Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

26K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63724

⸱

5 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Streszczenie

Błona śluzowa jelit to złożona fizyczna i biochemiczna bariera, która spełnia mnóstwo ważnych funkcji. Umożliwia transport, wchłanianie i metabolizm składników odżywczych i ksenobiotyków, ułatwiając jednocześnie symbiotyczny związek z mikrobiotą i ograniczając inwazję mikroorganizmów. Interakcja funkcjonalna między różnymi typami komórek oraz ich środowiskiem fizycznym i biochemicznym jest niezbędna do ustanowienia i utrzymania homeostazy tkanek jelitowych. Modelowanie tych złożonych interakcji i zintegrowana fizjologia jelit in vitro to ogromny cel, który może zmienić sposób, w jaki odkrywane i opracowywane są nowe cele terapeutyczne i kandydaci na leki.

Technologie organoidów i Organ-on-a-Chip zostały ostatnio połączone w celu wygenerowania istotnych dla człowieka chipów jelitowych, odpowiednich do badania funkcjonalnych aspektów fizjologii i patofizjologii jelit in vitro. Organoidy pochodzące z biopsji jelita cienkiego (dwunastnicy) i jelita grubego są umieszczane w górnej komorze chipa narządu, a następnie z powodzeniem rozszerzają się jako monowarstwy, zachowując jednocześnie wyraźne cechy komórkowe, molekularne i funkcjonalne każdego regionu jelita. Specyficzne dla tkanki jelita ludzkiego mikronaczyniowe komórki śródbłonka są wbudowane w dolny przedział chipa narządu, aby odtworzyć interfejs nabłonkowo-śródbłonkowy. Ta nowatorska platforma ułatwia ekspozycję światła na składniki odżywcze, leki i mikroorganizmy, umożliwiając badania transportu jelitowego, przepuszczalności i interakcji gospodarz-mikroorganizm.

Tutaj podano szczegółowy protokół tworzenia chipów jelitowych reprezentujących ludzką dwunastnicę (chip dwunastnicy) i okrężnicy (chip jelita grubego), a następnie ich hodowlę pod ciągłym przepływem i deformacjami podobnymi do perystaltyki. Przedstawiono metody oceny metabolizmu leków i indukcji CYP3A4 w chipie dwunastnicy z wykorzystaniem prototypowych induktorów i substratów. Na koniec przedstawiamy procedurę krok po kroku do modelowania in vitro przerwania bariery za pośrednictwem interferonu gamma (IFNγ) w chipie jelita grubego, w tym metody oceny zmiany przepuszczalności parakomórkowej, zmiany w wydzielaniu cytokin i profilowanie transkryptomiczne komórek w chipie.

Wprowadzenie

Ludzkie jelito jest złożonym i wielozadaniowym organem zdolnym do samoregeneracji. Dzieli się na jelito cienkie i grube. Podstawową funkcją jelita cienkiego jest dalsze trawienie pokarmu pochodzącego z żołądka, wchłanianie wszystkich składników odżywczych i przekazywanie pozostałości do jelita grubego, które odzyskuje wodę i elektrolity. Jelito cienkie jest dalej podzielone na wiele anatomicznie odrębnych regionów: dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, z których każdy jest przystosowany do pełnienia określonych funkcji. Na przykład dwunastnica pomaga w rozkładzie treści pokarmowej (treści żołądkowej), aby umożliwić prawidłowe wchłanianie składników odżywczych zawierających białka, węglowodany, witaminy i minerały w jelicie czczym. Ta proksymalna część jelita cienkiego jest również głównym miejscem wchłaniania i metabolizmu leków w jelitach grubych i charakteryzuje się wyższą ekspresją enzymów metabolizujących leki (np. CYP3A4) w porównaniu z ich ekspresją w jelicie krętym i okrężnicy1. Oprócz swojej głównej roli w trawieniu i wchłanianiu składników odżywczych, jelito jest również skuteczną barierą przed potencjalnie szkodliwą zawartością światła, taką jak mikroorganizmy chorobotwórcze, metabolity drobnoustrojów, antygeny dietetyczne i toksyny2,3. Warto zauważyć, że ludzka okrężnica jest zasiedlona przez dużą liczbę mikroorganizmów, znacznie przewyższającą liczbę wszystkich komórek w ludzkim ciele, które zapewniają wiele korzyści w zakresie odżywiania, metabolizmu i odporności. W związku z tym utrzymanie integralności bariery śluzowej utworzonej przez komórki nabłonka jelitowego ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia symbiotycznego związku między mikrobiotą jelitową a komórkami gospodarza poprzez ich fizyczną separację w celu uniknięcia niepotrzebnej aktywacji komórek odpornościowych2. Ponadto zaprogramowana śmierć komórek jelitowych odgrywa istotną rolę jako mechanizm samoobronny, zapobiegający utrzymywaniu się lub namnażaniu się zakażonych komórek - rozprzestrzeniając w ten sposób potencjalne patogeny3 - podczas gdy ciągłe samoodnawianie nabłonka jelitowego co cztery do siedmiu dni kompensuje utratę komórek, zapewniając integralność bariery i homeostazę tkanek. Upośledzenie opisanych funkcji jelit, w tym wchłaniania składników odżywczych, integralności bariery lub braku równowagi w śmierci komórek jelitowych i samoodnawianiu, może skutkować rozwojem szeregu zaburzeń żołądkowo-jelitowych, w tym niedożywienia i nieswoistego zapalenia jelit (IBD)2,3.

Poprzednio, modele zwierzęce i przekształcone linie komórek jelitowych pochodzących z raka były używane do badania fizjologicznych i patofizjologicznych funkcji ludzkiej tkanki jelitowej. Jednak coraz bardziej widoczne obawy dotyczące przekładalności badań na zwierzętach na ludzi, spowodowane obecnością znacznych różnic między tymi dwoma gatunkami, uwypukliły potrzebę alternatywnych metod istotnych dla człowieka4. Powszechnie stosowane linie komórkowe jelit in vitro obejmują komórki T84, Caco-2 i HT29. Chociaż naśladują pewne aspekty funkcji bariery jelitowej i transportu błonowego, charakteryzują się zmienioną ekspresją enzymów metabolizujących leki5, receptory powierzchniowe i transportery4. Ponadto brakuje im swoistości segmentu jelitowego i nie są w stanie podsumować złożoności nabłonka jelitowego, przy czym każdy model zawiera tylko jeden z pięciu typów komórek nabłonkowych obecnych w jelicie6.

Niedawno, hodowle organoidów ludzkich jelit powstałych na podstawie świeżych biopsji jelita cienkiego i okrężnicy7,8 lub indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)9 zostały wprowadzone jako alternatywne modele eksperymentalne z potencjałem uzupełnienia, ograniczenia i być może zastąpienia eksperymentów na zwierzętach w przyszłości. Podczas gdy iPSC można uzyskać w sposób nieinwazyjny, tworzenie organoidów z iPSC wymaga zastosowania złożonych i długotrwałych protokołów (z kilkoma etapami eksperymentalnymi) i generuje kultury przypominające ludzką tkankę płodową. Natomiast organoidy pochodzące z biopsji są wysoce skalowalne, ponieważ mogą wykorzystywać wrodzoną zdolność tkanki jelitowej do odnawiania i mogą być pasażowane i rozmnażane w nieskończoność in vitro. Co ważne, organoidy pochodzące z biopsji zachowują specyficzne dla choroby i regionu jelitowego cechy tkanki pierwotnej, z której się rozwinęły, oraz naśladują różnorodność komórkową nabłonka jelitowego. Organoidy mogą być wykorzystywane jako awatary specyficzne dla pacjenta in vitro w celu rozwikłania biologii i patogenezy różnych zaburzeń żołądkowo-jelitowych oraz poprawy ich postępowania terapeutycznego. Chociaż organoidy jelitowe osiągnęły imponujący stopień funkcjonalności fizjologicznej, nadal nie są w stanie odtworzyć złożoności narządów rodzimych ze względu na brak krytycznych składników zrębu - w tym naczyń krwionośnych, tkanki łącznej, nerwów obwodowych i komórek odpornościowych - a także stymulacji mechanicznej. Wiadomo, że parametry mechaniczne, takie jak przepływ, naprężenie ścinające, rozciąganie i ciśnienie, wpływają na morfogenezę i homeostazę tkanek in vivo, a wcześniej wykazano, że poprawiają dojrzewanie komórek in vitro10,11,12,13. Dodatkową istotną wadą układów organoidowych jest niedostępność światła, a co za tym idzie do wierzchołkowej strony nabłonka. Stanowi to wyzwanie dla badania różnych mechanizmów związanych ze spolaryzowaną ekspresją transporterów jonów i leków, interakcjami gospodarz-mikrobiom oraz testami toksyczności farmaceutycznej. Wreszcie, hodowle organoidów cierpią ze względu na znaczną zmienność wielkości, morfologii i funkcji, ze względu na stochastyczny charakter procesu samoorganizacji in vitro i wyborów dotyczących losu komórki. Dlatego, aby w pełni wykorzystać potencjał organoidów jelitowych w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej, konieczne jest zbadanie nowych strategii, które zmniejszają zmienność rozwoju organoidów, poprawiają dostęp do przedziału luminalnego i uwzględniają brakujące interakcje komórka-komórka.

Technologia Organ-on-a-Chip wprowadziła wiele technik wprowadzania sił mechanicznych i przepływu płynów do hodowli komórek jelitowych in vitro. Ponieważ jednak większość wstępnych badań potwierdzających słuszność koncepcji wykorzystywała linie komórkowe pochodzące z raka, które nie wykazywały wystarczającej różnorodności komórkowej, znaczenie tych systemów zostało zakwestionowane. Ostatnio synergistycznie połączyliśmy organoidy jelitowe i technologię organ-on-a-chip, aby połączyć najlepsze cechy każdego podejścia w jednym systemie in vitro14,15,16. Powstały w ten sposób chip jelitowy rekapituluje wielokomórkową architekturę nabłonka jelitowego, obecność interfejsu tkankowego nabłonkowo-śródbłonkowego oraz siły mechaniczne przepływu i rozciągania płynu, umożliwiając naśladowanie funkcji na poziomie narządów in vitro. Ponadto zastosowanie organoidów pochodzących z tkanek pierwotnych (które można pobrać z różnych regionów ludzkiego jelita) jako materiału wyjściowego zwiększa wszechstronność tego modelu, ponieważ chipy reprezentujące ludzką dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę można ustalić po podobnych procedurach wysiewu i hodowli. Co ważne, Intestine-Chips umożliwiają ocenę w czasie rzeczywistym: integralności bariery jelitowej; aktywność granicy szczotek i enzymów metabolizmu leków; produkcja mucyn; wydzielanie cytokin; oraz interakcji komórek jelitowych z mikroorganizmami chorobotwórczymi i komensalnymi, jak wykazano we wcześniej opublikowanych raportach. Warto zauważyć, że gdy stworzono chipy jelitowe przy użyciu organoidów wygenerowanych z tkanek różnych osób, modele te uchwyciły oczekiwaną zmienność między dawcami w funkcjonalnych odpowiedziach na różne leki i terapie. Podsumowując, połączenie organoidów z technologią Organ-on-a-Chip otwiera drzwi do bardziej zaawansowanych, spersonalizowanych modeli istotnych in vivo, które mogą poprawić fizjologiczne znaczenie i dokładność wyników in vitro, a także ich ekstrapolację na ludzi. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół tworzenia chipa jelitowego i jego zastosowania w badaniach funkcji fizjologicznych dwóch odcinków jelita: dwunastnicy i jelita grubego. W pierwszej kolejności opisano metody oceny aktywności enzymu metabolizującego leki CYP3A4 w chipie dwunastnicy, a także jego indukcji przez prototypowe związki, takie jak ryfampicyna i witamina D3. Po drugie, kroki wymagane do modelowania "nieszczelnego jelita" w chipie jelita grubego są opisane w protokole, przy czym przerwanie bariery nabłonkowej odbywa się za pomocą charakterystycznych cytokin zaangażowanych w patogenezę IBD. Krótko mówiąc, organoidy pochodzące z ludzkich biopsji są rozmnażane in vitro, poddawane trawieniu enzymatycznemu i wprowadzane do górnego kanału chipa. W obecności ciągłej perfuzji z pożywkami wzbogaconymi w czynnik wzrostu przekształcają się w zlewającą się monowarstwę nabłonka o architekturze 3D i łatwo dostępnej powierzchni komórek wierzchołkowych. Dolny, "naczyniowy" przedział chipa jest wysadzany mikronaczyniowymi komórkami śródbłonka wyizolowanymi z jelita cienkiego lub grubego. Nabłonek i śródbłonek są oddzielone porowatą, rozciągliwą błoną, która ułatwia interakcje parakrynne między dwiema tkankami, a pod wpływem cyklicznych deformacji naśladuje ruchy jelita ludzkiego przypominające perystaltykę. Kokultura jest utrzymywana w dynamicznych warunkach przepływu generowanych przez perfuzję światła i naczyń krwionośnych za pomocą odpowiednich pożywek do hodowli komórkowych. Na koniec opisujemy liczne rodzaje testów i analiz punktów końcowych, które można przeprowadzić bezpośrednio na chipie lub z próbek ścieków z hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe należy prowadzić z zachowaniem odpowiedniej techniki aseptycznej.

Ludzkie organoidy jelita wykorzystane w niniejszym badaniu zostały pozyskane z Uniwersytetu Johns Hopkins, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (Institutional Review Board) Uniwersytetu Johns Hopkins (IRB #NA 038329).

1. Przygotowanie odczynników do hodowli komórkowej

  1. Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów) i uzupełnić ją o primocynę w stężeniu 100 µg/mL.
  2. Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów) i uzupełnić ją o FBS w stosunku 1:20 vol/vol oraz primocynę w stężeniu 50 μg/ml zamiast 100 μg/ml.
  3. Rozpuścić Y-27632 (inhibitor kinazy Rho) w sterylnym 0,1% BSA w DPBS, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 mM. Rozdzielić do sterylnych mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
  4. Rozpuścić CHIR9021 (inhibitor GSK-3) w sterylnym dimetylosulfotlenku (DMSO), aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 5 mM. Rozdzielić do sterylnych mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
  5. Przygotować roztwór do trawienia ludzkich organoidów, mieszając w stosunku 1:1 vol/vol roztwór do dysocjacji organoidów (Tabela materiałów) z roztworem DPBS (Tabela materiałów) i uzupełniając go roztworem stokowym Y-27632 o stężeniu 10 µM. Odczynnik ten musi być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.

2. Hodowla ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka jelita (HIMECs)

  1. Rozpocząć hodowlę HIMEC (Tabela materiałów) na 7 dni przed ich wysianiem na chip. Do wysiewania na chip można używać wyłącznie HIMEC w pasażach 1-6.
  2. Dodać 5 mL roztworu czynnika adhezyjnego (Tabela materiałów) do kolby T150; inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 min, a następnie usunąć roztwór.
  3. Dodać do kolby 19 mL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, uprzednio ogrzanej do temperatury pokojowej (patrz krok 1.2).
  4. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z HIMEC (2 miliony komórek/fiolka) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
  5. Przenieść zawartość fiolki do kolby i delikatnie nią potrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na całą noc, aby umożliwić adhezję komórek śródbłonka.
  6. Następnego dnia oraz co 3 dni w dalszym ciągu wymienić pożywkę na 20 mL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, ogrzanej do temperatury pokojowej. W dniu zbioru komórek do eksperymentów na chipach hodowle powinny osiągnąć 90% konfluencji.

3. Mikrotworzywo i przygotowanie chipa

  1. Należy pozyskać chipy od dostawcy komercyjnego (Tabela materiałów). Rozpakować chipy i umieścić je w uchwycie do chipów znajdującym się w kwadratowej płytce Petriego (Tabela materiałów). Na przedniej stronie każdego nośnika chipu należy oznaczyć warunki eksperymentalne (Rycina 1A).
    ​UWAGA: Chociaż przedstawiony protokół opiera się na zastosowaniu konkretnego dostępnego komercyjnie chipu i aparatury, istnieje wiele urządzeń mikroprzepływowych oferowanych przez różnych dostawców, które mogą zapewniać inne zalety, lecz nie umożliwiają wprowadzenia rozciągania. Ponadto mikrofabrykacja układów Organs-on-Chips może być wykonana we własnym zakresie zgodnie z procedurami opisanymi przez Huh i wsp.21.

4. Aktywacja i powlekanie membrany ECM

  1. Przygotowanie roztworu aktywującego
    1. Doprowadzić odczynniki ER-1 i ER-2 (Tabela materiałów) do temperatury pokojowej w celu wyrównania temperatury przed użyciem. Odczynnik ER-1 jest światłoczuły i musi być obsługiwany w ciemności.
    2. Rozpuścić ER-1 w 10 mL odczynnika ER-2, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 mg/mL, a następnie upewnić się, że ER-1 został całkowicie rozpuszczony.
  2. Aktywacja powierzchni
    1. Ostrożnie wprowadzić 50 µL roztworu ER-1 przez oba kanały chipa (Rycina 1A).
    2. Usunąć nadmiar roztworu ER-1 z powierzchni chipa za pomocą aspiratora.
    3. Skontrolować chipy, aby upewnić się, że wszystkie otrzymały roztwór ER-1. W przypadku pojawienia się pęcherzyków powietrza wprowadzić więcej roztworu ER-1, aż pęcherzyki zostaną całkowicie usunięte.
    4. Inkubować chipy w komorze z lampą UV (Tabela materiałów) przez 15 min. Upewnić się, że lampa UV jest ustawiona w trybie Consistent.
    5. Przenieść aktywowane ER-1 chipy z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC). Odessać roztwór ER-1 z obu kanałów. Przepłukać pozostałości roztworu ER-1 za pomocą 20 µL ER-2.
    6. Wprowadzić 20 µL sterylnego soli fizjologicznej z buforowanym fosforanem Dulbecco (DBPS) przez kanały (Tabela materiałów) i pozostawić DBPS w kanałach do następnego etapu.
  3. Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i powlekanie błony
    1. Przygotowanie roztworów stokowych składników ECM
      1. Rozpuścić kolagen IV (Tabela materiałów) i fibronektynę (Tabela materiałów) w sterylnej wodzie klasy do hodowli komórkowych (Tabela materiałów) do stężenia końcowego 1 mg/mL. Przygotować alikwoty i przechowywać je w temperaturze -20°C do momentu użycia.
    2. Przygotowanie roztworu roboczego ECM do powlekania błony
      1. Przygotować po 1,5 mL każdego roztworu ECM dla kanału górnego i dolnego na każde 12 chipów do powlekania. Roztwór ECM należy zawsze przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.
      2. Dla kanału górnego zmieszać kolagen IV i rozpuszczalną macierz błony podstawnej (BMM) (Tabela materiałów) w sterylnym zimnym DBPS w stężeniach odpowiednio 20 µg/mL i 10 µg/mL. Dla kanału dolnego zmieszać kolagen IV i fibronektynę w sterylnym zimnym DPBS w stężeniach odpowiednio 200 µg/mL i 30 µg/mL.
    3. Powlekanie chipów ECM
      1. Odessać DBPS z obu kanałów chipów i zastąpić go odpowiednim roztworem roboczym ECM dla każdego kanału (Rycina 1A).
      2. Skontrolować każdy chip, aby upewnić się, że otrzymał roztwór powlekający. W przypadku pojawienia się pęcherzyków powietrza wprowadzić więcej roztworu powlekającego, aż wszystkie pęcherzyki zostaną całkowicie usunięte.
      3. Dodać sterylny DPBS do uchwytu na chipy i umieścić szalkę Petriego z chipami w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Inkubować przez noc, aby białka ECM mogły utworzyć wiązania jonowe z aktywowaną błoną PDMS. W razie potrzeby komórki można wysiać w dowolnym czasie od 2 h do 1 doby po powleczeniu chipów. Alternatywnie powleczone chipy można przechowywać w temperaturze 4°C przez noc, a następnie inkubować przez noc w 37°C i wysiać komórki.

5. Wysiewanie ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka jelita (HIMECs) do dolnego kanału chipa

UWAGA: HIMEC z jelita cienkiego i jelita grubego są wysiewane odpowiednio do dolnego kanału chipa dwunastnicy i chipa jelita grubego.

  1. Przygotowanie chipów
    1. Przenieś chipy pokryte ECM do BSC. Delikatnie odessij powłokę ECM z obu kanałów chipów, a następnie przemyj oba kanały odpowiednio 20 µL pożywki do wzrostu organoidów oraz pożywki do wzrostu komórek śródbłonka.
    2. Przechowuj przemyte chipy w inkubatorze w temperaturze 37°C do czasu rozpoczęcia siewu komórek śródbłonka.
  2. Zbiór komórek śródbłonka
    1. Przenieś kolbę z hodowlą HIMEC do BSC i przemyj ją za pomocą sterylnego DPBS.
    2. Dodaj do kolby 3 mL roztworu dysocjującego i pozostaw w inkubatorze w 37°C przez 2 min, aby umożliwić całkowite odklejenie komórek.
    3. Zbierz komórki do probówki stożkowej 15 mL i dolej pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka, aż objętość osiągnie 10 mL. Pobierz próbkę 15-20 µL zawiesiny komórkowej do zliczenia komórek. Wiruj przy 150 x g przez 5 min.
    4. Ostrożnie odessij supernatant i resuspenduj HIMEC do gęstości 8-10 x 106 komórek/mL w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka.
  3. Siew komórek śródbłonka do dolnego kanału chipu
    1. Przenieś płytkę Petri z chipami do BSC i delikatnie usuń całą pożywkę z dolnego kanału za pomocą pipety 1 0 µL.
    2. Wprowadź 10-15 µL zawiesiny HIMEC do dolnego kanału chipu. Sprawdź chip bezpośrednio po siewie, aby upewnić się, że gęstość siewu jest optymalna (80%-90% pokrycia), a rozkład komórek w kanale jest jednorodny (Rysunek 1D). Jeśli gęstość siewu jest wyższa lub niższa od oczekiwanej lub jest nierównomierna, przemyj kanał 2x 20 µL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i powtórz procedurę siewu.
    3. Odwróć płytkę Petri natychmiast po zasianiu każdej partii sześciu chipów, aby umożliwić przywieranie komórek śródbłonka do dolnej strony membrany PDMS. Umieść płytki Petri w inkubatorze w 37°C na 30 min do 1 h lub do momentu, aż HIMEC w dolnym kanale przywrą do membrany (Rysunek 1D).
  4. Przemywanie chipów
    1. Delikatnie wprowadź 20 µL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka przez wlot dolnego kanału, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki i uzupełnić składniki odżywcze w pożywce.
    2. Wypłucz komórki, które nie przywarły w górnym kanale, stosując 20 µL pożywki do wzrostu organoidów uzupełnionej o 5 µM CHIR99021 i 10 µM Y-27632.
    3. Umieść chipy w inkubatorze w 37°C do czasu rozpoczęcia siewu komórek nabłonkowych.

6. Wysiew fragmentów organoidów do górnego kanału chipa

UWAGA: Organoidy wyizolowane z biopsji różnych odcinków jelit mogą być hodowane w układzie intestine chip7. Należy postępować zgodnie z procedurami opisanymi przez Fujii i wsp. w celu izolacji ludzkich krypt jelitowych i ustanowienia kultur organoidów2. W niniejszej procedurze organoidy dwunastnicze i okrężnicze są wykorzystywane odpowiednio do generowania układów duodenum chip oraz colon chip. Ze względu na wysoką zmienność między partiami oraz między dawcami w procesie formowania i wzrostu organoidów, zaleca się przeprowadzenie wstępnej oceny gęstości komórek w zawiesinowej kulturze organoidów (w formacie płytki 24-dołkowej), aby uzyskać optymalną gęstość wysiewu wynoszącą 8 milionów komórek/mL.

  1. Wstępna ocena liczby komórek w studience w statycznej hodowli organoidów.
    UWAGA: Poniższa procedura służy wyłącznie do określenia liczby studni kultury zawiesiny organoidów wymaganych do zasiewu na chipie. Uzyskane pojedyncze komórki nie powinny być wykorzystywane do zasiewu na chipie.
    1. Ostrożnie odessaj supernatant z trzech studzienek płytki z hodowlą organoidów. Dodaj 500 µL lodowatego roztworu do dysocjacji BMM (Tabela materiałów) do każdej studzienki i za pomocą plastikowego skrobaka oddzielić rozpuszczone BMM od tworzywa.
    2. Przenieść zawiesinę organoidów do sterylnej probówki stożkowej o niskim wiązaniu białek, używając schłodzonej do temperatury lodu 1,000 µL pipetować. Inkubować w lodzie przez 60 min, mieszając co 15 min poprzez delikatne potrząsanie probówką. Wirować przy 30 x g przez 5 min w temperaturze 4°C.
    3. Odssać supernatant i dodać 2 mL trypsyny. Inkubować w 37°C przez 30 min, aby rozłożyć organoidy do poziomu pojedynczych komórek, a następnie dodać 10 ml kompletnej pożywki do wzrostu organoidów, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Odwirować przy 30 x g przez 5 min w temperaturze 4°C.
    4. Osad komórkowy resuspender w 1 ml pełnej pożywki do wzrostu organoidów i policzyć całkowitą liczbę komórek za pomocą hematocytometru zgodnie ze standardowymi metodami.
  2. Przygotowanie fragmentów organoidów i ich wysiew do chipa
    UWAGA: Poniższe procedury można zastosować do wysiewania organoidy dwunastnicze lub okrężnicze w górnym kanale chipa. Ustanowienie jednowarstwowego nabłonka z in vivo odpowiednia trójwymiarowa cytoarchitektura jest zależna od obecności przepływu15,23 oraż pomyślne wysianie fragmentów organoidów.
    1. Ostrożnie odessaj pożywkę z odpowiedniej liczby studzienek statycznej hodowli organoidów, określonej w kroku 6.1, aby uzyskać końcową gęstość wysiewu wynoszącą 8 milionów komórek/ml. Dodaj 500 µL lodowatego roztworu do dysocjacji BMM do każdej studzienki.
    2. Odmieść zsolubilizowane BMM z powierzchni dołków, używając plastikowego skrobaka lub 1,000 µL pipetką. Zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z niskim wiązaniem białek.
    3. Przechowywać zawiesinę w lodzie przez 60 min, mieszając co 15 min poprzez delikatne potrząsanie probówką. Następnie przystąpić do wirowania przy 30 x g przez 5 min w temperaturze 4°CPo odwirowaniu powinien być widoczny wyraźnie zdefiniowany granulat organoidów. Jeśli nad granulatem komórkowym zaobserwowano przezroczystą warstwę żelu (pozostałości rozpuszczonej macierzy BMM) (Rysunek 1B), należy przystąpić do następujących kroków.
      1. Wymieszaj supernatant z osadem komórkowym, a następnie dodaj do probówki taką samą objętość roztworu dysocjującego BMM. Delikatnie wymieszaj i przechowuj na lodzie przez kolejne 10 min, po czym przystąp do wirowania przy 30 x g przez 5 min w temperaturze 4°C.
      2. W razie potrzeby powtórzyć krok 6.2.3.1, aż do całkowitego usunięcia rozpuszczonych pozostałości BMM.
    4. Odrzucić nadosad i resuspender osad z organoidów w roztworze do trawienia organoidów (patrz krok 1.5). Należy użyć takiej objętości roztworu do trawienia organoidów, aby zapewnić całkowite zanurzenie osadu. 2 ml roztworu jest odpowiednie dla około 240–12 0 organoidów średniej wielkości (Rysunek 1D, po wysiewaniu). Inkubować w 37°C przez 1–3 min.
    5. Dodać do probówki pożywkę Advanced DMEM/F-12, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Należy użyć czterokrotnej objętości zastosowanego roztworu do trawienia. Odwirzyć przy 30 x g przez 5 min w temperaturze 4°C.
    6. Odsącz supernatant i resuspenduj osad z fragmentów organoidów w pełnej pożywce do wzrostu organoidów uzupełnionej o 5 µM CHIR9021 i 10 µM Y-27632 w celu uzyskania stężenia 8 milionów komórek/ml. Przygotować 360 µL alikwoty zawiesiny do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml z niskim wiązaniem białek, aby zapobiec zmniejszeniu gęstości komórek w wyniku ich przylegania do ścianek.
    7. Usuń pożywkę z górnego kanału powlekanych chipów. Dodaj 30 µL zawiesiny komórkowej do górnego kanału każdego chipa. Inkubować chipy przez noc w 37°C inkubator, aby umożliwić fragmentom organoidów przywieranie do błony pokrytej ECM (Rysunek 1D).

7. Dynamic hodowla na chipie jelitowym – inicjacja oraz utrzymanie przepływu i ruchów przypominających perystaltykę

  1. Przygotowanie i odgazowanie mediów
    1. Aby zachować stały przepływ laminarny przez chip, należy doprowadzić do wyrównania temperatury mediów do temperatury pokojowej, a następnie poddać je filtracji próżniowej przez 10 min przy użyciu pompy próżniowej i stożkowych probówek z filtrem PVDF (odgazowanie mediów).
  2. Przygotowanie modułów przenośnych
    UWAGA: Moduły przenośne to zbiorniki pełniące funkcję interfejsu pomiędzy chipami a modułem hodowlanym, co umożliwia powtarzalne pobieranie próbek i dozowanie mediów.
    1. Otwórz moduły przenośne w BSC i umieść je na tackach modułu hodowlanego, które są specjalistycznymi pojemnikami służącymi do wyrównania modułów przenośnych.
    2. Dodaj 3 mL uprzednio wyrównanego kompletnego medium do wzrostu organoidów uzupełnionego o 5 µM CHIR9021 i 10 µM Y-27632 do górnego zbiornika wlotowego oraz 3 mL uprzednio wyrównanego medium do wzrostu komórek śródbłonka do dolnego zbiornika wlotowego (Rysunek 1C). Dodaj 30 µL tych samych mediów do odpowiednich zbiorników wylotowych.
    3. Przenieś tacki do inkubatora 37°C i wsuń je do modułu hodowlanego (Rysunek 1C). Użyj elementów sterujących na ekranie modułu hodowlanego, aby uruchomić „Cykl Przygotowawczy” (Prime Cycle, czas trwania 1 min). Gdy pasek stanu wskaże „Ready”, Cykl Przygotowawczy został zakończony. Powtórz Cykl Przygotowawczy , aby upewnić się, że utworzyło się wystarczająco dużo kropel do pomyślnego połączenia chipów.
    4. Upewnij się, że wszystkie moduły przenośne są przygotowane i mają widoczne krople mediów.
  3. Wprowadzenie przepływu
    UWAGA: Przepływ jest zazwyczaj inicjowany 24 h po wysianiu fragmentów organoidów, aby umożliwić trwałe przytwierdzenie się komórek nabłonka jelita do membrany.
    1. Przepłucz oba kanały wysianych chipów 20 µL odpowiednich mediów, aby usunąć pęcherzyki powietrza lub szczątki komórkowe. Po płukaniu pozostaw małe krople mediów na portach. Wsuń nośnik chipa do modułu przenośnego (Rysunek 1C).
    2. Umieść moduły przenośne na tackach, a następnie w module hodowlanym. Użyj elementów sterujących na ekranie modułu hodowlanego, aby zaprogramować odpowiednie warunki hodowli w chipie organu (szybkość przepływu i rozciąganie).
      UWAGA: Dla standardowych warunków hodowli w chipach dwunastnicy i jelita grubego ustaw szybkość przepływu odpowiednio na 30 µL/h15 i 60 µL/h16 dla obu kanałów (górnego i dolnego). Szybkość przepływu dla każdego kanału jest jednak sterowana niezależnie i może być ustawiona w zakresie 0-1 0 µL/h. Zamiast przedstawionych tutaj modułów hodowlanych, do wprowadzenia przepływu laminarnego do chipów mikroprzepływowych można użyć pomp strzykawkowych lub perystaltycznych. Jednak ustanowienie niezawodnych połączeń hydraulicznych pomiędzy chipami a pompami za pomocą rurek i złączek może być technicznie trudne, gdy wymagana jest jednoczesna perfuzja wielu chipów.
    3. Uruchom „Cykl Regulacyjny” (Regulate Cycle, czas trwania 2 h), który zwiększa ciśnienie mediów hodowlanych w module przenośnym i chipie, aby zapobiec nukleacji pęcherzyków powietrza. Zaprogramowane warunki zostaną przywrócone po zakończeniu Cyklu Regulacyjnego.
  4. Wymiana mediów
    1. Przygotuj świeże media dla obu kanałów i uzupełniaj je co 48 h, dodając 2 mL świeżego medium do zbiorników wlotowych (Rysunek 1C).
    2. Wstrzymaj pracę modułów hodowlanych i przenieś tacki do BSC. Odessaj media ze wszystkich zbiorników i uzupełnij je świeżymi mediami. Przenieś tacki z powrotem i wznowij przepływ.
  5. Wprowadzenie rozciągania
    UWAGA: Pozwól komórkom urosnąć do 100% konfluencji przed zastosowaniem cyklicznego odkształcenia. Rozciąganie jest zazwyczaj wprowadzane 3 dni po wysianiu lub 48 h po zainicjowaniu hodowli przepływowej. Cykliczne odkształcenie 2% przy częstotliwości 0,2 lub 0,15 Hz, odpowiednio dla chipa jelita dwunastnicy1 i grubego24, jest stosowane przez pierwsze 24 h. Następnie zostaje ono zwiększone do 10% przez pozostały czas hodowli w chipie jelita , aby jak najściślej odwzorować cykliczne odkształcenie, jakiego doświadczają komórki nabłonka jelita in vivo (Rysunek 1D)25. Moduł hodowlany umożliwia zastosowanie cyklicznego odkształcenia w zakresie 2%-12% i częstotliwości do 0,4 Hz.
    1. Aby wprowadzić rozciąganie do trwającej hodowli przepływowej, wstrzymaj pracę modułu hodowlanego. Używając elementów sterujących na ekranie, zmień ustawienia rozciągania na 2%, częstotliwość 0,2 lub 0,15 Hz i uruchom ponownie moduł hodowlany.
    2. Po 24 h powtórz krok 7.5.1, aby zastosować 10% rozciąganie przy częstotliwości 0,2 lub 0,15 Hz.

8. Indukcja CYP450 przy użyciu prototypowych induktorów CYP w układzie duodenum-on-a-chip

UWAGA: Test indukcji cytochromu P450 (CYP450) umożliwia ocenę, czy badany związek zwiększa poziom mRNA i/lub aktywność katalityczną specyficznych enzymów CYP450. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oceny indukcji CYP3A4 zgodnie ze standardami przemysłowymi i zaleceniami organów regulacyjnych in vitro Induktory CYP, ryfampicyna (RIF) i 1,2-dihydroksywitamina D3 (VD3). Przedstawioną metodę można wykorzystać do oceny potencjału różnych związków testowych do indukowania różnych izoform CYP450 w ludzkiej tkance jelitowej. Dla każdej oceniającej izoformy enzymu konieczny będzie dobór odpowiednich zestawów starterów i sond substratowych.

  1. Ekspozycja na induktory CYP
    1. Przygotować roztwory zapasowe 20 mM RIF, 10 mM VD3 oraz 20 mM testosteronu (Tabela materiałów), używając sterylnego DMSO.
      OSTRZEŻENIE: Testosteron jest substancją kontrolowaną z grupy III. Podczas pracy należy przestrzegać procedur regulacyjnych.
    2. Przygotować pożywkę do dozowania z induktorami CYP poprzez rozcieńczenie roztworów zapasowych w pełnej pożywce do wzrostu organoidów oraz pożywce do wzrostu komórek śródbłonka, aby uzyskać stężenia 20 µM RIF i 10 nmol/L VD3. Przygotować kontrolę nośnika, rozcieńczając DMSO w odpowiednich pożywkach do stężenia 0,1% DMSO.
    3. Wstrzymać pracę modułu hodowlanego i przenieść tacki do komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC). Wymienić pożywkę we wszystkich zbiornikach wlotowych na 2 mL pożywki dozującej z induktorami lub kontroli nośnika. Umieścić moduły przenośne z powrotem w module hodowlanym i wznowić przepływ z prędkością 30 µL/h.
    4. Po 24 h wymienić pożywkę na roztwór indukujący i powtórzyć kroki 8.1.2-8.1.3. Roztwory indukujące należy przygotowywać codziennie na świeżo i uzupełniać co 24 h w trakcie trwania eksperymentu, który zazwyczaj trwa 48-72 h.
  2. Inkubacja z prototypowym substratem (testosteronem)
    1. W dniu zbioru przygotować roztwór substratu sondy z testosteronem wraz z odpowiednimi induktorami w Advanced DMEM/F12, aby uzyskać końcowe stężenie 20 µM. Pominąć dodawanie serum do pożywki, ponieważ może ono zakłócać analizę LCMS.
    2. Przenieść tacki do BSC i odpompować pożywkę dozującą ze wszystkich zbiorników. Przemyć i zastąpić zawartość górnych i dolnych zbiorników wlotowych odpowiednio ciepłą pożywką Advanced DMEM/F12 i pożywką do wzrostu komórek śródbłonka.
    3. Usunąć pożywkę płuczącą ze zbiorników i zastąpić ją 1 mL roztworu substratu sondy przygotowanego w kroku 8.2.1. Przepłukać chipy przy wysokim natężeniu przepływu 1 0 µL/h przez 5 min, a następnie odpompować zawartość górnych i dolnych zbiorników wylotowych. Umieścić chipy z powrotem w module hodowlanym i inkubować przez 1 h przy stałym przepływie 30 µL/h.
  3. Analiza danych
    1. Zbiór próbek do analizy LCMS
      1. Odmierzyć 20 µL roztworu zatrzymującego zawierającego acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym do wcześniej oznakowanych probówek 1,5 mL i umieścić je na lodzie. Skład roztworu zatrzymującego LCMS może się różnić w zależności od analizowanego substratu.
      2. Po zakończeniu 1-godzinnej obróbki zatrzymać przepływ i przenieść tacki z powrotem do BSC. Zebrać 10 µL effluentu z górnego zbiornika wylotowego i dodać go do odpowiedniej probówki zawierającej roztwór zatrzymujący (Rycina 2A). Natychmiast umieścić probówki na suchym lodzie. Próbki przechowywać w temperaturze -80°C przed przystąpieniem do analizy.
      3. Wyekstrahować i przeanalizować próbki przy użyciu techniki HPLC lub LC-MS/MS, monitorując tworzenie się metabolitu 6β-hydroksytestosteronu (6β-OH-T). Aktywność enzymu CYP można wyrazić jako pmol/min/mg białka, gdzie pmol odnosi się do ilości utworzonego podczas reakcji metabolitu (6β-OH-T). Całkowitą zawartość białka na chipie (białko; mg) określa się poprzez wykonanie testu Bradforda opisanego w kroku 8.3.2.
        figure-protocol-1
        Krotność indukcji aktywności oblicza się według wzoru: aktywność CYP (indukowana) / aktywność CYP (nośnik).
      4. W przypadku zbierania próbek do analizy mRNA przejść do kroku 8.3.3.
    2. Lizy komórek do analizy ekspresji białek
      UWAGA: Ekstrakcja białek z komórek na chipie jest przeprowadzana przy użyciu buforu do lizy białek, uzupełnionego o inhibitory proteaz i fosfataz (Tabela materiałów). Wyekstrahowane białko jest następnie ilościowo określane za pomocą testu Bradforda i wykorzystywane w dalszych analizach.
      1. Odłączyć chipy od modułów przenośnych i umieścić je w szalce Petriego. Przemyć oba kanały 20 µL sterylnego DPBS.
      2. Zablokować wylot dolnego kanału końcówką filtra do pipety 200 µL. Przełączyć 50 µL roztworu dysocjującego przez dolny kanał i inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej.
      3. Sprawdzić, czy komórki śródbłonka zostały całkowicie ododerwane. Pipetować w górę i w dół 1-2 razy, a następnie usunąć roztwór dysocjujący z kanału. Powtórzyć płukanie.
      4. Zablokować wylot górnego kanału końcówką filtra do pipety 20 µL. Przełączyć 75 µL buforu do lizy białek przez górny kanał. Pozostawić końcówkę pipety włożoną, aby zablokować wlot górnego kanału, i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Pipetować w górę i w dół 5-10 razy i zebrać lizaty komórkowe do wcześniej oznakowanej probówki 1,5 mL.
      5. Powtarzać krok 8.3.2.4 do czasu zaobserwowania całkowitego ododerwania komórek. Zebrać lizaty komórkowe do tej samej probówki 1,5 mL i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
      6. Wyekstrahować frakcję białkową zgodnie ze standardowymi metodami i określić całkowitą ilość białka za pomocą testu Bradforda (Tabela materiałów).
    3. Lizy komórek do analizy ekspresji genów
      ​UWAGA: Lizę komórek na chipie w celu ekstrakcji RNA można przeprowadzić przy użyciu buforu do lizy RNA uzupełnionego o 0,1% 2-merkaptoetanolu (Tabela materiałów). Alternatywnie można zastosować bufor do lizy RNA na bazie fenolu, jeśli wymagana jest wysoka wydajność wysokiej jakości RNA odpowiedniego do analiz NGS i mikromacierzy.
      1. Postępować zgodnie z krokami 8.3.2.1 do 8.3.2.2, aby przygotować chip jelita do lizy.
      2. Zablokować wylot górnego kanału za pomocą końcówki filtra do pipety 200 µL. Przełączyć 150 µL buforu do lizy RNA przez górny kanał. Pozostawić końcówkę pipety włożoną, aby zablokować wlot górnego kanału. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej. W przypadku lizy z użyciem buforu na bazie fenolu zastosować 350 µL odczynnika.
      3. Pipetować w górę i w dół 5-10 razy i zebrać lizaty komórkowe do wcześniej oznakowanej probówki 1,5 mL. Powtórzyć ten krok z kolejnymi 150 µL buforu do lizy RNA i zebrać. Przechowywać lizaty komórkowe w temperaturze -80 °C do czasu analizy. W przypadku późniejszej analizy sekwencjonowania RNA przeprowadzić analizę w ciągu 1 miesiąca od lizy.
      4. Wyekstrahować całkowite RNA z lizatów komórkowych przy użyciu zestawu do oczyszczania RNA.
      5. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję do cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji i wykonać real-time PCR za pomocą termocyklera do real-time PCR oraz odpowiednich starterów i buforu. Ilościowo określić wyniki metodą 2-ΔΔCt.

9. Zaburzenie bariery nabłonkowej przy użyciu cytokin prozapalnych w układzie colon chip

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje zaburzenie bariery nabłonka jelitowego przez cytokinę interferon gamma (IFNγ)26,27,28,29. Cytokina jest podawana do dolnego kanału chipa okrężnicy, ze względu na bazolateralną ekspresję receptora IFNγ na komórkach nabłonka jelitowego.  Bodziec prozapalny wprowadza się do chipa w 5. dniu hodowli, gdy tylko Papp ustabilizuje się poniżej 0,5 x 10-6 cm/s. Podobny schemat dawkowania można zastosować w przypadku innych cytokin prozapalnych i czynników zaburzających barierę.

  1. Stymulacja IFNγ
    1. Przygotuj 100 µg/mL roztworu zapasu IFNγ (Tabela materiałów) w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowywać roztwór zapasowy w temperaturze -80°C w trakcie trwania eksperymentu. Dla każdego eksperymentu należy zawsze używać świeżego roztworu zapasowego IFNγ należy unikać więcej niż trzech cykli zamrażania i rozmrażania.
    2. Przygotowanie IFNγ roztwór dawkujący poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w odgazowanym medium do hodowli komórek śródbłonka w celu uzyskania końcowego stężenia 10-10 ng/mL.
    3. Przenieś tacki do komory BSC, usuń pożywkę z rezerwuarów wlotowych dolnego kanału i zastąp ją 3 ml IFN.γ zawierającą pożywkę. Wymień IFNγ codzienne podawanie medium dawkującego.
    4. Umieść tacki w module inkubacyjnym i przeprowadź perfuzję chipów przy wysokim przepływie wynoszącym 1,000 µL/h przez 5 min w celu zainicjowania IFNγ leczenie. Przywrócić szybkość przepływu do 60 µL/h i kontynuować hodowlę w przepływie.
  2. Analiza danych
    1. Ocena funkcji bariery nabłonkowej. Pozorna przepuszczalność nabłonka (Paplikacja), lub funkcja barierowa, może być mierzona w różnych punktach czasowych hodowli po zastosowaniu IFNγ, w pożywce odpływowej zbiorników wlotowych i wylotowych obu kanałów. Tracer fluorescencyjny należy dodać do pożywki wzrostowej organoidów w kanale górnym 4 h przed oceną PaplikacjaZazwyczaj w charakterze znacznika fluorescencyjnego stosuje się dekstran Cascade Blue o masie 3 kDa, który dodaje się do medium na 24 h przed badaniem.
      1. Wstrzymaj pracę modułu hodowlanego i przenieś tacki do BSC.
      2. Oznakuj i przygotuj czarną płytkę 96-dołkową z 100 µL DPBS na dołek. Używając 200 µL pipeta wielokanałowa, zebrać i dodać 50 µL ścieków ze wszystkich zbiorników do odpowiednich studni (Rycina 2B).
      3. Aby przygotować krzywą wzorcową, należy rozcieńczyć pożywkę zawierającą 100 µg/mL dekstranu 3 kDa Cascade Blue 1:3 w DPBS. Następnie należy wykonać rozcieńczenia seryjne, stosując trzykrotne rozcieńczenie pożywki do wzrostu komórek śródbłonka w DPBS.
      4. Odczytaj fluorescencję przy wzbudzeniu 375 nm i emisji 420 nm przy użyciu czytnika płytek. Wykorzystaj zmierzone wartości OD do obliczenia pozornej przepuszczalności (Paplikacja) w następujący sposób:
        figure-protocol-2
    2. Barwienie immunofluorescencyjne komórek na chipie
      1. Płukać za pomocą 200 µL DPBS dla każdego kanału, trzykrotnie.
      2. Perfunduj 200 µL roztworu utrwalającego (4% PFA w DPBS) w każdym kanale. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
      3. Powtórzyć etap płukania 9.2.2.1. Na tym etapie wypłukane chipy można przechowywać przez maksymalnie 7 dni w 4°C.
      4. Przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 200 µL roztworu permeabilizującego (0,1% Triton-X 10 w 10% normalnym surowicy osła (NDS) w DPBS) dla każdego kanału. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Powtórzyć krok płukania 9.2.2.1.
      5. Zablokuj komórki na chipie, używając 200 µL roztworu blokującego (10% NDS w DPBS) dla każdego kanału. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
      6. Rozcieńcz przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze do przeciwciał (5% NDS w DPBS) w następujący sposób: anty-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:10, marker połączeń ścisłych nabłonka), anty-okludyna (1:10, marker połączeń ścisłych nabłonka), anty-claudyna 4 (1:10, marker połączeń ścisłych nabłonka), anty-E-kadheryna (1:10, marker połączeń przylegających nabłonka (Tabela materiałów). Przepłucz 200 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przez każdy kanał i inkubować przez noc w temperaturze 4 °CPowtórz etap płukania 9.2.2.1.
      7. Rozcieńczyć przeciwciała wtórne w roztworze przeciwciał (1:300, 5% NDS w DPBS). Przeprowadzić perfuzję 200 µL przeciągnąć ten roztwór przez każdy kanał i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap płukania 9.2.2.1. Jeśli jest to wymagane, do roztworu przeciwciał wtórnych można dodać faloidynę, będącą markerem cytoszkieletu.
      8. Przygotuj 50 µg/mL z 4′roztwór 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w DPBS i użyć go do perfuzji 200 µL przez każdy kanał. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. Powtórzyć etap płukania. Na tym etapie zabarwione chipy można przechowywać do 14 dni w 4°C.
    3. Ocena rozszczepienia kaspazy 3
      1. Wyizolować i oznaczyć całkowitą ilość białka komórek nabłonkowych zgodnie z opisem w kroku 8.3.2. Pominąć etap płukania 8.3.2.1. Próbki rozcieńczyć DPBS do stężenia końcowego wynoszącego 400 µg/mL.
      2. Ilościowo oznacz poziomy całkowitej i rozszczepionej kaspazy 3 za pomocą zestawu do detekcji kaspazy 3 zgodnie z protokołem producenta.
    4. Ocena wydzielania cytokin prozapalnych
      1. Należy wykorzystać odpływy zebrane z wylotu obu kanałów chipa jelita grubego do ilościowego oznaczenia wydzielanych prozapalnych cytokin ostrej fazy, zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta. W przypadku zestawu V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit należy wykonać 5-krotne rozcieńczenie, a w przypadku V-PLEX Human Proinflammatory Panel II rozcieńczenie dwukrotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1D podsumowuje harmonogram hodowli na chipie jelitowym i ilustruje komórki śródbłonka jelitowego oraz organoidy przed i po wysianiu na chipie. Co więcej, pokazuje on wyraźne różnice morfologiczne między chipami dwunastniczymi a okrężniczymi, podkreślone przez obecność struktur przypominających kosmki w chipie dwunastniczym, co jest reprezentatywne dla architektury jelita cienkiego.

Rycina 3A,B przedstawia krot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Połączenie technologii narządów na chipie i organoidów jelitowych daje nadzieję na dokładne modelowanie fizjologii i patofizjologii jelit człowieka. W tym miejscu przedstawiamy prosty i solidny protokół krok po kroku (opisany na rysunku 1) do tworzenia chipa jelitowego zawierającego nabłonek jelita cienkiego lub okrężnicy pochodzący z biopsji oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego jelita grubego hodowane wspólnie w urządzeniu mikroprzepływowym. Ta oparta na chipie symulacja ludzkiego jeli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi i Magdalena Kasendra są obecnymi lub byłymi pracownikami Emulate Inc. i mogą posiadać udziały. Emulate Inc. to firma, która produkuje chipy narządowe i opublikowała patenty związane z pracą opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Dziękujemy profesorowi Markowi Donowitzowi za dostarczenie organoidów pochodzących z biopsji jelitowej oraz Brettowi Clairowi za zaprojektowanie naukowych ilustracji modułu chip, przenośnego i hodowlanego. Cała reszta ilustracji naukowych została wygenerowana za pomocą BioRenderu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
jelito cienkie Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonkaAlphaBioRegenALHE150,5 komórek M/ml; kriokonserwowana
okrężnica Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka jelitowegoAlphaBioRegenALHE160,5 komórki M/ml; kriokonserwowane
organoidy dwunastnicy pochodzące z biopsjiHopkin's University-Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329).
Organoidy jelita grubego pochodzące z biopsjiUniwersytet Johna Hopkina-Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329).
Zoë CM-1 i handel;   Moduł kulturyEmulacja Inc.-Moduł kulturowy
Orb-HM1 i handel;   Emulacja modułu koncentratora Inc.-5% CO2, rozciąganie próżniowe i zasilanie
Chip-S1&handel; Rozciągliwy chipemulacyjny Inc.-Organ-Chip
Pod&handel; Emulacja modułów przenośnych Inc.-Przenośny moduł
UV Light BoxEmulate Inc.--
Emulacja kołyski na wióry Inc.-1 za kwadrat naczynia hodowlanego
Steriflip®-HV FiltersEMD MilliporeSE1M003M000,45  μ m  Filtr PVDF
Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych (120 x 120 mm)VWR82051-068-Ręczny
  próżnia  aspiratorCorning4930 -
Zasysający  pipety Corning / Falcon3575582 mL,  polistyren, indywidualnie  owinięte
Końcówki zasysające -Sterylne (autoklawowane)
Serologiczne  pipety -2 mL, 5 mL,  10 ml,  oraz  25 ml  niska endotoksyna, sterylna
PipetaP20, P200,  P1000  i standardowa pipeta wielokanałowa
  Porady P20, P200,  oraz  P1000.
Rury stożkowe ( Białko  LoBind® Dętki)Eppendorf0030122216;   0030122240Probówki 15 mL, 50 ml
Eppendorf  Dętki®   lo-bindEppendorf022431081probówki 1,5 ml
96 dołków płytka o czarnych ściankach-do analizy przepuszczalności nabłonka
Mikroskop (z kamerą)-Do jasnego pola  obrazowanie
Kąpiel wodna (lub koraliki)-Ustaw na 37° C
Konfiguracja próżni  --Minimum  ciśnienie: -70 kPa
Skrobaki do komórek KolbyBiotium220033
T75BD Falcon353136Kolba do hodowli komórkowych
Emuluj odczynnik-1 ( ER-1)Emuluj Inc.-Roztwór do powlekania wiórów
Emuluj odczynnik-2 ( ER-2)Emuluj Inc.-Roztwór do powlekania wiórów
Dulbecco' s PBS  (DPBS)Corning21-031-CV1X
Klasa hodowli komórkowej WodaCorningMT25055CV
Trypan niebieskiSigma93595Do liczenia komórek
TryplE  EkspresowyThermoFisher  Organoidy 12604013 naukowe  dysocjacja  i komórki śródbłonka  Oderwanie  rozwiązanie
Zaawansowany DMEM/F12ThermoFisher  Naukowe12634028Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human)Stem Cell technologies06010Pożywka do wzrostu organoidów
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2PromocellC-22121Podłoże śródbłonkowe
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF4135Serum
Primocin™  Środek przeciwdrobnoustrojowyInvivoGenANT-PM-1
Czynnik przyłączenia i handel;Cell Systems4Z0-210roztwór powlekający do kolby
Matrigel - Obniżony czynnik wzrostuCorning356231Solubilizowana matryca błony podstawnej
Kolagen IVSigmaC5533Składnik ECM
FibronektynaCorning356008Składnik ECM
Y-27632Technologie komórek macierzystych72304suplement podłoża organoidowego
CHIR99021Reprocell04-0004-10Suplement na podłoża organoidowe
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253Podstawa roztwór dysocjacji macierzy mebranowej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA957630%, sterylna
woda klasy hodowli komórkowejCorningMT25055CVsterylna, woda
DMSOSigmaD2650rozpuszczalnik
3KDa Dextran Cascade BlueInvitrogenD713210 mg proszek
Ryfampicyna (RIF)SigmaCat# R3501Induktor CYP
Hydrat testosteronuSigmaT1500Podłoże CYP
1,25-dihyroksy Witamina D3 (VD3)SigmaCat# D1530Induktor CYP
Acetonitryl z 0,1% (v/v) Kwas mrówkowySigma159002Rozwiązanie zatrzymujące LCMS
IFNγPeprotech300-02
4% Paraformaldehyd (PFA)EMS157-4Utrwalacz
Triton-X 100SigmaT8787
Normalna surowica osła (NDS)Sigma566460
antyokludynaThermoFisher  Scientific33-1500marker do szczelnych skrzyżowań
anty-Claudin 4ThermoFisher  Scientific36-4800marker połączeń ścisłych
anty-E-kadherynaAbcamab1416marker połączeń przylegających do nabłonka
anty-VE-kadherynaAbcamab33168marker połączeń przylegających do śródbłonka
anty- Zonula Occludens 1 (ZO-1)połączeń szczelnychThermo Fischer339194
DAPIThermoFisher  Scientific62248barwienie jądrowe
2-merkaptoetanolSigmaM6250
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183020zestaw do lizy, izolacji i oczyszczania RNA
SuperScript&handel; IV VILO&handel; Master MixInvitrogen11756050zestaw do odwrotnej transkryptazy
TaqMan™ Szybki zaawansowany odczynnik Master MixApplied Biosystems4444557qPCR
QuantStudio™ 5 System PCR w czasie rzeczywistymApplied BiosystemsA28573Cykler do PCR w czasie rzeczywistym
Starter 18SThermoFisher ScientificHs99999901_s1Starter eukariotyczny 18S rRNA
CYP3A4ThermoFisher ScientificHs00604506_m1Cytochrome  rodzina 3 podrodzina A członek 4
Pierce™ Zestaw testowy Coomassie Plus (Bradford)ThermoFisher Scientific23236Zestaw do oznaczania ilościowego białek
Bufor do lizy MSD TrisDiagnostyka w skali mezoR60TX-3Bufor do lizy białek
Zestaw lizatu całokomórkowego rozszczepionego/całkowitego kaspazy-3 Diagnostyka wskali mezoK15140DZestaw do wykrywania kaspazy 3
V-PLEX Panel urazów naczyniowych 2 Zestaw dla ludziDiagnostyka w skali mezoK15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)Diagnostyka w skali mezo K15053D
Mikroskop konfokalnyZeiss LSM 880Zeiss
LD plan-Neofluar 20x/0,40 Korr M27Soczewki obiektywowe dalekiego zasięguZeiss-20X
Zeiss AXIOvert.A1MikroskopZeiss-Brightfield
Zeiss LD A-Plan 10X/0,25 Ph1Soczewki obiektywowe Zeiss-10X
jelitowego John Marker

Bibliografia

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761(2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135(2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43(2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106(2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chip jelitowybariera jelitowamonowarstwa nab onkowaprzepuszczalno parakom rkowametabolizm lek windukcja CYP3A4interakcja gospodarz mikrobinterferon gamma
Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.