Method Article

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja mitochondriów w nerwach obwodowych towarzyszy kilku chorobom związanym z neuropatią obwodową, które mogą być wywołane przez wiele przyczyn, w tym choroby autoimmunologiczne, cukrzycę, infekcje, dziedziczne zaburzenia i nowotwory. Ocena funkcji mitochondriów w nerwach obwodowych myszy może być trudna ze względu na małą wielkość próbki, ograniczoną liczbę mitochondriów obecnych w tkance oraz obecność osłonki mielinowej. Technika opisana w tej pracy minimalizuje te wyzwania poprzez zastosowanie unikalnego protokołu przepuszczalności dostosowanego do protokołu stosowanego do włókien mięśniowych, do oceny funkcji mitochondriów nerwu kulszowego zamiast izolowania mitochondriów od tkanki. Mierząc produkcję fluorymetrycznych form reaktywnych za pomocą Amplex Red/Peroxidazy i porównując różne substraty mitochondrialne i inhibitory w nerwach permeabilizowanych saponinami, możliwe było jednoczesne wykrycie mitochondrialnych stanów oddechowych, reaktywnych form tlenu (ROS) i aktywności kompleksów mitochondrialnych. W związku z tym przedstawiona tutaj metoda oferuje korzyści w porównaniu z oceną funkcji mitochondriów za pomocą innych technik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędne do utrzymania żywotności komórek i pełnią liczne funkcje komórkowe, takie jak metabolizm energetyczny (szlaki metabolizmu glukozy, aminokwasów, lipidów i nukleotydów). Jako główne miejsce produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), mitochondria odgrywają kluczową rolę w kilku procesach sygnalizacji komórkowej, takich jak apoptoza, i uczestniczą w syntezie klastrów żelazowo-siarkowych (Fe-S), imporcie i dojrzewaniu białek mitochondrialnych oraz utrzymaniu ich genomu i rybosomów1,2,3. Sieć dynamiki błon mitochondrialnych jest kontrolowana przez procesy fuz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt w Badaniach, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) oraz wytyczne National Institutes of Health dotyczące opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych. Nerw kulszowy jest izolowany od czteromiesięcznych samców myszy C57BL/6, które zostały poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi instytucji. Kroki protokołu są zoptymalizowane, aby uniknąć pogorszenia stanu mitochondriów. Dlatego w tym protokole kalibracja polarograficznych czujników tlenu została przeprowadzona przed preparacją tkanki nerwowej nerwu kulszowego myszy i przepuszczalnością.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zużycie tlenu w mitochondriach przez permeabilizowany nerw kulszowy jest przedstawione w Rysunek 2. Czerwony ślad reprezentuje strumień O2 na jednostkę masy w pmol/s.mg. Po zarejestrowaniu podstawowego zużycia tlenu za pomocą substratów endogennych (rutynowe oddychanie), bursztynian (SUCC) jest wstrzykiwany w celu zarejestrowania oddychania napędzanego kompleksem II (dehydrogenaza bursztynianowa), co powoduje wzrost szybkości zużycia tlenu. W sekwencji dodawane jest nasycone stęże.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka chorób lub stanów towarzyszących neuropatiom ma dysfunkcję mitochondriów jako czynnik ryzyka. Ocena funkcji mitochondriów w nerwach obwodowych jest niezbędna do wyjaśnienia, w jaki sposób mitochondria działają w tych stanach neurodegeneracyjnych. Ocena funkcji mitochondriów jest pracochłonna ze względu na trudność metody izolacji i niedobór materiału. W związku z tym niezbędny jest rozwój technik przenikania tkanek, które nie wymagają izolacji mitochondriów.

Aby ocenić funkcję mitochondr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Jesteśmy wdzięczni dr Antonio Galinie Filho, dr Monice Montero Lomeli i dr Claudio Masuda za wsparcie w postaci wyposażenia laboratoryjnego oraz dr Marcie Sorenson za miłe i cenne uwagi dotyczące ulepszania artykułu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hydrat soli disodowej adenozyno-5'trifosforanuSigma-AldrichA26209
Sól sodowa adenozyno-5′-difosforanuSigma-AldrichA2754
Amplex Red OdczynnikThermo Fisher scientificA12222Amplex Red jest przygotowywany w DMSO zgodnie z kartą charakterystyki
produktu Antymycyna A (ze Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7030frakcja szoku cieplnego, bez proteazy, bez kwasów tłuszczowych, zasadniczo bez globulin, pH 7, ≥ 98%
Węglan wapniaSigma-AldrichC6763
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonylu (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cytochrom cSigma-AldrichC7752(z serca konia; mała hemoproteina)
DataLab wersja 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Cyfrowa wytrząsarka orbitalna do mikropłytek 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sól sodowaSigma-AldrichE8145
StrzykawkaHamilton Sigma-Aldrich HAM8007510 uL, 25 uL i 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Wodór roztwór nadtlenku 30% w/wMerckH1009
ImidazolSigma-AldrichI2399
L-(−)-Kwas jabłkowySigma-AldrichM7397
Chlorek magnezu sześciowodnySigma-AldrichM2393
Sól sodowa MESSigma-AldrichM3885
Kleszczyki mikropreparacyjne, zakrzywioneSigma-AldrichF4142
Kleszczyki do mikropreparacji, prosteSigma-AldrichF4017
O2K - Zestaw filtrów Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometria: produkcja HRR i H2O2 w mitochondriach mózgu myszy. Mitochondrowa sieć fizjologiczna 17.17.
O2K - Fluorescencyjna dioda LED2 - składnik modułu Fluorescance-Sensor ZielonyOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
OligomycynaSigma-AldrichO4876(z Streptomyces diastatochromogenes; mieszanina oligomycyn A, B i C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Austriahttp://www.oroboros.at
Palmitoylkarnityna (Palmitoyl-DL-karnityna-HCl)Sigma-AldrichP4509
Peroksydaza z chrzanuSigma-AldrichP8375
Szalki Petriego, polistyrenMERCKP5606
Sól disodowa fosfokreatyny hydratSigma-AldrichP7936
Diwodorofosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichPHR1330
WodorotlenekpotasuSigma-Aldrich221473
RotenonSigma-AldrichR8875
SaponinaSigma-AldrichSAE0073
Pirogronian soduSigma-AldrichP5280
Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodnySigma-AldrichS2378
SacharozaSigma-AldrichS9378
TaurynaSigma-AldrichT0625

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles