W synapsach pobudzających w mózgu ssaków presynaptyczny glutaminian aktywuje receptory osadzone w błonie postsynaptycznej 1,2. Siła tych połączeń synaptycznych ulega plastyczności zależnej od doświadczenia, właściwości, która pozwala na różnorodne formy uczenia się i zapamiętywania 3,4,5,6,7,8,9. Patologiczne zmiany w liczbie synaps i ich właściwościach sygnalizacyjnych prowadzą do zmiany aktywności obwodów i przetwarzania informacji, co przejawia się w licznych zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych 10,11,12. W związku z tym istnieje krytyczna potrzeba zrozumienia podstawowych mechanizmów, które rządzą połączeniami neuronalnymi i siłą połączeń synaptycznych.
Synapsy pobudzające tworzą się na kolcach dendrytycznych, maleńkich postsynaptycznych wypukłościach zawierających białka rusztowania, receptory, czynniki sygnałowe, białka cytoszkieletu i organelle transportowe 1,2,13,14,15,16. Te mikronowe przedziały sygnalizacyjne pozwalają na kontrolę siły synaps na zasadzie synapsa po synapsie13,16. Morfologia kolców dendrytycznych zmienia się wzdłuż długości dendrytów neuronalnych, przy czym kształty kręgosłupów są zwykle opisywane jako cienkie, filopodialne, przysadziste, grzybowe lub rozgałęzione13. Co ważne, kształt kręgosłupa jest skorelowany z funkcją synaps i stabilnością. Na przykład większe kolce mają zwiększoną liczbę receptorów i większą siłę synaptyczną 16,17,18. W przeciwieństwie do cienkich kolców, większe kolce mogą utrzymywać się przez miesiące in vivo, co może pozwolić na stabilne połączenia synaptyczne i przechowywanie pamięci długotrwałej19,20.
Morfologia i gęstość kręgosłupa wzdłuż dendrytu są powszechnie śledzone w celu zbadania stopnia połączeń neuronalnych i właściwości synaps pobudzających w określonym regionie mózgu, zarównow stanie normalnym, jak i chorobowym. Opracowano różnorodne metody wizualizacji morfologii kręgosłupa w różnych preparatach tkankowych i systemach modelowych przy użyciu standardowej mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej, a także mikroskopii superrozdzielczej i elektronowej (EM)21. Te potężne techniki obrazowania dostarczyły ogromnego wglądu w naszą obecną wiedzę na temat organizacji, funkcji i chorób mózgu. Zbiór tych metod obejmuje ważne techniki obrazowania do monitorowania złożoności morfologicznej dendrytów i kolców, a także narzędzia optogenetyczne do aktywacji i pomiaru aktywności neuronalnej w dendrytach i pojedynczych kolcach.
Pekarek i wsp.22 prezentują stosunkowo szybki, wysokoprzepustowy protokół do obrazowania i ilościowego określania struktury dendrytów neuronalnych głęboko w nienaruszonej tkance nerwowej. Autorzy przeprowadzająC lear Lipid-exchangeed Azhybrydyzowany krylamidem Rigid Imaging/immunostaining/in situ-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY), technikę oczyszczania tkanek, która usuwa lipidy z tkanki mózgowej i pomaga zminimalizować rozpraszanie światła podczas późniejszego obrazowania23. Po oczyszczeniu stosy Z neuronów wyrażających białka fluorescencyjne zebrano za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej. Analiza obrazu i zautomatyzowana kwantyfikacja pozwoliły na precyzyjne pomiary gęstości i kształtu kręgosłupa, a także złożoności drzew dendrytycznych. Protokół ten pozwala na jednoczesne obrazowanie struktur, od pojedynczych kolców po drzewa dendrytyczne, a także eliminuje czasochłonny i potencjalnie szkodliwy etap cięcia cienkich sekcji. Technika ta będzie bardzo przydatna dla badaczy, którzy chcą określić ilościowo zmiany w morfologii kręgosłupa i złożoności dendrytycznej w nienaruszonych tkankach mózgowych po wprowadzeniu lub usunięciu interesującego genu (genów).
Opracowane ponad 100 lattemu 24 barwienie Golgiego pozostaje potężnym narzędziem do wizualizacji organizacji układu nerwowego i morfologii neuronów. W tej metodzie rzadkie populacje neuronów są barwione przez mikrokrystalizację chromianu srebra, co pozwala na wizualizację aksonów, drzew dendrytycznych i kolców25. Frankfurt i Bowmanszczegółowo opisują protokół szybkiej impregnacji Golgiego w celu wizualizacji neuronów i kolców dendrytycznych w hipokampie szczura i przyśrodkowej korze przedczołowej. Autorzy pokazują, jak przygotować, wybarwić i zobrazować tkankę do późniejszej mikroskopii świetlnej, a także określić ilościowo gęstość kolców wzdłuż drzew dendrytycznych. Opisany tutaj protokół zapewnia konsekwentną, niezawodną impregnację neuronów i zmniejsza narażenie na toksyczne chemikalia.
Podczas gdy mikroskopia świetlna i fluorescencyjna dobrze nadają się do obrazowania dendrytów i kolców, EM pozwala na wizualizację struktur pre- i postsynaptycznych z rozdzielczością nanometrową21. Podejścia EM są zwykle stosowane do pomiaru właściwości ultrastrukturalnych synaps, w tym wymiarów gęstości postsynaptycznej, a także liczby i wielkości pęcherzyków synaptycznych21. W tej kolekcji Śliwińska i wsp.27 podają protokół pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów EM za pomocą skanowania Serial Block-face Electron Microscopy (SBEM) w tkance myszy hipokampa 28,29. W szczególności opisują, jak przygotowywać próbki, zatapiać tkankę w żywicy, montować i przycinać próbki, wykonywać SBEM i analizować obrazy w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D. Protokół ten generuje obrazy o wysokim kontraście z dobrze zdefiniowanymi błonami i może być dostosowany do różnych typów tkanek.
Podczas rozwoju układu nerwowego neurony ulegają dramatycznym zmianom morfologicznym, ponieważ połączenia synaptyczne są tworzone i udoskonalane przez aktywność neuronalną30,31. Aby śledzić dojrzewanie neuronów w rozwijającym się móżdżku, Chan i wsp.32 przedstawiają protokół elektroporacji in vivo po pourodzeniu rozwijających się neuronów ziarnistych. W tym przypadku naukowcy wstrzyknęli i elektropokowali DNA do tyłomózgowia młodych myszy po urodzeniu, aby transfekować nieliczną populację neuronów za pomocą białek fluorescencyjnych. Mikroskopia konfokalna o wysokiej rozdzielczości i obrazowanie 3D pozwoliły naukowcom scharakteryzować morfologię dendrytów i pazurów dendrytycznych na kilku etapach rozwoju poporodowego. Co ważne, podejście to może pozwolić na wprowadzenie lub usunięcie genów, które mogą wpływać na dojrzewanie i funkcję komórek ziarnistych, i będzie przedmiotem dużego zainteresowania naukowców zajmujących się rozwojem móżdżku i dojrzewaniem neuronów ziarnistych.
Wreszcie, protokoły Cuentasa-Condori i Millera33 wykorzystują obrazowanie w superrozdzielczości34, optogenetykę35 i obrazowanie dynamiki wapnia na żywych komórkach36 w celu zbadania aktywności neuronów GABA-ergicznych w nicieniu C. elegans. Korzystając z mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obrazowanie w superrozdzielczości37, autorzy dokonują ekspresji białek fluorescencyjnych w dendrytach, aby zmierzyć częstotliwość występowania różnych kształtów kręgosłupa. Ponadto autorzy oceniają funkcję neuronalną poprzez presynaptyczną ekspresję białka optogenetycznego i postsynaptycznego wskaźnika wapnia. Po aktywacji świetlnej zakończeń zaobserwowano przejściowe stany wapnia w obrębie poszczególnych kolców dendrytycznych. Protokoły te, wraz z ostatnimi odkryciami38, podkreślają ekscytujące zastosowanie C. elegans jako potężnego systemu modelowego do śledzenia morfologii kręgosłupa i aktywności synaptycznej.
Podsumowując, protokoły opisane w tym zbiorze metod uzupełnią i tak już bogaty zestaw narzędzi do wizualizacji struktury i funkcji neuronalnej21. Zastosowanie tych metod w przyszłych badaniach prawdopodobnie dostarczy dodatkowych informacji na temat procesów, które napędzają plastyczność synaptyczną związaną z uczeniem się oraz mechanizmy komórkowe leżące u podstaw stanów chorobowych.