Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Błona śluzowa jelit to złożona fizyczna i biochemiczna bariera, która spełnia mnóstwo ważnych funkcji. Umożliwia transport, wchłanianie i metabolizm składników odżywczych i ksenobiotyków, ułatwiając jednocześnie symbiotyczny związek z mikrobiotą i ograniczając inwazję mikroorganizmów. Interakcja funkcjonalna między różnymi typami komórek oraz ich środowiskiem fizycznym i biochemicznym jest niezbędna do ustanowienia i utrzymania homeostazy tkanek jelitowych. Modelowanie tych złożonych interakcji i zintegrowana fizjologia jelit in vitro to ogromny cel, który może zmienić sposób, w jaki odkrywane i opracowywane są nowe cele terapeutyczne i kandydaci na leki.
Technologie organoidów i Organ-on-a-Chip zostały ostatnio połączone w celu wygenerowania istotnych dla człowieka chipów jelitowych, odpowiednich do badania funkcjonalnych aspektów fizjologii i patofizjologii jelit in vitro. Organoidy pochodzące z biopsji jelita cienkiego (dwunastnicy) i jelita grubego są umieszczane w górnej komorze chipa narządu, a następnie z powodzeniem rozszerzają się jako monowarstwy, zachowując jednocześnie wyraźne cechy komórkowe, molekularne i funkcjonalne każdego regionu jelita. Specyficzne dla tkanki jelita ludzkiego mikronaczyniowe komórki śródbłonka są wbudowane w dolny przedział chipa narządu, aby odtworzyć interfejs nabłonkowo-śródbłonkowy. Ta nowatorska platforma ułatwia ekspozycję światła na składniki odżywcze, leki i mikroorganizmy, umożliwiając badania transportu jelitowego, przepuszczalności i interakcji gospodarz-mikroorganizm.
Tutaj podano szczegółowy protokół tworzenia chipów jelitowych reprezentujących ludzką dwunastnicę (chip dwunastnicy) i okrężnicy (chip jelita grubego), a następnie ich hodowlę pod ciągłym przepływem i deformacjami podobnymi do perystaltyki. Przedstawiono metody oceny metabolizmu leków i indukcji CYP3A4 w chipie dwunastnicy z wykorzystaniem prototypowych induktorów i substratów. Na koniec przedstawiamy procedurę krok po kroku do modelowania in vitro przerwania bariery za pośrednictwem interferonu gamma (IFNγ) w chipie jelita grubego, w tym metody oceny zmiany przepuszczalności parakomórkowej, zmiany w wydzielaniu cytokin i profilowanie transkryptomiczne komórek w chipie.
Wprowadzenie
Ludzkie jelito jest złożonym i wielozadaniowym organem zdolnym do samoregeneracji. Dzieli się na jelito cienkie i grube. Podstawową funkcją jelita cienkiego jest dalsze trawienie pokarmu pochodzącego z żołądka, wchłanianie wszystkich składników odżywczych i przekazywanie pozostałości do jelita grubego, które odzyskuje wodę i elektrolity. Jelito cienkie jest dalej podzielone na wiele anatomicznie odrębnych regionów: dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, z których każdy jest przystosowany do pełnienia określonych funkcji. Na przykład dwunastnica pomaga w rozkładzie treści pokarmowej (treści żołądkowej), aby umożliwić prawidłowe wchłanianie składników odżywczych zawi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe należy prowadzić z zachowaniem odpowiedniej techniki aseptycznej.
Ludzkie organoidy jelita wykorzystane w niniejszym badaniu zostały pozyskane z Uniwersytetu Johns Hopkins, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (Institutional Review Board) Uniwersytetu Johns Hopkins (IRB #NA 038329).
1. Przygotowanie odczynników do hodowli komórkowej
- Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów zgodnie z instrukcj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1D podsumowuje harmonogram hodowli na chipie jelitowym i ilustruje komórki śródbłonka jelitowego oraz organoidy przed i po wysianiu na chipie. Co więcej, pokazuje on wyraźne różnice morfologiczne między chipami dwunastniczymi a okrężniczymi, podkreślone przez obecność struktur przypominających kosmki w chipie dwunastniczym, co jest reprezentatywne dla architektury jelita cienkiego.
Rycina 3A,B przedstawia krot.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Połączenie technologii narządów na chipie i organoidów jelitowych daje nadzieję na dokładne modelowanie fizjologii i patofizjologii jelit człowieka. W tym miejscu przedstawiamy prosty i solidny protokół krok po kroku (opisany na rysunku 1) do tworzenia chipa jelitowego zawierającego nabłonek jelita cienkiego lub okrężnicy pochodzący z biopsji oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego jelita grubego hodowane wspólnie w urządzeniu mikroprzepływowym. Ta oparta na chipie symulacja ludzkiego jeli.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi i Magdalena Kasendra są obecnymi lub byłymi pracownikami Emulate Inc. i mogą posiadać udziały. Emulate Inc. to firma, która produkuje chipy narządowe i opublikowała patenty związane z pracą opisaną w tym artykule.
Podziękowania
Dziękujemy profesorowi Markowi Donowitzowi za dostarczenie organoidów pochodzących z biopsji jelitowej oraz Brettowi Clairowi za zaprojektowanie naukowych ilustracji modułu chip, przenośnego i hodowlanego. Cała reszta ilustracji naukowych została wygenerowana za pomocą BioRenderu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| jelito cienkie Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0,5 komórek M/ml; kriokonserwowana |
| okrężnica Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka jelitowego | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0,5 komórki M/ml; kriokonserwowane |
| organoidy dwunastnicy pochodzące z biopsji | Hopkin's University | - | Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329). |
| Organoidy jelita grubego pochodzące z biopsji | Uniwersytet Johna Hopkina | - | Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329). |
| Zoë CM-1 i handel; Moduł kultury | Emulacja Inc. | - | Moduł kulturowy |
| Orb-HM1 i handel; Emulacja modułu koncentratora | Inc. | - | 5% CO2, rozciąganie próżniowe i zasilanie |
| Chip-S1&handel; Rozciągliwy chip | emulacyjny Inc. | - | Organ-Chip |
| Pod&handel; Emulacja modułów przenośnych | Inc. | - | Przenośny moduł |
| UV Light Box | Emulate Inc. | - | - |
| Emulacja kołyski na wióry | Inc. | - | 1 za kwadrat naczynia hodowlanego |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0,45 μ m Filtr PVDF |
| Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068-Ręczny | |
| próżnia aspirator | Corning | 4930 | - |
| Zasysający | pipety Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polistyren, indywidualnie owinięte |
| Końcówki zasysające | - | Sterylne (autoklawowane) | |
| Serologiczne pipety | - | 2 mL, 5 mL, 10 ml, oraz 25 ml niska endotoksyna, sterylna | |
| Pipeta | P20, P200, P1000 i standardowa pipeta wielokanałowa | ||
| Porady | P20, P200, oraz P1000. | ||
| Rury stożkowe ( Białko LoBind® Dętki) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | Probówki 15 mL, 50 ml |
| Eppendorf Dętki® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | probówki 1,5 ml |
| 96 dołków płytka o czarnych ściankach | - | do analizy przepuszczalności nabłonka | |
| Mikroskop (z kamerą) | - | Do jasnego pola obrazowanie | |
| Kąpiel wodna (lub koraliki) | - | Ustaw na 37° C | |
| Konfiguracja próżni | - | - | Minimum ciśnienie: -70 kPa |
| Skrobaki do komórek Kolby | Biotium | 220033 | |
| T75 | BD Falcon | 353136 | Kolba do hodowli komórkowych |
| Emuluj odczynnik-1 ( ER-1) | Emuluj Inc. | - | Roztwór do powlekania wiórów |
| Emuluj odczynnik-2 ( ER-2) | Emuluj Inc. | - | Roztwór do powlekania wiórów |
| Dulbecco' s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Klasa hodowli komórkowej Woda | Corning | MT25055CV | |
| Trypan niebieski | Sigma | 93595 | Do liczenia komórek |
| TryplE Ekspresowy | ThermoFisher Organoidy 12604013 naukowe | dysocjacja i komórki śródbłonka Oderwanie rozwiązanie | |
| Zaawansowany DMEM/F12 | ThermoFisher Naukowe | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Pożywka do wzrostu organoidów |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2 | Promocell | C-22121 | Podłoże śródbłonkowe |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | Środek przeciwdrobnoustrojowy | InvivoGen | ANT-PM-1 |
| Czynnik przyłączenia i handel; | Cell Systems | 4Z0-210 | roztwór powlekający do kolby |
| Matrigel - Obniżony czynnik wzrostu | Corning | 356231 | Solubilizowana matryca błony podstawnej |
| Kolagen IV | Sigma | C5533 | Składnik ECM |
| Fibronektyna | Corning | 356008 | Składnik ECM |
| Y-27632 | Technologie komórek macierzystych | 72304 | suplement podłoża organoidowego |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | Suplement na podłoża organoidowe |
| Roztwór do odzyskiwania komórek | Corning | 354253 | Podstawa roztwór dysocjacji macierzy mebranowej |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, sterylna |
| woda klasy hodowli komórkowej | Corning | MT25055CV | sterylna, woda |
| DMSO | Sigma | D2650 | rozpuszczalnik |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg proszek |
| Ryfampicyna (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | Induktor CYP |
| Hydrat testosteronu | Sigma | T1500 | Podłoże CYP |
| 1,25-dihyroksy Witamina D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | Induktor CYP |
| Acetonitryl z 0,1% (v/v) Kwas mrówkowy | Sigma | 159002 | Rozwiązanie zatrzymujące LCMS |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyd (PFA) | EMS | 157-4 | Utrwalacz |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normalna surowica osła (NDS) | Sigma | 566460 | |
| antyokludyna | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | marker do szczelnych skrzyżowań |
| anty-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | marker połączeń ścisłych |
| anty-E-kadheryna | Abcam | ab1416 | marker połączeń przylegających do nabłonka |
| anty-VE-kadheryna | Abcam | ab33168 | marker połączeń przylegających do śródbłonka |
| anty- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | połączeń szczelnych | Thermo Fischer | 339194 |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | barwienie jądrowe |
| 2-merkaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | zestaw do lizy, izolacji i oczyszczania RNA |
| SuperScript&handel; IV VILO&handel; Master Mix | Invitrogen | 11756050 | zestaw do odwrotnej transkryptazy |
| TaqMan™ Szybki zaawansowany odczynnik Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR |
| QuantStudio™ 5 System PCR w czasie rzeczywistym | Applied Biosystems | A28573 | Cykler do PCR w czasie rzeczywistym |
| Starter 18S | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Starter eukariotyczny 18S rRNA |
| CYP3A4 | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome rodzina 3 podrodzina A członek 4 |
| Pierce™ Zestaw testowy Coomassie Plus (Bradford) | ThermoFisher Scientific | 23236 | Zestaw do oznaczania ilościowego białek |
| Bufor do lizy MSD Tris | Diagnostyka w skali mezo | R60TX-3 | Bufor do lizy białek |
| Zestaw lizatu całokomórkowego rozszczepionego/całkowitego kaspazy-3 Diagnostyka w | skali mezo | K15140D | Zestaw do wykrywania kaspazy 3 |
| V-PLEX Panel urazów naczyniowych 2 Zestaw dla ludzi | Diagnostyka w skali mezo | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Diagnostyka w skali mezo K15053D | ||
| Mikroskop konfokalny | Zeiss LSM 880 | Zeiss | |
| LD plan-Neofluar 20x/0,40 Korr M27 | Soczewki obiektywowe dalekiego zasięgu | Zeiss-20X | |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Mikroskop | Zeiss-Brightfield | |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0,25 Ph1 | Soczewki obiektywowe Zeiss-10X |
Bibliografia
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
