RNA i genetykę odwrotną, można wywołać losową mutagenezę substytucyjną w całym genomie. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą tę technikę do syntezy różnych bibliotek w celu identyfikacji mutantów wirusowych o interesujących fenotypach. Ta metoda, zwana syntezą zmutowanego RNA na pełnej długości (FL-MRS), oferuje następujące korzyści: (i) możliwość stworzenia dużej biblioteki za pomocą wysoce wydajnego, jednoetapowego, podatnego na błędy PCR; (ii) zdolność do tworzenia grup bibliotek o różnym poziomie różnorodności genetycznej poprzez manipulowanie wiernością polimerazy DNA; (iii) stworzenie pełnowymiarowego produktu PCR, który może bezpośrednio służyć jako matryca do syntezy zmutowanego RNA; oraz (iv) zdolność do tworzenia RNA, które może być dostarczane do komórek gospodarza jako niewybrana pula wejściowa w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem mutantów wirusa o pożądanym fenotypie. Odkryliśmy, stosując podejście genetyki odwrotnej, że FL-MRS jest wiarygodnym narzędziem do badania ewolucji ukierunkowanej na wirusa na wszystkich etapach cyklu życiowego wirusa zapalenia wątroby typu C, izolatu JFH1. Technika ta wydaje się być nieocenionym narzędziem do zastosowania ukierunkowanej ewolucji w celu zrozumienia adaptacji, replikacji i roli genów wirusowych w patogenezie i oporności przeciwwirusowej w wirusach RNA o dodatnim sensie.

Wprowadzenie

Genetyczne badanie przesiewowe rozpoczyna się od interesującego nas fenotypu wirusa, a następnie, poprzez sekwencjonowanie jego genomu i porównanie go z genomem oryginalnego szczepu, próbuje zidentyfikować mutację (mutacje) powodującą ten fenotyp. W przeciwieństwie do tego, w odwróconych genetycznych badaniach przesiewowych, losowe mutacje są wprowadzane do genu docelowego, po czym następuje badanie wynikowego fenotypu (fenotypów)1. W przypadku podejścia opartego na genetyce odwrotnej, mutageneza in vitro jest najczęściej stosowaną techniką tworzenia puli wariantów, które są następnie badane pod kątem fenotypów będących przedmiotem zainteresowania. Opisano różne narzędzia genetyczne do osiągnięcia losowej mutagenezy wirusów RNA w całym genomie, w tym podatny na błędy PCR (ep-PCR)2,3, circular polymerase extension4 i mutageneza insercji Mu-transpozonu 5,6,7. Dwie ostatnie metody dają biblioteki o ograniczonej różnorodności sekwencji i są podatne na wprowadzanie dużych insercji i delecji, które są wysoce śmiertelne dla wirusów i poważnie ograniczają odzyskiwanie zakaźnych wariantów wirusa.

ep-PCR to dobrze znana, potężna technika mutagenezy, szeroko stosowana w inżynierii białkowej, do generowania zmutowanych enzymów do wyboru fenotypów o pożądanych właściwościach, takich jak zwiększona stabilność termiczna, specyficzność substratu i aktywność katalityczna8,9,10. Ta technika jest łatwa do wykonania, ponieważ wymaga prostego sprzętu, nie wiąże się ze żmudnymi manipulacjami, wykorzystuje dostępne na rynku odczynniki i jest szybka; Co więcej, generuje wysokiej jakości biblioteki.

Tutaj opracowaliśmy nową metodę pełnej syntezy zmutowanego RNA (FL-MRS) do generowania kompletnych genomów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) poprzez integrację ep-PCR, która indukuje losową mutagenezę substytucyjną całego genomu i genetykę odwrotną. Nawet insercja lub delecja pojedynczego nukleotydu jest wysoce szkodliwa dla wirusów RNA o dodatnim sensie ([+]ssRNA); w związku z tym mutageneza substytucyjna oparta na PCR jest preferowaną metodą iteracyjnego generowania dużych, zróżnicowanych bibliotek pełnych (+)ss genomów wirusa RNA o dobrej żywotności.

FL-MRS to proste podejście, które można zastosować do każdego wirusa RNA o dodatnim znaczeniu o długości genomu ~10 kb dzięki skrupulatnemu zaprojektowaniu zestawu starterów, który wiąże się z klonem cDNA wirusa. pJFH1 to zakaźny klon cDNA, który koduje genotyp 2a HCV i może podsumować wszystkie etapy cyklu życia wirusa. Stosując podejście FL-MRS, wykazaliśmy syntezę losowo zmutagenizowanych bibliotek pełnego genomu (zmutowane biblioteki [ML]) w celu wytworzenia kompetentnych replikacyjnie wariantów JFH1, dla których nie było wcześniejszej wiedzy na temat właściwości związanych z mutacjami. Po ekspozycji na lek przeciwwirusowy niektóre warianty wirusa szybko pokonały presję leku, uzyskując pożądaną zmianę fenotypową. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, można wygenerować mnóstwo wariantów wirusa, co stwarza możliwości badania ewolucji wirusów (+)ssRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Użyty tutaj szczep JFH1 (WT) był miłym prezentem od Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Ludzka linia komórkowa wątrobaka, Huh7.5, była miłym prezentem od Charlesa Rice'a z Uniwersytetu Rockefellera. Schemat metody jest pokazany w Rysunek 1.

1. Mutageneza substytucyjna całego genomu JFH1 przy użyciu podatnego na błędy PCR

  1. Aby przeprowadzić ep-PCR, należy przygotować mieszankę wzorcową do czterech zestawów eksperymentów ze starterami J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTAAAACGACGGC-3' i J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Rysunek 1A), wraz ze składnikami reakcji opisanymi w Tabeli 1 bez matrycy pJFH1 (plazmid wyizolowany ze szczepu JFH1).
  2. Podwielokrotnić mieszaninę wzorcową do czterech probówek, dodać 100 ng, 50 ng, 25 ng i 10 ng matrycy do poszczególnych probówek i dostosować całkowitą objętość reakcji do 50 μl. Zastosować warunki cykliczne opisane w Tabeli 2 w celu amplifikacji fragmentu pary zasad 9736 (bp) zawierającego promotor T7 i genom HCV o pełnej długości (Rysunek 2).
    UWAGA: Produkt ep-PCR musi zawierać sekwencję promotora T7, aby ułatwić transkrypcję genomu wirusa in vitro. Dlatego starter do przodu musi znajdować się przed promotorem T7 klonu cDNA wirusa, a odwrotna sekwencja startera powinna kończyć się na końcu 3' genomu wirusa, aby ułatwić odpływ transkrypcji. Zoptymalizuj każdy składnik reakcji ep-PCR w zakresie zalecanym przez producenta polimerazy DNA Taq, aby osiągnąć amplifikację o wysokiej wydajności. Oprócz zróżnicowanych ilości matryc, niezrównoważone dNTP (szczególnie niskie stężenie dATP i/lub dGTP) mogą być również stosowane w celu zwiększenia różnorodności długości genomów wirusowych od 6-8 kb long3.
  3. Oszacuj produkt ep-PCR amplifikowany, ładując równe objętości produktów PCR (5 μl) i porównując ze znanymi ilościami drabinki DNA o mocy 1 kilozasady (kb), przeprowadzając elektroforezę w żelu agarozowym na bazie 0,8% tris-octanu EDTA (TAE)11. Oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Oszacuj stężenie oczyszczonego produktu, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego12. W razie potrzeby należy zagęścić próżniowo produkt ep-PCR, aby uzyskać stężenie produktu ≥100 ng/μL.
    UWAGA: Dokładniejszego oszacowania można dokonać, ładując dwukrotne seryjne rozcieńczenia produktu ep-PCR i porównując ich intensywność ze znanymi ilościami drabiny DNA 1 kb.

2. Synteza wirusowego RNA

  1. Ustawić reakcję 40 μl w celu wytrawienia 5 μg klonalnego pJFH1 z 4 U enzymu XbaI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, a następnie oczyścić kolumnę i zmierzyć absorbancję przy 260 nm w spektrofotometrze mikroobjętościowym12. Przygotować 20 μl reakcji transkrypcji in vitro oczyszczonego kolumnowo produktu ep-PCR lub klonalnego pJFH1 (WT) przy użyciu dostępnego na rynku systemu do produkcji RNA na dużą skalę zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 200 μl wymieszać około 1 μg oczyszczonego produktu ep-PCR (biblioteki mutantów) lub strawionego XbaI klonalnego pJFH1, 10 μl buforu 2x zawierającego rybonukleotydy i 2 μl mieszanki enzymów T7. Wymieszaj wszystkie składniki i krótko je odwiruj. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 45 minut, a następnie dodać enzym DNazy wolny od RNazy 1 U i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut (Rysunek 1C).
  3. Oczyść zsyntetyzowane RNA in vitro za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z instrukcjami producenta, eluuj w 40 μl wody wolnej od RNaz i DNaz i oszacuj stężenie oczyszczonego RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego12. W razie potrzeby należy przygotować porcje (5 μg lub 2 μg), aby uniknąć zamarzania i rozmrażania, i przechowywać je w temperaturze −80 °C. Sprawdź integralność i rozmiar transkryptów wirusa, używając 2 μg RNA dla MOPS formaldehyd 0,8% żelu agarozowego elektroforeza13 (Rysunek 3).

3. Oszacowanie proporcji mutacji w produktach ep-PCR (biblioteki mutantów)

UWAGA: W tym kroku oszacowano, że proporcja nukleotydów zmutowanych przez subklonowanie produktu uzyskanego w kroku 2. wykazała korzyści z zastosowania ep-PCR do stworzenia genetycznej heterogeniczności przy użyciu dwóch pełnych bibliotek mutantów genomu (ML50 i ML25) oraz klonalnych wirusowych RNA pochodzących z pJFH1. Proporcję mutacji oszacowano w genie HCV NS5A, który był również fenotypowym genem odczytu (oporności na leki) w tym badaniu.

  1. Ustaw reakcję syntezy cDNA 20 μl, dodając około 1 μg wirusowego RNA zsyntetyzowanego w kroku 2., 5 μM odwrotnego startera 5'-GTGTGTGTGCCGCTCTA-3' i odwrotnej transkryptazy 200 U zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Używając cDNA, amplifikuj fragment o długości 2571 pz, który zawiera kompletny gen NS5A. Aby to zrobić, przygotuj mieszaninę reakcyjną zawierającą 0,5 μM dla starterów 5272F i 7848R (stężenie końcowe; Tabela 3), 1,5 mM MgCl2, 1x bufor PCR i polimeraza Taq o wysokiej wierności 1 U w całkowitej objętości 50 μL i uruchomić cykl amplifikacji w warunkach opisanych w Tabeli 4.
  3. Uruchom produkt na 0,8% żelu agarozowym na bazie TAE, aby potwierdzić wielkość produktu 2571 pz, a następnie oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego zgodnie z zaleceniami producenta. Produkt oczyszczony w kolumnie należy elutować w 40 μl sterylnej wody.
  4. Aby dodać zwis 3' A do produktu, dodaj 0,5 μM dATP i 1 U polimerazy DNA Taq o niskiej wierności i inkubuj cały produkt PCR w temperaturze 70 °C przez 30 minut wraz z 1x buforem PCR i 1,5 mM MgCl2 (stężenie końcowe). Oczyść mieszaninę za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego zgodnie z zaleceniami producenta
    UWAGA: Alternatywnie należy usunąć produkt o długości ~9,7 kb z żelu z kroku 1.4. i przeprowadzić klonowanie przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do klonowania produktu long-PCR zgodnie z instrukcjami producenta lub wykonać NGS produktu ep-PCR przy użyciu platformy Illumina2.
  5. Ustawić reakcję ligacji, dodając 5 μl 2x buforu ligacyjnego, 50 ng DNA wektora T, około 3-krotny nadmiar molowy insercji DNA zsyntetyzowanego w kroku 3.4., 3 jednostki Weissa ligazy DNA T4 i wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 10 μl. Inkubować tę reakcję w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a następnie dodać 100 μl Escherichia coli DH5α z ligowanym DNA; szok termiczny ogniw w temperaturze 42 °C przez 35 s (Rysunek 1B).
  6. Dodać 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) (bez antybiotyku) i inkubować, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu odzyskania. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 13 800 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl świeżej pożywki LB.
  7. Umieścić 100 μl przekształconych komórek DH5α E. coli na płytce LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Ustawić minipreparaty 25-30 kolonii w 5 ml pożywki LB + 50 μg/ml ampicyliny i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
  8. Następnego dnia wyekstrahuj plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta i przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym w objętości 10 μl z 200 ng izolowanych plazmidów, 2 U EcoR1 i 1x buforem restrykcyjnym dla wszystkich kolonii.
  9. Po inkubacji mieszanin wytrawiających w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, rozpuścić produkty na 0,8% żelu agarozowym na bazie TAE, aby potwierdzić insercję plazmidowego DNA.
  10. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera plazmidów 25 dodatnich klonów przy użyciu starterów M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF i 6748-SPF (Tabela 3), aby określić proporcję mutacji (wyrażoną jako proporcja zmutowanych nukleotydów) w wirusowych RNA pochodzących z bibliotek i klonalnych pJFH1 (Rysunek 1B i Rysunek 4).

4. Transfekcja wirusowego RNA linii komórkowej Huh7.5

UWAGA: Używaj materiałów do hodowli tkanek wolnych od RNaz/DNaz i pracuj w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Pracuj w zalecanym obiekcie przechowawczym zgodnie z wytycznymi organizacji dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Utrzymać komórki Huh7,5 przez inkubację w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C w kolbie do hodowli tkankowej T75 cm2 zawierającej 15 ml kompletnej zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (obj. / obj.) płodowej surowicy bydlęcej, penicyliny (100 U/ml) i streptomycyny (100 μg/ml; Rysunek 1D).
  2. Podziel komórki w stosunku 1:3, gdy zbieg osiągnie 90%. Umyj komórki 1x wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; pH 7,4). Dodać 5 ml 1x roztworu trypsyny-EDTA, aby całkowicie pokryć warstwę komórkową, delikatnie zakręcić kolbą, a następnie inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić; Inkubować komórki, aż warstwa komórkowa zostanie całkowicie oderwana od powierzchni kolby do hodowli komórkowych.
  3. Dodać 10 ml 1x wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM, rozproszyć komórki przez wielokrotne pipetowanie i zebrać zawiesinę komórek w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 252 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 6 ml kompletnego DMEM i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 .
  4. W celu ciągłego utrzymywania naiwnych, transfekowanych lub zakażonych wirusem komórek Huh7.5, powtórz krok 4.2 i krok 4.3.
  5. Na 1 dzień przed transfekcją podzielić komórki zgodnie z opisem w krokach 4.1.-4.3., policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru, wysiać komórki Huh7,5 o gęstości 0,6 x 106 na szalkach 35 mm w 2 ml kompletnego DMEM i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .
  6. Następnego dnia przygotuj kompleks transkryptywno-lipidowy. W tym celu należy rozcieńczyć 10 μl odczynnika do transfekcji w 50 μl minimalnej pożywki niezbędnej i oddzielnie rozcieńczyć 5 μg transkryptów wirusowych w 50 μl minimalnej pożywki niezbędnej.
  7. Inkubować obie mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wymieszać je w jednej sterylnej probówce do mikrowirówek i dalej inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utworzyć kompleks transkryptywno-lipidowy.
  8. Po 16 godzinach inkubacji komórek wyjmij pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego, umyj komórki 2x wstępnie podgrzanym 1x PBS i dodaj 1,5 ml minimalnej pożywki niezbędnej. Powoli dodawaj kompleks transkryptyczno-lipidowy do naczynia i delikatnie obracaj rękami, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kompleksów.
  9. Inkubować komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 godzin. Następnie usuń pożywkę, przemyj transfekowane komórki 2x 1 ml podgrzanego 1x PBS i dodaj 2 ml kompletnego DMEM.

5. Produkcja wirusów

  1. Dziel transfekowane komórki Huh7.5 co 2 dni lub 3 dni, gdy osiągną 90% konfluencji. Zbieraj supernatanty wirusa przy każdym rozszczepieniu i przechowuj je w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
  2. Przy każdym podziale należy monitorować rozprzestrzenianie się wirusa za pomocą testu tworzenia ogniskowania (FFA), jak opisano w kroku 6.2. Zbieraj wirusa, aż rozprzestrzenianie się wirusa osiągnie >80% transfekowanych komórek (Rysunek 1D).
    UWAGA: Podziel transfekowane komórki w stosunku 1:1 przez pierwsze kilka pasaży, aby uratować maksymalną liczbę wariantów wirusa. Rozprzestrzenianie się wirusa spowalnia, a żywotność maleje wraz ze wzrostem proporcji mutacji w pełnogenomowym MLs2.

6. Kwantyfikacja mian wirusów

  1. Kwantyfikacja wirusowego RNA
    1. Wyizolować wirusowe RNA ze 140 μl supernatantów hodowlanych za pomocą zestawu do izolacji wirusowego RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przygotuj 10 μl reakcji qRT-PCR przy użyciu komercyjnego zestawu qRT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj startera do przodu R6-130-S17, startera odwrotnego R6-290-R19 (stężenie końcowe 0,2 μM każdy) i sondy R9-148-S21FT (stężenie końcowe 0,3 μM) do kwantyfikacji RNA HCV (Tabela 3). Ustaw warunki pracy jako 48 °C przez 20 min, 95 °C przez 10 min, a następnie 45 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 min.
      UWAGA: Sonda powinna zawierać fluorescencyjny barwnik reporterowy 6-karboksyfluoresceinę (FAM) i barwnik gaszący 6-karboksy-tetrametylo-rodaminę (TAMRA) odpowiednio na końcach 5' i 3'.
    3. Uruchamiaj reakcje w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym. Ustaw kontrole negatywne, tj. RNA wyekstrahowane z supernatantów pozorowanych zakażonych komórek i jednocześnie wodę wolną od nukleaz, aby zapewnić brak zanieczyszczenia krzyżowego.
    4. Równolegle wygeneruj krzywą wzorcową przy użyciu 10-krotnie seryjnie rozcieńczonej znanej liczby kopii transkryptów HCV (1 x 108 do 0) w celu ilościowego określenia wirusowego RNA. Wykonaj kwantyfikację w trzech egzemplarzach (Rysunek 1D).
  2. Kwantyfikacja miana wirusa zakaźnego przy użyciu 50% dawki zakaźnej posiewu tkankowego (TCID50)
    1. Około 16 godzin przed dodaniem wirusa umieścić na płytce 6,5 x 103 Huh7,5 komórek/basenik na 96-dołkowej płytce i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. W komorze klasy bezpieczeństwa biologicznego II należy wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (po 1 ml każde), obejmujące 1 x 10−1 do 1 x 10−6 rozcieńczeń (osiem rozcieńczeń) zebranego wirusa (uzyskanego, gdy rozprzestrzenianie się wirusa osiągnie >80% komórek, jak opisano w kroku 5.). Dodać 100 μl/basenik (z ośmioma powtórzeniami) rozcieńczonego wirusa w celu zakażenia komórek Huh7,5 i przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni.
    3. Po 3 dniach przemyć zainfekowane komórki 3x 0,1 ml PBS za każdym razem, a następnie utrwalić i przepuszczalnić komórki 0,1 ml lodowatego metanolu w temperaturze -20 °C przez 20 min. Przemyć studzienki 1x PBS 3x, a następnie 1x PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
    4. Po usunięciu PBS-T zablokuj komórki na 30 minut w temperaturze pokojowej 0,1 ml 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zawierającej 0,2% mleka odtłuszczonego w PBST. Usuń roztwór blokujący i traktuj komórki przez 5 minut 0,1 ml 3%H2O2 przygotowanym w 1x PBS.
    5. Ponownie, umyj komórki 2x 1x PBS i 1x PBS-T, a następnie dodaj 50 μL/studzienkę anty-NS5A 9E10 mAb (1:10000, zapas 1 mg / ml; miły prezent od Charlesa Rice'a, Uniwersytet Rockefellera) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj studzienki ponownie 3x za pomocą 1x PBS i 1x za pomocą PBS-T.
    6. Dodać 50 μl / studzienkę koziej anty-mysiej anty-mysiej IgG sprzężonej z HRP (1:4000), inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć niezwiązane przeciwciało, przemłukując studzienki 0,1 ml 1x PBS.
    7. Dodać 30 μl kolorowego podłoża DAB (tetrachlorowodorek diaminobenzydyny) i inkubować płytkę, delikatnie kołysząc przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na podłożu na powierzchni studzienki tworzy się brązowy osad, który wskazuje na antygen HCV NS5A. Usuń roztwór DAB i umyj studzienki 2x 1x PBS i 1x wodą destylowaną. Dodać 100 μl PBS zawierającego 0,03% azydku sodu.
    8. Zbadaj każdą studzienkę pod mikroskopem światła odwróconego za pomocą obiektywu 10x. Policz liczbę dodatnich dołków. Jeśli studzienka zawiera jedną lub więcej komórek NS5A-dodatnich, oznacza to, że jest dodatnia; jeśli studzienka wykazuje brak komórek NS5A-dodatnich, oznacza to, że jest ujemna. Użyj kalkulatora Reeda i Muencha, aby oszacować rozcieńczenie punktu końcowego, które infekuje 50% studzienek (TCID50)14,15. Odwrotnością rozcieńczenia wymaganego do uzyskania TCID50 jest miano zakaźności wirusa (jednostki tworzące ogniska) na jednostkę objętości.
      UWAGA: Miana zakaźności wirusów różnią się w zależności od biblioteki mutantów.

7. Wybór lekoopornych wariantów wirusa

  1. Rozpuścić pibrentaswir (PIB), inhibitor NS5A, w 100% DMSO do stężenia 1 mM i dalej rozcieńczyć go w pełnym DMEM do stężenia 10 nM.
  2. Aby określić 50% efektywne stężenie PIB, wysiewa się komórki Huh7,5 o gęstości 0,6 x10 6/dołek na 6-dołkowej płytce i inkubuje komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 . Po 16 godzinach inkubacji komórek dodać dawkę wirusa ML50 lub klonalnego wirusa JFH1, aby zainfekować 50% komórek, a następnie, po 12 godzinach od zakażenia (h p.i.), potraktować komórki serią dwukrotnego rozcieńczenia PIB w zakresie 0,5-100 pM. Zmierz FFA i określ ilościowo FFU, jak w kroku 6.2. po 3 dniach inkubacji.
  3. Wykreślić krzywe dawka-odpowiedź, używając wartości testu redukcji FFU w oprogramowaniu do analizy statystycznej. Z krzywej esicy uzyskać 50% stężenie skuteczne (EC50; Rysunek 5).
    UWAGA: Skuteczny zakres stężeń może się różnić w zależności od klasy, między lekami przeciwwirusowymi HCV z tej samej klasy oraz w zależności od biblioteki mutantów.
  4. W eksperymencie należy zainfekować naiwne komórki Huh7,5 przy 70% zbiegu dawką wirusa ML50 (warianty pochodzące z ML50 RNA), aby zainfekować 50% komórek przez 12 godzin, a następnie przenieść zakażone komórki na płytki 6-dołkowe 24 godziny po zakażeniu.
  5. Dodać 1x EC50 PIB (47,3 pM) do zakażonych komórek po 16 godzinach od podziału komórek. Zrób to po każdym podziale komórki przez sześć kolejnych pasaży (18 dni), po których następują trzy cykle pasażu wolne od leku, i monitoruj rozprzestrzenianie się wirusa za pomocą FFA, jak opisano w kroku 6.2. Zwiększ skalę odczynników FFA zgodnie z obszarem wzrostu. Zebrać supernatanty wirusowe przy każdym pasażu i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Rozprzestrzenianie się wirusa do ponad 50% komórek podczas obserwacji leczenia można zdefiniować jako przełom, a rozprzestrzenianie się wirusa w okresie odstawienia leku można zdefiniować jako nawrót wirusa16.
  6. Wyodrębnij wirusowe RNA z supernatantu w dniu 18, jak opisano w kroku 6.1.1., a następnie zsyntetyzuj cDNA, jak pokazano w kroku 3.1. Amplifikować gen NS5A za pomocą 5 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:5 i składników PCR opisanych w kroku 3.2. Następnie wykonaj kroki 3.3.-3.5. w celu określenia mutacji oporności na leki NS5A w 6-8 dodatnich plazmidach bakteryjnych przy użyciu starterów sekwencjonowania NS5A 6186F, 6862F i 6460R (Tabela 3 i Tabela 4).
    UWAGA: W tym badaniu opisaliśmy substytucje w NS5A wariantów wybranych podczas leczenia PIB przy 1x EC50. Wykluczy to wpływ podstawień innych niż NS5A na zmniejszenie podatności na PIB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Można wygenerować i przesiewać liczne warianty pełnowymiarowego HCV w celu poszukiwania interesujących fenotypów lekoopornych, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w Rycina 1Biblioteki mutantów pełnego genomu zsyntetyzowano z użyciem clonal-pJFH1 w malejących ilościach (100–10 ng), jak pokazano w Rycina 2Średnie wydajności produktów ep-PCR (bibliotek mutantów) wynosiły od 3,8 do 12,5 ng/µL. Rycina 3 przedstawia transkrypty wir...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu szczegółowo opisaliśmy prostą i szybką procedurę FL-MRS, która integruje ep-PCR18 i genetykę odwrotną w celu syntezy bibliotek pełnego genomu HCV, które można następnie wykorzystać w systemie hodowli komórkowej w celu wygenerowania wariantów kompetentnych do replikacji do badań przesiewowych fenotypów opornych na leki. Zastosowanie polimerazy DNA Taq o niskiej wierności jest warunkiem wstępnym ep-PCR, który umożliwia włączenie podstawień podczas amplifikacji PCR pełnowymiarowego geno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie finansowe (numer grantu BT/PR10906/MED/29/860/2014) dla tego badania zostało zapewnione przez Departament Biotechnologii Rządu Indii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb plus drabinka DNA Thermo Fisher10787018
Probówka wirówkowa 1,5 mlTarsons500010
15 ml probówka wirówkowaTarsons546021
35 mm naczynie do hodowli komórkowych Tarsons960010
50 ml probówka wirówkowaTarsons546041
Kwas octowyMerckA6283
Agaroza HiMediaMB080
Urządzenie do elektroforezy w żelu AgroseGabinet bezpieczeństwa biologicznego 1704406
klasa IIESCOAC2 4S
Albumina surowicy bydlęcej WirówkaHiMediaMB083
 Eppendorf5424-R
CFX Connect BioRad1855201
Płytki klonujące 90 mm Inkubator CO
 New BrunswickGalaxy 170R
Colibri11050140Titertek-Berthold
DAB  Podłoże  Zestaw Abcamab94665
Roztwór dATP NEBN0440S Zestaw roztworów
deoksynukleotydu (dNTP)NEBN0446
Pirowęglan dietylu (DEPC) SRL chemiczny46791
Dimetylosulfotlenek (DMSO)HiMediaMB058
DMEM wysoki poziom glukozyLonzaBE12-604F
EcoR1-HFNEBR3101
EDTA sól tetrasodowa dwuwodnaHiMediaGRM4918
Bromek etydynyAmrescoX328
Płodowa surowica bydlęca Gibco26140079
Formaldehyd Fishser Scientific12755
ALPHA IMAGER
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H+L), HRPThermo FisherA16066
Nadtlenek wodoru 30%Merck107209
Mikroskop odwróconyNickon  Rosół ECLIPSE Ts2
LB HiMediaM1245
Lipofectamina 2000 Odczynnik dotransfekcjiThermo Fisher 116680270
Zestaw pipet mechanicznychEppendorf   
MetanolMerck106009
Micro Końcówki 0,2-10 i mikro; l Tarsons521000
Mikro Końcówki 10 - 100 & mikro; l Tarsons521010
Mikro końcówki 200-1000 i mikro; l Tarsons521020
 GeNei3601805001730
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140050
One Shot TOP10 Kompetentne chemicznie E. coliInvitrogenC404010E.coli DH5α
Opti-MEMGibco1105-021minimalna niezbędna pożywka
probówka do PCR 0,2 mlTarsons510051
Pencillin/streptomycyna Gibco15070063
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360T-wektor DNA
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)HiMediaTI1099
Phusion  Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530S
PibrentasvirCayman Chemical27546
Kontroler pipet Gilson 
Polimeraza DNA Platinum Taq Oprogramowanie do
PrismGraphPad
QIAamp Viral RNA Mini Zestaw do izolacji wirusaQiagen52904
Zestaw do miniprzygotowania QIAprep SpinQiagen27106
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Zestawoczyszczania cokumQIAGEN28104
Zestaw RNeasy Mini QIAGEN74104Zestaw do czyszczenia RNA
Pipety serologiczne 25 mlThermo Fisher170357N
Pipety serologiczne 5 mlPipety170355N10
mlThermo Fisher170356N
Jednoniciowy marker RNA 0,2-10 kbMerckR7020
Mleko odtłuszczone HiMediaM530
Azydek sodu 0,1 M roztwórMerck8591
SuperScript III Odwrotna transkryptaza Invitrogen18080044odwrotną transkryptazę
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
T175 kolba do hodowli komórkowych Tarsons159910
Kolba do hodowli komórkowych T25 Tarsons950040
T7 RiboMax Express System produkcji RNA na dużą skalę PromegaP1320  System produkcji RNA na dużą skalę 
Kolba do hodowli komórkowych T75 Tarsons950050
Taq DNA PolimerazaGenetix Biotech (Puregene)PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-etapowy zestawApplied Biosystems4392653
TaqMan RNA-to-CT  1-Krok  ZestawThermo Fisher4392653komercyjny zestaw qRT-PCR 
TOPO-XL--2 Kompletny zestaw do klonowania PCRZestaw Thermo FisherK8050-10do klonowania produktu long-PCR 
Tris baseHiMediaTC072
Roztwór Trypsin-EDTAHiMediaTCL007
Tween 20HiMediaMB067
Koncentrator próżni Eppendorf, Concentrator Plus100248
Kąpiel wodna DOTACJAJBN-18
Xba1NEBR0145S
BioRad, System detekcji PCR w czasie rzeczywistym Tarson 460091Spektrometr mikroobjętościowy System dokumentacji żelu 3120000909Bufor MOPS F110120 analizy statystycznej Thermo 10966034 do serologiczne Thermo Fisher

Bibliografia

  1. Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
  2. Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).
  3. Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).
  4. Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
  5. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).
  6. Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
  7. Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).
  8. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  9. Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
  10. Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
  11. Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  12. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  13. Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
  14. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
  15. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
  16. Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
  17. Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).
  18. Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PCR podatna na b dywirusowa biblioteka mutant wsynteza pe nej d ugo ci RNAewolucja sterowanaoporno NS5Awirus zapalenia w troby Ctransfekcja RNAtest tworzenia ognisk focus forming assay

Powiązane artykuły