Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63735

⸱

4 maja 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Streszczenie

Spektrometria mas może zapewnić dogłębne pokrycie modyfikacji potranslacyjnych (PTM), chociaż często konieczne jest wzbogacenie tych modyfikacji ze złożonych matryc biologicznych ze względu na ich niską stechiometrię w porównaniu do niemodyfikowanych analitów. Większość procesów wzbogacania PTM na peptydy w procesach proteomiki oddolnej, w których białka są trawione enzymatycznie przed analizą powstałych peptydów, wzbogaca tylko jeden rodzaj modyfikacji. Jednak to cały zestaw PTM prowadzi do funkcji biologicznych, a wzbogacenie pojedynczego typu PTM może przegapić takie przesłuchy PTM. Przesłuchy PTM zaobserwowano między glikozylacją i fosforylacją białek, dwoma najczęstszymi PTM w białkach ludzkich, a także dwoma najczęściej badanymi PTM przy użyciu przepływów pracy spektrometrii mas. Korzystając z opisanej w niniejszym dokumencie strategii jednoczesnego wzbogacania, oba PTM są wzbogacane o pośmiertną ludzką tkankę trzustki, złożoną matrycę biologiczną. Dwufunkcyjna chromatografia powinowactwa do metali immobilizowana Ti(IV) służy do jednoczesnego rozdzielania różnych form glikozylacji i fosforylacji w wielu frakcjach w wygodnej metodzie opartej na końcówce spinowej, umożliwiając dalsze analizy potencjalnych oddziaływań przesłuchów PTM. Ten proces wzbogacania gliko- i fosfopeptydów można zastosować do różnych typów próbek w celu uzyskania głębokiego profilowania wielu PTM i identyfikacji potencjalnych cząsteczek docelowych do przyszłych badań.

Wprowadzenie

Potranslacyjne modyfikacje białek (PTMs) odgrywają kluczową rolę w modulowaniu struktur białkowych, a w konsekwencji ich funkcji i następujących po nich procesów biologicznych. Różnorodność ludzkiego proteomu wzrasta wykładniczo dzięki zmienności kombinatorycznej wynikającej z różnych modyfikacji PTMs. Różne warianty białek różniące się od ich kanonicznych sekwencji przewidzianych przez genom nazywane są proteoformami, a wiele z nich powstaje w wyniku PTMs1. Badanie różnorodności proteoform w stanie zdrowia i choroby stało się w ostatnich latach obszarem badań budzącym ogromne zainteresowanie2,3.

Badanie proteoform, a w szczególności PTM z dużą dokładnością, stało się łatwiejsze dzięki rozwojowi metod proteomiki opartych na spektrometrii mas (MS). W metodach MS anality są jonizowane, fragmentowane i identyfikowane na podstawie wartości m/z fragmentów. Ze względu na niską względną zawartość PTM w porównaniu z niezmodyfikowanymi formami białek, często konieczne jest stosowanie metod wzbogacania. Choć analiza nienaruszonych białek i ich PTM, nazywana analizą top-down, stała się bardziej rutynowa, trawienie enzymatyczne białek i analiza ich peptydów składowych w analizach bottom-up wciąż pozostaje najszerzej stosowaną drogą analizy PTM. Dwiema najczęściej badanymi modyfikacjami PTM oraz dwiema najczęstszymi PTM in vivo są glikozylacja i fosforylacja4. Te dwie PTM odgrywają kluczowe role w sygnalizacji i rozpoznawaniu komórkowym, przez co są istotnymi modyfikacjami do scharakteryzowania w badaniach nad chorobami.

Właściwości chemiczne różnych PTM często umożliwiają wzbogacanie tych PTM na poziomie białek i peptydów przed przeprowadzeniem analizy. Glikozylacja jest hydrofilową modyfikacją PTM ze względu na dużą liczbę grup hydroksylowych w każdym monosacharydzie. Właściwość tę można wykorzystać do wzbogacania glikopeptydów w chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC), która pozwala oddzielić bardziej hydrofilowe glikopeptydy od hydrofobowych peptydów niemodyfikowanych5. Fosforylacja dodaje grupę fosforanową, która jest naładowana ujemnie, z wyjątkiem środowiska o niskim pH. Ze względu na ten ładunek, różne kationy metali, w tym tytan, mogą być wykorzystywane do przyciągania i wiązania fosfopeptydów, podczas gdy formy niefosforylowane są wypłukiwane. Jest to zasada działania chromatografii powinowactwa do zunieruchomionych jonów metali (IMAC). Dalsze omówienia tych oraz innych strategii wzbogacania dla glikozylacji i fosforylacji można znaleźć w niedawnych przeglądach literatury6,7.

Ze względu na niską stechiometrię modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w peptydach, protokoły wzbogacania często wymagają stosunkowo dużych ilości materiału wyjściowego (0,5 mg lub więcej). W sytuacjach, gdy uzyskanie takiej ilości próbki może być utrudnione, na przykład podczas analizy biopsji gruboigłowej guza lub płynu mózgowo-rdzeniowego, korzystne jest zastosowanie uproszczonych schematów postępowania, które pozwalają na uzyskanie maksymalnej ilości informacji biomolekularnych. Strategie opracowane ostatnio przez nasz zespół oraz inne grupy badawcze podkreśliły możliwość jednoczesnej i równoległej analizy glikozylacji oraz fosforylacji w ramach tego samego procesu wzbogacania PTM.8,9,10,11,12Choć właściwości chemiczne tych dwóch Modyfikacji Potranslacyjnych (PTM) mogą się różnić, analizę tych PTM można przeprowadzić w wielu etapach dzięki zastosowaniu innowacyjnych technik i materiałów separacyjnych. Na przykład chromatografia oparta na odpychaniu elektrostatycznym i oddziaływaniach hydrofilowych (ERLIC) łączy separacje oparte na oddziaływaniach hydrofilowych między analitami a fazą ruchomą z oddziaływaniami ładunek-ładunek między analitami a materiałem fazy stacjonarnej.13,14,15,16Przy niskim pH przyciąganie fosforylowanych peptydów do fazy stacjonarnej może poprawić ich retencję i separację od peptydów niemodyfikowanych. Materiał składający się z Ti(IV) unieruchomionego na mikrosferach hydrofilowych może być wykorzystywany w elucji opartej na HILIC i IMAC do rozdziału fosfopeptydów oraz neutralnych, kwasowych i mannozo-6-fosforylowanych glikopeptydów.17,18Strategia ta jest znana jako dual-funkcjonalny Ti(IV)-IMAC. Wykorzystanie tych strategii do wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w ramach jednego procesu może ułatwić analizę potencjalnych oddziaływań typu crosstalk między PTM. Dodatkowo, całkowita ilość próbki oraz zapotrzebowanie czasowe są mniejsze niż w przypadku konwencjonalnych metod wzbogacania wykonywanych równolegle (tj., HILIC i IMAC na oddzielnych alikwotach próbek).

Aby zademonstrować dwufunkcyjną strategię Ti(IV)-IMAC w jednoczesnej analizie glikozylacji i fosforylacji białek, zastosowaliśmy ją do analizy tkanek trzustki człowieka pobranych po śmierci. Trzustka produkuje zarówno enzymy trawienne, jak i hormony regulacyjne, w tym insulinę i glukagon. Funkcja trzustki jest upośledzona w chorobach trzustki. W cukrzycy zaburzona jest regulacja poziomu cukru we krwi, co prowadzi do wyższego stężenia glukozy we krwi. W zapaleniu trzustki stan zapalny wynika z autotrawienia organu3. Zmiany w profilach PTM, w tym glikozylacji i fosforylacji, mogą występować, jak ma to często miejsce, w innych chorobach.

W niniejszej pracy opisujemy protokół jednoczesnej metody wzbogacania opartej na końcówkach wirówkowych (spin-tip), wykorzystujący dwufunkcyjną strategię Ti(IV)-IMAC dla N-glikopeptydów i fosfopeptydów pochodzących z białek wyekstrahowanych z tkanki trzustki. Protokół obejmuje ekstrakcję i trawienie białek, wzbogacanie, gromadzenie danych MS oraz przetwarzanie danych, co przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywne dane z niniejszego badania są dostępne poprzez ProteomeXchange Consortium pod identyfikatorem PXD033065.

Schemat analizy tkanki trzustki, od kriopulweryzacji do nRPLC-MS, z wyróżnieniem wzbogacania peptydów.
Rysunek 1: Workflow jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki. Tkanki są najpierw poddawane kriopulweryzacji w celu uzyskania drobnego proszku, a następnie ekstrakcji białek z użyciem detergentu sodku dodecylosulfianu (SDS). Białka poddawane są następnie trawieniu enzymatycznemu. Otrzymane peptydy są rozdzielane na aalikwoty przed wzbogaceniem przy użyciu dwufunkcyjnego Ti(IV)-IMAC. Surowe dane są zbierane przy użyciu nanoskaloowej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej sprzężonej ze spektrometrią mas (nRPLC-MS) i analizowane za pomocą oprogramowania do przeszukiwania baz danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Niniejszy protokół ma na celu zwiększenie dostępności analiz PTM oraz umożliwienie szerszego zastosowania analizy wielu PTM w ramach jednego procesu badawczego. Protokół ten można zastosować również do innych złożonych matryc biologicznych, w tym komórek i płynów ustrojowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano zgodę na wykorzystanie tkanek trzustki do badań od najbliższej rodziny zmarłego i uzyskano autoryzację od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Wisconsin-Madison. Nadzór IRB nie jest wymagany, ponieważ nie obejmuje ludzi, jak uznano w 45 CFR 46.102(f).

UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z odczynnikami używanymi w tym protokole, które obejmują kwasy (mrówkowy, octowy, trifluorooctowy), zasady (wodorotlenek amonu) i kriogeny (ciekły azot). Przeczytaj karty charakterystyki stosowanych odczynników, aby zapoznać się z powiązanymi zagrożeniami i niezbędnymi środkami ostrożności. Stężenia oznaczone w procentach to objętość/objętość całkowita (v/v) i są rozcieńczane wodą.

1. Krioproszkowanie tkanek, liza i ekstrakcja białek

  1. Napełnij dewara ciekłym azotem. Wstępnie schłodzić części rozdrabniacza do tkanek, które będą miały kontakt z tkankami trzustki, a mianowicie komorę, rozdrabniacz i łyżkę regeneracyjną w pojemniku z polistyrenu.
  2. Przenieś zamrożone kawałki tkanki do wstępnie schłodzonego uchwytu na próbkę i dodaj łyżkę ciekłego azotu do tkanki.
  3. Umieść rozdrabniacz w komorze i uderz nim młotkiem od pięciu do dziesięciu razy, aby zmiażdżyć próbkę. Wyjmij rozpylacz z komory i zeskrob przylegający proszek i kawałki tkanki.
  4. Dodaj łyżkę ciekłego azotu do komory, jeśli tkanki zaczną się topić. Powtarzaj proces proszkowania, aż próbka stanie się drobnym proszkiem bez dużych kawałków tkanki. Porcjować próbki na porcje o objętości około 100 mg do wstępnie schłodzonych probówek.
  5. Przygotować bufor do lizy zawierający 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 150 mM NaCl i 25 mM Tris (pH = 7,4). Rozpuścić po jednej tabletce proteazy i inhibitora fosfatazy w 500 μl wody, aby uzyskać 20-krotny zapas każdego z nich. Dodaj wymaganą objętość 20x zapasu każdego inhibitora do buforu do lizy, aby uzyskać końcowe stężenie 1x.
  6. Dodać do probówki 600 μl buforu do lizy na 100 mg tkanki i inkubować w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym przez 10 minut z wytrząsaniem przy 800 obr./min. Wyjmij próbki z bloku grzewczego i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.
  7. Sonikuj próbki przy energii 60 W (20 kHz) przez 45 s za pomocą 15-sekundowych impulsów z 30-sekundową przerwą pomiędzy nimi. Osadzać próbki w temperaturze 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Dodać supernatant do 5-krotnego rozpuszczalnika strącającego, 300 μl buforu do lizy do 1,5 ml rozpuszczalnika strącającego, zawierającego 50% acetonu, 49,9% etanolu i 0,1% kwasu octowego. Schłodzić przez noc w temperaturze -20 °C.
  9. Ponownie zagnieździć próbki w temperaturze 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Umyj granulkę, rozbijając ją szpatułką i mieszając z taką samą ilością rozpuszczalnika strącającego. Ponownie osadź peletek, powtarzając krok prania 2x.
  10. Osadzać próbkę w temperaturze 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Próbkę suszyć na powietrzu w dygestorium przez 15 minut i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do dalszych czynności.

2. Trawienie i odsalanie białek

  1. Zawiesić osad białkowy w 300 μl świeżo przygotowanego buforu wytrawiającego zawierającego 50 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i 8 M mocznika.
  2. Oszacować stężenie białka w roztworze za pomocą testu białkowego zgodnie z protokołem producenta.
  3. Do białka w roztworze dodać ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 5 mM, wymieszać i redukować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodaj jodoacetamid (IAA) do końcowego stężenia 15 mM, wymieszaj i alkilatuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Ugasić alkilowanie, powtarzając dodawanie DTT w tej samej objętości co poprzednio i wymieszać.
  4. Dodać LysC/trypsynę w stosunku enzym do białka 1:100 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Następnie dodać 50 mM TEAB w celu rozcieńczenia 8 M mocznika użytego do < 1 M. Dodać trypsynę w stosunku enzym do białka 1:100 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Ugasić trawienie dodatkiem kwasu trifluorooctowego (TFA) do 0,3% v/v. Na każdy 1 mg białka wyjściowego kondycjonuj wkład odsalający (1 cm3, 10 mg) z 1 ml acetonitrylu (ACN) i 3 razy z 1 ml 0,1% TFA.
  6. Załaduj strawioną mieszaninę na wkład odsalający. Przemyj mieszaninę 3x używając 1 ml 0,1% TFA. Jeśli elucja jest powolna, należy zastosować nadciśnienie, ale unikać natężenia przepływu > jednej kropli na sekundę.
  7. Elute peptydy za pomocą 1 ml 60% roztworu ACN i 0,1% roztworu kwasu mrówkowego (FA). Wysuszyć eluowane peptydy w temperaturze około 35 °C za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.
  8. Zawiesić peptydy w 300 μl wody i oszacować stężenia peptydów za pomocą testu peptydowego zgodnie z protokołem producenta. Porcjować peptydy na porcje o objętości 500 μg i całkowicie wysuszyć.

3. Wzbogacenie w N-glikopeptydy ERLIC

UWAGA: Dokładne prędkości i czasy wirówki mogą się różnić w zależności od próbek i muszą być zoptymalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, 300 x g przez 2 minuty jest odpowiednie do kondycjonowania i mycia materiału, a 100 x g przez 5 minut do elucji.

  1. Zważyć około 3 mg waty bawełnianej i zapakować ją do pustej końcówki do pipety o pojemności 200 μl (końcówka wirowa; patrz tabela materiałów).
  2. Przenieść materiał wzbogacający w silną wymianę anionów do probówki i dodać 200 μl 0,1% TFA na 10 mg materiału. Do wzbogacenia 500 μg peptydów należy użyć 15 mg materiału. Aktywuj materiał potrząsając przez 15 minut.
  3. Za pomocą adaptera do probówki umieść końcówkę wirującą na probówce o pojemności 2 ml i dodaj do końcówki wystarczającą ilość zawiesiny na 15 mg materiału. Usuń płyn, obracając go w wirówce stołowej.
  4. Kondycjonować materiał przez odwirowanie 3x z 200 μl ACN. Powtórzyć trzykrotne kondycjonowanie przy użyciu 100 mM octanu amonu (NH4Ac), 1% TFA i 80% ACN/0,1% TFA (bufor ładujący).
  5. Zawiesić 500 μg próbek peptydów w około 200 μl buforu ładującego i przepuścić przez końcówkę wirową. Załaduj ponownie przepływowy 2x, aby zapewnić pełne wiązanie.
  6. Przepłukać materiał przez odwirowanie 5x przy użyciu 200 μL 80% ACN/0,1% TFA, a następnie 2x przy użyciu 200 μL 80% ACN/0,1% FA.
  7. Eluować peptydy przez odwirowanie z 200 μl każdego z poniższych: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. Przepłukać materiał przez odwirowanie 2x z 200 μL 80% ACN/5% NH4OH. Pozostałe peptydy należy eluować 200 μl 10% NH4OH (E5).
  9. Całkowicie wysuszyć wszystkie elucjacje za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego w temperaturze około 35 °C.
  10. Przeprowadzić odsalanie elucji zasadowej (E5) za pomocą końcówki odsalającej zgodnie z protokołem producenta.
  11. Wysuszyć elucję z końcówki odsalającej za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego w temperaturze około 35 °C do uzyskania pełnej gotowości.

4. Wzbogacenie fosfopeptydem Ti(IV)-IMAC

UWAGA: Dokładne prędkości i czasy wirówki mogą się różnić w zależności od próbek i muszą być zoptymalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, 300 x g przez 2 minuty jest odpowiednie do kondycjonowania i mycia materiału, a 100 x g przez 5 minut do elucji.

  1. Zważ około 3 mg waty i zapakuj ją do pustej końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  2. Przenieść materiał wzbogacający fosfopeptyd Ti-IMAC do probówki i dodać 200 μl 0,1% TFA na 10 mg materiału. Do wzbogacenia peptydów o wielkości 500 μg należy użyć 10 mg materiału.
  3. Za pomocą adaptera do probówki umieść końcówkę wirującą na probówce o pojemności 2 ml i dodaj do końcówki wystarczającą ilość zawiesiny na 10 mg materiału. Usuń płyn, obracając go w wirówce stołowej.
  4. Kondycjonować materiał za pomocą 200 μl 40% ACN/3% TFA, używając tych samych ustawień wirówki, jak opisano powyżej. Zawiesić próbki peptydów w 200 μl 40% ACN/3% TFA i przepuścić przez końcówkę wirującą. Ponownie załaduj przepływowy dwa razy, aby zapewnić pełniejsze wiązanie.
  5. Przepłukać materiał przez odwirowanie 200 μl 50% ACN, 6% TFA i 200 mM roztworu NaCl, a następnie przemyć 2x w 200 μl 30% roztworu ACN i 0,1% TFA.
  6. Peptydy elute za pomocą 200 μL 10% NH4OH. Wysuszyć elucję całkowicie w próżni. Odsalanie należy przeprowadzić za pomocą końcówki odsalającej zgodnie z protokołem producenta. Wysuszyć elucję z końcówki odsalającej w próżni do całkowitej konsystencji.

5. Równoczesne wzbogacanie dwufunkcyjnego Ti(IV)

UWAGA: Dokładne prędkości i czasy wirówki mogą się różnić w zależności od próbek i muszą być zoptymalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, 300 x g przez 2 minuty jest odpowiednie do kondycjonowania i mycia materiału, a 100 x g przez 5 minut do elucji.

  1. Zważ około 3 mg waty i zapakuj ją do pustej końcówki wirowej.
  2. Przenieść około 1 g materiału Ti(IV)-IMAC do probówki. Dodać 0,1% TFA do znanego stężenia materiału, np. 20 mg/200 μl (materiał można przechowywać w tej zawiesinie w temperaturze 4 °C).
  3. W celu wzbogacenia z peptydów o wielkości 500 μg, dodaj wystarczającą ilość gnojowicy do końcówki przędzalniczej, aby przenieść 20 mg materiału. Przepłukać końcówkę wirową przez odwirowanie z 200 μl 0,1% TFA.
  4. Zawiesić próbki w 200 μl rozpuszczalnika naładowującego/myjącego (80% ACN i 3% TFA) i przepuścić przez końcówkę wirującą. Załaduj ponownie przepływowy 2x.
  5. Umyj końcówkę wirującą 6 razy, odwirowując 200 μl rozpuszczalnika ładującego/myjącego. Umyj końcówkę wirówki 200 μl roztworu 80% ACN/0,1% FA.
  6. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 60% ACN/0,1% FA (E1) i 40% ACN/0,1% FA (E2). Analizuj każdą elucję osobno.
  7. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 20% ACN/0,1% FA i 0,1% FA. Połączyć dwie elucjacje i analizować jako jedną próbkę (E3).
  8. Eluuj peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200% mM NaCl; i 30% ACN/0,1% TFA. Połącz te elucjacje i przeanalizuj jako jeden (E4) po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.
  9. Kondycjonuj materiał do zasadowego pH za pomocą 200 μL 90% ACN/2,5% NH4OH przez 3 razy. Wyrzuć te pranie.
  10. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 60% ACN/10% NH4OH (E5) i 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analizuj te elucjacje oddzielnie po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.
  11. Eluować peptydy za pomocą 200 μl każdego z poniższych: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; i 10% NH4OH. Połącz te elucjacje i przeanalizuj jako jedno (E7) po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.
  12. Wysuszyć wszystkie elucjacje całkowicie w próżni.

6. Nano-przepływowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami - spektrometria mas (nRPLC-MS)

UWAGA: Metody pozyskiwania i analizy danych MS są różnorodne, dlatego tylko jeden sugerowany potok LC-MS (i związane z nim parametry) jest tutaj opisany w następujących krokach. Próbki wygenerowane przy użyciu opisanych wcześniej etapów przygotowania i wzbogacania próbek mogą być analizowane przy użyciu innych konfiguracji instrumentalnych, w tym przy użyciu dostępnych na rynku kolumn chromatograficznych, pod warunkiem wystarczającej jakości danych.

  1. Pociągnij i zapakuj kapilarnę o długości 15 cm (średnica wewnętrzna 75 μm) za pomocą materiału C18, jak opisano w19. Przygotować ruchomą fazę A (0,1% FA w wodzie) i ruchomą fazę B (0,1% FA w ACN).
  2. Rozpuść wzbogacone próbki peptydów w 15 μl 3% ruchomej fazy B. Załaduj 2 μl próbki (~13% objętości próbki) bezpośrednio do kolumny. Przeanalizuj każdą próbkę w duplikacie technicznym.
  3. Peptydy elutowujące się w gradientzie od 3% do 30% fazy ruchomej B przez 90 minut przy natężeniu przepływu 0,3 μl/min. Przemywać kolumnę przy użyciu 75% B przez 8 minut, a następnie 95% B przez 8 minut, kończąc metodę z równoważeniem w temperaturze 3% B przez 12 minut.
  4. Uruchomić spektrometr masowy w trybie jonów dodatnich, wykorzystując zależną od danych akwizycję 20 górnych pików o następujących parametrach: napięcie rozpylania 2 kV; MS1 detekcja w LC/MS od 400-2 000 m/z przy rozdzielczości 120 000, cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 2E5, maksymalny czas wtrysku 100 ms, soczewka 30% RF, izolacja kwadrupolowa z oknem 1,6 m/z, dla stanów naładowania 2-8 i nieokreślonych, oraz dynamiczne wykluczenie 30 s; MS2 detekcja w LC/MS przy użyciu stopniowanej fragmentacji HCD na poziomie 22%, 30% i 38%, stała pierwsza masa 120 m/z przy rozdzielczości 30 000, cel 5E4 AGC i wymagana minimalna intensywność 2.5E4.

7. Analiza danych MS

UWAGA: Tutaj przedstawiono jeden potok analizy danych przy użyciu dwóch różnych programów do analizy tego samego zestawu danych. Fosforylacja i glikozylacja mogą być wyszukiwane w tym samym czasie za pomocą jednego oprogramowania zamiast dwóch oddzielnych programów, jak opisano tutaj, chociaż ogólnie czas wyszukiwania oprogramowania jest proporcjonalny do przestrzeni wyszukiwania, tj. liczby rozważanych PTM. Z tego powodu do poszukiwania glikopeptydów i fosfopeptydów stosuje się równolegle dwa różne programy.

  1. Przetwarzaj pliki z surowymi danymi za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).
    1. Przeszukaj widma w ludzkiej (lub odpowiedniej gatunkowej) bazie danych UniProto. Ustaw karbamidomemetylację Cys jako stałą modyfikację. Ustaw maksymalną liczbę pominiętych rozszczepień enzymatycznych na dwa.
  2. W plikach z surowymi danymi, korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów), wyszukaj glikopeptydy do analizy20. Stosować tolerancję masy prekursora 10 ppm i tolerancję masy fragmentu 0,01 Da przy minimalnej długości peptydu wynoszącej cztery pozostałości.
    1. Wyszukiwanie za pomocą wbudowanej w oprogramowanie bazy danych N-glikanów rozszerzonej o typowe glikany mannozo-6-fosforanu(M6P), w tym HexNAc(2)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Fosfo(1) i HexNAc(3)Hex(3-4)Fosfo(1).
    2. Ustaw N-glikozylację jako powszechną modyfikację. Ustaw maksymalną całkowitą modyfikację na dopasowanie widmowe peptydu (PSM) jako jedną powszechną i dwie rzadkie.
    3. Ustaw następujące modyfikacje zmiennych: utlenianie Met (rzadko), deamidacja w Asn i Gln (rzadko) oraz fosforylacja w Ser, Thr i Tyr (często). Ustaw następujące filtry identyfikacyjne: punkt odcięcia wyniku > 150, |log prob| > 1, a wynik modu delta > 10.
    4. Eksportuj i analizuj wyniki wyszukiwania na kartach Białka i Grupa peptydów.
    5. Ręcznie przebadać identyfikatory zawierające glikany M6P na obecność jonu PhosphoHex oxonium (243 m/z) w widmach MS/MS i usunąć fałszywie dodatnie identyfikacje, które nie zawierają tego jonu diagnostycznego.
  3. W plikach z surowymi danymi, korzystając z oprogramowania typu open source (patrz Spis materiałów), wyszukaj fosfopeptydy do analizy21. Użyj tolerancji peptydów pierwszego wyszukiwania 20 ppm i głównej tolerancji peptydów 4.5 ppm.
    1. Ustaw maksymalną liczbę modyfikacji na peptyd na 5. Ustaw PSM i współczynnik fałszywego wykrywania białek (FDR) na 1%, a minimalną długość peptydu na 7 reszt.
    2. Ustaw zmienne modyfikacje, takie jak utlenianie w Met, N-końcowa acetylacja białek i fosforylacja w Ser, Thr i Tyr. Analizuj wyniki wyszukiwania przy użyciu plików modificationSpecificPeptides.
  4. Określ liczbę identyfikacji PTM na poziomie białka, peptydu i miejsca modyfikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne dane z spektrometrii masowej, w tym pliki surowe i wyniki wyszukiwania, zostały przekazane do konsorcjum ProteomeXchange poprzez repozytorium partnerskie PRIDE z identyfikatorem zbioru danych PXD03306522.

W niniejszej pracy dla każdego eluatu wzbogacenia przeanalizowano powtórzone wstrzyknięcia. Identyfikacje uzyskane z obu powtórzeń technicznych zestawiono w końcowej analizie. Ze względu na półstochastyczny charakter akwizycji zależnej od danyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dwufunkcyjna strategia Ti(IV)-IMAC jest przydatna do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z tej samej próbki w procesie przygotowania pojedynczej próbki. Wykazano również, że metody oparte na ERLIC umożliwiają jednoczesne wzbogacanie PTM. Obie strategie były już wcześniej stosowane do głębokiego pokrycia w analizach PTM 14,18. Dostosowując metodę podwójnego Ti do skrócenia czasu inkubacji próbki za pomocą końcówek spinowych, mamy nadzieję, że prot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez granty z NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 i R21AG065728) oraz Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B i-2016-168-S-B). Przedstawione tutaj dane zostały również częściowo uzyskane dzięki wsparciu z nagrody NIH/NCATS UL1TR002373 przyznanej przez Instytut Badań Klinicznych i Translacyjnych Uniwersytetu Wisconsin. Instrumenty Orbitrap zostały zakupione dzięki wsparciu grantu NIH (NIH-NCRR S10RR029531) oraz Biura Wicekanclerza ds. Badań i Kształcenia Podyplomowego na Uniwersytecie Wisconsin-Madison. Chcielibyśmy również podziękować za hojne wsparcie organizacji University of Wisconsin Organ and Tissue Donation Organization, która dostarczyła ludzką trzustkę do badań, a także za pomoc Dana Tremmela, dr Sary D. Sackett i prof. Jona Odorico za dostarczenie próbek do naszego laboratorium. Nasz zespół badawczy pragnie złożyć szczególne podziękowania rodzinom, które oddały tkanki do tego badania. L.L. potwierdza grant NIH S10OD025084, pilotażowy grant na raka trzustki z University of Wisconsin Carbone Cancer Center (233-AAI9632), a także profesurę Vilas Distinguished Achievement Professorship i Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship z finansowaniem zapewnionym przez Wisconsin Alumni Research Foundation i University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy, lodowaty (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA38S-500
Aceton (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitryl, klasa Optima LC/MSOctanA955-4
(krystaliczny/certyfikowany ACS)Fisher ScientificA637-500
Wodorotlenek amonu (certyfikowany ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aKomercyjne oprogramowanie używane do analizy glikoproteomicznej (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 Materiał BEHWody186002353Materiał usunięty z kolumny i używany do pakowania nanokapilar (ciągnionych do integracji końcówki używanej bezpośrednio w linii z wlotem instrumentu)
CAE-Ti-IMAC, 100%J& K Scientific2749380-1GMateriał używany do dwufunkcyjnego Ti(IV)-IMAC; może być również stosowany do konwencjonalnego wzbogacania IMAC/konwencjonalnego fosfopeptydu
Zestaw CellcrusherCellcrushern/aSłuży do mielenia próbek tkanek na proszek przed ekstrakcją
Eppendorf 5424RFisher Scientific05-401-205Do wirowania
w kontrolowanej temperaturzecKompletne tabletki koktajlowe inhibitorów proteazySigma11697498001
DTT, klasy molekularnej (DL-ditiotreitol)PromegaV3151Środek redukujący białko
Etanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analogowy mikser wirowyFisher Scientific02-215-414
Probówki wirówkowe Fisherbrand o niskiej retencji (1,5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Probówki wirówkowe Fisherbrand o niskiej retencji (2 ml)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Dysmembrator sonicznyFisher ScientificFB120110Do lizy próbek za pomocą ultradźwięków
Kwas mrówkowy, 99,0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Kapilara ze stopionej krzemionki (75 μ m średnica wewnętrzna, 360 μ m średnica zewnętrzna)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375Do wewnętrznych kolumn ciągnionych i wypełnionych ze zintegrowanym emiterem
Kwas fluorowodorowy (48 % wag. w H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLSłuży do otwierania emitera ciągniętej kolumny kapilarnej
Jodoacetamid, BioUltraSigmaI1149-5GOdczynnik redukujący białka
Oprogramowanie MaxQuantnie dotyczyn/aDarmowe oprogramowanie do analizy fosfoproteomicznej (https://www.maxquant.org/)
Wytrząsarka Multi-therm z ogrzewaniem i chłodzeniemBenchmark ScientificH5000-HCBlok grzewczy
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg sorbentu na wkład, 30 µ m, 100/pkWody186000383Odsalanie w kartridżu na większą skalę do trawienia tryptycznego (pojemność około 1 mg każda)
Końcówki do pipet OMIX C18, 100 i mikro; Końcówka L, 10 - 100 μ L objętość elucji, 1 x 96 końcówekAgilentA57003100Mniejsza końcówka do pipet w opakowaniu do odsalania w celu wzbogacania elucji
P-2000 Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-2000/FDo ciągnięcia kolumn nanokapilarnych do tabletek
inhibitora fosfatazy LC-MS PhosSTOPSigma4906845001
Pierce BCA Protein AssayKit Thermo Fisher Scientific23225
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowyThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μ m, wielkość porów 300 & Aring ;)PolyLCBMSX1203Materiał do chromatografii z mocną wymianą anionową, stosowany do wzbogacania ERLIC/konwencjonalnym glikopeptydem
Monobasic fosforan potasu (krystaliczny / certyfikowany ACS)Fisher ScientificP285-500
Ciśnieniowa cela iniekcyjna ze zintegrowanym mieszadłem magnetycznymNext AdvancePC77-MAGDo wypełniania kolumn nanokapilarnych z fazą stacjonarną do limitu
2500 psiOprogramowanie Proteome DiscovererThermo Fisher Scientificn/aKomercyjne oprogramowanie do analizy proteomicznej (ze zintegrowanymi węzłami oprogramowania do przeszukiwania baz danych) i wizualizacji danych (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
Koncentrator próżni SpeedVac SC110 Model SC110-120Savantn/aOdśrodkowy koncentrator próżniowy do suszenia próbek (w cieple)
Roztwór SDS, 10% roztwór dodecylosiarczanu sodu, biologia molekularna/elektroforezaFisher ScientificBP2436200
Sekwencjonowanie Zmodyfikowana trypsynaPromegaV5111
Chlorek sodu (krystaliczny/certyfikowany ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Pusta, 10-200 &mikro; L, opakowanie 96szt. Glygen CorporationTT2EMT.96Pusta końcówka pipety z otworem o rozmiarach mikronów, która może być używana do pakowania materiałów chromatograficznych w celu wzbogacenia, w zestawie z adapterami probówek
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB, 1 M, pH 8,5 (lotny))Sigma90360-100ML
Kwas trifluorooctowy, klasa odczynnika, 99%Fisher Scientific60-017-61
Baza Tris (białe kryształy lub krystaliczny proszek/biologia molekularna)Fisher ScientificBP152-500
Mieszanka trypsyny/Lys-C, klasa masowaPromegaV5071
Mocznik (certyfikowany ACS)Fisher ScientificU15-500
Woda, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64
amonu Fisher Scientific

Bibliografia

  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438(2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzbogacanie N-glikopeptydówwzbogacanie fosfopeptydówmetoda Spin Tiptytanowy IMACspektrometria mastkanka trzustkimodyfikacje potranslacyjneglikozylacjafosforylacjatrawienie białekodkrywanie biomarkerów
Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.