Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

26K wyświetleń

DOI:

10.3791/63724

5 maja 2022

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Streszczenie

Błona śluzowa jelit to złożona fizyczna i biochemiczna bariera, która spełnia mnóstwo ważnych funkcji. Umożliwia transport, wchłanianie i metabolizm składników odżywczych i ksenobiotyków, ułatwiając jednocześnie symbiotyczny związek z mikrobiotą i ograniczając inwazję mikroorganizmów. Interakcja funkcjonalna między różnymi typami komórek oraz ich środowiskiem fizycznym i biochemicznym jest niezbędna do ustanowienia i utrzymania homeostazy tkanek jelitowych. Modelowanie tych złożonych interakcji i zintegrowana fizjologia jelit in vitro to ogromny cel, który może zmienić sposób, w jaki odkrywane i opracowywane są nowe cele terapeutyczne i kandydaci na leki.

Technologie organoidów i Organ-on-a-Chip zostały ostatnio połączone w celu wygenerowania istotnych dla człowieka chipów jelitowych, odpowiednich do badania funkcjonalnych aspektów fizjologii i patofizjologii jelit in vitro. Organoidy pochodzące z biopsji jelita cienkiego (dwunastnicy) i jelita grubego są umieszczane w górnej komorze chipa narządu, a następnie z powodzeniem rozszerzają się jako monowarstwy, zachowując jednocześnie wyraźne cechy komórkowe, molekularne i funkcjonalne każdego regionu jelita. Specyficzne dla tkanki jelita ludzkiego mikronaczyniowe komórki śródbłonka są wbudowane w dolny przedział chipa narządu, aby odtworzyć interfejs nabłonkowo-śródbłonkowy. Ta nowatorska platforma ułatwia ekspozycję światła na składniki odżywcze, leki i mikroorganizmy, umożliwiając badania transportu jelitowego, przepuszczalności i interakcji gospodarz-mikroorganizm.

Tutaj podano szczegółowy protokół tworzenia chipów jelitowych reprezentujących ludzką dwunastnicę (chip dwunastnicy) i okrężnicy (chip jelita grubego), a następnie ich hodowlę pod ciągłym przepływem i deformacjami podobnymi do perystaltyki. Przedstawiono metody oceny metabolizmu leków i indukcji CYP3A4 w chipie dwunastnicy z wykorzystaniem prototypowych induktorów i substratów. Na koniec przedstawiamy procedurę krok po kroku do modelowania in vitro przerwania bariery za pośrednictwem interferonu gamma (IFNγ) w chipie jelita grubego, w tym metody oceny zmiany przepuszczalności parakomórkowej, zmiany w wydzielaniu cytokin i profilowanie transkryptomiczne komórek w chipie.

Wprowadzenie

Ludzkie jelito jest złożonym i wielozadaniowym organem zdolnym do samoregeneracji. Dzieli się na jelito cienkie i grube. Podstawową funkcją jelita cienkiego jest dalsze trawienie pokarmu pochodzącego z żołądka, wchłanianie wszystkich składników odżywczych i przekazywanie pozostałości do jelita grubego, które odzyskuje wodę i elektrolity. Jelito cienkie jest dalej podzielone na wiele anatomicznie odrębnych regionów: dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, z których każdy jest przystosowany do pełnienia określonych funkcji. Na przykład dwunastnica pomaga w rozkładzie treści pokarmowej (treści żołądkowej), aby umożliwić prawidłowe wchłanianie składników odżywczych zawi....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe należy prowadzić z zachowaniem odpowiedniej techniki aseptycznej.

Ludzkie organoidy jelita wykorzystane w niniejszym badaniu zostały pozyskane z Uniwersytetu Johns Hopkins, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (Institutional Review Board) Uniwersytetu Johns Hopkins (IRB #NA 038329).

1. Przygotowanie odczynników do hodowli komórkowej

  1. Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów zgodnie z instrukcj....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1D podsumowuje harmonogram hodowli na chipie jelitowym i ilustruje komórki śródbłonka jelitowego oraz organoidy przed i po wysianiu na chipie. Co więcej, pokazuje on wyraźne różnice morfologiczne między chipami dwunastniczymi a okrężniczymi, podkreślone przez obecność struktur przypominających kosmki w chipie dwunastniczym, co jest reprezentatywne dla architektury jelita cienkiego.

Rycina 3A,B przedstawia krot.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Połączenie technologii narządów na chipie i organoidów jelitowych daje nadzieję na dokładne modelowanie fizjologii i patofizjologii jelit człowieka. W tym miejscu przedstawiamy prosty i solidny protokół krok po kroku (opisany na rysunku 1) do tworzenia chipa jelitowego zawierającego nabłonek jelita cienkiego lub okrężnicy pochodzący z biopsji oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego jelita grubego hodowane wspólnie w urządzeniu mikroprzepływowym. Ta oparta na chipie symulacja ludzkiego jeli.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi i Magdalena Kasendra są obecnymi lub byłymi pracownikami Emulate Inc. i mogą posiadać udziały. Emulate Inc. to firma, która produkuje chipy narządowe i opublikowała patenty związane z pracą opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Dziękujemy profesorowi Markowi Donowitzowi za dostarczenie organoidów pochodzących z biopsji jelitowej oraz Brettowi Clairowi za zaprojektowanie naukowych ilustracji modułu chip, przenośnego i hodowlanego. Cała reszta ilustracji naukowych została wygenerowana za pomocą BioRenderu.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
jelito cienkie Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonkaAlphaBioRegenALHE150,5 komórek M/ml; kriokonserwowana
okrężnica Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka jelitowegoAlphaBioRegenALHE160,5 komórki M/ml; kriokonserwowane
organoidy dwunastnicy pochodzące z biopsjiHopkin's University-Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329).
Organoidy jelita grubego pochodzące z biopsjiUniwersytet Johna Hopkina-Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329).
Zoë CM-1 i handel;   Moduł kulturyEmulacja Inc.-Moduł kulturowy
Orb-HM1 i handel;   Emulacja modułu koncentratora Inc.-5% CO2, rozciąganie próżniowe i zasilanie
Chip-S1&handel; Rozciągliwy chipemulacyjny Inc.-Organ-Chip
Pod&handel; Emulacja modułów przenośnych Inc.-Przenośny moduł
UV Light BoxEmulate Inc.--
Emulacja kołyski na wióry Inc.-1 za kwadrat naczynia hodowlanego
Steriflip®-HV FiltersEMD MilliporeSE1M003M000,45  μ m  Filtr PVDF
Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych (120 x 120 mm)VWR82051-068-Ręczny
  próżnia  aspiratorCorning4930 -
Zasysający  pipety Corning / Falcon3575582 mL,  polistyren, indywidualnie  owinięte
Końcówki zasysające -Sterylne (autoklawowane)
Serologiczne  pipety -2 mL, 5 mL,  10 ml,  oraz  25 ml  niska endotoksyna, sterylna
PipetaP20, P200,  P1000  i standardowa pipeta wielokanałowa
  Porady P20, P200,  oraz  P1000.
Rury stożkowe ( Białko  LoBind® Dętki)Eppendorf0030122216;   0030122240Probówki 15 mL, 50 ml
Eppendorf  Dętki®   lo-bindEppendorf022431081probówki 1,5 ml
96 dołków płytka o czarnych ściankach-do analizy przepuszczalności nabłonka
Mikroskop (z kamerą)-Do jasnego pola  obrazowanie
Kąpiel wodna (lub koraliki)-Ustaw na 37° C
Konfiguracja próżni  --Minimum  ciśnienie: -70 kPa
Skrobaki do komórek KolbyBiotium220033
T75BD Falcon353136Kolba do hodowli komórkowych
Emuluj odczynnik-1 ( ER-1)Emuluj Inc.-Roztwór do powlekania wiórów
Emuluj odczynnik-2 ( ER-2)Emuluj Inc.-Roztwór do powlekania wiórów
Dulbecco' s PBS  (DPBS)Corning21-031-CV1X
Klasa hodowli komórkowej WodaCorningMT25055CV
Trypan niebieskiSigma93595Do liczenia komórek
TryplE  EkspresowyThermoFisher  Organoidy 12604013 naukowe  dysocjacja  i komórki śródbłonka  Oderwanie  rozwiązanie
Zaawansowany DMEM/F12ThermoFisher  Naukowe12634028Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human)Stem Cell technologies06010Pożywka do wzrostu organoidów
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2PromocellC-22121Podłoże śródbłonkowe
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF4135Serum
Primocin™  Środek przeciwdrobnoustrojowyInvivoGenANT-PM-1
Czynnik przyłączenia i handel;Cell Systems4Z0-210roztwór powlekający do kolby
Matrigel - Obniżony czynnik wzrostuCorning356231Solubilizowana matryca błony podstawnej
Kolagen IVSigmaC5533Składnik ECM
FibronektynaCorning356008Składnik ECM
Y-27632Technologie komórek macierzystych72304suplement podłoża organoidowego
CHIR99021Reprocell04-0004-10Suplement na podłoża organoidowe
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253Podstawa roztwór dysocjacji macierzy mebranowej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA957630%, sterylna
woda klasy hodowli komórkowejCorningMT25055CVsterylna, woda
DMSOSigmaD2650rozpuszczalnik
3KDa Dextran Cascade BlueInvitrogenD713210 mg proszek
Ryfampicyna (RIF)SigmaCat# R3501Induktor CYP
Hydrat testosteronuSigmaT1500Podłoże CYP
1,25-dihyroksy Witamina D3 (VD3)SigmaCat# D1530Induktor CYP
Acetonitryl z 0,1% (v/v) Kwas mrówkowySigma159002Rozwiązanie zatrzymujące LCMS
IFNγPeprotech300-02
4% Paraformaldehyd (PFA)EMS157-4Utrwalacz
Triton-X 100SigmaT8787
Normalna surowica osła (NDS)Sigma566460
antyokludynaThermoFisher  Scientific33-1500marker do szczelnych skrzyżowań
anty-Claudin 4ThermoFisher  Scientific36-4800marker połączeń ścisłych
anty-E-kadherynaAbcamab1416marker połączeń przylegających do nabłonka
anty-VE-kadherynaAbcamab33168marker połączeń przylegających do śródbłonka
anty- Zonula Occludens 1 (ZO-1)połączeń szczelnychThermo Fischer339194
DAPIThermoFisher  Scientific62248barwienie jądrowe
2-merkaptoetanolSigmaM6250
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183020zestaw do lizy, izolacji i oczyszczania RNA
SuperScript&handel; IV VILO&handel; Master MixInvitrogen11756050zestaw do odwrotnej transkryptazy
TaqMan™ Szybki zaawansowany odczynnik Master MixApplied Biosystems4444557qPCR
QuantStudio™ 5 System PCR w czasie rzeczywistymApplied BiosystemsA28573Cykler do PCR w czasie rzeczywistym
Starter 18SThermoFisher ScientificHs99999901_s1Starter eukariotyczny 18S rRNA
CYP3A4ThermoFisher ScientificHs00604506_m1Cytochrome  rodzina 3 podrodzina A członek 4
Pierce™ Zestaw testowy Coomassie Plus (Bradford)ThermoFisher Scientific23236Zestaw do oznaczania ilościowego białek
Bufor do lizy MSD TrisDiagnostyka w skali mezoR60TX-3Bufor do lizy białek
Zestaw lizatu całokomórkowego rozszczepionego/całkowitego kaspazy-3 Diagnostyka wskali mezoK15140DZestaw do wykrywania kaspazy 3
V-PLEX Panel urazów naczyniowych 2 Zestaw dla ludziDiagnostyka w skali mezoK15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)Diagnostyka w skali mezo K15053D
Mikroskop konfokalnyZeiss LSM 880Zeiss
LD plan-Neofluar 20x/0,40 Korr M27Soczewki obiektywowe dalekiego zasięguZeiss-20X
Zeiss AXIOvert.A1MikroskopZeiss-Brightfield
Zeiss LD A-Plan 10X/0,25 Ph1Soczewki obiektywowe Zeiss-10X
jelitowego John Marker

Bibliografia

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chip jelitowybariera jelitowamonowarstwa nab onkowaprzepuszczalno parakom rkowametabolizm lek windukcja CYP3A4interakcja gospodarz mikrobinterferon gamma