Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63715

⸱

3 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Nantong University, 2Medical School, Nantong University, 3Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu Province and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, 4Nantong Maternal and Child Health Care Hospital, 5Laboratory Animals Center, Nantong University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

Streszczenie

Jako kręgowiec, danio pręgowany był szeroko stosowany w badaniach biologicznych. Danio pręgowany i ludzie mają wspólną wysoką homologię genetyczną, co pozwala na wykorzystanie jej jako modelu chorób ludzkich. Badanie funkcji genów opiera się na wykrywaniu wzorców ekspresji genów. Chociaż immunohistochemia oferuje skuteczny sposób oznaczania ekspresji białek, ograniczona liczba komercyjnie dostępnych przeciwciał u danio pręgowanego ogranicza stosowanie barwienia. Hybrydyzacja in situ jest szeroko stosowana w zarodkach danio pręgowanego do wykrywania ekspresji mRNA. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii dla skrawków zarodków danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Immunohistochemię i obrazowanie pojedynczej kriosekcji przeprowadzono po hybrydyzacji in situ. Protokół jest pomocny w rozwikłaniu wzorca ekspresji dwóch genów, najpierw poprzez wykrywanie transkryptu in situ, a następnie przez immunohistochemię białka w tej samej sekcji.

Wprowadzenie

Danio pręgowany jest potężnym modelem kręgowców do badań nad rozwojem i genetyką1,2. Danio pręgowany i ludzi łączy wysoka homologia genetyczna (70% genów jest wspólnych z ludzkim genomem), co pozwala na wykorzystanie go jako modelu chorób ludzkich3. U danio pręgowanego dość często wykrywa się wzorce ekspresji dwóch genów i ich związek przestrzenny. Immunohistochemia została po raz pierwszy użyta w 1941 roku do wykrywania patogenów w zakażonych tkankach poprzez zastosowanie przeciwciał znakowanych FITC4. Białko docelowe w sekcji tkanki jest najpierw znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie fragment jest znakowany przeciwciałem drugorzędowym przeciwko immunoglobulinie gatunku żywiciela przeciwciała pierwotnego. Barwienie przeciwciał jest solidnym podejściem do wykrywania lokalizacji białek, które zapewnia wysoką rozdzielczość optyczną na poziomie wewnątrzkomórkowym. Jednak liczba dostępnych przeciwciał u danio pręgowanego jest bardzo ograniczona. Niedawne badanie pokazuje, że około 112 000 przeciwciał jest dostępnych na rynku dla myszy; Wykazano jednak, że bardzo niewiele przeciwciał jest wiarygodnych u danio pręgowanego5.

Zamiast tego, u danio pręgowanego, hybrydyzacja in situ była szeroko stosowana do analizy wzorców ekspresji genów. Metoda ta została po raz pierwszy użyta do oceny ekspresji genów w zarodkach Drosophila w latach 80. XX wieku6,7 i od tego czasu technologia ta jest stale rozwijana i ulepszana. Początkowo do wykrywania transkryptów mRNA używano znakowanych radioaktywnie sond DNA; Jednak rozdzielczość przestrzenna była stosunkowo niska, a radioaktywność powodowała potencjalne zagrożenia dla zdrowia. Następnie hybrydyzacja in situ opiera się na sondach RNA znakowanych digoksygeniną (DIG) lub fluoresceiną (Fluo), które są sprzężone z fosfatazą alkaliczną (AP) lub wykrywane przez fluorescencyjne wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA)8,9. Chociaż TSA została wykorzystana do wykrycia dwóch lub trzech genów, znakowanie DIG sond RNA i przeciwciało sprzężone z antyDIG AP są nadal wysoce czułymi, stabilnymi i szeroko stosowanymi metodami hybrydyzacji in situ. Dlatego skomercjalizowane przeciwciała w połączeniu z sondami in situ znakowanymi DIG są przydatne do uzyskania wglądu w lokalizację białka i ekspresję jednego genu.

Embriony z pełnym wierzchowcem nie mogą ujawnić przestrzennego związku między genami ze względu na niską rozdzielczość optyczną, mimo że zarodki danio pręgowanego są małe i przezroczyste10. W związku z tym sekcje są niezbędne do analizy wzorców ekspresji genów na poziomie wewnątrzkomórkowym. Kriosekcja jest szeroko stosowana u danio pręgowanego, ponieważ jest łatwa do wykonania i może skutecznie zachować antygen. Dlatego hybrydyzacja in situ w połączeniu z immunohistochemią w kriosekcjach danio pręgowanego oferuje potężny sposób analizy wzorców ekspresji dwóch genów. Kombinacja hybrydyzacji in situ i immunohistochemii została zastosowana do danio pręgowanego11. Jednak leczenie proteinazą K zastosowano w celu zwiększenia penetracji sondy kosztem integralności antygenu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, protokół ten wykorzystuje ogrzewanie do indukcji pobierania antygenu. Protokół ten ma zastosowanie nie tylko do zarodków w różnych stadiach rozwoju i skrawków tkanek o różnej grubości (14 μm skrawków głowy i 20 μm odcinków rdzenia kręgowego), ale został również zweryfikowany przy użyciu genów ulegających ekspresji w dwóch narządach, w tym w głowie i rdzeniu kręgowym.

Ten artykuł opisuje, jak połączyć hybrydyzację in situ i barwienie przeciwciał w zarodkach danio pręgowanego w kriosekcjach. Wszechstronność tego protokołu została zademonstrowana poprzez zastosowanie szeregu kombinacji hybrydyzacji i immunohistochemii in situ, w tym sond hybrydyzacji in situ dla dwóch różnych neuronów. Metoda ta nadaje się do wykrywania mRNA i białka w różnych regionach i zarodkach w różnym wieku, a także wzorców ekspresji dwóch genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Nantong (nr S20191210-402).

1. Kolekcja zarodków danio pręgowanego

  1. Ustaw parę danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych w noc przed zebraniem jaj, jedną transgeniczną danio pręgowany, a drugą zebry AB typu dzikiego (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB typu dzikiego lub Tg (hb9:egfp) X AB typu dzikiego) (patrz Tabela materiałów). Użyj ukośnej plastikowej przegrody, aby oddzielić mężczyznę i kobietę, aby uniemożliwić fizyczny dostęp. Następnego dnia zamontuj górną część zbiornika hodowlanego w czystej dolnej części wypełnionej świeżą wodą i wyjmij przegrodę zbiornika hodowlanego. Pozwól rybie łączyć się w pary przez 10-20 minut i zbierz jaja po opadnięciu na dno zbiornika hodowlanego.
  2. Wyhodować zarodki w pożywce dla zarodków E3 (patrz tabela materiałów) zawierającej błękit metylenowy (1 ml 0,05% błękitu metylenowego w 1 litrze pożywki dla zarodków E3) w temperaturze 28,5 °C.
  3. Po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy potraktować zarodki fenylotiomocznikiem (PTU, patrz tabela materiałów), aby zapobiec tworzeniu się pigmentu.
    UWAGA: W eksperymentach wykorzystuje się zwierzęta obu płci.

2. Hybrydyzacja in situ

UWAGA: Woda użyta w krokach 2.1-2.11 to woda uzdatniona pirowęglanem dietylu (DEPC) (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Utrwal ~10 zarodków za pomocą 0,5-1 ml świeżego 4% paraformaldehydu (PFA, patrz tabela materiałów) w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 °C przez noc przez 12-14 godzin
    UWAGA: Protokół hybrydyzacji in situ jest nieznacznie zmodyfikowany w stosunku do wcześniej opublikowanej literatury12. PFA musi być świeżo przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C w ciągu jednego tygodnia od użycia lub przez jeden miesiąc w temperaturze -20 °C. Wszystkie poniższe etapy hybrydyzacji in situ przeprowadzono przy użyciu probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
  2. Użyj pęsety, aby usunąć skórę tylko z zarodków starszych niż 48 hpf.
    UWAGA: Skóra jest usuwana w celu ułatwienia penetracji sond RNA do obszaru tułowia zarodków starszych niż 48 hpf.
  3. Stopniowo odwadniaj zarodki, przemłukując 25%, 50% i 75% metanolem w 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 0,1% Tween-20 kolejno (PBST, patrz Tabela Materiałów) przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej. Następnie myj zarodki przez 5 minut w 100% metanolu w temperaturze pokojowej. Inkubować zarodki w 100% metanolu w temperaturze -20 °C przez co najmniej noc przez 12-14 godzin
    UWAGA: Odwodnione zarodki można przechowywać w 100% metanolu w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.
  4. Stopniowo nawadniaj zarodki, przemłukując je 75%, 50% i 25% metanolem w PBST kolejno przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj zarodek trzy razy PBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Trawić zarodki za pomocą 10 μg/ml proteinazy K (patrz tabela materiałów) w PBST w temperaturze pokojowej (patrz tabela 1).
  6. Myj zarodki PBST przez 5 minut. Wykonaj ten etap mycia trzy razy.
  7. Ponownie utrwal umyte zarodki w 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ten etap zatrzymuje trawienie, ponieważ PFA dezaktywuje proteinazę K. Upewnij się, że próbka jest delikatnie wymieszana, aby wystawić wszystkie zarodki na działanie PFA; Probówki można umieścić na bokach, aby równomiernie rozprowadzić zarodki w roztworze. Ten PFA nie musi być świeży (można go przechowywać w lodówce do 2 tygodni).
  8. Umyj zarodek trzy razy PBST, inkubując przez 5 minut podczas każdego płukania.
  9. Przeprowadzić prehybrydyzację zarodków przez inkubację z roztworem prehybrydyzacyjnym (preHYB, patrz tabela materiałów) w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Zastąp preHYB roztworem hybrydyzacyjnym (HYB, patrz tabela materiałów) i poddaj prehybrydyzacji przez co najmniej 4 godziny w HYB.
    UWAGA: Przed przystąpieniem do wstępnej hybrydyzacji należy podgrzać roztwory do temperatury 65 °C. Formamid (patrz Tabela Materiałów) służy do utrzymania kształtu i struktury tkanki. Formamid zapobiega również wiązaniu się niehomologicznych fragmentów w niskich temperaturach.
  10. Podgrzewać sondę (Insm1a lub 5-HT2C) w HYB przez 5 minut w temperaturze 95 °C przed dodaniem do zarodków. Użyj sondy o stężeniu 1 μg/ml HYB. Usuń jak najwięcej preHYB, nie dopuszczając do kontaktu zarodków z powietrzem, i dodaj podgrzaną sondę w HYB do probówki zawierającej zarodki.
    UWAGA: Znakowana sonda RNA może być użyta do hybrydyzacji z docelową sekwencją mRNA w zarodkach. Dlatego sonda może być używana do wykrywania ekspresji interesującego genu i lokalizacji mRNA.
  11. Pozostawić sondę do hybrydyzacji przez noc (12-14 godzin) w temperaturze 50-70 °C.
    UWAGA: Temperatura hybrydyzacji różni się dla różnych sond.
  12. Następnego dnia należy odessać roztwór sondy za pomocą pipety i przechowywać go w probówce w temperaturze -20 °C, aby mógł być wielokrotnie używany.
  13. Umyj zarodki w następujący sposób:
    1. Myć zarodki przez 15 minut 100% HYB w temperaturze 65 °C.
    2. Płucz zarodki kolejno 75%, 50% i 25% HYB w 2x standardowym roztworze soli fizjologicznej zawierającym 0,1% Tween-20 (SSCT, patrz tabela materiałów) przez 15 minut każdy w temperaturze 65 °C.
    3. Myć zarodki przez 15 minut w 2x SSCT w temperaturze 65 °C.
    4. Myć zarodki przez 15 minut w 0,2x SSCT w temperaturze 65 °C.
  14. Umyj zarodki dwa razy przez 10 minut w buforze kwasu maleinowego zawierającym 0,02% Tween-20 (MABT, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej.
  15. Zablokuj zhybrydyzowane i umyte zarodki przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej za pomocą 2% roztworu blokującego-1 (patrz Tabela materiałów).
  16. Zastąpić roztwór blokujący-1 antydigoksygeniną AP (rozcieńczenie 1:4 000, patrz Tabela Materiałów) w świeżym 2% roztworze blokującym-1 i wstrząsać przez noc przez 12-14 godzin w temperaturze 4 °C.
  17. Umyj zarodki cztery razy przez 30 minut w MABT w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wyjmij BM fioletowy (patrz Tabela Materiałów) z lodówki podczas trzeciego prania i potrząśnij nim od czasu do czasu podczas kolejnych prań.
  18. Umyj zarodki dwa razy przez 10 minut w NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, patrz tabela materiałów).
  19. Użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej NTMT z zarodków. Zastąp fioletowym substratem BM AP i zabarwij zarodki w temperaturze pokojowej w ciemności. Monitoruj zmiany koloru co 30 minut, aby kontrolować stopień zabarwienia.
    UWAGA: Konkretny czas barwienia jest inny i należy go dostosować do każdej sondy. Inkubacja zarodków w temperaturze 37 °C może przyspieszyć reakcję. Inkubacja zarodków w temperaturze 4 °C może wydłużyć czas reakcji i może być przeprowadzona przez noc.
  20. Gdy rozwinie się do pożądanego stopnia, zatrzymaj reakcję, dwukrotnie krótko spłukując NTMT. Po hybrydyzacji in situ przepłukać zarodki trzykrotnie PBST przez 20 minut.

3. Osadzanie

  1. Zanurzyć zarodki w 5% sacharozie w 1x PBS (patrz Tabela Materiałów) na noc na 12-14 godzin w temperaturze 4 °C.
  2. Zmienić roztwór pokrywający zarodki na 15% sacharozy w 1x PBS i inkubować przez noc przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.
  3. Zmienić roztwór pokrywający zarodki na 30% sacharozy w 1x PBS i inkubować przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Inkubować w tym roztworze, aż zarodki opadną na dno probówki.
  4. Napełnij kriomoldę medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz Tabela materiałów). Przenieś zarodki w 30% sacharozie do kriomoldu za pomocą pożywki OCT. Wymieszaj je, aby usunąć sacharozę z zarodków.
  5. Przenieś zarodki do nowego kriomoldu na tkankę i delikatnie wypełnij je pożywką OCT, unikając tworzenia się pęcherzyków.
  6. Zanurz każdy zarodek, popychając go na dno krioformy i umieść każdy zarodek w pożądanej orientacji (grzbietowo-brzusznej lub bocznej). Utrzymuj zarodki w linii prostej.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się umieszczanie tylko jednego zarodka w każdym kriomoldu (patrz Tabela Materiałów).
  7. Umieść osadzone zarodki w krioformach w kąpieli etanolowej z suchym lodem.
  8. Przechowywać w temperaturze -80 °C co najmniej przez noc przez 12-14 h.
    UWAGA: Krioformy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej jeden miesiąc.

4. Kriosekcja

  1. Ustawić kriosekcje za pomocą kriostatu na -20 °C.
  2. Wyjmij blok próbki z kriomoldu i umieść go w kriostacie. Umieść pożywkę OCT na podstawie schłodzonego uchwytu i umieść blok na górze.
  3. Upewnij się, że blok próbki jest równoległy do żyletki. Ostrożnie odetnij nadmiar pożywki OCT wokół próbki.
  4. Pociąć na odcinki o grubości 12-20 μm za pomocą kriostatu. Szybko przenieś sekcje na szkiełka podstawowe, tak aby każda szkiełko miało 3-4 sekcje. Pozostawić próbki do osiągnięcia temperatury pokojowej i przechowywać skrawki w szczelnie zamkniętym pudełku na suwaki w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

5. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Barwienie GFP jest wykonywane na sekcjach.

  1. Myć szkiełka zawierające sekcje PBS przez 5 minut.
  2. Podgrzej bufor cytrynianowy do wrzenia w kuchence mikrofalowej.
  3. Umieść szkiełka w buforze i kontynuuj podgrzewanie, aby roztwór był bliski wrzenia przez około 20 minut.
    UWAGA: Ten krok pomaga w odzyskiwaniu antygenu. Tkanka pozostaje nienaruszona nawet w wysokich temperaturach, co poprawia jakość barwienia, zapobiegając fałdowaniu, uszkodzeniu lub oderwaniu tkanek.
  4. Pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej przed następnym krokiem. Odcedź nadmiar roztworu, ostrożnie osusz obszar wokół każdej sekcji kawałkiem chusteczki i narysuj okrąg wokół sekcji za pomocą wodoodpornego pisaka (patrz Tabela materiałów), aby utworzyć hydrofobową barierę. Uważaj, aby nie wysuszyć skrawków tkanki.
  5. Umyj szkiełka dwa razy PBS, inkubując przez 10 minut podczas każdego mycia.
  6. Blokować przez 2 godziny w roztworze blokującym-2 (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej.
  7. Odpipetować roztwór przeciwciał pierwotnych (mysi monoklonalny α-GFP, 1:250, patrz Tabela Materiałów) na szkiełko podstawowe i inkubować szkiełka w mokrym pojemniku immunohistochemicznym w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS, inkubując przez 10 minut podczas każdego mycia.
  9. Odcedź nadmiar PBS. Inkubować szkiełka z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (1:400, patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w PBS.
  10. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS, inkubując przez 10 minut podczas każdego mycia.
  11. Spuść nadmiar PBS, odpipetuj pożywkę mocującą na szkiełko podstawowe i zamontuj za pomocą szkiełka nakrywkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół może być wykorzystany do jednoczesnego badania wzorca ekspresji jednego mRNA oraz jednego białka. Rysunek 1 przedstawia schemat postępowania eksperymentalnego. Receptor 5-HT2C jest podtypem receptora 5-HT wiążącego neuroprzekaźnik serotoninę (5-hydroksytryptaminę, 5-HT). Jest on szeroko rozpowszechniony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i może w znacznym stopniu regulować szereg funkcji mózgu, w tym apetyt, nastrój, lęk oraz zachowania rozrodcze13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten proponuje połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii, co jest ważnym krokiem w eksperymentach kolokalizacyjnych na zarodkach danio pręgowanego. Metoda ta służy jako łatwy i skuteczny sposób jednoczesnej analizy jednego mRNA i jednego białka. Hybrydyzację in situ i barwienie przeciwciałami przeprowadzono na zarodkach danio pręgowanego. W przeciwieństwie do kilku opublikowanych wcześniej protokołów 14,15,16, immunofluorescencja i immunohistochemia zostały wykorzystane do zbadania eks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) oraz Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488InvitrogenA21202
Anty-Digoxigenina AP Fragmenty Fab11093274910
Przeciwciało anty-GFPOdczynnik blokujący MilliporeMAB3580
Roche11096176001
Rozwiązanie blokujące-1wyprodukowane w laboratoriumNie dotyczyRozpuścić odczynnik blokujący w 1X MAB do końcowego stężenia 10% (wag./obj.). Autoklaw i przechowywanie w temperaturze -20 ° C przed użyciem.
Roztwór blokujący-2wyprodukowany w laboratoriumNie dotyczy0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% kozia surowica w 1x PBS
BM fioletowyRoche11442074001
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaB2064
CaCl2SigmaC5670
Bufor cytrynianowyLeageneIH0305
Kwas cytrynowySigmaC2404
Cryomold do tkanek, 15 mm x 15 mm x 5 mmGłowica BiotechnologyH4566
Woda uzdatniona DEPCSangon Biotech B501005
Aparat cyfrowy, mikroskop fluorescencyjnyPożywkaNikon NI-SSR 931479
E3wykonana w laboratoriumN/A5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
FormamidInvitrogenAM9342
Serum kozieSigmaG9023
Sól sodowa heparynyJ& K Scientific542858
HYBwykonane w laboratoriumN/ApreHYB plus 50 µ g/ml soli sodowej heparyny, 100 i mikro; g/ml kwasu rybonukleinowego, sól dietyloaminoetanolowa
Immunohistochemiczne pudełko mokreMkbioMH10002
KClSigmaP5405
Niskoprofilowe ostrza Leica Leica819
MABT (1x)wykonane w laboratoriumN/A0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl, 0,02% Tween-20, pH 7,5
Kwas maleinowySigmaM0375
MetanolJ& K Scientific116481
Błękit metylenowyMacklinM859248
MgSO4SigmaM2643
NaClSigmaS5886
NTMTwyprodukowany w laboratoriumN/A0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1% Tween-20
OCT mediumTissue-Tek4583
PAP penEnzo Nauki biologiczneADI-950-233
Paraformaldehyd, 4%Abbexaabx082483wyprodukowano w laboratorium w 1x PBS
PBST (1x)wyprodukowano w laboratoriumNie dotyczy1x PBS plus 0,1% Tween-20
FenylotiomocznikMerck103-85-5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)InvitrogenAM9624
preHYBwyprodukowany w laboratoriumNie dotyczy50% formamid, 5x SSC, 9,2 mM kwas cytrynowy (pH 6,0), 0,1%
Proteinaza KRoche1092766
Kwas rybonukleinowy Sól dietyloaminoetanolowaSigmaR3629
RNaz 1,5 mlAmbionAM12400
SSC (20x)InvitrogenAM9770
SSCT (0,2x)wyprodukowane w laboratoriumN/A0,2x SSC plus 0,1% Tween-20
SSCT (1x)wyprodukowane w laboratoriumNie dotyczy1x SSC plus 0,1% Tween-20
SacharozaInvitrogen15503022
Triton X-100SigmaT9284
Tween-20SigmaP1379
Laboratorium ZebryCentrum Zwierząt Uniwersytetu NantongN/A
Roche zarodkowa bez

Bibliografia

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
  3. Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  4. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  5. Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
  6. Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
  7. Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
  8. Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
  9. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  10. Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
  11. Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  13. Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
  14. Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344(2019).
  15. Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575(2020).
  16. Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
  17. O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriosekcjonowanieekspresja gen wdetekcja mRNAekspresja bia ekbarwienie przeciwcia amitransgeniczne rybki zebrafishznakowanie bia kami fluorescencyjnymi
In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.