Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63716

⸱

7 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Texas Woman’s University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Streszczenie

Ekstrakcja genomowego DNA z jednego lub kilku Caenorhabditis elegans ma wiele dalszych zastosowań, w tym PCR do genotypowania linii, klonowania i sekwencjonowania. Tradycyjne metody ekstrakcji genomowego DNA z C. elegans oparte na proteinazie K trwają kilka godzin. Komercyjne zestawy do ekstrakcji, które skutecznie otwierają naskórek C. elegans i ekstrahują genomowe DNA, są ograniczone. Łatwa, szybsza (~15 min) i opłacalna metoda ekstrakcji genomowego DNA C. elegans, która dobrze sprawdza się w zastosowaniach szkolnych i badawczych, została opisana tutaj. Ta metoda ekstrakcji DNA jest zoptymalizowana pod kątem wykorzystania pojedynczych lub kilku późnych larw (L4) lub dorosłych nicieni jako materiału wyjściowego do uzyskania wiarygodnej matrycy do przeprowadzenia PCR. Wyniki wskazują, że jakość DNA jest odpowiednia do amplifikacji celów genów o różnych rozmiarach za pomocą PCR, co pozwala na genotypowanie pojedynczych lub kilku zwierząt nawet przy rozcieńczeniu do jednej pięćdziesiątej genomowego DNA od pojedynczej osoby dorosłej na reakcję. Zgłoszone protokoły mogą być niezawodnie wykorzystane do szybkiego wytworzenia matrycy DNA z pojedynczej lub małej próbki C. elegans do zastosowań opartych na PCR.

Wprowadzenie

Tutaj przedstawiono dwa powiązane protokoły lizy Caenorhabditis elegans, aby DNA stało się dostępne dla zastosowań opartych na PCR. PCR jest powszechnie stosowaną techniką molekularną wykorzystywaną do wielu zastosowań, w tym między innymi do genotypowania i amplifikacji fragmentów DNA do klonowania i sekwencjonowania. Mała (1 mm), wolno żyjąca glista C. elegans jest popularnym systemem zwierzęcym do badań biologicznych. Uzyskanie odpowiedniego genomowego DNA od pojedynczego zwierzęcia lub kilku zwierząt jest wystarczające do amplifikacji sekwencji za pomocą PCR. Późne larwy L4 i dorosłe osobniki zawierają tylko ~1,000 komórek somatycznych (w tym niektóre wielojądrowe, poliploidalne komórki), komórki rozrodcze i (jeśli zwierzę jest grawitacyjnym hermafrodytą) potomstwo w macicy1. Jednak zwierzęta te są chronione przez naskórek, który musi zostać przerwany, aby wyodrębnić genomowe DNA2. Standardowe metody przygotowania matrycy genomowego DNA nicieni do PCR obejmują wiele etapów i zajmują kilka godzin. Zwierzęta są najpierw zamrażane w buforze do lizy robaków zawierającym proteinazę K (-70 °C lub niższą) na co najmniej 15-45 minut (dłużej jest zalecane przez niektóre protokoły)3,4,5,6. Ten krok otwiera zwierzęta.

Po zamrożeniu, zwierzęta są inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze 60-65 °C, aby proteinaza K działała, następnie enzym jest inaktywowany przez 15-30 minut w temperaturze 95 °C. Proteinaza K niszczy nukleazy, które degradują DNA. Inaktywacja proteinazy K przed PCR jest ważna, aby zapobiec degradacji polimerazy DNA przez proteinazę K. Opisane tutaj dwa protokoły oparte na zestawach są szybkimi, niezawodnymi i opłacalnymi metodami ekstrakcji genomowego DNA od pojedynczego zwierzęcia lub kilku nicieni do codziennych zastosowań badawczych i dydaktycznych. Używany zestaw został pierwotnie zoptymalizowany przez producenta do ekstrakcji DNA z tkanek zwierzęcych, śliny i włosów7. Wykorzystuje opatentowany roztwór do przygotowania tkanek i roztwór do ekstrakcji w celu lizy komórek i udostępnienia genomowego DNA. Opatentowany roztwór neutralizujący neutralizuje następnie składniki, które mogą hamować PCR (np. sole, jony i cząsteczki wiążące Mg2+).

Podczas genotypowania można przetestować pojedyncze zwierzę. Przy określaniu, czy szczep jest homozygotyczny, testowanie sześciu lub więcej potomstwa z jednego zwierzęcia daje dużą pewność, że linia jest homozygotyczna, czy nie (istnieje 0,02% szansy na losowe wybranie sześciu homozygotycznych zmutowanych potomków od heterozygotycznego rodzica [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Ta metoda 1) jest prosta, składa się z mniejszej liczby etapów niż metoda proteinazy K i 2) skraca czas przygotowania matrycy do 15 minut. Wyniki tej pracy pokazują, że opracowany protokół działa niezawodnie w ekstrakcji genomowego DNA z jednego lub kilku robaków, co może być niezawodnie wykorzystywane do dalszych zastosowań, które nie wymagają wysoce oczyszczonego DNA, w tym PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Utrzymanie C. elegans

UWAGA: Szczepy N2 (typ dziki) i blmp-1(tm548) C. elegans były utrzymywane na standardowych płytkach z pożywkami do hodowli nicieni (NGM) w temperaturze 20 °C.

  1. Przygotować płytki NGM, rozpuszczając 23,005 g proszku NGM w 973 ml wody w kolbie o pojemności 2 l. Przykryj otwór kolby folią aluminiową (lub nasadką nadającą się do sterylizacji w autoklawie, która umożliwia odpowietrzenie) i zabezpiecz pokrywę taśmą autoklawową. Autoklaw w celu rozpuszczenia proszku i sterylizacji zawartości w cyklu sterylizacji trwającym co najmniej 30 minut.
  2. Schłodzić podłoże do temperatury 60 °C w łaźni wodnej.
  3. Do schłodzonej pożywki dodać 25 ml sterylnego 1 M buforu fosforanowego (KH2PO4) o pH 6,0, 1 ml 1 M roztworu chlorku wapnia i 1 ml 1 M roztworu siarczanu magnezu.
  4. Wymieszać pożywkę na magnetycznej płytce mieszającej, aby uzyskać jednorodną mieszaninę i zapobiec nierównomiernemu chłodzeniu i krzepnięciu (~5 min). Upewnij się, że mieszadło obraca się wystarczająco szybko, aby wytworzyć wir, ale nie tak szybko, aby wprowadzić bąbelki (~250-300 obr./min).
  5. Wlej ~25 ml pożywki do każdej 10 cm płytki Petriego (w sumie ~40 płytek). Wysuszyć płytki w temperaturze pokojowej przez noc (zwykle 16-25 °C).
  6. Hoduj kolonię Escherichia coli OP50 w 30-50 ml bulionu LB przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Wysiewaj każdą płytkę 500 μl kultury E. coli OP50 i pozwól jej wyschnąć w temperaturze pokojowej przed użyciem (zwykle 16-25 °C)8. Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.
  8. Przenieś C. elegans na płytki z nasionami za pomocą drucianego kilofa lub innej metody i pozwól im urosnąć do stadium L4 lub dorosłego w temperaturze wymaganej dla szczepu (zwykle 16-25 °C, 1-2 dni, jeśli zwierzęta były posiewane głodzone jako dauery, 3-4 dni, jeśli zwierzęta były posiewane jako zarodki)8.

2. Ekstrakcja DNA pojedynczego robaka

UWAGA: Ta metoda jest przydatna do ekstrakcji DNA z pojedynczego robaka (jeden robak na 1,8 μL całkowitej objętości). Mieszankę wzorcową można wykonać, jeśli jednocześnie będzie lizowanych wiele robaków.

  1. Zaprogramować termocykler na jeden cykl w temperaturze 55 °C na 10 minut, a następnie 95 °C na 3 minuty (program lizy).
  2. Podwielokrotność 0,8 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 ml probówki do PCR na lodzie. Dodać 0,2 μl roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego. Wymieszać pipetując.
  3. Zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym9. Aby zidentyfikować hermafrodyty L4, poszukaj charakterystycznego sromu, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Zidentyfikuj dorosłe hermafrodyty, szukając największych zwierząt na talerzu, które mogą mieć owalne zarodki widoczne w macicy.
  4. Za pomocą platynowego drucianego wykałacza przenieś wybrane zwierzę do roztworu10.
  5. Krótko odwirować probówkę (2-3 s, ≤6 000 obr./min / 2 000 × g) w temperaturze pokojowej, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
  6. Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program lizy ustawiony w kroku 2.1.
  7. Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Dodać 0,8 μl roztworu neutralizującego z zestawu do mieszaniny. Wymieszać pipetując.
  8. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).
  9. Lizat należy stosować bezpośrednio do PCR lub przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Wyekstrahowane DNA jest stabilne w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy7.

3. Ekstrakcja DNA kilku osób

UWAGA: Ta metoda jest przydatna do ekstrakcji DNA z kilku robaków. Mieszankę wzorcową można przygotować, jeśli wiele szczepów będzie poddanych lizie w tym samym czasie.

  1. Zaprogramować termocykler na jeden cykl w temperaturze 55 °C na 10 minut, a następnie 95 °C na 3 minuty (program lizy).
  2. Podwielokrotność 2,0 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 ml probówki do PCR na lodzie. Dodać 0,5 μl roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego. Wymieszać pipetując.
  3. Zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzęta pod mikroskopem preparacyjnym9. Hermafrodyty L4 mają charakterystyczny srom, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Dorosłe hermafrodyty są największymi zwierzętami na talerzu i mogą mieć owalne zarodki widoczne w macicy.
  4. Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś kilka zwierząt do roztworu: 9 zwierząt daje 1 zwierzęcy odpowiednik genomowego DNA na 0,5 μl lizatu, a 16 zwierząt daje ~1 zwierzęcy odpowiednik genomowego DNA w 0,25 μl (3,5 nicienia / μL) 10,
    UWAGA: Trudno jest przenieść do tego tomu więcej niż 16 zwierząt.
  5. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).
  6. Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program lizy ustawiony w kroku 3.1.
  7. Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Dodać 2 μl roztworu neutralizującego z zestawu do mieszaniny. Wymieszać pipetując.
  8. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).
  9. Bezpośrednio użyj lizy do PCR lub przechowuj ją w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Wyekstrahowane DNA jest stabilne w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy7.

4. Reakcja PCR

UWAGA: Opisano jedno z dalszych zastosowań tej techniki lizy robaków, wykrywające mutację delecji za pomocą szybkiej polimerazy. Wykazano również skuteczność dwóch protokołów lizy robaków w wytwarzaniu matrycy genomowej DNA do udanego PCR w rozcieńczeniach do 1/50 robaka na reakcję.

  1. Wyodrębnij DNA z pojedynczego robaka i 16 robaków przy użyciu N2 typu dzikiego i zmutowanych szczepów, jak opisano powyżej w Kroku 2 i Kroku 3.
  2. Przygotować 2-, 10-, 20- i 50-krotne rozcieńczenia DNA pojedynczego robaka od zwierząt N2 typu dzikiego.
  3. Skonfigurować reakcje PCR zgodnie z protokołem producenta, używając starterów specyficznych dla sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania i głównej mieszanki PCR na gorąco (Tabela 1 i Tabela 2). Użyć 1 μl nierozcieńczonego DNA lub 2 μl rozcieńczonego DNA jako matrycy w każdej reakcji.
  4. Potwierdź produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Genomic DNA z pojedynczych lub kilku dorosłych osobników typu dzikiego wyekstrahowano za pomocą komercyjnego zestawu lub tradycyjnego protokołu lizy, aby porównać skuteczność tych dwóch metod. Uzyskane lizaty wykorzystano następnie jako matryce w reakcji PCR w celu amplifikacji większego fragmentu docelowego o długości ~2 100 bp (kodującego blmp-1) lub mniejszego fragmentu docelowego o długości ~500 bp (kodującego fragment sma-10). Obie metody pozwoliły na uzyskanie odpowiednich produktów PCR (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Określenie genotypów C. elegans jest ważnym krokiem podczas wykonywania krzyżówek genetycznych w celu stworzenia nowych szczepów C. elegans . Ekstrakcja genomowego DNA przy użyciu jednego lub kilku C. elegans jest kluczowym krokiem w genotypowaniu C. elegans. Protokół ten opisuje ekstrakcję genomowego DNA z C. elegans przy użyciu komercyjnego zestawu. Ta metoda jest szybka i działa solidnie. Genomowe DNA wyekstrahowane tą metodą może być wykorzystane do dalszych zastosowań, w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Szczep N2 i bakterie E. coli OP50 zostały uzyskane z Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Szczep blmp-1(tm548) został uzyskany z National Bioresource Project w Japonii. Autorzy dziękują WormBase. Praca ta była wspierana przez NIH R01GM097591 dla TLG, wewnętrzne finansowanie przez Texas Woman's University dla TLG oraz Centrum Badań Studenckich TWU dla MFL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
taśma autoklawuDefend43237-2
folia aluminiowa, wytrzymałaReynolds Wrap2182934
chlorek wapniaMillipore Sigma102382 (CAS 10035-04-8)
Zestaw Extract-N-Amp (zawiera roztwór do przygotowania tkanek, roztwór ekstrakcyjny i roztwór neutralizacyjny)Sigma-Aldrich Co. LLCXNAT2-1KT
Izotemp płyta grzejna/mieszadłoFisher Scientific11-100-495H
LB media, Lennox, kapsułkiMP Biomedicals, LLC3002-131
siarczan magnezu, 97% czysty, bezwodnyThermo ScientificAC413485000 (CAS 7487-88-9)
mikrowirówkaLabnet International, Inc.PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England Biolabs, Inc.M0515S"Pol E" użyty na rysunku uzupełniającym S1, szybka polimeraza o wysokiej wierności (20– 30 s / kb)
NGM w proszkuUS Biological Life SciencesN1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF NewEngland Biolabs, Inc.M0531S"Pol D" na rysunku 1B, szybka polimeraza o wysokiej wierności (15– 30 s/kb)
starteryZintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy
PrimeSTAR GXL polimerazaTakara Bio Inc.R050B"Pol C" na rysunku 1B, polimeraza o wysokiej wierności (1 min/kb) dla matryc bogatych w GC i matryc do 30 kb
Szybko ładowana fioletowa drabina DNA o długości 2 log (0,1 i nd; 10.0 kb)New England Biolabs, Inc.N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master MixTakara Bio Inc.RR350A"Pol A" na rysunku 1B, polimeraza stosowana na rysunku 1A, C, D, szybka polimeraza (10 s/kb) dla celów do 5 kb
Mieszanina reakcyjna Sigma ReadyMix Taq PCRSigma-Aldrich Co. LLCP4600"Pol B" na rysunku 1B, polimeraza (1 min/kb) dla celów do 7 kb
Termocykler SimpliAmpApplied BiosystemsA24812
mieszadłoFisher Scientific14-512-126
mieszalnik wirowyFisher Scientific2215365
kilof do robakówGenesee Scientific Corporation59-AWP

Bibliografia

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
  6. Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
  7. Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja genomowego DNAlizy DNAmatryca PCRmetoda z użyciem proteinazy Kpęseta z drutu platynowegoliza w termocyklerzeprzygotowanie tkankigenotypowanie nicieniamplifikacja DNA
Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.