Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Masowy chów i badania molekularne owadów szkodników Tortricidae

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63737

⸱

25 marca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę hodowli owadów szkodników w laboratoriach. Procedury rozróżniania płci owadów i ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości są ustalane przy użyciu dwóch szkodników tortricid.

Streszczenie

Tortricidae (Lepidoptera), powszechnie znany jako tortrix lub leafroller, zawiera wiele szkodników rolniczych i leśnych, które powodują poważne straty w rolnictwie. Aby zrozumieć biologię takich szkodników, istnieje duże zapotrzebowanie na podstawowe techniki. Tutaj opracowywane są metody masowej hodowli, obserwacje i badania molekularne przy użyciu dwóch tortrixów herbacianych, Homona magnanima i Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Owady były hodowane masowo przy użyciu plastrów sztucznej diety i utrzymywane w chowu wsobnym przez ponad 100 pokoleń, biorąc pod uwagę ich cechy biologiczne. Owady mają różne dymorfizmy płciowe; W związku z tym trudno jest rozróżnić płeć w fazach rozwojowych, co uniemożliwiło późniejsze testy. W niniejszej pracy podkreślono, że płeć larw tortricidae można określić poprzez obserwację jąder lub barwienie orceiną mlekowo-octową w celu uwidocznienia specyficznego dla samicy chromosomu W. Ponadto, wykorzystując metody determinacji płci, niniejsze badanie umożliwiło ekstrakcję kwasów nukleinowych z zarodków zdeterminowanych płciowo i zastosowanie w sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Wskazówki te mają zastosowanie do innych szkodników i ułatwią dalsze badania morfologiczne i genetyczne.

Wprowadzenie

Owady Lepidoptera stanowią ponad 10% wszystkich opisanych żyjących gatunków1, a niektóre gatunki taksonów powodują poważne uszkodzenia roślin i poważne straty rolnicze2,3. Chociaż badania molekularne i genetyczne zostały opracowane przy użyciu owadów modelowych, takich jak jedwabnik Bombyx mori4,5, szkodniki pozostają niezbadane, częściowo z powodu trudności w hodowli i obsłudze6,7. Dlatego niezbędne są podstawowe badania i techniki, aby zrozumieć biologię takich niemodelowych szkodników.

Tortricidae (Lepidoptera), powszechnie znana jako tortrix lub leafrollers, składa się z wielu szkodników rolniczych i leśnych8. Spośród taksonów owadów, orientalny tortrix herbaciany Homona magnanima Diakonoff i letni tortrix owocowy Adoxophyes honmai Yasuda są poważnymi polifagicznymi szkodnikami, o których wiadomo, że uszkadzają drzewa herbaciane w Azji Wschodniej7. Oba gatunki składają płaskie i owalne skupiska jaj (lub masy jajowe) składające się z cienkich, miękkich i kruchych jaj pokrytych wydzielinami matki. Chociaż etapy embriogenezy mają kluczowe znaczenie dla rozwoju owadów i determinacji płci9, struktura jaj uniemożliwia dalszą analizę i zrozumienie biologii owadów. Ważne jest, aby przezwyciężyć trudności związane z dalszymi badaniami nad szkodnikami składającymi jaja w tak złożonej masie jajowej.

Tutaj, aby zrozumieć biologię tortricidae, opracowano metody masowej hodowli, obserwacje i badania molekularne przy użyciu A. honmai i H. magnanima. Po pierwsze, metody masowej hodowli utrzymują oba tortricidy przez ponad 100 pokoleń przez chów wsobny. Oddzielenie jaj od połączonej masy jajowej przypominającej łuski ułatwiło obserwację embriogenezy tortricidów przy użyciu rozpuszczalników alkalicznych i organicznych, wcześniej opracowanych na podstawie technik stosowanych u much10. Ponadto w niniejszym badaniu ustalono dyskryminację małych zarodków ze względu na płeć poprzez opracowanie metod barwienia chromatyny płciowej samic lepidoptera przy użyciu orceiny mlekowo-octowej11. Łącząc te metody, z zarodków zdeterminowanych płciowo wyekstrahowano wysokiej jakości i ilości kwasów nukleinowych, co w innym przypadku było trudne do ustalenia6. Wyekstrahowane RNA wykorzystano do sekwencjonowania nowej generacji. Łącznie przedstawione tutaj metody mają zastosowanie do innych owadów z rzędu Lepidoptera i innych taksonów owadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zbieranie owadów i masowy chów

  1. Zbieraj owady płochowate z pól zgodnie z wcześniej opublikowanymi Bibliografia8,12.
    UWAGA: Larwy H. magnanima i A. honmai zbiera się z uszkodzonych liści herbaty (Ryc. 1A); dorośli są przyciągani za pomocą przenośnego światła UV o mocy 4 W (długość fali 365 nm, patrz Tabela Materiałów, Rysunek 1B).
  2. Wychowuj zebrane larwy (Rysunek 1C,D) pojedynczo na kawałku sztucznej diety w kubku o pojemności 1/2 uncji przez 2-3 tygodnie, aż do osiągnięcia dorosłego osobnika (Rysunek 1E,F). Potwierdź płeć poczwarek i osobników dorosłych za pomocą cech morfologicznych (Rysunek 1G,I).
  3. Połącz samce i samice w plastikowym pudełku (30 cm x 20 cm x 5 cm), aby złożyć jaja w jajach na bibułce parafinowej (Rysunek 1J-L). Umieść samicę i dwóch samców w plastikowym kubku o pojemności 120 ml z kawałkiem bibuły parafinowej, aby ustalić matrylinę.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać zagniecenia na bibule parafinowej. W przypadku H. magnanima papier parafinowy musi znajdować się na spodzie opakowania. Tymczasem, w przypadku A. honmai, połóż papier na suficie skrzynki, aby zebrać jaja (Ryc. 1L), ponieważ H. magnanima oviposit masa jajowa znajduje się na górnej stronie liści herbaty, ale A. honmai składa jaja na spodniej stronie liści8. Procedury zostały również zweryfikowane u innych gatunków tortricide i lepiej jest umieścić dokumenty po obu stronach, jeśli ekologia i zachowanie gatunków docelowych nie są jasne.
  4. Na bibułce parafinowej wytnij nożyczkami masy jaj (około 100-200 jaj na masę jaj12, Rysunek 1M). Umieść jajka w kubku o pojemności 1/2 uncji z wysypanym papierem na 5-7 dni.
    UWAGA: Dojrzały zarodek wykazuje kapsułkę z zaskórnikami (Ryc. 1N). Okresy embriogenezy są różnie przypisywane gatunkom tortricidae, ale na ogół 5 dni po złożeniu jaj (dpo) dla H. magnanima i 4 dpo dla A. honmai w temperaturze 25 °C przy wilgotności względnej 60%, 16 h światła/8 h cykli ciemności7.
  5. Przechowywać masy jajowe z czarnymi kapsułkami w temperaturze 4-8 °C przez 7 dni.
  6. Pokrój ~60 g sztucznych diet za pomocą tarki do masowej hodowli. Masę jajową wypełnioną dojrzałymi zarodkami umieścić na pokrojonej sztucznej diecie w plastikowym pojemniku (23 cm x 16 cm x 8 cm). Ułóż bibułki parafinowe na masie jajecznej z pokrojoną dietą (ryc. 10).
    UWAGA: Wilgotność względna poniżej 30% jest uważana za zbyt suchą, podczas gdy ponad 70% jest zbyt wilgotna. Lepiej jest zrobić otwory w pokrywie plastikowego pojemnika, aby zapewnić lepszą wentylację. Wypełnij otwory bawełną, aby zapobiec ucieczce małych larw.
  7. Aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe z jaj, namocz masę jajową w 3% formalinie i 0,2% roztworze chlorku benzalkoniowego odpowiednio przez 5 minut12. Aby wyeliminować bakterie jelitowe lub wewnątrzkomórkowe, należy stosować sztuczną dietę uzupełnioną 0,05% (w/w) chlorowodorku tetracykliny lub 0,06% (w/w) ryfampicyny zamiast normalnej sztucznej diety (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Ważne jest, aby równomiernie ugniatać Silk Mate 2S i 0,05% (w/w) chlorowodorku tetracykliny lub 0,06% (w/w) ryfampicyny, aby uzyskać spójność.
  8. Zbierz poczwarki z plastikowego pojemnika i rozróżnij płeć na podstawie cech morfologicznych12 (Rysunek 1G-I).
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, tortricidy mają 5-6 stopni rozwojowych do momentu przepoczwarzenia12. Larwy H. magnanima i A. honmai potrzebują odpowiednio 3 tygodni i 2 tygodni po wykluciu do przepoczwarzenia.
  9. Umieść 15 samców i 10 samic w plastikowym pudełku (30 cm x 20 cm x 5 cm, Rysunek 1K) do krycia w temperaturze 25 °C, 16 L/8 D. Zbieraj jaja co 5-7 dni i powtarzaj kroki 1.4-1.9. dla każdego pokolenia.
    UWAGA: Jeśli konieczne jest zebranie nowo złożonych jaj do późniejszej analizy, należy ustawić początek i koniec okresu ciemnego, np. od 9 rano do 17 po południu. W tym stanie H. magnanima i A. honami zwykle składają jaja po 5 godzinach (14
    10. ).

2. Oddzielanie jaj i larw faratu od mas jajowych w celu utrwalenia, przepuszczalności i barwienia

  1. Namoczyć masę jajową w 1 000 μl 1,2% wodnego roztworu podchlorynu sodu na 10 minut lub w 1 000 μl 5 M wodnego roztworu wodorotlenku potasu na 30 minut w celu oddzielenia jaj.
  2. Oddzielone jaja umyć w 1 000 μl PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% monolaurynianu polioksyetylenu (20) sorbitanu [Tween-20] pH 7,4, patrz tabela materiałów) zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7.
  3. Namocz jajka w mieszaninie 500 μl 100% heptanu i 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu-PBSt (w/v). Mieszać przez 10 minut przy 1 500 obr./min za pomocą mieszalnika wirowego.
  4. Namocz jajka w mieszaninie 500 μl 100% heptanu i 500 μl 100% metanolu. Mieszać przez 10 minut przy 1 500 obr./min.
  5. Umyj jajka dwukrotnie 1 000 μl 100% metanolu i przechowuj w temperaturze 4 °C w 100% metanolu do czasu dalszych eksperymentów (Rysunek 2A).
    UWAGA: Jaja można przechowywać przez co najmniej 1 rok w temperaturze 4 °C.
  6. Namocz jajka kolejno w 99%, 70%, 50% etanolu i PBSt przez 5 minut każdy w celu hydrofilizacji zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7.
  7. Umyj jajka PBSt, zanurz jajka w 1 μg/ml roztworu DAPI na 5 minut, a następnie umyj jajka dwukrotnie 1x PBS. Namocz jaja w 20 μl 1,25% (w/w) roztworu mlekowo-octowego orceiny (patrz Tabela Materiałów)11, aby uwidocznić heterochromatynę, aż jądra wykażą jaskrawoczerwony kolor (waha się to od 5 do 60 minut) (Rysunek 2B,C).
    UWAGA: Okresy barwienia orceiną mlekowo-octową zależą od temperatury i wilgotności. Lepiej jest sprawdzić, czy barwienie jest prawidłowe, za pomocą mikroskopu o powiększeniu 4x-10x.
  8. Przełóż poplamione jaja za pomocą pipety do szkiełka podstawowego. Załącz poplamione jaja odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu (patrz Tabela Materiałów) i szklaną pokrywą7.
  9. Ekstrahuj larwy H. magnanima i A. honmai (4-5 dni po złożeniu jaj (dpo)) z mas jajowych za pomocą kleszczy (Ryc. 2D). Przetnij larwy na szkiełku (Rysunek 2E).
  10. Utrwal dowolne tkanki (np. ganglionu podprzełykowego, zwoje piersiowe, kanaliki malpighiego itp.) mieszaniną 1:3 (v/v) 99,7% kwasu octowego/100% metanolu przez 5 min. Zabarwić je 1,25% (w/w) mlekowo-octowym roztworem orceiny11, aż jądra zostaną zabarwione (może to zająć 5-60 minut, w zależności od temperatury i wilgotności).
  11. Określ płeć każdej próbki, obserwując obecność (samica) lub brak (mężczyzna) heterochromatyny (chromosom W, Rysunek 2F,G) pod mikroskopem.
    UWAGA: Płeć jest określana poprzez wizualizację chromatyny płciowej. Każda komórka reprezentuje chromatynę płciową jako kropkę w żeński 11,< klasie sup = "xref">12, podczas gdy pozostała część tkanek larwalnych faranu (nieustalona) powinna być natychmiast zanurzona w buforze do lizy komórek12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA i 1% SDS, pH 8,0) lub odczynnikach do ekstrakcji RNA zawierających fenol do ekstrakcji DNA lub RNA. Przed preparacją należy wcześniej dozować 20 μl odczynników do probówek PCR o pojemności 0,2 ml (Rysunek 3A). Zanurzyć próbki i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu dalszej ekstrakcji. Próbki mogą być przechowywane przez co najmniej 3 miesiące, ale lepiej jest kontynuować dalsze eksperymenty, aby zapobiec degradacji kwasów nukleinowych.

3. Ekstrakcje DNA i RNA z larw farów faratu determinowane płciowo

  1. Zebrać 12 determinowanych płciowo męskich lub żeńskich larw faratu (zarodek 5 dpo) i dodać bufor do lizy komórek lub odczynniki do ekstrakcji RNA (patrz krok 2.11 i tabela materiałów) do jednej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z krokami 3.2-3.7 dla ekstrakcji DNA i krokami 3.8-3.11 dla ekstrakcji RNA.
  2. Homogenizować tkanki w 600 μl buforu do lizy komórek (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA i 1% SDS, pH 8,0) i odwirowywać próbki przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać supernatant (500 μl) za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 50 °C z 1,5 μl proteinazy K (20 mg/ml, patrz tabela materiałów) przez 5 godzin na bloku grzewczym.
  4. Próbki należy traktować 1,0 μl roztworu RNazy o stężeniu 10 mg/ml (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Dodać 200 μl roztworu do wytrącania białek (patrz Tabela Materiałów) do probówek7, a następnie wirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zmieszać sklarowany nad osadem (500 μl) z 500 μl 100% izopropanolu, a następnie odwirować przy 20 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Przemyj granulowane DNA dwukrotnie 1 000 μl 70% etanolu. Następnie wysuszyć na powietrzu (5-10 min w temperaturze pokojowej), rozpuścić DNA w 30 μl 10 mM buforu Tris-Cl (pH 8,5).
  8. Homogenizować tkanki w 600 μl odczynników do ekstrakcji RNA i dodać 240 μl ultraczystej wody destylowanej do probówki. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Zmieszać supernatant (600 μl) z 600 μl 100% izopropanolu i przenieść mieszaninę do krzemionkowej kolumny wirowej (patrz tabela materiałów). Odwirować probówki o masie 17 900 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  10. Przemyć kolumnę 750 μl 70% etanolu i odwirować kolumnę dwukrotnie przy 17 900 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  11. Załaduj 15 μl ultraczystej wody destylowanej do kolumny. Odwirować probówki o stężeniu 17 900 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu wymycia RNA.
  12. Oblicz i zweryfikuj jakość i ilość DNA i RNA za pomocą spektrofotometru na bazie promieniowania UV. Oceń czystość kwasów nukleinowych za pomocą proporcji A260/A280 (kwasy nukleinowe/białko) i A260/A230 (kwasy nukleinowe/sole i inne zanieczyszczenia)13.
    UWAGA: W przypadku ekstrakcji RNA zastosowano wcześniej opublikowaną procedurę12, co spowodowało zanieczyszczenie fenolem (Tabela 1). Wyekstrahowane DNA i RNA z pojedynczego zarodka lub larw pharate daje próbki o niskiej ilości i niskiej jakości. Zazwyczaj ekstrakcja DNA z 12 larw pharate daje 100-600 ng, podczas gdy ekstrakcja RNA przy użyciu obecnej metody generuje 900-1,500 ng, jak pokazano w tabeli 1.
    UWAGA: Kroki 3.13-3.15 są opcjonalne dla dalszych testów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.
  13. Oblicz ilości DNA i RNA za pomocą spektrofotometru opartego na fluorescencji.
    UWAGA: Stosunek ilości RNA (stężenie UV (ng/μL)/stężenie fluorescencyjne (ng/μL)) obliczono w celu oceny jakości do dalszego zastosowania eksperymentalnego. Na przykład, gdy stężenia UV i fluorescencji wynoszą odpowiednio 80 ng/uL i 60 ng/uL, stosunek ten wyniesie 1,5 (80/60). Zazwyczaj współczynniki poniżej 1,5 wskazują na wystarczającą czystość dla dalszych zastosowań wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości13.
  14. Analizuj jakość RNA za pomocą elektroforezy mikroprocesorowej14.
  15. Wykorzystaj kwalifikowane RNA do przygotowania biblioteki RNA za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki RNA (patrz Tabela materiałów). Sekwencjonuj biblioteki za pomocą platformy odpowiedniej dla przygotowanych bibliotek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ustanowienie i utrzymanie linii gospodarzy
Żywotność larw zebranych w terenie jest w różnym stopniu uzależniona od lokalizacji, sezonów oraz warunków hodowli (np. 90% żywotności w Taoyuan na Tajwanie, jak wykazano w pracy Arai et al.12). Około 30%–50% par zazwyczaj daje początek kolejnej generacji. W przypadku H. magnanima oraz A. honmai linie matczyne były utrzymywane poprzez inbredy przez ponad 100 pokoleń.

Obserwacje mor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tortricid obejmuje kilka szkodników rolniczych i leśnych; W niniejszej pracy przedstawiono metody hodowli tortrixa na przestrzeni pokoleń, obserwacji embriogenezy i płci owadów oraz przeprowadzania analizy molekularnej na dojrzałych zarodkach.

Jedną z przeszkód w badaniach nad owadami szkodnikami jest ustalenie metod chowu. Zwłaszcza chów wsobny czasami negatywnie wpływa na przystosowanie gatunku. Zmniejszenie sprawności przez chów wsobny, zwane depresją wsobną, było szeroko obserwowane u różn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) Research Fellowships dla młodych naukowców [Numer grantu 19J13123 i 21J00895].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1/2 uncji kubekFP CHUPACP070009hodowla owadów; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 uncji pokrywka kubkaFP CHUPACP070011hodowla owadów; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99,7% kwas octowyFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japonia36289utrwalenie; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Bioanalizator Agilent 2100Agilent Technologiesnie pokazanoKwantyfikacja kwasów nukleinowych; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 zestaw nanoAgilent Technologies5067-1511Kwantyfikacja kwasów nukleinowych; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
roztwór chlorku benzalkoniowegoNihon Pharmaceutical Co., LtdNo.4987123116046Sterylizacja; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
BawełnaAOUME8-1611-02hodowla owadów; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
roztwór DAPIDojindo, Tokio, Japonia340-07971barwienia; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Wodorofosforan disodowyFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
Zestaw do oznaczania ilościowego DSDN HSInvitrogenQ33231Kwantyfikacja kwasów nukleinowych; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Kolumna Econospin RNA IIEpoch Life Science, Inc.EP-11201Ekstrakcja RNA; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
EtanolFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, JaponiaUtrwalanie4.98748E+12
Kwas etylenodiamino-N,N',N'-tetraoctowy Sól tetrasodowa czterowodna (4NA)FUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Bufor do lizy komórek (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Papier pergaminowyHEIKO2100010hodowli owadów; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc& utm_source=
Blok ciepła Adw
WSC-2620 PowerBLOCKATTO, Tokio, Japonia4002620inkubacji; https://www.attoeng.site/
heptanFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, JaponiaUtrwalenie4.98748E+12
https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html INSECTA LFNosan Co., Ltdnie pokazanoSztuczna dieta; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Ekstrakcja RNAISOGENIINippon Gene311-07361
izopropanolFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12ekstrakcja kwasów nukleinowych; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Kwas mlekowyFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12barwienia; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
metanolFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, JaponiaUtrwalanie4.98748E+12
MSV-3500 vortexBiosanBS-010210-TAKMieszalnik Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Fotometr NP 80Implennie pokazanoKwantyfikacja kwasów nukleinowych; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Naturalna szerokapaczka Inomata chemiczna hodowla1859; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3% 82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki RNA IlluminaNew England BioLabsE7770S; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orceinFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Barwienia; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
ParaformaldehydFUJIFILM Wako Chemicals Co.160-16061utrwalenie; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Monolaurynian polioksyetylenu(20) sorbitanuFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Przenośne czarne światło UV (długość fali 4 W, 365 nm)Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japonianie pokazanoKolekcja owadów; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Chlorek potasuFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Diwodorofosforan potasuFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Anti Blaknięcie MountantInvitrogen, MA, USAP36965antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Roztwór proteinazy K EkstrakcjaMerck71049-4CN; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
roztwór do wytrącania białekQiagen158912ekstrakcja DNA; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4InvitrogenQ33238Kwantyfikacja kwasów nukleinowych; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
ryfampicynaFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japonia4.98748E+12Sterylizacja; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
Zestaw do oznaczania ilościowego RNA HSInvitrogenQ32855Kwantyfikacja kwasów nukleinowych; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
Roztwór RNazyEkstrakcja genu Nippon313-01461; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2SNosan Co., Ltdnie pokazanoSztuczna dieta; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Chlorek soduFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Dodecylosiarczan soduFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Bufor do lizy komórek (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
wodny roztwór podchlorynu soduFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japonia4.98748E+12separacja jaj; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Chlorowodorek tetracyklinyFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japonia4.98748E+12Sterylizacja; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HClFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Bufor do lizy komórek; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra czystej wody destylowanejInvitrogen10977023ekstrakcji RNA; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015
; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html;; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html owadów DNA

Bibliografia

  1. Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
  2. Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).
  3. Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
  4. Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
  6. Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
  7. Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).
  8. vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
  9. Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
  10. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
  11. Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
  12. Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
  13. Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
  14. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).
  15. Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
  16. Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
  17. Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
  18. Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
  19. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
  20. Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

oznaczanie płcidieta sztucznabarwienie orceiną mleczno-octowąekstrakcja DNAekstrakcja RNAsekwencjonowanie nowej generacjibarwienie zarodków
Masowy chów i badania molekularne owadów szkodników Tortricidae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.