Artykuł metodologiczny

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

DOI:

10.3791/63735

⸱

4 maja 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas może zapewnić dogłębne pokrycie modyfikacji potranslacyjnych (PTM), chociaż często konieczne jest wzbogacenie tych modyfikacji ze złożonych matryc biologicznych ze względu na ich niską stechiometrię w porównaniu do niemodyfikowanych analitów. Większość procesów wzbogacania PTM na peptydy w procesach proteomiki oddolnej, w których białka są trawione enzymatycznie przed analizą powstałych peptydów, wzbogaca tylko jeden rodzaj modyfikacji. Jednak to cały zestaw PTM prowadzi do funkcji biologicznych, a wzbogacenie pojedynczego typu PTM może przegapić takie przesłuchy PTM. Przesłuchy PTM zaobserwowano między glikozylacją i fosforylacją białek, dwoma najczęstszymi PTM w białkach ludzkich, a także dwoma najczęściej badanymi PTM przy użyciu przepływów pracy spektrometrii mas. Korzystając z opisanej w niniejszym dokumencie strategii jednoczesnego wzbogacania, oba PTM są wzbogacane o pośmiertną ludzką tkankę trzustki, złożoną matrycę biologiczną. Dwufunkcyjna chromatografia powinowactwa do metali immobilizowana Ti(IV) służy do jednoczesnego rozdzielania różnych form glikozylacji i fosforylacji w wielu frakcjach w wygodnej metodzie opartej na końcówce spinowej, umożliwiając dalsze analizy potencjalnych oddziaływań przesłuchów PTM. Ten proces wzbogacania gliko- i fosfopeptydów można zastosować do różnych typów próbek w celu uzyskania głębokiego profilowania wielu PTM i identyfikacji potencjalnych cząsteczek docelowych do przyszłych badań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne białek (PTM) odgrywają główną rolę w modulowaniu struktur białkowych, a co za tym idzie ich funkcji i dalszych procesów biologicznych. Różnorodność ludzkiego proteomu wzrasta wykładniczo ze względu na kombinatoryczną zmienność zapewnianą przez różne PTM. Różne warianty białek z ich kanonicznych sekwencji, zgodnie z przewidywaniami genomu, są znane jako proteoformy, a wiele proteoform powstaje z PTMs1. Badanie różnorodności proteoform w zdrowiu i chorobie stało się obszarem badań o dużym zainteresowaniu w ostatnich latach2,3.

Badanie proteoform, a dokładniej PTM o dużej głębokości, stało się łatwiejsze dzięki rozwojowi metod proteomicznych opartych na spektrometrii mas (MS). Za pomocą MS anality są jonizowane, fragmentowane i identyfikowane na podstawie m/z fragmentów. Metody wzbogacania są często konieczne ze względu na niską względną obfitość PTM w porównaniu z niemodyfikowanymi formami białek. Chociaż analiza nienaruszonych białek i ich PTM, zwana analizami odgórnymi, stała się bardziej rutynowa, trawienie enzymatyczne białek i analiza ich peptydów składowych w analizach oddolnych jest nadal najczęściej stosowaną drogą analizy PTM. Dwa najczęściej badane PTM i dwa najczęściej występujące PTM in vivo to glikozylacja i fosforylacja4. Te dwa PTM odgrywają główną rolę w sygnalizacji komórkowej i rozpoznawaniu, a zatem są ważnymi modyfikacjami do scharakteryzowania w badaniach nad chorobami.

Właściwości chemiczne różnych PTM często dostarczają dróg do wzbogacenia tych PTM na poziomie białka i peptydu przed analizą. Glikozylacja jest hydrofilowym PTM ze względu na obfitość grup hydroksylowych na każdym cuchardzie monosacharydowym. Ta właściwość może być wykorzystana do wzbogacenia glikopeptydów w chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC), która może oddzielić bardziej hydrofilowe glikopeptydy od hydrofobowych niemodyfikowanych peptydów5. Fosforylacja dodaje ugrupowanie fosforanowe, które jest naładowane ujemnie, z wyjątkiem kwaśnego pH. Ze względu na ten ładunek różne kationy metali, w tym tytan, mogą być używane do przyciągania i wiązania fosfopeptydów, podczas gdy gatunki niefosforylowane są wypłukiwane. Jest to zasada działania chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC). Dalsze dyskusje na temat tych i innych strategii wzbogacania glikozylacji i fosforylacji można znaleźć w ostatnich przeglądach6,7.

Często potrzebne są stosunkowo duże ilości wyjściowego materiału peptydowego (0,5 mg lub więcej) do protokołów wzbogacania ze względu na niską stechiometrię PTM na peptydach. W scenariuszach, w których taka ilość próbki może nie być łatwa do uzyskania, takich jak biopsja rdzenia guza lub analiza płynu mózgowo-rdzeniowego, korzystne jest stosowanie łatwych procesów pracy, które skutkują maksymalną ilością informacji biomolekularnych. Ostatnie strategie opracowane przez nasze laboratorium i inne kraje zwróciły uwagę na jednoczesną i równoległą analizę glikozylacji i fosforylacji przy użyciu tego samego przepływu pracy wzbogacania PTM8,9,10,11,12. Chociaż właściwości chemiczne tych dwóch PTM mogą się różnić, mogą one być analizowane w wielu etapach ze względu na innowacyjne techniki separacji i zastosowane materiały. Na przykład chromatografia oddziaływań elektrostatyczno-hydrofilowych (ERLIC) nakłada separacje oparte na oddziaływaniach hydrofilowych między analitami a fazą ruchomą na oddziaływania ładunek-ładunek między analitami a materiałem fazy stacjonarnej13,14,15,16. Przy kwaśnym pH przyciąganie fosforylowanych peptydów do fazy stacjonarnej może poprawić ich zatrzymywanie i oddzielanie od niemodyfikowanych peptydów. Materiał składający się z Ti(IV) unieruchomiony na mikrosferach hydrofilowych może być używany do elucji opartej na HILIC i IMAC w celu oddzielenia fosfopeptydów oraz obojętnych, kwaśnych i fosforylowanych mannozo-6-fosforylowanych glikopeptydów17,18. Strategia ta jest znana jako dwufunkcyjny Ti(IV)-IMAC. Wykorzystanie tych strategii do wzbogacania wielu PTM w jednym przepływie pracy może sprawić, że analizy potencjalnych interakcji przesłuchów PTM będą bardziej dostępne. Ponadto całkowita ilość próbki i wymagania czasowe są mniejsze niż w przypadku konwencjonalnych metod wzbogacania, gdy są wykonywane równolegle (tj. HILIC i IMAC na oddzielnych podwielokrotnościach próbki).

Aby zademonstrować dwufunkcyjną strategię Ti(IV)-IMAC do jednoczesnej analizy glikozylacji i fosforylacji białek, zastosowaliśmy ją do analizy pośmiertnych tkanek ludzkiej trzustki. Trzustka wytwarza zarówno enzymy trawienne, jak i hormony regulatorowe, w tym insulinę i glukagon. Funkcja trzustki jest upośledzona w chorobie trzustki. W cukrzycy zaburzona jest regulacja poziomu cukru we krwi, co prowadzi do wyższego poziomu glukozy we krwi. W zapaleniu trzustki stan zapalny wynika z samoczynnego trawienia narządu3. Zmiany w profilach PTM, w tym glikozylacja i fosforylacja, mogą wynikać, jak to często bywa, w innych chorobach.

Tutaj opisujemy protokół metody jednoczesnego wzbogacania opartej na spin-tip, opartej na dwufunkcyjnej strategii Ti(IV)-IMAC, dla N-glikopeptydów i fosfopeptydów pochodzących z białek ekstrahowanych z tkanki trzustki. Protokół obejmuje ekstrakcję i trawienie białek, wzbogacanie, gromadzenie danych MS i przetwarzanie danych, jak można zobaczyć na Rysunek 1. Reprezentatywne dane z tego badania są dostępne za pośrednictwem ProteomeXchange Consortium z identyfikatorem PXD033065.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przepływ pracy do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki. Tkanki są najpierw kriosproszkowane na drobny proszek przed ekstrakcją białka przy użyciu detergentu dodecylosiarczanu sodu (SDS). Białka są następnie poddawane trawieniu enzymatycznemu. Otrzymane peptydy są porcjowane przed wzbogaceniem przy użyciu dwufunkcyjnego Ti(IV)-IMAC. Surowe dane są zbierane za pomocą nanoskalowej chromatografii cieczowej ze odwróconą fazą i spektrometrią mas (nRPLC-MS) i analizowane za pomocą oprogramowania do przeszukiwania baz danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten protokół ma na celu uczynienie analiz PTM bardziej dostępnymi i umożliwienie szerszej analizy wielu PTM w tym samym przepływie pracy. Protokół ten można zastosować do innych złożonych matryc biologicznych, w tym komórek i płynów biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano zgodę na wykorzystanie tkanek trzustki do badań od najbliższej rodziny zmarłego i uzyskano autoryzację od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Wisconsin-Madison. Nadzór IRB nie jest wymagany, ponieważ nie obejmuje ludzi, jak uznano w 45 CFR 46.102(f).

UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z odczynnikami używanymi w tym protokole, które obejmują kwasy (mrówkowy, octowy, trifluorooctowy), zasady (wodorotlenek amonu) i kriogeny (ciekły azot). Przeczytaj karty charakterystyki stosowanych odczynników, aby zapoznać się z powiązanymi zagrożeniami i niezbędnymi środkami ostrożności. Stężenia oznaczone w procentach to objętość/objętość całkowita (v/v) i są rozcieńczane wodą.

1. Krioproszkowanie tkanek, liza i ekstrakcja białek

  1. Napełnij dewara ciekłym azotem. Wstępnie schłodzić części rozdrabniacza do tkanek, które będą miały kontakt z tkankami trzustki, a mianowicie komorę, rozdrabniacz i łyżkę regeneracyjną w pojemniku z polistyrenu.
  2. Przenieś zamrożone kawałki tkanki do wstępnie schłodzonego uchwytu na próbkę i dodaj łyżkę ciekłego azotu do tkanki.
  3. Umieść rozdrabniacz w komorze i uderz nim młotkiem od pięciu do dziesięciu razy, aby zmiażdżyć próbkę. Wyjmij rozpylacz z komory i zeskrob przylegający proszek i kawałki tkanki.
  4. Dodaj łyżkę ciekłego azotu do komory, jeśli tkanki zaczną się topić. Powtarzaj proces proszkowania, aż próbka stanie się drobnym proszkiem bez dużych kawałków tkanki. Porcjować próbki na porcje o objętości około 100 mg do wstępnie schłodzonych probówek.
  5. Przygotować bufor do lizy zawierający 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 150 mM NaCl i 25 mM Tris (pH = 7,4). Rozpuścić po jednej tabletce proteazy i inhibitora fosfatazy w 500 μl wody, aby uzyskać 20-krotny zapas każdego z nich. Dodaj wymaganą objętość 20x zapasu każdego inhibitora do buforu do lizy, aby uzyskać końcowe stężenie 1x.
  6. Dodać do probówki 600 μl buforu do lizy na 100 mg tkanki i inkubować w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym przez 10 minut z wytrząsaniem przy 800 obr./min. Wyjmij próbki z bloku grzewczego i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.
  7. Sonikuj próbki przy energii 60 W (20 kHz) przez 45 s za pomocą 15-sekundowych impulsów z 30-sekundową przerwą pomiędzy nimi. Osadzać próbki w temperaturze 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Dodać supernatant do 5-krotnego rozpuszczalnika strącającego, 300 μl buforu do lizy do 1,5 ml rozpuszczalnika strącającego, zawierającego 50% acetonu, 49,9% etanolu i 0,1% kwasu octowego. Schłodzić przez noc w temperaturze -20 °C.
  9. Ponownie zagnieździć próbki w temperaturze 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Umyj granulkę, rozbijając ją szpatułką i mieszając z taką samą ilością rozpuszczalnika strącającego. Ponownie osadź peletek, powtarzając krok prania 2x.
  10. Osadzać próbkę w temperaturze 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Próbkę suszyć na powietrzu w dygestorium przez 15 minut i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do dalszych czynności.

2. Trawienie i odsalanie białek

  1. Zawiesić osad białkowy w 300 μl świeżo przygotowanego buforu wytrawiającego zawierającego 50 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i 8 M mocznika.
  2. Oszacować stężenie białka w roztworze za pomocą testu białkowego zgodnie z protokołem producenta.
  3. Do białka w roztworze dodać ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 5 mM, wymieszać i redukować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodaj jodoacetamid (IAA) do końcowego stężenia 15 mM, wymieszaj i alkilatuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Ugasić alkilowanie, powtarzając dodawanie DTT w tej samej objętości co poprzednio i wymieszać.
  4. Dodać LysC/trypsynę w stosunku enzym do białka 1:100 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Następnie dodać 50 mM TEAB w celu rozcieńczenia 8 M mocznika użytego do < 1 M. Dodać trypsynę w stosunku enzym do białka 1:100 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Ugasić trawienie dodatkiem kwasu trifluorooctowego (TFA) do 0,3% v/v. Na każdy 1 mg białka wyjściowego kondycjonuj wkład odsalający (1 cm3, 10 mg) z 1 ml acetonitrylu (ACN) i 3 razy z 1 ml 0,1% TFA.
  6. Załaduj strawioną mieszaninę na wkład odsalający. Przemyj mieszaninę 3x używając 1 ml 0,1% TFA. Jeśli elucja jest powolna, należy zastosować nadciśnienie, ale unikać natężenia przepływu > jednej kropli na sekundę.
  7. Elute peptydy za pomocą 1 ml 60% roztworu ACN i 0,1% roztworu kwasu mrówkowego (FA). Wysuszyć eluowane peptydy w temperaturze około 35 °C za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.
  8. Zawiesić peptydy w 300 μl wody i oszacować stężenia peptydów za pomocą testu peptydowego zgodnie z protokołem producenta. Porcjować peptydy na porcje o objętości 500 μg i całkowicie wysuszyć.

3. Wzbogacenie w N-glikopeptydy ERLIC

UWAGA: Dokładne prędkości i czasy wirówki mogą się różnić w zależności od próbek i muszą być zoptymalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, 300 x g przez 2 minuty jest odpowiednie do kondycjonowania i mycia materiału, a 100 x g przez 5 minut do elucji.

  1. Zważyć około 3 mg waty bawełnianej i zapakować ją do pustej końcówki do pipety o pojemności 200 μl (końcówka wirowa; patrz tabela materiałów).
  2. Przenieść materiał wzbogacający w silną wymianę anionów do probówki i dodać 200 μl 0,1% TFA na 10 mg materiału. Do wzbogacenia 500 μg peptydów należy użyć 15 mg materiału. Aktywuj materiał potrząsając przez 15 minut.
  3. Za pomocą adaptera do probówki umieść końcówkę wirującą na probówce o pojemności 2 ml i dodaj do końcówki wystarczającą ilość zawiesiny na 15 mg materiału. Usuń płyn, obracając go w wirówce stołowej.
  4. Kondycjonować materiał przez odwirowanie 3x z 200 μl ACN. Powtórzyć trzykrotne kondycjonowanie przy użyciu 100 mM octanu amonu (NH4Ac), 1% TFA i 80% ACN/0,1% TFA (bufor ładujący).
  5. Zawiesić 500 μg próbek peptydów w około 200 μl buforu ładującego i przepuścić przez końcówkę wirową. Załaduj ponownie przepływowy 2x, aby zapewnić pełne wiązanie.
  6. Przepłukać materiał przez odwirowanie 5x przy użyciu 200 μL 80% ACN/0,1% TFA, a następnie 2x przy użyciu 200 μL 80% ACN/0,1% FA.
  7. Eluować peptydy przez odwirowanie z 200 μl każdego z poniższych: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. Przepłukać materiał przez odwirowanie 2x z 200 μL 80% ACN/5% NH4OH. Pozostałe peptydy należy eluować 200 μl 10% NH4OH (E5).
  9. Całkowicie wysuszyć wszystkie elucjacje za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego w temperaturze około 35 °C.
  10. Przeprowadzić odsalanie elucji zasadowej (E5) za pomocą końcówki odsalającej zgodnie z protokołem producenta.
  11. Wysuszyć elucję z końcówki odsalającej za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego w temperaturze około 35 °C do uzyskania pełnej gotowości.

4. Wzbogacenie fosfopeptydem Ti(IV)-IMAC

UWAGA: Dokładne prędkości i czasy wirówki mogą się różnić w zależności od próbek i muszą być zoptymalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, 300 x g przez 2 minuty jest odpowiednie do kondycjonowania i mycia materiału, a 100 x g przez 5 minut do elucji.

  1. Zważ około 3 mg waty i zapakuj ją do pustej końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  2. Przenieść materiał wzbogacający fosfopeptyd Ti-IMAC do probówki i dodać 200 μl 0,1% TFA na 10 mg materiału. Do wzbogacenia peptydów o wielkości 500 μg należy użyć 10 mg materiału.
  3. Za pomocą adaptera do probówki umieść końcówkę wirującą na probówce o pojemności 2 ml i dodaj do końcówki wystarczającą ilość zawiesiny na 10 mg materiału. Usuń płyn, obracając go w wirówce stołowej.
  4. Kondycjonować materiał za pomocą 200 μl 40% ACN/3% TFA, używając tych samych ustawień wirówki, jak opisano powyżej. Zawiesić próbki peptydów w 200 μl 40% ACN/3% TFA i przepuścić przez końcówkę wirującą. Ponownie załaduj przepływowy dwa razy, aby zapewnić pełniejsze wiązanie.
  5. Przepłukać materiał przez odwirowanie 200 μl 50% ACN, 6% TFA i 200 mM roztworu NaCl, a następnie przemyć 2x w 200 μl 30% roztworu ACN i 0,1% TFA.
  6. Peptydy elute za pomocą 200 μL 10% NH4OH. Wysuszyć elucję całkowicie w próżni. Odsalanie należy przeprowadzić za pomocą końcówki odsalającej zgodnie z protokołem producenta. Wysuszyć elucję z końcówki odsalającej w próżni do całkowitej konsystencji.

5. Równoczesne wzbogacanie dwufunkcyjnego Ti(IV)

UWAGA: Dokładne prędkości i czasy wirówki mogą się różnić w zależności od próbek i muszą być zoptymalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, 300 x g przez 2 minuty jest odpowiednie do kondycjonowania i mycia materiału, a 100 x g przez 5 minut do elucji.

  1. Zważ około 3 mg waty i zapakuj ją do pustej końcówki wirowej.
  2. Przenieść około 1 g materiału Ti(IV)-IMAC do probówki. Dodać 0,1% TFA do znanego stężenia materiału, np. 20 mg/200 μl (materiał można przechowywać w tej zawiesinie w temperaturze 4 °C).
  3. W celu wzbogacenia z peptydów o wielkości 500 μg, dodaj wystarczającą ilość gnojowicy do końcówki przędzalniczej, aby przenieść 20 mg materiału. Przepłukać końcówkę wirową przez odwirowanie z 200 μl 0,1% TFA.
  4. Zawiesić próbki w 200 μl rozpuszczalnika naładowującego/myjącego (80% ACN i 3% TFA) i przepuścić przez końcówkę wirującą. Załaduj ponownie przepływowy 2x.
  5. Umyj końcówkę wirującą 6 razy, odwirowując 200 μl rozpuszczalnika ładującego/myjącego. Umyj końcówkę wirówki 200 μl roztworu 80% ACN/0,1% FA.
  6. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 60% ACN/0,1% FA (E1) i 40% ACN/0,1% FA (E2). Analizuj każdą elucję osobno.
  7. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 20% ACN/0,1% FA i 0,1% FA. Połączyć dwie elucjacje i analizować jako jedną próbkę (E3).
  8. Eluuj peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200% mM NaCl; i 30% ACN/0,1% TFA. Połącz te elucjacje i przeanalizuj jako jeden (E4) po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.
  9. Kondycjonuj materiał do zasadowego pH za pomocą 200 μL 90% ACN/2,5% NH4OH przez 3 razy. Wyrzuć te pranie.
  10. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 60% ACN/10% NH4OH (E5) i 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analizuj te elucjacje oddzielnie po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.
  11. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; i 10% NH4OH. Połącz te elucjacje i przeanalizuj jako jedno (E7) po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.
  12. Wysuszyć wszystkie elucjacje całkowicie w próżni.

6. Nano-przepływowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami - spektrometria mas (nRPLC-MS)

UWAGA: Metody pozyskiwania i analizy danych MS są różnorodne, dlatego tylko jeden sugerowany potok LC-MS (i związane z nim parametry) jest tutaj opisany w następujących krokach. Próbki wygenerowane przy użyciu opisanych wcześniej etapów przygotowania i wzbogacania próbek mogą być analizowane przy użyciu innych konfiguracji instrumentalnych, w tym przy użyciu dostępnych na rynku kolumn chromatograficznych, pod warunkiem wystarczającej jakości danych.

  1. Pociągnij i zapakuj kapilarnę o długości 15 cm (średnica wewnętrzna 75 μm) za pomocą materiału C18, jak opisano w19. Przygotować ruchomą fazę A (0,1% FA w wodzie) i ruchomą fazę B (0,1% FA w ACN).
  2. Rozpuść wzbogacone próbki peptydów w 15 μl 3% ruchomej fazy B. Załaduj 2 μl próbki (~13% objętości próbki) bezpośrednio do kolumny. Przeanalizuj każdą próbkę w duplikacie technicznym.
  3. Peptydy elutowujące się w gradientzie od 3% do 30% fazy ruchomej B przez 90 minut przy natężeniu przepływu 0,3 μl/min. Przemywać kolumnę przy użyciu 75% B przez 8 minut, a następnie 95% B przez 8 minut, kończąc metodę z równoważeniem w temperaturze 3% B przez 12 minut.
  4. Uruchomić spektrometr masowy w trybie jonów dodatnich, wykorzystując zależną od danych akwizycję 20 górnych pików o następujących parametrach: napięcie rozpylania 2 kV; MS1 detekcja w LC/MS od 400-2 000 m/z przy rozdzielczości 120 000, cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 2E5, maksymalny czas wtrysku 100 ms, soczewka 30% RF, izolacja kwadrupolowa z oknem 1,6 m/z, dla stanów naładowania 2-8 i nieokreślonych, oraz dynamiczne wykluczenie 30 s; MS2 detekcja w LC/MS przy użyciu stopniowanej fragmentacji HCD na poziomie 22%, 30% i 38%, stała pierwsza masa 120 m/z przy rozdzielczości 30 000, cel 5E4 AGC i wymagana minimalna intensywność 2.5E4.

7. Analiza danych MS

UWAGA: Tutaj przedstawiono jeden potok analizy danych przy użyciu dwóch różnych programów do analizy tego samego zestawu danych. Fosforylacja i glikozylacja mogą być wyszukiwane w tym samym czasie za pomocą jednego oprogramowania zamiast dwóch oddzielnych programów, jak opisano tutaj, chociaż ogólnie czas wyszukiwania oprogramowania jest proporcjonalny do przestrzeni wyszukiwania, tj. liczby rozważanych PTM. Z tego powodu do poszukiwania glikopeptydów i fosfopeptydów stosuje się równolegle dwa różne programy.

  1. Przetwarzaj pliki z surowymi danymi za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).
    1. Przeszukaj widma w ludzkiej (lub odpowiedniej gatunkowej) bazie danych UniProto. Ustaw karbamidomemetylację Cys jako stałą modyfikację. Ustaw maksymalną liczbę pominiętych rozszczepień enzymatycznych na dwa.
  2. W plikach z surowymi danymi, korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów), wyszukaj glikopeptydy do analizy20. Stosować tolerancję masy prekursora 10 ppm i tolerancję masy fragmentu 0,01 Da przy minimalnej długości peptydu wynoszącej cztery pozostałości.
    1. Wyszukiwanie za pomocą wbudowanej w oprogramowanie bazy danych N-glikanów rozszerzonej o typowe glikany mannozo-6-fosforanu(M6P), w tym HexNAc(2)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Fosfo(1) i HexNAc(3)Hex(3-4)Fosfo(1).
    2. Ustaw N-glikozylację jako powszechną modyfikację. Ustaw maksymalną całkowitą modyfikację na dopasowanie widmowe peptydu (PSM) jako jedną powszechną i dwie rzadkie.
    3. Ustaw następujące modyfikacje zmiennych: utlenianie Met (rzadko), deamidacja w Asn i Gln (rzadko) oraz fosforylacja w Ser, Thr i Tyr (często). Ustaw następujące filtry identyfikacyjne: punkt odcięcia wyniku > 150, |log prob| > 1, a wynik modu delta > 10.
    4. Eksportuj i analizuj wyniki wyszukiwania na kartach Białka i Grupa peptydów.
    5. Ręcznie przebadać identyfikatory zawierające glikany M6P na obecność jonu PhosphoHex oxonium (243 m/z) w widmach MS/MS i usunąć fałszywie dodatnie identyfikacje, które nie zawierają tego jonu diagnostycznego.
  3. W plikach z surowymi danymi, korzystając z oprogramowania typu open source (patrz Spis materiałów), wyszukaj fosfopeptydy do analizy21. Użyj tolerancji peptydów pierwszego wyszukiwania 20 ppm i głównej tolerancji peptydów 4.5 ppm.
    1. Ustaw maksymalną liczbę modyfikacji na peptyd na 5. Ustaw PSM i współczynnik fałszywego wykrywania białek (FDR) na 1%, a minimalną długość peptydu na 7 reszt.
    2. Ustaw zmienne modyfikacje, takie jak utlenianie w Met, N-końcowa acetylacja białek i fosforylacja w Ser, Thr i Tyr. Analizuj wyniki wyszukiwania przy użyciu plików modificationSpecificPeptides.
  4. Określ liczbę identyfikacji PTM na poziomie białka, peptydu i miejsca modyfikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne dane spektrometrii mas, w tym surowe pliki i wyniki wyszukiwania, zostały zdeponowane w Konsorcjum ProteomeXchange za pośrednictwem repozytorium partnerskiego PRIDE z identyfikatorem zestawu danych PXD03306522.

W tej pracy, zduplikowane repliki iniekcji były analizowane dla każdej elucji wzbogacenia. Identyfikacje dokonane na podstawie obu replik technicznych zestawiono w końcowej analizie. Ze względu na półstochastyczny charakter akwizycji zale...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwufunkcyjna strategia Ti(IV)-IMAC jest przydatna do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z tej samej próbki w procesie przygotowania pojedynczej próbki. Wykazano również, że metody oparte na ERLIC umożliwiają jednoczesne wzbogacanie PTM. Obie strategie były już wcześniej stosowane do głębokiego pokrycia w analizach PTM 14,18. Dostosowując metodę podwójnego Ti do skrócenia czasu inkubacji próbki za pomocą końcówek spinowych, mamy nadzieję, że prot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez granty z NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 i R21AG065728) oraz Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B i-2016-168-S-B). Przedstawione tutaj dane zostały również częściowo uzyskane dzięki wsparciu z nagrody NIH/NCATS UL1TR002373 przyznanej przez Instytut Badań Klinicznych i Translacyjnych Uniwersytetu Wisconsin. Instrumenty Orbitrap zostały zakupione dzięki wsparciu grantu NIH (NIH-NCRR S10RR029531) oraz Biura Wicekanclerza ds. Badań i Kształcenia Podyplomowego na Uniwersytecie Wisconsin-Madison. Chcielibyśmy również podziękować za hojne wsparcie organizacji University of Wisconsin Organ and Tissue Donation Organization, która dostarczyła ludzką trzustkę do badań, a także za pomoc Dana Tremmela, dr Sary D. Sackett i prof. Jona Odorico za dostarczenie próbek do naszego laboratorium. Nasz zespół badawczy pragnie złożyć szczególne podziękowania rodzinom, które oddały tkanki do tego badania. L.L. potwierdza grant NIH S10OD025084, pilotażowy grant na raka trzustki z University of Wisconsin Carbone Cancer Center (233-AAI9632), a także profesurę Vilas Distinguished Achievement Professorship i Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship z finansowaniem zapewnionym przez Wisconsin Alumni Research Foundation i University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy, lodowaty (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA38S-500
Aceton (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitryl, klasa Optima LC/MSOctanA955-4
(krystaliczny/certyfikowany ACS)Fisher ScientificA637-500
Wodorotlenek amonu (certyfikowany ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aKomercyjne oprogramowanie używane do analizy glikoproteomicznej (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 Materiał BEHWody186002353Materiał usunięty z kolumny i używany do pakowania nanokapilar (ciągnionych do integracji końcówki używanej bezpośrednio w linii z wlotem instrumentu)
CAE-Ti-IMAC, 100%J& K Scientific2749380-1GMateriał używany do dwufunkcyjnego Ti(IV)-IMAC; może być również stosowany do konwencjonalnego wzbogacania IMAC/konwencjonalnego fosfopeptydu
Zestaw CellcrusherCellcrushern/aSłuży do mielenia próbek tkanek na proszek przed ekstrakcją
Eppendorf 5424RFisher Scientific05-401-205Do wirowania
w kontrolowanej temperaturzecKompletne tabletki koktajlowe inhibitorów proteazySigma11697498001
DTT, klasy molekularnej (DL-ditiotreitol)PromegaV3151Środek redukujący białko
Etanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analogowy mikser wirowyFisher Scientific02-215-414
Probówki wirówkowe Fisherbrand o niskiej retencji (1,5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Probówki wirówkowe Fisherbrand o niskiej retencji (2 ml)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Dysmembrator sonicznyFisher ScientificFB120110Do lizy próbek za pomocą ultradźwięków
Kwas mrówkowy, 99,0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Kapilara ze stopionej krzemionki (75 μ m średnica wewnętrzna, 360 μ m średnica zewnętrzna)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375Do wewnętrznych kolumn ciągnionych i wypełnionych ze zintegrowanym emiterem
Kwas fluorowodorowy (48 % wag. w H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLSłuży do otwierania emitera ciągniętej kolumny kapilarnej
Jodoacetamid, BioUltraSigmaI1149-5GOdczynnik redukujący białka
Oprogramowanie MaxQuantnie dotyczyn/aDarmowe oprogramowanie do analizy fosfoproteomicznej (https://www.maxquant.org/)
Wytrząsarka Multi-therm z ogrzewaniem i chłodzeniemBenchmark ScientificH5000-HCBlok grzewczy
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg sorbentu na wkład, 30 µ m, 100/pkWody186000383Odsalanie w kartridżu na większą skalę do trawienia tryptycznego (pojemność około 1 mg każda)
Końcówki do pipet OMIX C18, 100 i mikro; Końcówka L, 10 - 100 μ L objętość elucji, 1 x 96 końcówekAgilentA57003100Mniejsza końcówka do pipet w opakowaniu do odsalania w celu wzbogacania elucji
P-2000 Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-2000/FDo ciągnięcia kolumn nanokapilarnych do tabletek
inhibitora fosfatazy LC-MS PhosSTOPSigma4906845001
Pierce BCA Protein AssayKit Thermo Fisher Scientific23225
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowyThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μ m, wielkość porów 300 & Aring ;)PolyLCBMSX1203Materiał do chromatografii z mocną wymianą anionową, stosowany do wzbogacania ERLIC/konwencjonalnym glikopeptydem
Monobasic fosforan potasu (krystaliczny / certyfikowany ACS)Fisher ScientificP285-500
Ciśnieniowa cela iniekcyjna ze zintegrowanym mieszadłem magnetycznymNext AdvancePC77-MAGDo wypełniania kolumn nanokapilarnych z fazą stacjonarną do limitu
2500 psiOprogramowanie Proteome DiscovererThermo Fisher Scientificn/aKomercyjne oprogramowanie do analizy proteomicznej (ze zintegrowanymi węzłami oprogramowania do przeszukiwania baz danych) i wizualizacji danych (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
Koncentrator próżni SpeedVac SC110 Model SC110-120Savantn/aOdśrodkowy koncentrator próżniowy do suszenia próbek (w cieple)
Roztwór SDS, 10% roztwór dodecylosiarczanu sodu, biologia molekularna/elektroforezaFisher ScientificBP2436200
Sekwencjonowanie Zmodyfikowana trypsynaPromegaV5111
Chlorek sodu (krystaliczny/certyfikowany ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Pusta, 10-200 &mikro; L, opakowanie 96szt. Glygen CorporationTT2EMT.96Pusta końcówka pipety z otworem o rozmiarach mikronów, która może być używana do pakowania materiałów chromatograficznych w celu wzbogacenia, w zestawie z adapterami probówek
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB, 1 M, pH 8,5 (lotny))Sigma90360-100ML
Kwas trifluorooctowy, klasa odczynnika, 99%Fisher Scientific60-017-61
Baza Tris (białe kryształy lub krystaliczny proszek/biologia molekularna)Fisher ScientificBP152-500
Mieszanka trypsyny/Lys-C, klasa masowaPromegaV5071
Mocznik (certyfikowany ACS)Fisher ScientificU15-500
Woda, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64
amonu Fisher Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438(2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wzbogacanie N glikopeptyd wwzbogacanie fosfopeptyd wmetoda Spin Tiptytanowy IMACspektrometria mastkanka trzustkimodyfikacje potranslacyjneglikozylacjafosforylacjatrawienie bia ekodkrywanie biomarker w

Powiązane artykuły