Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Tutaj przedstawiono dwa powiązane protokoły lizy Caenorhabditis elegans, aby DNA stało się dostępne dla zastosowań opartych na PCR. PCR jest powszechnie stosowaną techniką molekularną wykorzystywaną do wielu zastosowań, w tym między innymi do genotypowania i amplifikacji fragmentów DNA do klonowania i sekwencjonowania. Mała (1 mm), wolno żyjąca glista C. elegans jest popularnym systemem zwierzęcym do badań biologicznych. Uzyskanie odpowiedniego genomowego DNA od pojedynczego zwierzęcia lub kilku zwierząt jest wystarczające do amplifikacji sekwencji za pomocą PCR. Późne larwy L4 i dorosłe osobniki zawierają tylko ~1,000 komórek somatycznych (w tym niektóre wielojądrowe, poliploidalne komórki), komórki rozrodcze i (jeśli zwierzę jest grawitacyjnym hermafrodytą) potomstwo w macicy¹. Jednak zwierzęta te są chronione przez naskórek, który musi zostać przerwany, aby wyodrębnić genomowe DNA². Standardowe metody przygotowania matrycy genomowego DNA nicieni do PCR obejmują wiele etapów i zajmują kilka godzin. Zwierzęta są najpierw zamrażane w buforze do lizy robaków zawierającym proteinazę K (-70 °C lub niższą) na co najmniej 15-45 minut (dłużej jest zalecane przez niektóre protokoły)^3,4,5,6. Ten krok otwiera zwierzęta.

Po zamrożeniu, zwierzęta są inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze 60-65 °C, aby proteinaza K działała, następnie enzym jest inaktywowany przez 15-30 minut w temperaturze 95 °C. Proteinaza K niszczy nukleazy, które degradują DNA. Inaktywacja proteinazy K przed PCR jest ważna, aby zapobiec degradacji polimerazy DNA przez proteinazę K. Opisane tutaj dwa protokoły oparte na zestawach są szybkimi, niezawodnymi i opłacalnymi metodami ekstrakcji genomowego DNA od pojedynczego zwierzęcia lub kilku nicieni do codziennych zastosowań badawczych i dydaktycznych. Używany zestaw został pierwotnie zoptymalizowany przez producenta do ekstrakcji DNA z tkanek zwierzęcych, śliny i włosów⁷. Wykorzystuje opatentowany roztwór do przygotowania tkanek i roztwór do ekstrakcji w celu lizy komórek i udostępnienia genomowego DNA. Opatentowany roztwór neutralizujący neutralizuje następnie składniki, które mogą hamować PCR (np. sole, jony i cząsteczki wiążące Mg²⁺).

Podczas genotypowania można przetestować pojedyncze zwierzę. Przy określaniu, czy szczep jest homozygotyczny, testowanie sześciu lub więcej potomstwa z jednego zwierzęcia daje dużą pewność, że linia jest homozygotyczna, czy nie (istnieje 0,02% szansy na losowe wybranie sześciu homozygotycznych zmutowanych potomków od heterozygotycznego rodzica [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Ta metoda 1) jest prosta, składa się z mniejszej liczby etapów niż metoda proteinazy K i 2) skraca czas przygotowania matrycy do 15 minut. Wyniki tej pracy pokazują, że opracowany protokół działa niezawodnie w ekstrakcji genomowego DNA z jednego lub kilku robaków, co może być niezawodnie wykorzystywane do dalszych zastosowań, które nie wymagają wysoce oczyszczonego DNA, w tym PCR.

1. Utrzymanie C. elegans

UWAGA: Szczepy N2 (typ dziki) i blmp-1(tm548) C. elegans były utrzymywane na standardowych płytkach z pożywkami do hodowli nicieni (NGM) w temperaturze 20 °C.

1. Przygotować płytki NGM, rozpuszczając 23,005 g proszku NGM w 973 ml wody w kolbie o pojemności 2 l. Przykryj otwór kolby folią aluminiową (lub nasadką nadającą się do sterylizacji w autoklawie, która umożliwia odpowietrzenie) i zabezpiecz pokrywę taśmą autoklawową. Autoklaw w celu rozpuszczenia proszku i sterylizacji zawartości w cyklu sterylizacji trwającym co najmniej 30 minut.
2. Schłodzić podłoże do temperatury 60 °C w łaźni wodnej.
3. Do schłodzonej pożywki dodać 25 ml sterylnego 1 M buforu fosforanowego (KH₂PO₄) o pH 6,0, 1 ml 1 M roztworu chlorku wapnia i 1 ml 1 M roztworu siarczanu magnezu.
4. Wymieszać pożywkę na magnetycznej płytce mieszającej, aby uzyskać jednorodną mieszaninę i zapobiec nierównomiernemu chłodzeniu i krzepnięciu (~5 min). Upewnij się, że mieszadło obraca się wystarczająco szybko, aby wytworzyć wir, ale nie tak szybko, aby wprowadzić bąbelki (~250-300 obr./min).
5. Wlej ~25 ml pożywki do każdej 10 cm płytki Petriego (w sumie ~40 płytek). Wysuszyć płytki w temperaturze pokojowej przez noc (zwykle 16-25 °C).
6. Hoduj kolonię Escherichia coli OP50 w 30-50 ml bulionu LB przez noc w temperaturze 37 °C.
7. Wysiewaj każdą płytkę 500 μl kultury E. coli OP50 i pozwól jej wyschnąć w temperaturze pokojowej przed użyciem (zwykle 16-25 °C)⁸. Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.
8. Przenieś C. elegans na płytki z nasionami za pomocą drucianego kilofa lub innej metody i pozwól im urosnąć do stadium L4 lub dorosłego w temperaturze wymaganej dla szczepu (zwykle 16-25 °C, 1-2 dni, jeśli zwierzęta były posiewane głodzone jako dauery, 3-4 dni, jeśli zwierzęta były posiewane jako zarodki)⁸.

2. Ekstrakcja DNA pojedynczego robaka

UWAGA: Ta metoda jest przydatna do ekstrakcji DNA z pojedynczego robaka (jeden robak na 1,8 μL całkowitej objętości). Mieszankę wzorcową można wykonać, jeśli jednocześnie będzie lizowanych wiele robaków.

1. Zaprogramować termocykler na jeden cykl w temperaturze 55 °C na 10 minut, a następnie 95 °C na 3 minuty (program lizy).
2. Podwielokrotność 0,8 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 ml probówki do PCR na lodzie. Dodać 0,2 μl roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego. Wymieszać pipetując.
3. Zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym⁹. Aby zidentyfikować hermafrodyty L4, poszukaj charakterystycznego sromu, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Zidentyfikuj dorosłe hermafrodyty, szukając największych zwierząt na talerzu, które mogą mieć owalne zarodki widoczne w macicy.
4. Za pomocą platynowego drucianego wykałacza przenieś wybrane zwierzę do roztworu¹⁰.
5. Krótko odwirować probówkę (2-3 s, ≤6 000 obr./min / 2 000 × g) w temperaturze pokojowej, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
6. Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program lizy ustawiony w kroku 2.1.
7. Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Dodać 0,8 μl roztworu neutralizującego z zestawu do mieszaniny. Wymieszać pipetując.
8. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).
9. Lizat należy stosować bezpośrednio do PCR lub przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
   UWAGA: Wyekstrahowane DNA jest stabilne w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy⁷.

3. Ekstrakcja DNA kilku osób

UWAGA: Ta metoda jest przydatna do ekstrakcji DNA z kilku robaków. Mieszankę wzorcową można przygotować, jeśli wiele szczepów będzie poddanych lizie w tym samym czasie.

1. Zaprogramować termocykler na jeden cykl w temperaturze 55 °C na 10 minut, a następnie 95 °C na 3 minuty (program lizy).
2. Podwielokrotność 2,0 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 ml probówki do PCR na lodzie. Dodać 0,5 μl roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego. Wymieszać pipetując.
3. Zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzęta pod mikroskopem preparacyjnym⁹. Hermafrodyty L4 mają charakterystyczny srom, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Dorosłe hermafrodyty są największymi zwierzętami na talerzu i mogą mieć owalne zarodki widoczne w macicy.
4. Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś kilka zwierząt do roztworu: 9 zwierząt daje 1 zwierzęcy odpowiednik genomowego DNA na 0,5 μl lizatu, a 16 zwierząt daje ~1 zwierzęcy odpowiednik genomowego DNA w 0,25 μl (3,5 nicienia / μL) ¹⁰,
   UWAGA: Trudno jest przenieść do tego tomu więcej niż 16 zwierząt.
5. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).
6. Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program lizy ustawiony w kroku 3.1.
7. Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Dodać 2 μl roztworu neutralizującego z zestawu do mieszaniny. Wymieszać pipetując.
8. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).
9. Bezpośrednio użyj lizy do PCR lub przechowuj ją w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
   UWAGA: Wyekstrahowane DNA jest stabilne w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy⁷.

4. Reakcja PCR

UWAGA: Opisano jedno z dalszych zastosowań tej techniki lizy robaków, wykrywające mutację delecji za pomocą szybkiej polimerazy. Wykazano również skuteczność dwóch protokołów lizy robaków w wytwarzaniu matrycy genomowej DNA do udanego PCR w rozcieńczeniach do 1/50 robaka na reakcję.

1. Wyodrębnij DNA z pojedynczego robaka i 16 robaków przy użyciu N2 typu dzikiego i zmutowanych szczepów, jak opisano powyżej w Kroku 2 i Kroku 3.
2. Przygotować 2-, 10-, 20- i 50-krotne rozcieńczenia DNA pojedynczego robaka od zwierząt N2 typu dzikiego.
3. Skonfigurować reakcje PCR zgodnie z protokołem producenta, używając starterów specyficznych dla sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania i głównej mieszanki PCR na gorąco (Tabela 1 i Tabela 2). Użyć 1 μl nierozcieńczonego DNA lub 2 μl rozcieńczonego DNA jako matrycy w każdej reakcji.
4. Potwierdź produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania¹¹.

Genomowe DNA od jednego lub kilku dorosłych osobników dzikiego typu zostało wyekstrahowane przy użyciu komercyjnego zestawu lub tradycyjnego protokołu lizy w celu porównania skuteczności tych dwóch metod. Lizaty te zostały następnie wykorzystane jako matryce do PCR w celu amplifikacji większego celu ~ 2 100 pz (kodowanie blmp-1) lub mniejszego celu ~ 500 pz (kodowanie części sma-10). Obie metody z powodzeniem dały odpowiednie produkty PCR (Rysunek 1A).

Następnie, zademonstrowano zdolność genomowego DNA ekstrahowanego zestawem do służenia jako matryca dla różnych polimeraz DNA. Wyekstrahowane genomowe DNA wykorzystano jako matrycę do amplifikacji produktu o wielkości 0,5 kb przy użyciu czterech polimeraz, które mają różne możliwości (w tym szybkość, wierność i rozmiar produktu). Produkty o oczekiwanych rozmiarach zostały wygenerowane przez te polimerazy przy użyciu matrycy z lizy pojedynczej osoby dorosłej lub lizy z dziewięcioma osobami dorosłymi (Rysunek 1B). Sekwencję matrycy i wierność polimeraz PCR w celu prawidłowego amplifikowania sekwencji matrycy można potwierdzić przez sekwencjonowanie (rysunek uzupełniający S1). Wynik ten pokazuje, że genomowe DNA wyekstrahowane z protokołów zestawu stanowi odpowiednią matrycę dla szeregu polimeraz.

Skuteczność PCR została przetestowana przy użyciu różnych stężeń genomowego DNA pobranego od jednego zwierzęcia za pomocą komercyjnego zestawu. DNA rozcieńczano 2-, 10-, 20- lub 50-krotnie, a do PCR użyto równowartości około połowy, jednej dziesiątej, jednej dwudziestej i jednej pięćdziesiątej robaka na reakcję. Te stężenia matryc DNA wspierały amplifikację albo większego celu ~2,1 kb, albo mniejszego celu ~0,5 kb (Rysunek 1C)12. Podczas gdy zaobserwowano zależną od stężenia DNA wydajność produktu PCR o zawartości 0,5 kb, wydajność produktu PCR o zawartości 2,1 kb wydawała się równoważna we wszystkich reakcjach.

Aby wykazać, że te protokoły wytwarzają genomowe DNA z C. elegans, które nadaje się do genotypowania PCR, genomowe DNA zostało wyekstrahowane z pojedynczych i 16 mutantów typu dzikiego i BLMP-1 z utratą funkcji (BLMP-1(tm548)). Gen blmp-1 koduje czynnik transkrypcyjny, który odgrywa ważną rolę w migracji komórek dystalnego wierzchołka, wielkości ciała i rozwoju12,13,14,15,16. Mutant blmp-1 ma delecję 810 pz, która usuwa części eksonu 3 i intronu 315. Zaprojektowano startery, które dają produkt o wartości 2,134 pz, gdy używana jest matryca DNA typu dzikiego, i produkt o wartości 1,324 pz, jeśli stosuje się DNA blmp-1(-). Produkty PCR o odpowiednich rozmiarach wykryto przy użyciu 1 μl lizy pojedynczego robaka (około 0,5 robaka na reakcję) lub 16 robaków od zwierząt w stadium L4 (3,5 robaka na reakcję) (Rysunek 1D). Wynik ten pokazuje, że genomowe DNA wyekstrahowane za pomocą dowolnego protokołu zapewnia równie skuteczne matryce dla linii PCR do genotypu.

Te wyniki pokazują, że preparaty genomowego DNA C. elegans wykorzystujące komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA tkanek od pojedynczych i wielu zwierząt mogą być niezawodnie używane jako matryce do PCR.

Rysunek 1: Preparaty DNA przy użyciu komercyjnego zestawu z pojedynczych nicieni i wielu nicieni umożliwiają solidną amplifikację metodą PCR. Produkty PCR załadowano na 1% żelu agarozowym do 1x buforu TAE (5 μL (A,B) lub 10 μL (C,D) i pracowano pod napięciem 90-100 V przez 30 min do 2 godzin. Do wszystkich żeli użyto drabinki DNA o długości 2 logarytmów. (A) Porównanie lizy DNA za pomocą zestawu z tradycyjnymi metodami proteinazy K w celu stworzenia matrycy przy użyciu dwóch zestawów starterów. Dorosłe osobniki typu dzikiego poddano lizie, a jako matrycę dla wszystkich reakcji użyto odpowiednika jednego zwierzęcia. Pasy 1-4, 2.1 kb produktu. Tor 1, PCR z lizy pojedynczego robaka przez proteinazę K. Tor 2, PCR z lizy pojedynczego robaka metodą zestawową. Tor 3, PCR z lizy dziewięciorobakowej przez proteinazę K. Pas 4, PCR z lizy dziewięciorobakowej metodą kitową. Pasy 5-8, 0,5 kb produktu. Tor 5, PCR z lizy pojedynczego robaka przez proteinazę K. Tor 6, PCR z lizy pojedynczego robaka metodą zestawową. Tor 7, PCR z lizy dziewięciorobakowej przez proteinazę K. Pas 8, PCR z lizy dziewięcioślimakowej metodą zestawową. (B) Metoda kitowa do lizy DNA zapewnia odpowiednią matrycę do PCR za pomocą wielu polimeraz. Dorosłe osobniki typu dzikiego poddano lizie metodą zestawową, a jako matrycę PCR dla produktu o wielkości 0,5 kb użyto odpowiednika połowy zwierzęcia. Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat polimerazy. Tor 1, PCR z lizy pojedynczego robaka z polimerazą o dużej prędkości. Tor 2, PCR z lizy dziewięcioślimakowej z polimerazą o dużej prędkości. Tor 3, PCR z lizy pojedynczego robaka z polimerazą Taq. Tor 4, PCR z lizy dziewięcioślimakowej z polimerazą Taq. Tor 5, PCR z lizy pojedynczego robaka z polimerazą o wysokiej wierności. Tor 6, PCR z lizy dziewięcioślimakowej z polimerazą o wysokiej wierności. Tor 7, PCR z lizy pojedynczego robaka z szybką polimerazą o wysokiej wierności. Tor 8, PCR z lizy dziewięcioślimakowej z polimerazą o wysokiej szybkości i wierności. (C) Rozcieńczenia jednego robaka L4 typu dzikiego dostarczają matrycy do PCR. Pasy 1-5, produkt 2.1 kb. Pasy 6-10, cel 0,5 kb. Tor 1 i tor 6, nierozcieńczone DNA. Pas 2 i tor 7, 2-krotnie rozcieńczone DNA. Tor 3 i tor 8, 10-krotnie rozcieńczone DNA. Pas 4 i tor 9, 20-krotnie rozcieńczone DNA. Pas 5 i tor 10, 50-krotnie rozcieńczone DNA. (D) Genotypowanie locus blmp-1 metodą PCR przy użyciu 1 μl preparatów DNA pojedynczych i 16 robaków jako matrycy. Tor 1, PCR z lizy pojedynczego robaka typu dzikiego. Tor 2, PCR z lizy pojedynczego robaka blmp-1(-). Tor 3, PCR z lizy 16 robaków typu dzikiego. Tor 4, PCR z lizy 16-robakowej BLMP-1(-). Skróty: prep = metoda przygotowania; kb = kilobaza; st. = stadium nicienia; dil. = rozcieńczenie DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista starterów.

Tabela 2: Składniki reakcji PCR.

Rysunek uzupełniający S1: Sekwencjonowanie w celu potwierdzenia jakości genomowego DNA przygotowanego za pomocą komercyjnego zestawu. Wyniki dwóch reakcji sekwencjonowania całkowicie odpowiadają oczekiwanej sekwencji ponad 1600 nukleotydów DNA amplifikowanych przez szybką polimerazę o wysokiej wierności (Pol E) z lizy 16 robaków (Tabela 1, Tabela 2A i Tabela 2D). Końcówki odczytu sekwencjonowania zostały przycięte w celu usunięcia podstawowych odczytów o niskiej jakości. Wyrównanie przeprowadzono przy użyciu narzędzia do wyrównywania wielu sekwencji EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.