Artykuł metodologiczny

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63714

⸱

5 maja 2022

 ,  , 
1Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, The University of Queensland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Streszczenie

Organoidy mózgowe są trójwymiarowymi modelami rozwijającego się ludzkiego mózgu i stanowią atrakcyjną, najnowocześniejszą platformę do modelowania chorób oraz badań przesiewowych genomu i leków na dużą skalę. Ze względu na samoorganizujący się charakter komórek w organoidach mózgowych i rosnący zakres dostępnych protokołów ich generowania, zidentyfikowano problemy z heterogenicznością i zmiennością między organoidami. W tym dokumencie dotyczącym protokołu opisujemy solidny i powtarzalny protokół, który w dużej mierze przezwycięża te problemy i generuje organoidy korowe z neuroektodermalnych komórek progenitorowych w ciągu 1 miesiąca i który może być utrzymywany przez ponad 1 rok. Ten wysoce powtarzalny protokół można łatwo przeprowadzić w standardowym pomieszczeniu do hodowli tkankowej i daje w wyniku organoidy o bogatej różnorodności typów komórek, które zwykle znajdują się w rozwijającej się korze człowieka. Pomimo wczesnej budowy rozwojowej, neurony i inne typy komórek mózgowych człowieka zaczną wykazywać typowe oznaki starzenia się komórek neuronalnych po długotrwałej hodowli in vitro, co czyni je cenną i użyteczną platformą do badania procesów neuronalnych związanych ze starzeniem się. Protokół ten przedstawia również metodę wykrywania takich komórek starczych w organoidach korowych mózgu za pomocą barwienia beta-galaktozydazą związanego ze starzeniem się.

Wprowadzenie

Nasza obecna wiedza na temat ludzkiego mózgu opiera się głównie na modelach zwierzęcych i pośmiertnych próbkach mózgu. Biologia komórek macierzystych to szybko rozwijająca się dziedzina, która dostarcza nowych informacji na temat podstawowej biologii rozwoju ludzkiego mózgu i patologicznych czynników powodujących zaburzenia ludzkiego mózgu. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są nieocenionym narzędziem do modelowania ludzkiego mózgu poprzez generowanie organoidów, trójwymiarowej tkanki przypominającej narządy (3D), która zazwyczaj podsumowuje trajektorie rozwojowe, skład komórkowy i architekturę rozwijającego się ludzkiego mózgu. Organoidy mózgowe są samoorganizujące się i składają się z nerwowych komórek macierzystych, określonych progenitorów nerwowych, dojrzałych neuronów i typów komórek glejowych. Organoidy stanowią zatem wyjątkową okazję do zbadania wczesnego ludzkiego mózgu, który często jest niedostępny do bezpośrednich eksperymentów, ale ma również wewnętrzne ograniczenia, takie jak brak układu naczyniowego i odpornościowego.

Metodologie generowania organoidów mózgowych były realizowane na dwa różne sposoby: niekierowane różnicowanie i kierowane różnicowanie. Niekierowane metody organoidów mózgu opierają się na spontanicznych wewnętrznych zdolnościach różnicowania komórek macierzystych, które napędzają morfogenezę tkanek1,2 i pozwalają na pojawienie się różnych tożsamości linii komórkowych, od przodomózgowia, śródmózgowia i tyłomózgowia, po splot naczyniówkowy, siatkówkę i mezodermę. W przeciwieństwie do tego, metody organoidów mózgowych wymagają znacznego wykorzystania czynników zewnętrznych, aby skierować hPSC w kierunku pożądanego wzorca linii neuronalnych reprezentujących jeden typ regionu mózgu, takiego jak wyniosłość przyśrodkowa zwoju przyśrodkowego3, forebrain4, midbrain5, hypothalamus6, cerebellum7 i splot naczyniówkowy8. Ta zdolność do generowania różnych regionów mózgu z różnymi liniami komórkowymi i potencjał do ich łączenia w dowolnym momencie sprawia, że organoidy mózgowe są doskonałym modelem do badania rozwoju ludzkiego mózgu i rozszyfrowywania mechanizmów leżących u podstaw chorób związanych z mózgiem. Chociaż te metody generowania organoidów mózgowych stanowią przełom w modelowaniu obszarów ludzkiego mózgu, zmienność i niejednorodność między organoidami pozostaje istotnym ograniczeniem dla badań systematycznych i ilościowych, takich jak badania przesiewowe leków.

Obecny protokół opiera się na metodzie opracowanej w naszym ostatnim artykule9 i obejmuje selektywne różnicowanie kolonii hPSC w kierunku tożsamości neuroektodermy (NEct) za pomocą podwójnych inhibitorów SMAD (SB-431542 i LDN 193189), które następnie mają zdolność do samoorganizacji w ciągu 4 dni w sferoidy neuroepithelium 3D pod wpływem sygnalizacji FGF2. Te sferoidy neuroepithelium niezawodnie generują jednorodne organoidy korowe o składzie komórkowym podobnym do in vivo w ciągu 4 tygodni od różnicowania. Opisany tutaj protokół opiera się na naszych wcześniejszych odkryciach pokazujących, że hamowanie podwójnej sygnalizacji SMAD (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) sprzyja różnicowaniu hPSC w kierunku rostralnych nerwowych komórek macierzystych pochodzących z neuroektodermalnych komórek progenitorowych10 poprzez, między innymi, hamowanie wyboru losu komórek endodermalnych, mezodermalnych i trofektodermy11. Co więcej, osadzenie sferoid neuroepithelium w macierzy błony podstawnej kwalifikowanej do hESC powoduje znaczne pączkowanie neuroepitelii, tworząc komory o polaryzacji apikopodstawnej. Hodowla na dużą skalę wykazała powtarzalność i jednorodność organoidów korowych niezależnie od linii komórkowych, klonów lub partii, a tym samym stanowi niezawodny i stabilny system komórek macierzystych, który naśladuje wczesny rozwój kory mózgowej człowieka w zdrowiu i chorobie in vitro. Ponadto nakreślamy protokół wykrywania markerów starzejących się komórek neuronalnych w organoidach korowych mózgu pochodzących z hPSC, które były hodowane przez dłuższy czas.

Po posiewie hPSC o gęstości wysiewu 20%-30%, komórki są traktowane podwójnymi inhibitorami SMAD przez 3 dni, aby zróżnicować kolonie hPSC w kierunku kolonii neuroektodermalnych. Kolonie te są następnie delikatnie podnoszone za pomocą dyspasy i wysiewane na 6-dołkowe płytki o bardzo niskim przyłączeniu uzupełnione FGF2. Pływające kolonie 2D samoorganizują się w sferoidy neuroektodermalne 3D w ciągu nocy i są utrzymywane przez 4 dni w pożywce N2 uzupełnionej codziennie FGF2. Gdy sferoidy utworzą warstwę neuronabłonkową, mogą zostać osadzone w macierzy błony podstawnej. Rutynowo dodając świeżą pożywkę różnicującą końcówki, naukowcy będą obserwować postępującą ekspansję i pączkowanie neuroepitelii w organoidach korowych. Naukowcy mogą chcieć oddzielić te organoidy w celu przeprowadzenia profilowania transkrypcyjnego i proteomicznego. Dodatkowo zaleca się obrazowanie w jasnym polu w celu monitorowania jakości organoidów korowych. Analizę można przeprowadzić przez utrwalanie, kriosekcję i barwienie immunologiczne. Opisy i metody dla tych technik zostały już wcześniej opisane12. Ostatecznie protokół ten pozwala naukowcom szybko i solidnie generować jednorodne organoidy korowe mózgu do modelowania rozwijającego się ludzkiego mózgu korowego, przy niskich kosztach i ograniczonym sprzęcie, oraz do badania aspektów starzenia się neuronów komórkowych, jak opisano w tym artykule.

Protokół

1. Generowanie organoidów korowych w mózgu

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w tej sekcji protokołu będą miały miejsce w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Indukcja kolonii neuroektodermalnych 2D z hodowli hPSC 2D (dni od -1 do 3)
    1. Przed indukcją umieść kolonie hPSC na matrycy błony podstawnej z kwalifikacją hESC na 6-dołkowej płytce o gęstości 20%-30%. Osiągnij tę gęstość poprzez pasażowanie kolonii hPSC z jednego dołka płytki 6-dołkowej przy 60% konfluencji do trzech dołków płytki 6-dołkowej.
    2. W przypadku powlekania matrycy membrany podstawnej należy rozcieńczyć matrycę błony podstawnej w stosunku 1:50 w zwykłym podłożu podstawowym. Równomiernie umieścić 1 ml / dołek na 6-dołkowej płytce, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie aspirować.
    3. Utrzymuj kolonie hPSC przez 1 dzień w 2 ml pożywki do hodowli komórek bez surowicy przed różnicowaniem.
    4. W dniu różnicowania hPSC należy sprawdzić kolonie hPSC za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu od 4 do 10 razy, aby upewnić się, że kolonie są zdrowe bez wykrywalnego różnicowania.
      UWAGA: Zdrowe hPSC będą tworzyć ciasne kolonie krawędziowe z komórkami, które mają duże jądro, bardzo małą cytoplazmę i wydatne jąderka. Zróżnicowane kolonie iPSC będą wykazywać wyraźne różnice morfologiczne w stosunku do opisanych powyżej kolonii hPSC, szczególnie wokół zewnętrznych krawędzi kolonii lub w środku.
    5. Dodać odczynniki wymienione w tabeli 1 w celu uzupełnienia pożywki N2 wymaganej do różnicowania. Przynieś to podłoże do RT przed użyciem.
    6. Po osiągnięciu temperatury rzeczywistej odessać pożywkę do hodowli komórkowych bez surowicy z każdej studzienki płytki 6-dołkowej i zastąpić 2 ml pożywki N2 delikatnie dodanej pipetą serologiczną o pojemności 5 ml.
    7. Dodaj podwójne inhibitory SMAD, SB-431542 (10 μM) i LDN 193189 (100 nM).
      UWAGA: Inhibitory SMAD można dodać do pożywki N2 po umieszczeniu pożywki w każdym dołku lub do wymaganej ilości pożywki N2 przed wymianą pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy. Inhibitory mogą być równomiernie wprowadzane do pożywki poprzez delikatne obracanie płytki lub odwrócenie rurki zawierającej pożywkę i inhibitory 3-4 razy.
    8. Dodawaj świeże pożywki N2 uzupełnione SB-431542 (10 μM) i LDN 193189 (100 nM) codziennie do każdego dołka przez następne 2 dni.
      UWAGA: Świeże podłoże N2 dodaje się w celu zmniejszenia długotrwałej ekspozycji komórek na DMSO, który służy do rozpuszczania związków SB-431542 i LDN 193189 oraz zapobiegania cytotoksyczności.
  2. Generowanie sferoid neuroektodermalnych 3D z indukowanych kolonii neuroektodermalnych 2D (dni od 3 do 7)
    1. Podnieś indukowane kolonie neuroektodermalne za pomocą dypazy, wykonując kroki 1.2.2-1.2.8.
    2. Najpierw wyjmij 2 ml pożywki N2 z płytki 6-dołkowej i przemyj 1x HBSS, aby upewnić się, że cała pożywka N2 została usunięta.
      UWAGA: Pożywka N2 może zakłócać aktywność enzymatyczną dypazy, uniemożliwiając odpowiednie oderwanie kolonii neuroektodermalnych od studzienki.
    3. Dodaj 1 ml 2,4 jednostki/ml dypazy do każdej studzienki zawierającej kolonię.
    4. Inkubować studzienkę przez 20-25 minut (maksymalnie 30 minut) w temperaturze 37 °C. Regularnie sprawdzać, czy kolonia nie została oderwana.
      UWAGA: Małe kolonie mogą oderwać się w ciągu 20 minut. Wszelkie kolonie, które utknęły po 30 minutach, należy zignorować.
    5. Po inkubacji dodać 1 ml pożywki N2 do studzienki, aby zatrzymać aktywność enzymu dyspazy i przenieść kolonie do probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze lub zmodyfikowanej końcówki do pipety P1000 wyciętej sterylnymi nożyczkami (dzięki czemu jest to końcówka P1000 o szerokim otworze).
    6. Pozwól, aby grudki kolonii opadły na dno rurki z grawitacją.
      UWAGA: Ten proces zajmie około 1 minuty.
    7. Gdy grudki opadną, ostrożnie usuń supernatant za pomocą standardowej końcówki pipety P1000 i zastąp go 1 ml świeżej pożywki N2. Powtórz ten krok prania trzy razy, aby zapewnić całkowite usunięcie dispase.
      UWAGA: Pozostała dypaza zapobiegnie równomiernemu tworzeniu się sferoid neuroektodermalnych i wywoła śmierć komórki.
    8. Po umyciu ponownie zawieś grudki komórek w 3 ml pożywki N2 i przenieś do jednego dołka 6-dołkowej płytki i dodaj 40 ng/ml bFGF.
      UWAGA: Jeśli duża liczba kolonii neuroektodermalnych zostałaby odłączona, kolonie te można by posiać w dwóch lub więcej dołkach 6-dołkowej płytki, aby zapobiec fuzji sferoid. Po 24 godzinach od odłączenia kolonii należy sprawdzić, czy uformowały się sferoidy.
    9. Utrzymuj sferoidy w tym samym podłożu przez następne 3-4 dni, ale codziennie dodawaj świeży bFGF (40 ng / ml) do każdej studzienki, aby promować proliferację komórek neuroektodermalnych, samoorganizację oraz indukować i rozszerzać neuroepitelia.
      UWAGA: Jeśli sferoidy zostały posiane z większą gęstością, podłoże prawdopodobnie zmieni kolor na żółty i będzie wymagało wymiany co 2 dni na świeży bFGF (40 ng / ml). Nie jest to jednak zalecane, a zamiast tego w każdej studzience należy utrzymywać mniejszą liczbę sferoid, aby uniknąć tego problemu. Sferoidy mogą zostać osadzone w macierzy błony podstawnej po 3 dniach, jeśli widoczne są neuroepitelie. Jeśli nabłonek nerwowy nie jest widoczny lub nie wygląda na silny, utrzymuj sferoidy przez kolejny dzień i sprawdź ponownie.
  3. Różnicowanie i utrzymanie organoidów korowych w mózgu (Dzień 8)
    1. Przygotować końcowe pożywki różnicujące (DM) przy użyciu odczynników wymienionych w tabeli 2. Przynieś ten nośnik do RT.
    2. Rozmrozić w 100% zakwalifikowaną do hESC matrycę membrany podstawnej na lodzie.
    3. Na 10 cm szalce Petriego przygotuj arkusz parafilmu z wgłębieniami wysterylizowanymi 70% etanolem i umieść go na mikroskopie stereoskopowym pod kapturem.
      UWAGA: Pusta taca z końcówkami do pipet o pojemności 200 μl może być użyta do wygenerowania siatki wgłębień.
    4. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 100 μl (aby uzyskać szeroki otwór). Zostanie to wykorzystane do osadzenia sferoid neuronalnych w macierzy podstawy bez ich łamania.
    5. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wybierz sferoidy neuronowe o podobnej wielkości (500 μm) z płytki 6-dołkowej i przenieś je do wgłębień parafilmu za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze 100 μl, umieszczając pojedynczą sferoidę neuronalną na wgłębienie.
    6. Delikatnie usuń nadmiar podłoża, pozostawiając tylko tyle, aby pokryć sferoidy.
      UWAGA: Ma to na celu utrzymanie jakości sferoid przed dodaniem matrycy podstawowej i upewnienie się, że nie wyschną.
    7. Delikatnie dodaj 18 μl macierzy podstawowej na sferoidę, umieszczając sferoidę w środku kropli matrycy. Użyj końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby wyśrodkować sferoidy w matrycy.
      UWAGA: Staraj się dodać matrycę podstawową tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć wysychania nadmiaru mediów wokół sferoid.
    8. Przykryć 10 cm szalkę Petriego i przenieść do inkubatora, a następnie inkubować szalkę parafilmu ze sferoidami osadzonymi w matrycy podstawowej w temperaturze 37 °C przez 25 minut.
    9. Po inkubacji spłucz osadzone sferoidy na 24-dołkową płytkę o niskim nakładzie za pomocą końcówki P1000 z 0,5 ml pożywki DM, upewniając się, że poszczególne osadzone sferoidy są umieszczone w jednym dołku każdy.
      UWAGA: Jeśli więcej niż jedna osadzona sferoida wpadnie do jednej studzienki, użyj końcówki P1000 o szerokim otworze, aby przenieść drugą sferoidę do nowej studzienki.
    10. Utrzymuj zróżnicowane organoidy korowe mózgu w pożywce DM przez dłuższy czas, przy czym zmiany w pożywce zachodzą co 2 dni, gdy organoidy stają się większe i starsze.
      UWAGA: W pierwszym tygodniu różnicowania podłoże można zmieniać co 3 dni.

2. Charakterystyka starzenia się neuronów w organoidach korowych

  1. Organoidy korowe procesowe do kriosekcji:
    UWAGA: Czynności zostały wykonane w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2.
    1. Przygotuj 2 ml probówek, z których każda wypełniona jest 1,5 ml 4% paraformaldehydu (PFA).
    2. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 (aby uzyskać szeroki otwór) i delikatnie przenieś każdy organoid do jednej z 2 ml probówek przygotowanych powyżej (po jednym organoidzie na probówkę).
      UWAGA: Aby zapobiec mieszaniu się nadmiaru pożywki DM z PFA, pozwól organoidowi opaść w kierunku otworu końcówki pipety P1000 i oprzyj końcówkę tuż nad górną częścią PFA w probówce przed odpipetowaniem organoidu. Umożliwi to badaczowi przeniesienie tylko organoidu i bardzo minimalnej ilości pożywki.
    3. Pozostawić proces utrwalania w temperaturze 4°C na 1 godzinę.
    4. Używając nieobciętej końcówki pipety P1000, ostrożnie odessać nadmiar PFA i dodać 1,5 ml zimnego 1x PBS.
    5. Przenieś rurki do wytrząsarki orbitalnej ustawionej na 70 obr./min na 10 minut przy RT.
    6. Powtórz proces prania z zimnym 1x PBS trzy razy, aby upewnić się, że cały PFA został dokładnie usunięty.
      UWAGA: Nie wyrzucaj PFA do zwykłych pojemników na odpady; zamiast tego przygotuj do tego specjalny pojemnik na odpady chemiczne, ponieważ PFA stanowi zagrożenie.
    7. Zanurzyć organoidy w 1x PBS zawierającym 30% sacharozy i inkubować w temperaturze 4 °C, aż wszystkie organoidy opadną na dno probówki.
      UWAGA: Czas potrzebny do tego, aby organoidy opadły, zależy od wielkości/wieku organoidów. 3-miesięczne organoidy mogą potrzebować do 5 godzin.
    8. Za pomocą naciętej końcówki pipety P1000 o szerokim otworze delikatnie przenieś od trzech do pięciu organoidów do formy montażowej zawierającej roztwór montażowy wykonany w 30% z sacharozy i pożywki o 100% optymalnej temperaturze cięcia (OCT), w stosunku 3:2.
    9. Użyj końcówki do pipety o pojemności 10 μl za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zorientować i ustawić organoidy w kształcie siatki.
    10. Umieść formę na suchym lodzie, aby zestalić roztwór sacharozy OCT przed przystąpieniem do kriosekcji (16-20 μm) za pomocą kriostatu.
      UWAGA: W przypadku beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się wszystkie tkanki muszą zostać przetworzone do sekcji po ich zatonięciu. W celu immunofluorescencji tkanki można przetworzyć do sekcji następnego dnia. Wszystkie szkiełka zawierające skrawki muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C przed późniejszą immunofluorescencją lub beta-galaktozydazą, jeśli nie zostaną natychmiast wybarwione.
  2. Proces analizy starzenia się organoidów korowych mózgu:
    UWAGA: Poniższe czynności można wykonać na zwykłym stole laboratoryjnym.
    1. Przenieść szkiełka do pojemnika do barwienia szkiełek mikroskopowych z pokrywką i umyć podzieloną tkankę organoidową trzykrotnie 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar roztworu montażowego.
    2. Następnie inkubować umytą tkankę ze świeżo przygotowanym roztworem barwiącym beta-galaktozydazę przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Roztwór do barwienia beta-galaktozydazy składa się z buforu fosforanowego (na 10 ml buforu fosforanowego: 8,15 ml 1 M NaH2PO4, 1,85 ml 1M Na2HPO4) o skorygowanym pH = 6, 100 mM heksacyjanożelazianu (III) potasu, 100 mM trójwodzianu heksacyjanożelazianu potasu (II), 5 M NaCl, 1 M MgCl2, 20 mg/ml X-Gal. Należy unikać stosowania standardowego inkubatora do hodowli komórkowych zawierającego CO2 , ponieważ CO2 zmieni pH roztworu barwiącego beta-galaktozydazę.
    3. Przemyć poplamione tkanki 1x PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia roztworu beta-galaktozydazy.
    4. Zamontuj umyte chusteczki za pomocą szklanego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu i pozwól roztworowi montażowemu zestalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed obejrzeniem pod mikroskopem.

Wyniki

W niniejszej pracy opisaliśmy solidny protokół, który umożliwia badaczom generowanie homogenicznych organoidów kory mózgowej pochodzących z hPSC, naśladujących obszar kory mózgu człowieka in vivo w ciągu 1-3 miesięcy hodowli. Kolonie hPSC są najpierw hodowane w pożywce różnicującej w celu wytworzenia kolonii neuroektodermalnych, które mogą następnie służyć do formowania sferoidów neuronalnych. Sferoidy te są następnie osadzane w macierzy błony podstawnej i utrzymywane przez dłuższy czas w celu wytworzenia organoidów, które mogą być wykorzystane do modelowania starzenia się neuronów (schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1). Warto zauważyć, że hodowanie tych organoidów w ultra-niepowlekanych płytkach 24-dołkowych wywołuje stres komórkowy i promuje fenotypy związane ze starzeniem się w ciągu 13 tygodni hodowli in vitro. Organoidy wytworzone zgodnie z tym protokołem mogą być również utrzymywane w bioreaktorach z mieszadłem w celu optymalnego wzrostu i różnicowania komórek neuronalnych płytki korowej lub na granicy faz powietrze-ciecz.

W pierwszej kolejności kolonie hPSC hoduje się przez 1 dzień przed różnicowaniem w kierunku neuroektodermy. Kluczowe jest, aby kolonie hPSC osiągnęły jedynie 20%-30% konfluencji i były najwyższej możliwej jakości: w formie zwartej, płaskiej monowarstwy, bez zanieczyszczenia kolonii komórkami zróżnicowanymi (Rycina 2A,B). Pluripotencję kolonii hPSC należy potwierdzić poprzez ekspresję markerów takich jak NANOG (Rycina 2C). Następnie zwalidowane kolonie hPSC poddaje się działaniu pożywki do różnicowania neuroektodermalnego N2 z dodatkiem SB-431542 i LDN 193189. Po 3 dniach utrzymania w tej pożywce kolonie hPSC powinny zróżnicować się w kolonie neuroektodermalne i przestać wykazywać charakterystyczną dla hPSC morfologię zwartej, płaskiej monowarstwy (Rycina 2B); zamiast tego komórki przyjmą wydłużony, kolumnowy kształt (Rycina 2B). Komórki te będą również negatywne pod kątem markerów pluripotencji, takich jak NANOG (Rycina 2C).

Na tym etapie kolonie neuroektodermalne są odlepiane enzymatycznie za pomocą dispazy, a każda zdrowa i pomyślnie odlepiona kolonia może samoorganizować się i tworzyć młody sferoid neuronalny (Rysunek 2D, Wideo dodatkowe 1). Tylko zdrowe i czyste kolonie neuroektodermalne odlepią się w czasie określonym dla aktywności dispazy; wszystkie pozostałe kolonie należy zignorować, ponieważ doprowadziłyby one do powstania sferoidów gorszej jakości. Dzięki codziennej ekspozycji na FGF2 w pożywce N2, komórki macierzyste neuronów (SOX2+) w tych sferoidach (Rysunek 2D, dzień 1) będą proliferować i tworzyć znaczną liczbę rozet neuronalnych (Rysunek 2D, dzień 4). Rozety te będą wykazywać ekspresję białka ZO1 (markera połączeń szczelnych i nabłonkowych) w komórkach zlokalizowanych w centrum rozet oraz wzdłuż zewnętrznej krawędzi sferoidu, co demonstruje polaryzację apikalno-bazalną sferoidu (Rysunek 2D, dzień 4). Metoda trójwymiarowego obrazowania całych sferoidów została opisana wcześniej13. Codzienna inspekcja sferoidów powinna wykazać powstanie ciasnej, ciemnej krawędzi zewnętrznej i jasnej peryferii sferoidów, co stanowi warstwę neuroepithelialną. Warstwa ta powinna być wystarczająco uformowana po 3-4 dniach, osiągając przybliżoną średnicę 500 µm, po czym sferoidy można zatopić w matrycy podstawowej. Jeśli warstwa ta nie jest obecna lub jest słabo uformowana, oznacza to, że sferoidy nie są wystarczająco rozwinięte, aby kontynuować procedurę. Zaleca się odczekać kolejny dzień w celu zaobserwowania zmian, jednak jeśli nie nastąpi poprawa, należy odrzucić te sferoidy.

Reprezentatywny obraz w polu jasnym sferoidów po 3 dniach hodowli przedstawiono na Rysunku 2D. Do osadzenia w macierzy podstawowej wybierane są sferoidy z gęstą warstwą neuroepithelialną, które nie zlały się z sąsiednimi sferoidami, posiadają półprzezroczystą tkankę i wykazują formowanie rozet neuralnych. Po osadzeniu sferoid będzie szybko proliferował i zacznie pączkować: pojawią się węzły zwartej tkanki, rozszerzające się na zewnątrz z głównego ciała sferoidu. Jest to widoczne między 1. a 3. tygodniem w macierzy podstawowej i można to zaobserwować w wielu liniach komórkowych (Rysunek 3A). Analiza ilościowa osadzonych sferoidów potwierdza obecność komórek nabłonkowych w maksymalnie 100% sferoidów w trzech różnych liniach komórkowych, co potwierdza homogeniczność i powtarzalność oczekiwaną od tego protokołu (Rysunek 3B). Ilościowe oznaczenie średnicy organoidów podczas różnicowania in vitro dodatkowo potwierdza powtarzalność w różnych liniach hPSC (Rysunek 3C). Jeśli pączkowanie nie występuje, sferoidy nie rozwijają się prawidłowo i powinny zostać odrzucone. Po osadzeniu sferoidów w macierzy ich rozwój postępuje, a sferoidy są odtąd nazywane organoidami. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdza również obecność komórek progenitorowych neuronów (PAX6) oraz markerów warstw korowych barwionych przeciwciałami CTIP2 i SATB2 w organoidach z wyraźną warstwowością (Rysunek 3D,E). Warstwowość ta jest obserwowalna w różnych punktach czasowych utrzymywania organoidów (Rysunek 3D,E). Metoda immunohistochemii tkanek została opisana wcześniej14.

Jednym z możliwych zastosowań tych organoidów jest badanie wpływu procesów związanych ze starzeniem się neuronów na mózg. Aby to zbadać, pomyślnie wygenerowane organoidy są pobierane w wielu różnych punktach czasowych w celu wykonania skrawków i barwienia na standardowe molekularne biomarkery starzenia, takie jak beta-galaktozydaza związana ze starzeniem oraz p21. Rysunek 4A przedstawia reprezentatywny obraz barwienia organoidów na beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem w 4. i 13. tygodniu po osadzeniu w macierzy błony podstawnej. Pomiędzy 4. a 13. tygodniem obserwuje się wyraźny wzrost obecności beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem, co sugeruje, że w tym czasie hodowli doszło do starzenia się komórek, które jest uznanym czynnikiem starzenia się organizmu. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów w 13. tygodniu potwierdziło obecność innego markera starzenia, p21, współbarwionego z markerem dojrzałych neuronów korowych (CTIP2), co pokazano na Rysunku 4B. Należy jednak zauważyć, że obecność p21 jest markerem zatrzymania cyklu komórkowego i sama w sobie nie stanowi definitywnego markera starzenia; aby jednoznacznie zidentyfikować komórki jako starzejące się, zaleca się wykrycie innych markerów starzenia, takich jak p16 oraz czynniki SASP (fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem).

Schemat procesu tworzenia organoidów z iPSC; kroki obejmują indukcję neuroektodermalną, tworzenie sferoidów i osadzanie.
Rysunek 1: Schemat generowania powtarzalnych organoidów kory mózgu. Schematyczny przebieg procedury eksperymentalnej w celu wytworzenia organoidów kory mózgu z hPSC hodowanych w pośrodku bez fibroblastów (feeder-free). Schemat przedstawia sześć etapów różnicowania hPSC z hodowli 2D w trójwymiarowe, wzorowane na strukturze płytki korowej ludzkie tkanki w formie organoidów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

różnicowanie hiPSC w kolonie neuroektodermalne, immunobarwienie dla NANOG, SOX2, ZO1, obrazy mikroskopowe.
Rysunek 2: Generowanie sferoidów neuronalnych pochodzących z kolonii neuroektodermalnych hPSC. (A) Reprezentatywne obrazy ludzkich PSC wykazujących optymalne (biały znacznik) oraz zróżnicowane kolonie (biały krzyżyk). Pasek skali: 200 µm, powiększenie 4x. (B) Reprezentatywny obraz kolonii neuroektodermalnej pochodzącej z hPSC po 3 dniach traktowania podwójnymi inhibitorami SMAD. Pasek skali: 200 µm, powiększenie 4x. (C) Kolonie ludzkich PSC zostały zróżnicowane w kierunku kolonii neuroektodermalnych. Obrazy przedstawiają barwienie kolonii PSC (w dniu 1.) i neuroektodermalnych (w dniu 3.) przeciwciałami przeciwko SOX2 (czerwony), NANOG (zielony); wszystkie jądra zostały przeciwbarwione Hoechst 33342 (niebieski). Pasek skali: 40 µm, powiększenie 100x. (D) Obrazy przedstawiające etapy rozwoju sferoidów korowych mózgu w czasie hodowli in vitro w świetle przechodzącym oraz preparaty całych sferoidów immunobarwionych przeciwko SOX2 (czerwony) w dniu 1. i podwójnie immunobarwionych przeciwko SOX2 (czerwony) oraz ZO1 (zielony) w dniu 4. Pasek skali obrazu w świetle przechodzącym wynosi 500 µm, powiększenie 4x; paski skali na dolnych obrazach wynoszą 40 µm, powiększenie 20x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost organoidów korowych w Matrigelu; obrazy mikroskopowe, histogramy. Immunobarwienie wizualizuje markery.
Rycina 3: Charakterystyka organoidów kory mózgowej pochodzących z różnych linii hPSC. (A) Reprezentatywne obrazy organoidów kory mózgowej pochodzących z ludzkich linii iPSC G22, WTC i EU79 hodowanych przez 3 tygodnie in vitro. Pasek skali na wszystkich obrazach wynosi 500 µm, powiększenie 2x. (B) Procenty skutecznej generacji organoidów kory mózgowej w 3. tygodniu różnicowania in vitro w różnych liniach hPSC (G22, WTC i EU79). N = 3. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. (C) Wykresy słupkowe przedstawiające wzrost organoidów kory mózgowej (na podstawie średnicy średniej) w 1. i 3. tygodniu różnicowania in vitro w różnych liniach ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (G22, WTC i EU79). N = 3. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. (D) Reprezentatywne obrazy przekrojów 6- i 9-tygodniowych organoidów kory mózgowej pochodzących z hPSC G22, poddanych immunobarwieniu na marker strefy komorowej PAX6 (czerwony) i płytki korowej CTIP2 (zielony). Wszystkie przekroje zbarwiono przeciwbarwnikiem Hoechst 33342 (niebieski). Pasek skali = 140 µm, powiększenie 20x. W oznacza tydzień. (E) Reprezentatywne obrazy przekrojów 10- i 13-tygodniowych organoidów kory mózgowej pochodzących z hPSC WTC, poddanych immunobarwieniu na marker IV warstwy korowej SATB2 (zielony). Wszystkie przekroje zbarwiono przeciwbarwnikiem Hoechst 33342 (niebieski). Obraz z 10. tygodnia: pasek skali = 50 µm, powiększenie 40x. Obraz z 13. tygodnia: pasek skali = 150 µm, powiększenie 40x. W oznacza tydzień. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Starzenie w organoidach korowych wykazane przez barwienie beta-galaktozydazą oraz mikroskopię fluorescencyjną CTIP2/p21.
Rysunek 4: Charakterystyka starzenia w organoidach korowych mózgu pochodnych z hPSC. (A) Reprezentatywne obrazy przekrojów ludzkich organoidów korowych mózgu pochodnych z hPSC WTC hodowanych przez 4 i 13 tygodni in vitro i barwionych SA-β-gal. Pasek skali = 500 µm, pasek skali na powiększonych obrazach = 250 µm, powiększenie 4x. Przerywana ramka wskazuje obszar powiększonego obrazu. (B) Reprezentatywne obrazy przekrojów 13-tygodniowych organoidów korowych mózgu pochodnych z ludzkich hPSC EU79, poddanych immunobarwieniu na neurony korowe CTIP2 (zielony) i p21 (czerwony). Wszystkie przekroje przeciwbarwiono Hoechst 33342 (niebieski). Pasek skali = 25 µm, pasek skali na powiększonych obrazach = 10 µm, powiększenie 40x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Składniki pożywkiStężenie
Mieszanina nutrientów DMEM/F-12 10x 500 ml (DMEM/F-12)
suplement N2 5 ml (100x)z dodatkiem 1%
Suplement B 27 10 mlUzupełnione do 2%
Roztwór nieessentialnych aminokwasów do pożywki MEM (100x)Uzupełniony do 1%
penicylina-streptomycyna (10 000 j.m./ml)Uzupełnione do 1%
2-merkaptoetanol 50 ml (1000x)z dodatkiem 0,1%

Tabela 1: Pożywka N2. Tabela zawiera listę odczynników wymaganych do przygotowania pożywki N2.

Składniki pożywkiStężenie
DMEM Nutrient mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)Pożywka DM przygotowana w stosunku 1:1 DMEM/F12 i pożywki Neurobasal
Neurobasal Medium
N2 Supplement 5 mL (100x)Dodatek 0,5%
B 27 Supplement 10 mLDodatek 1%
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Dodatek 1%
GlutaMAX Supplement 100xDodatek 1%
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Dodatek 1%
Insulin Solution Human Recombinant12.5 µL na 50 mL pożywki
2-Mercaptoethanol 50 mL (1000x )17.5 µL na 50 mL pożywki

Tabela 2: Pożywka różnicująca (DM). W tabeli wymieniono odczynniki niezbędne do przygotowania pożywki różnicującej.

Wideo uzupełniające 1. Obrazowanie na żywo konwersji indukowanych 2D arkuszy/kolonii hNEct w struktury 3D pod wpływem bFGF. Indukowane kolonie hNEct zostały delikatnie odseparowane od naczynia za pomocą dispazy, zgodnie z powyższym opisem, i przeniesione na 6-dołkową płytkę hodowlaną o niskim powinowactwie (low attachment). 2D kolonie hNEct przekształciły się w 3D sferoidy hNEct w ciągu 12 h. Obrazy seryjne rejestrowano co 5 min. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Aby umożliwić wykorzystanie organoidów mózgowych pochodzących z hPSC w badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób, kluczowe znaczenie ma tworzenie organoidów zgodnie z powtarzalnym i wiarygodnym protokołem15. Organoidy mózgowe są zwykle generowane z ciał embrionalnych pochodzących z hPSC, które są następnie osadzane w macierzy zewnątrzkomórkowej, która sprzyja ekspansji tkanek i różnicowaniu neuronalnemu. W porównaniu z takimi protokołami, jakLancaster 1,16,17 i Velasco18, które rozpoczynają się od ciał embrionalnych i pozwalają na domyślną ścieżkę różnicowania, która ma być podążana przez rozwijające się organoidy, odkryliśmy, że rozpoczęcie tworzenia organoidów korowych mózgu od ludzkich komórek NEct, a nie od ciał embrionalnych, poprawia spójność tworzenia organoidów korowych w mózgu. W związku z tym pozwala to również na skalowanie wymagane do badań przesiewowych leków i fenotypów. Ponieważ ludzkie komórki NEct mogą być nie tylko namnażane do znacznych ilości, ale także mogą być łatwo kriokonserwowane, takie podejście poprawia również powtarzalność między eksperymentami. Należy również zauważyć, że w porównaniu z innymi protokołami, które przyjęły wykorzystanie bioreaktorów i podobnych technologii, do tego protokołu nie jest wymagany żaden specjalistyczny sprzęt, dzięki czemu nadaje się on do każdego laboratorium6. Wreszcie, czas potrzebny do wygenerowania dojrzałych organoidów, które są dodatnie dla markerów warstwy korowej, takich jak SATB2, jest skrócony w porównaniu z protokołami Lancaster1 i bioreaktorów 6,19, co czyni go bardziej odpowiednim do badania trajektorii rozwojowej rozwoju kory mózgowej człowieka w zdrowiu i chorobach 1,6,16.

Ponadto, biorąc pod uwagę stale rosnący globalny wpływ chorób związanych ze starzeniem się, takich jak demencja, na opiekę zdrowotną, które są związane ze wzrostem typów komórek starczych w mózgu, co przyczynia się do patogenezy, możliwość identyfikacji i testowania związków, które mogą złagodzić starzenie się mózgu, jest niezwykle interesująca. Pomimo tego, że wiadomo, że hPSC są epigenetycznie odmładzane podczas procesu przeprogramowania20, stwierdzamy silny wzrost komórek starczych w organoidach korowych mózgu hodowanych przez dłuższy czas. Jest to obiecujące osiągnięcie, które umożliwia obecnie badania przesiewowe leków, które eliminują takie komórki starcze z mózgu (senolityki) lub spowalniają ten proces (senostatyka)21. Ponieważ ludzkie organoidy korowe mózgu pochodzące z NEct są pochodzenia ludzkiego, takie podejście prawdopodobnie skróci tradycyjną drogę do wprowadzenia na rynek takich nowatorskich środków terapeutycznych.

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Pierwszym z nich jest prawidłowy poziom konfluencji kolonii hPSC w momencie różnicowania. Kolonie hPSC muszą być zlewane w co najwyżej 30%, aby zapewnić, że wygenerowane kolonie NEct nie łączą się z sąsiednimi koloniami i że poszczególne organoidy są napędzane klonalnie. Drugim krytycznym krokiem jest prawidłowe użycie dypazy w celu podniesienia kolonii NEct i wytworzenia sferoid nerwowych. Czas inkubacji z dypazą ma kluczowe znaczenie dla ostatecznej jakości generowanych sferoid nerwowych. Dzieje się tak, ponieważ nadmierna ekspozycja kolonii z dypazą jest toksyczna dla komórek22 i ostatecznie wpływa na jakość wytwarzanych organoidów. Ograniczeniem tego protokołu jest to, że trudno jest kontrolować rozmiar sferoid neuronalnych, ponieważ zależy on od wielkości początkowych kolonii, które są podnoszone za pomocą dispasy. Jednak ten problem można rozwiązać, wybierając sferoidy neuronowe, które mają podobny rozmiar podczas przechodzenia do etapu osadzania.

Wreszcie, przyszłe zastosowania mogą obejmować wykorzystanie tych odtwarzalnych organoidów korowych w analizie robotycznej i biofarmaceutycznych badaniach przesiewowych, zwykle stosowanych w tej branży. Potwierdzają to wstępne dane z naszego laboratorium wskazujące, że generowanie organoidów korowych mózgu z ludzkich komórek NEct można łatwo zautomatyzować, co czyni je zgodnymi z tymi podejściami.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Medical Research Future Fund-Accelerated Research, flagowy projekt walki z leukodystrofią Massimo's Mission (EPCD000034), Medical Research Future Fund-Stem Cell Mission (APP2007653). Autorzy chcieliby podziękować dr Ju-Hyun Lee (Korea University) za wygenerowanie danych w Supplementary Video 1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% formaldehydu (W/V) Bez metanoluThermo Fisher Scientific289084% PFA rozcieńcza się w 1x PBS
2-merkaptoetanol 50 ml (1000x)Life Technologies Australia (TFS)21985023Stosowany w podłożach NM i DM
B 27 Suplement 10 mlLife Technologies Australia (TFS)17504044Stosowany w mediach NM i DM
Mikroskop CKX53 z kamerą SC50Olympus
Corning Costar 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychSigma Aldrich Pty LtdCLS3516-50EA
Dispase II w proszkuThermo Fisher Scientific17105041Powder rozpuszcza się w HBSS, filtruje przez 0,22 i mikro; m filtr, porcja w 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
DMEM Mieszanka odżywcza F12 10x 500 ml (DMEM/F-12)Thermofisher11320082Stosowany w podłożach NM i DM
DMSO Dimethyl SulfoxideSigma Aldrich Pty LtdD2650-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma Aldrich Pty LtdD1408-500ML
Falcon Matrigel Matryca z kwalifikacją hESCIn Vitro Technologies Pty LtdFAL354277Zrób podkwotowania 100 &mikro; L i przechowywane w temperaturze -20 & deg; C
GlutaMAX Suplement 100xThermo Fisher Scientific35050061Stosowany w podłożach NM i DM
Hanks Zrównoważony roztwór soliSigma Aldrich Pty LtdH8264
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (EU79)Reporogram wewnętrzny z fibroblastów skóry
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (G22)BiokomórkiGeneiUzyskane z Genea Biocells (San Diego, Stany Zjednoczone)
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (WTC)Prezent od profesora Bruce'a Conklina
InSolution TGF-Β Inhibitor kinazy RI VI, SB431542MerckUS1616464-5MG
Roztwór insuliny Ludzka rekombinowanaSigma Aldrich Pty LtdI9278Stosowany w podłożach NM i DM
LDN193189 DichlorowodorekSigma Aldrich Pty LtdSML0559-5MGStosowany podczas różnicowania
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050Stosowany w podłożach NM i DM
mTeSR PlusSTEMCELL TECHNOLOGIES100-0276Służy do utrzymywania kolonii hiPSC przed różnicowaniem za pomocą NM media
Suplement N2 5 ml (100x)Life Technologies Australia Pty Ltd17502048Stosowany w podłożach NM i DM
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Stosowany w mediach DM
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 ml / butelkę)Tissue Tek4583
Parafilm M Rozmiar rolki 4 cale x 125 stópSigma Aldrich Pty LtdP7793
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)Thermo Fisher Scientific15140122Stosowany w podłożach NM i DM
Trójwodzian heksacyjanożelazianu potasu (II)Sigma Aldrich Pty LtdCP1087
Heksacyjanożelazian potasu (III)Sigma Aldrich Pty Ltd455946
Prolong Glass Antifade MountantLife Technologies Australia (TFS)P36980
Rekombinowany ludzki FGF podstawowyR& D Systems233-FB-01MPorcjecie produkowane są w temperaturze 20 &mikro; g/ml i przechowywane w temperaturze -20 ° C
SB431542Tocris1614Używany podczas różnicowania
SacharozaSigma Aldrich Pty Ltd  PHR1001-1G30% sacharozy rozcieńcza się w 1x
PBS Ultra-Low attachment multiwell plates, 24-dołkowa płytka, polistyrenSigma Aldrich Pty LtdCLS3473-24EA
X-GAL EALife Technologies Australia (TFS)R0404Przygotować porcje 20 mg / ml i przechowywać w temperaturze -80 ° Z

Bibliografia

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  3. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  4. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nature Methods. 14 (7), 743(2017).
  5. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  6. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Shaker, M. R., Cooper-White, J., Wolvetang, E. J. Self-organizing 3D human choroid plexus-ventricle-cortical organoids. BioRxiv. , (2020).
  9. Shaker, M. R., Aguado, J., Chaggar, H. K., Wolvetang, E. J. Klotho inhibits neuronal senescence in human brain organoids. npj Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 1-12 (2021).
  10. Shaker, M. R., et al. Anteroposterior Wnt-RA gradient defines adhesion and migration properties of neural progenitors in developing spinal cord. Stem Cell Reports. 15 (4), 898-911 (2020).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  12. Shaker, M. R., et al. Rapid and efficient generation of myelinating human oligodendrocytes in organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 631548(2021).
  13. Lee, J. -H., Shaker, M. R., Lee, E., Lee, B., Sun, W. NeuroCore formation during differentiation of neurospheres of mouse embryonic neural stem cells. Stem Cell Research. 34, 101691(2020).
  14. Shaker, M. R., et al. Spatiotemporal contribution of neuromesodermal progenitor-derived neural cells in the elongation of developing mouse spinal cord. Life Sciences. 282, 119393(2021).
  15. Shaker, M. R., et al. Neural epidermal growth factor-like like protein 2 Is expressed in human oligodendroglial cell types. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 803061(2022).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
  18. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  19. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  20. Hunter, Z. L., Leeson, H. C., Shaker, M. R., Wolvetang, E. J., Vadlamudi, L. Human induced pluripotent stem cells generated from epilepsy patients for use as in vitro models for drug screening. Stem Cell Research. 60, 102673(2022).
  21. Kaur, A., Macip, S., Stover, C. M. An appraisal on the value of using nutraceutical based senolytics and senostatics in aging. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 218(2020).
  22. Wang, F., et al. Safety and efficacy of dispase and plasmin in pharmacologic vitreolysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (9), 3286-3290 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Generowanie organoidów mózguprogenitory neuroektodermalnetrójwymiarowe modele mózgubarwienie beta-galaktodaząrozety neuralneludzkie pluripotencjalne komórki macierzystepowtarzalność organoidówmodele starzenia się mózgu
Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.