Doustne skojarzone leczenie przeciwretrowirusowe u humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV-1

Oczekiwana długość życia osób zakażonych wirusem HIV znacznie się poprawiła dzięki skojarzonemu leczeniu antyretrowirusowemu (cART)^1,2. cART skutecznie zmniejsza replikację HIV-1 i zwiększa liczbę limfocytów T CD4+ do normalnego poziomu u większości uczestników przewlekle zakażonych wirusem HIV-1³, co skutkuje poprawą ogólnego stanu zdrowia i radykalnym zmniejszeniem postępu choroby⁴. Jednak utajony rezerwuar HIV-1 powstaje nawet wtedy, gdy ART jest inicjowany podczas ostrej infekcji^5,6,7. Rezerwuary utrzymują się przez lata podczas ART i szybkiego odbicia wirusa po przerwaniu ART jest dobrze udokumentowane^8,9. Osoby żyjące z wirusem HIV na ART są również predysponowane do większego ryzyka chorób współistniejących, takich jak choroby układu krążenia, nowotwory i zaburzenia neurologiczne^10,11,12. Dlatego potrzebne jest funkcjonalne lekarstwo na HIV. Modele zwierzęce do wykrywania zakażenia wirusem HIV-1 oferują oczywiste korzyści w opracowywaniu i walidacji nowych strategii leczenia HIV^13,14,15. Humanizowane myszy, jako mały model zwierzęcy, mogą zapewnić wieloliniową rekonstytucję ludzkich komórek odpornościowych w różnych tkankach, co pozwala na dokładne badanie zakażenia wirusem HIV^16,17,18,19. Wśród modeli humanizowanych, humanizowany model szpiku kostnego, wątroby i grasicy (BLT) z powodzeniem podsumowuje przewlekłe zakażenie HIV-1, a także funkcjonalne odpowiedzi immunologiczne człowieka na zakażenie HIV-1^{20,21,22,23,24}. Dlatego humanizowany model myszy BLT jest szeroko stosowany do badania różnych aspektów w dziedzinie badań nad HIV. Humanizowane myszy BLT są nie tylko dobrze ugruntowanymi modelami rekapitulacji uporczywego zakażenia HIV-1 i patogenezy, ale także narzędziami konsekwentnymi do oceny strategii interwencyjnych opartych na terapii komórkowej. Obecni autorzy i inni wykazali, że humanizowany model myszy BLT podsumowuje uporczywe zakażenie HIV-1 i patogenezę^25,26,27 i dostarcza narzędzi do oceny strategii interwencji opartych na terapii komórkowej ^{28,29,30,31,32,33}.

cART schematy składające się z kombinacji leków antyretrowirusowych, które są przyjmowane codziennie, hamują replikację HIV-1 do tego stopnia, że wiremia u osób skutecznie leczonych pozostaje niewykrywalna przez długi czas³⁴. Wyniki leczenia humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV za pomocą klinicznie istotnych schematów cART przypominają te obserwowane u osób zakażonych wirusem HIV-1 leczonych ART²²: Poziomy HIV-1 są tłumione poniżej granic wykrywalności, a przerwanie cART powoduje odbicie replikacji HIV z utajonego rezerwuaru³⁵. Podskórne (SC)^27,36,37 lub dootrzewnowe (IP)^37,38,39 iniekcja jest powszechnie stosowaną drogą leczenia cART u humanizowanych myszy. Jednak intensywne codzienne wstrzykiwanie wywołuje stres u zwierząt poprzez fizyczne ograniczenie⁴⁰. Jest to również pracochłonne i potencjalnie niebezpieczne dla badaczy ze względu na zwiększone narażenie na wirusa HIV podczas używania ostrych narzędzi. Podawanie doustne jest idealne do naśladowania wchłaniania, dystrybucji i wydalania leków cART, które są przyjmowane przez osoby zakażone wirusem HIV-1. Podawanie doustne zazwyczaj wiąże się z dostosowanymi i często pracochłonnymi procedurami umieszczania leków antyretrowirusowych w wysterylizowanym (koniecznym ze względu na niedobór odporności myszy) jedzeniu^24,37,41 lub water^{42,43,44,45,46}, które mogą, ale nie muszą, być chemicznie kompatybilne z wieloma lekami antyretrowirusowymi lub powodować coś, czego myszy nie byłyby skłonne do jedzenia lub picia (co wpłynęłoby na dawkę i poziom leku w organizmie). Zaproponowana tu nowatorska metoda doustnego podawania cART przewyższa wcześniejsze próby podania ze względu na kompatybilność z różnymi rodzajami leków antyretrowirusowych, bezpieczeństwo oraz łatwość przygotowania i podawania oraz zmniejszenie stresu i niepokoju zwierząt wynikających z codziennego wstrzykiwania.

Fumaran dizoproksylu tenofowiru (TDF), Elvitegravir (ELV) i Raltegravir (RAL) są lekami słabo rozpuszczalnymi w wodzie. Co ciekawe, zwiększoną biodostępność TDF obserwuje się w przypadku tłustych pokarmów, co sugeruje, że konkurencyjne hamowanie lipaz przez tłuste pokarmy może zapewnić pewną ochronę dla TDF⁴⁷. Dlatego kubki DietGel Boost zostały wybrane tak, aby zastąpić zwykłą karmę dla gryzoni jako metodę dostarczania w oparciu o ich niewielką zawartość tłuszczu (20,3 g na 100 g) w porównaniu ze zwykłą karmą dla gryzoni (10 g na 100 g) i typową dietą wysokotłuszczową dla myszy (40-60 g na 100 g)⁴⁸. Całkowita waga jednej filiżanki to 75 g; W ten sposób każda filiżanka będzie zawierała ilość pokarmu, a tym samym leku, wystarczającą dla pięciu myszy w ciągu 3 dni.

Zanonimizowana ludzka tkanka płodowa została pozyskana komercyjnie. Badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytet Kalifornijski w Los Angeles i Komitet Badań nad Zwierzętami (ARC) (UCLA) zgodnie ze wszystkimi wytycznymi federalnymi, stanowymi i lokalnymi. W szczególności wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami i wytycznymi dotyczącymi trzymania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi National Institutes of Health (NIH) oraz Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International na mocy protokołu UCLA ARC o numerze 2010-038-02B. Wszystkie operacje przeprowadzono w znieczuleniu ketaminą (100 mg/kg)/ksylazyną (5 mg/kg) i izofluranem (2-3% obj.) i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierząt.

1. Humanizowane myszy zakażone wirusem HIV-1

UWAGA: Humanizowane myszy zostały skonstruowane zgodnie z wcześniejszym opisem w^30,31,49. Protokół jest pokrótce opisany poniżej.

1. Oczyść hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+ z ludzkiej wątroby płodu za pomocą mikrogranulek anty-CD34 zgodnie z protokołem producenta.
2. Przed zabiegiem znieczulić 6-8-tygodniowe myszy NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) i poddać je subletalnemu napromienianiu (2,7 Gy).
3. Wszczepić grasicę, pochodzącą od tego samego dawcy co wątroba płodu, pod torebkę nerkową wraz z wątrobą.
4. Po implantacji wstrzyknij myszom dożylnie od 0,5 miliona do miliona komórek CD34 +.
5. Po 8-10 tygodniach zbierz 100 μl krwi myszy przez krwawienie zadoczodołowe⁵⁰ do probówek mikrowirówek zawierających 5 μl EDTA i wiruj przy 350 x g przez 3 min.
6. Przechowywać osocze w temperaturze -80 °C w celu monitorowania wiremii po zakażeniu myszy wirusem HIV-1. Dodaj 2 ml 83% roztworu NH4C i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek.
7. Dodaj 10 ml RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aby zatrzymać lizę. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 min.
8. Aspirowany supernatant. Wybarwić komórki panelem przeciwciał (patrz tabela materiałów) i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia wszczepienia ludzkich komórek odpornościowych.
9. Zakażone myszy wykazujące ponad 50% krążących komórek CD45 + poprzez wstrzyknięcie żyły zaoczodołowej ^51,52 z co najmniej 200 ng p24 szczepu HIV-1 (tj. NFNSXSL9^30,53,54) za pomocą strzykawki insulinowej. Pobieraj krew co dwa tygodnie do analizy cytometrii przepływowej i pomiaru wiremii.

2. Przygotowanie leków ART

1. Zważ poszczególne leki; na przykład, aby przygotować 10 kubków na żywność z cART, użyj sterylnych skrobaków do komórek, aby odważyć 250 mg FTC (emtrycytabiny), 375 mg TDF i 500 mg RAL lub ELV do pojedynczych sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Dodaj 1 ml DMSO do probówki FTC 250 mg (końcowe stężenie 250 mg / ml), dodaj 1,5 ml DMSO do probówki 375 mg TDF (końcowe stężenie 250 mg / ml) i dodaj 1 ml DMSO do 500 mg RAL lub probówki ELV (końcowe stężenie 500 mg / ml). Mieszać lub pipetować mieszaninę leku aż do całkowitego rozpuszczenia i uzyskania klarownego roztworu.
3. Użyj hydrofilowego filtra membranowego PVDF o wielkości porów 0,22 μM, aby sterylizować roztwory za pomocą sterylnej strzykawki. Poszczególne roztwory leków można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 12 tygodni.
4. Gotowy do użycia roztwór świeżo rozmrozić po jednej porcji każdego roztworu leku w temperaturze 37 °C, aż roztwór stanie się klarowny. Dobrze wymieszać za pomocą pipety.
5. Połącz leki i dobrze wymieszaj, aby utworzyć mieszankę główną: 1 ml FTC w DMSO, 1,5 ml TDF w DMSO i 1 ml ELV lub RAL w DMSO.
   UWAGA: Z tej ilości wyjdzie 10 kubków na żywność.
6. Dodaj 350 μl roztworu cART master mix do jednej filiżanki, aby przygotować jedną filiżankę DietGel Boost cART.
7. Dodać 0,75 ml trimetoprimu-sulfametoksazolu (0,48 mg/ml stężenia końcowego) do filiżanki.
8. Dokładnie wymieszać za pomocą sterylnych końcówek do pipet o pojemności 1 ml.
9. W razie potrzeby przechylić pojemnik na żywność zawierającą cART z oryginalnego kubka za pomocą mikroszpatułki na szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Zważ karmę na wadze, aby obliczyć ilość kubka z jedzeniem zawierającego cART dla każdej klatki w zależności od liczby myszy.

3. Podawanie leków ART myszom zakażonym wirusem HIV-1

1. Wyjmij zwykłą karmę z klatki i zastąp ją kubkiem na żywność zawierającym cART.
   UWAGA: Średnio mysz zjada do 5 g jedzenia dziennie. Około jednego kubka z jedzeniem można podawać pięciu myszom przez 2 dni.
2. Odświeżaj jedzenie cART trzy razy w tygodniu.
3. Zważ zużyte kubki, aby monitorować spożycie. Waż myszy co tydzień, aby potwierdzić spożycie.

4. Monitorowanie wiremii za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

1. Oceń ludzkie komórki odpornościowe (poziomy limfocytów T CD4 i CD8) i replikację HIV-1 u myszy BLT co 2 tygodnie przez krwawienie zaoczodołowe. Zbierz osocze, postępując zgodnie z instrukcjami w krokach 1.5-1.8.
2. Monitoruj miano wirusa w osoczu myszy zakażonych wirusem HIV-1 przed i podczas doustnego podawania cART przez 8 tygodni. Wyodrębnij wirusowe RNA osocza z osocza za pomocą zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA i określ go ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów i sond (patrz Tabela materiałów), jak opisano wcześniej^27,30,31. Stosuj następujący protokół cykliczny: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), a następnie cyklicznie 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) przez 45 cykli.

5. Oceń proporcje CD4/CD8 za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przygotować zawiesiny jednokomórkowe z krwi obwodowej z krwawień dwutygodniowych, wykonując czynności 1.5-1.8.
2. Wybarwić komórki markerami powierzchniowymi i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj następujących przeciwciał markera powierzchniowego^27,30,43,49 w cytometrii przepływowej: CD45 (klon HI30), CD8 (klon SK1), CD3 (klon OKT3), CD4 (klon RPA-T4)^27,30,42,49.

Zakładając, że przeciętna mysz ważąca 25 g spożywa 4 g jedzenia dziennie, dzienna dawka leku po spożyciu doustnym odpowiada 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC i 768 mg/kg RAL. Aby sprawdzić, czy zoptymalizowany schemat żywieniowy jest toksyczny i wpływa na ogólny stan zdrowia w porównaniu z codziennym wstrzykiwaniem cART, masę ciała myszy monitorowano co tydzień przed i podczas cART poprzez wstrzyknięcie doustne lub podskórne. Nie stwierdzono istotnych różnic w masie ciała przed podaniem cART w każdej grupie (Ryc. 1). Jednak masa myszy stale zmniejszała się podczas codziennego wstrzykiwania cART SC. Natomiast FTC/TDF/ELV lub FTC/TDF/RAL w DietGel przywróciły wagę myszy do poziomu sprzed inicjacji ART po 5 tygodniach doustnego podawania cART. Ponadto nie zaobserwowano istotnych zmian masy ciała między grupami otrzymującymi raltegrawir i elwitegrawir.

Aby sprawdzić, czy doustne podawanie cART tłumi wiremię tak skutecznie jak codzienne wstrzyknięcie, co dwa tygodnie oceniano miano wirusa w osoczu za pomocą RT-PCR. Rysunek 2 pokazuje, że schemat żywieniowy FTC/TDF/ELV ART w 100% skutecznie stłumił replikację wirusa do niewykrywalnego poziomu w ciągu 4 tygodni; Schemat żywieniowy FTC/TDF/RAL ART może stłumić 80% myszy do niewykrywalnych poziomów w ciągu 4 tygodni, podczas gdy tylko 70% myszy otrzymujących wstrzyknięcie SC osiągnęło niewykrywalne poziomy po 4 tygodniach leczenia. Wyniki wykazały, że podawanie doustne hamuje replikację wirusa szybciej i skuteczniej niż wstrzyknięcie SC. Co więcej, schemat żywieniowy cART zapobiegł dalszemu spadkowi proporcji CD4 / CD8 we krwi obwodowej przed codziennym wstrzyknięciem SC (Ryc. 3). Wyniki te sugerują, że proponowany doustny schemat cART może skutecznie stłumić wiremię osocza poniżej poziomu wykrywania, szybko przywrócić poziom limfocytów T CD4 i poprawić ogólny stan zdrowia zwierząt u humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV-1.

Rysunek 1: Masa ciała myszy zmienia się przed i w trakcie leczenia cART po zakażeniu HIV-1 w różnych grupach. Humanizowane myszy zostały zakażone wirusem HIVNFNSXSL9 po rekonstytucji immunologicznej. Po 4 tygodniach od zakażenia wirusem HIV-1 myszy były leczone przez kolejne 7,5 tygodnia schematem FTC/TDF/RAL poprzez wstrzyknięcie podskórne (SC) lub doustne podawanie FTC/TDF/RAL lub FTC/TDF/ELV. Masę ciała myszy mierzono od 1 tygodnia przed zakażeniem wirusem HIV. Wszystkie porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu Manna-Whitneya, średnia z grupy raportującej (± S.E.). Zielone gwiazdki pokazują różnice statystyczne między grupą doustną FTC/TDF/ELV a grupą iniekcji FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 w każdej grupie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Doustne podawanie cART w żywności pokazuje szybszą supresję wirusa. Jak opisano w Rysunek 1, myszy były albo nieleczone, albo leczone schematem FTC/TDF/RAL poprzez wstrzyknięcie podskórne oraz poprzez doustne podawanie schematów żywieniowych imitacji kubków spożywczych, FTC/TDF/RAL lub FTC/TDF/ELV przez kolejne 7,5 tygodnia. (A) Miano wirusa w osoczu w czasie po zakażeniu HIV-1 w różnych grupach. (B) Podsumowanie wiremii w czasie po zakażeniu HIV-1 w różnych grupach, raportując średnią geometryczną grupy z 95% przedziałem ufności (CI). Czarne strzałki wskazują czas rozpoczęcia leczenia cART dla grup leczonych cART. (C) Analiza przeżycia czasu po leczeniu cART do niewykrywalnego miana wirusa dla każdej grupy. n = 6-7 w każdej grupie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Doustne podawanie pokarmów metodą ART wykazuje szybsze przywracanie proporcji CD4/CD8. Stosunek CD4/CD8 we krwi obwodowej w czasie po zakażeniu HIV-1 dla każdej grupy. Wszystkie porównania statystyczne zostały przeprowadzone przy użyciu testu Manna-Whitneya, średnia z grupy (± S.E.). Czerwone gwiazdki pokazują różnice statystyczne między grupą doustną FTC/TDF/RAL a grupą iniekcji FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 w każdej grupie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

SK jest założycielem CDR3 Inc. Pozostali autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.