Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63758

⸱

28 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę zakładania i przeprowadzania testu ran drapanych na dwuwymiarowych (2D) monowarstwach pochodzących z trójwymiarowych (3D) enteroidów wyizolowanych z jelita krętego naczelnych innych niż ludzkie.

Streszczenie

Testy ran in vitro są powszechnie używane do badania mechanizmów i cech gojenia się nabłonka w różnych typach tkanek. W tym miejscu opisujemy protokół generowania dwuwymiarowej (2D) monowarstwy z trójwymiarowych (3D) enteroidów naczelnych innych niż człowiek pochodzących z krypt jelitowych końcowego odcinka jelita krętego. Te monowarstwy pochodzące z enteroidów zostały następnie wykorzystane w teście in vitro na ranach drapanych w celu przetestowania zdolności hialuronianu 35 kDa (HA35), naśladującego kwas hialuronowy w mleku ludzkim, do promowania migracji i proliferacji komórek wzdłuż krawędzi rany nabłonkowej. Po tym, jak monowarstwy zostały wyhodowane do zlewania się, zostały ręcznie zarysowane i poddane działaniu HA35 (50 μg/ml, 100 μg/mL, 200 μg/ml) lub kontrolnej (PBS). Migrację i proliferację komórek do szczeliny zobrazowano za pomocą mikroskopu światła przechodzącego wyposażonego w obrazowanie żywych komórek. Zamknięcie rany określono ilościowo jako procent gojenia się ran za pomocą wtyczki Wound Healing Size w ImageJ. Obszar zadrapania i szybkość migracji komórek oraz procent zamknięcia rany mierzono w ciągu 24 godzin. HA35 in vitro przyspiesza gojenie się ran w monowarstwach jelita cienkiego, prawdopodobnie poprzez połączenie proliferacji komórek na krawędzi rany i migracji do obszaru rany. Metody te mogą być potencjalnie wykorzystane jako model do badania regeneracji jelit w jelicie cienkim wcześniaków.

Wprowadzenie

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest jednym z najczęstszych przypadków żołądkowo-jelitowych u wcześniaków1. Choroba charakteryzuje się ciężkim stanem zapalnym jelit, który może szybko ulec pogorszeniu do martwicy jelit, posocznicy i potencjalnie śmierci. Chociaż etiologia jest niejasna, dowody sugerują, że NEC jest wieloczynnikowy i jest wynikiem złożonej interakcji żerowania, nieprawidłowej kolonizacji bakteryjnej i niedojrzałego nabłonka jelitowego2,3. Wcześniaki mają zwiększoną przepuszczalność jelit, nieprawidłową kolonizację bakteryjną i niską zdolność regeneracyjną enterocytów4,5, co zwiększa ryzyko dysfunkcji bariery jelitowej, translokacji bakteryjnej i rozwoju NEC. Dlatego określenie strategii lub interwencji w celu przyspieszenia dojrzewania nabłonka jelitowego i promowania regeneracji lub gojenia nabłonka jelitowego ma kluczowe znaczenie w zapobieganiu tej śmiertelnej chorobie.

Badania wykazały, że mleko kobiece (HM) chroni przed NEC u wcześniaków6,7,8,9,10,11. Zarówno badania na ludziach, jak i na zwierzętach wykazały, że formuła na bazie bydła zwiększa przepuszczalność jelit i jest bezpośrednio toksyczna dla komórek nabłonka jelitowego2,12. Chociaż nie zostało to w pełni wyjaśnione, dowody sugerują, że ochronne działanie HM jest pośredniczone przez składniki bioaktywne, takie jak laktoferyna, immunoglobulina A (IgA) i oligosacharydy HM 13. HM jest również bogaty w hialuronian (HA), unikalnie niesiarczanowany glikozaminoglikan z powtarzającym się kwasem D-glukuronowym i disacharydami N-acetylo-D-glukozaminy14,15. Co ważne, wykazaliśmy, że doustny 35 kDa HA (HA35), naśladujący HM HA, łagodzi nasilenie uszkodzenia jelit, zapobiega translokacji bakteryjnej i zmniejsza śmiertelność w mysim modelu uszkodzenia jelit podobnego do NEC16,17.

Tutaj dalej badane są efekty HA35 na gojenie i regenerację jelit in vitro. Obecnie najpowszechniej stosowanym testem in vitro do leczenia i naprawy jelit jest test ran drapanych wykonywany w monowarstwach komórek raka jelita grubego (CRC). Fizjologiczne znaczenie takiego modelu dla jelita wcześniaków jest ograniczone, ponieważ gojenie ran w komórkach CRC opiera się w dużej mierze na wysoce proliferacyjnej naturze komórek rakowych, a nie na procesach naprawczych napędzanych komórkami macierzystymi18. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opisano tutaj ustanowienie modelu 2D rany brzusznej enteroidalnej, w tym procedurę izolacji i utrzymania pierwotnych enteroidów jelita cienkiego pochodzących z komórek macierzystych od wcześniaków naczelnych (NHP). Biorąc pod uwagę, że wcześniak NEC jest najczęściej zgłaszany w dystalnym jelicie cienkim, zastosowanie pierwotnych organoidów komórek nabłonkowych w modelu uszkodzenia i naprawy jelit zapewnia bardziej fizjologicznie przekładalny model in vitro w porównaniu z istniejącymi modelami wykorzystującymi tradycyjne monowarstwy jelita grubego18,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Oklahoma Health Sciences Center. Po uzyskaniu zgody instytucjonalnej, próbki jelita cienkiego płodu pobrane w sposób wygodny od przedwcześnie urodzonego naczelnego (NHP, 90% okresu gestacji, pawian oliwkowy, Papio anubis) zostały pozyskane po eutanazji przeprowadzonej na potrzeby oddzielnego badania (Protokół nr 101523-16-039-I)20.

1. Ustanowienie trójwymiarowych enteroidów jelitowych przedwcześnie urodzonych naczelnych

  1. Przygotowanie pożywek
    UWAGA: Pożywki można przygotować do 1 tygodnia przed izolacją krypt, stosując standardową technikę aseptyczną. W przypadku komórek pierwotnych, jeśli jest to pożądane, zamiast antybiotyków o szerokim spektrum działania można zastosować penicylinę/streptomycynę (stężenie końcowe 1%).
    1. Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów + Y-27632 (HOGMY), mieszając 50 mL podstawowej pożywki do wzrostu ludzkich organoidów z 50 mL suplementu do organoidów (Tabela materiałów). Dodać 200 µL antybiotyków o szerokim spektrum działania (stężenie końcowe 100 µg/mL) (Tabela materiałów) oraz Y-27632 (do stężenia końcowego 10 µM). Pozostawić na blacie w temperaturze pokojowej do ogrzania.
    2. Przygotować pożywkę do wzrostu ludzkich organoidów (HOGM), mieszając 50 mL podstawowej pożywki do wzrostu ludzkich organoidów z 50 mL suplementu do organoidów. Dodać 200 µL antybiotyków o szerokim spektrum działania (100 µg/mL). Pozostawić na blacie w temperaturze pokojowej do ogrzania.
      UWAGA: Pożywka HOGM będzie stosowana podczas wymiany pożywek po pierwszych 2-3 dniach od pasażowania.
    3. Schłodzić 100 mL 1x fosforanu buforu soli (PBS) bez wapnia i magnezu do temperatury lodowej.
    4. Przygotować 50 mL buforu do płukania, łącząc 1x PBS bez wapnia i magnezu z 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Schłodzić do temperatury lodowej.
    5. Przygotować bufor do płukania DMEM-F12, dodając 1 mL antybiotyków o szerokim spektrum działania (100 µg/mL) do 500 mL DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + bufor HEPES 15 mM). Przechowywać w temperaturze lodowej.
  2. Izolacja i wysiew krypt
    UWAGA: Hydrożel oparty na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) musi pozostawać w lodzie przez cały czas trwania procedury. Procedura ta zakłada dostępność wystarczającej ilości tkanki do wypełnienia sześciu kopułek z hydrożelu ECM. Jeśli pobrano inną gęstość krypt, liczbę kopułek należy odpowiednio zmienić.
    1. Rozmrozić 150 µL ekstraktu z błony podstawnej (BME) o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (GFR) (wolnego od czerwieni fenolowej) przez noc w lodzie w temperaturze 2-8 °C.
    2. Inkubować płytkę polistyrenową 24-dołkową o płaskim dnie, traktowaną do hodowli tkankowych, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez minimum 30 min przed użyciem.
    3. Po eutanazji NHP i pobraniu tkanek, wypłukać fragment jelita krętego z zanieczyszczeń za pomocą końcówki pipety 1000 µL, używając lodowatego 1x PBS w jednorazowej płytce Petriego.
      UWAGA: Świeża tkanka musi zostać pobrana szybko i przechowywana w temperaturze lodowej, aby uzyskać zdrowe enteroidy.
    4. Przeciąć jelito kręte wzdłużnie na całej długości jelita i przemyć 3x lodowatym PBS. Posiekać tkankę na małe fragmenty (o długości około 2 mm) za pomocą sterylnych nożyczek nad 50 mL probówką stożkową zawierającą 15 mL lodowatego PBS, zaczynając od części segmentu jelita krętego najbliższej probówce.
    5. Użyć pipety serologicznej 10 mL, aby rozbić krypty poprzez pipetowanie w górę i w dół 5-10x. Pozostawić fragmenty tkanki do osadzenia się na dnie probówki, następnie usunąć nadosad i zastąpić go świeżym, lodowatym PBS. Powtarzać ten proces minimum 7-10x, aż nadosad będzie przejrzysty i wolny od zanieczyszczeń.
    6. Po uzyskaniu przejrzystości usunąć nadosad i resuspender krypty w 25 mL odczynnika do dysocjacji komórek. Umieścić probówkę na platformie kołyszącej przy 20 obr./min przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    7. Wyjąć probówkę z kołysarki, pozwolić komórkom osadzić się przez około 30 s do 1 min i usunąć nadosad. Dodać 10 mL lodowatego buforu do płukania. Pipetować w górę i w dół pipetą p1000, aby dalej dysocjować do pojedynczych krypt.
    8. Przefiltrować tkankę przez sitko komórkowe 70 µm do nowej probówki stożkowej 50 mL. Przepłukać oryginalną probówkę stożkową 50 mL za pomocą 10 mL lodowatego buforu do płukania i przefiltrować przez sitko 70 µm, aby upewnić się, że wszystkie krypty zostały usunięte z oryginalnej probówki. Powtarzać to płukanie tkanki łącznie 4x.
    9. Odwirować filtrat przy 300 x g przez 5 min w 4 °C i usunąć nadosad. Dodać 600 µL HOGMY i rozbić osad poprzez pipetowanie w górę i w dół pipetą 200 µL. Umieścić probówkę w lodzie, aż roztwór osiągnie temperaturę lodową.
      UWAGA: Jeśli roztwór nie będzie lodowaty, kopułka nie utrzyma właściwej struktury po wysiewie. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas pipetowania kopułek z hydrożelu ECM, ponieważ pęcherzyki uniemożliwią prawidłowe przyleganie do dna płytki.
    10. Dodać 600 µL lodowatego hydrożelu ECM, aby zawiesić osad komórkowy i dobrze wymieszać pipetą 200 µL.
    11. Wyjąć płytkę 24-dołkową z inkubatora i umieścić ją na podgrzewaczu do płytek o temperaturze 37 °C. Pipetować 50 µL lodowatej mieszaniny HOGMY/hydrożelu ECM do środka 24 dołków płytki hodowlanej 24-dołkowej (50 µL na kopułkę).
    12. Po wysiewie pozostawić kopułki na podgrzewaczu do płytek 37 °C przez 1 min, aby umożliwić przyleganie do dna płytki. Ostrożnie odwrócić płytkę, upewnić się, że na dnie nie skropliła się woda, i umieścić odwróconą płytkę w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2.
    13. Po 15 min odwrócić płytkę z powrotem i pipetować 750 µL HOGMY w temperaturze pokojowej do każdego dołka.
      UWAGA: Pożywkę pipetować powoli po ściance dołków, uważając, aby nie zniszczyć nowo powstałej trójwymiarowej kopułki z hydrożelu ECM.
    14. Po wypełnieniu wszystkich dołków pożywką, umieścić płytkę w inkubatorze i wymieniać pożywkę co 3 dni na 750 µL HOGM. Pasażować enteroidy co 7-10 dni.
  3. Pasażowanie enteroidów jelitowych
    UWAGA: Poniższy protokół dotyczy jednej płytki hodowlanej 24-dołkowej zawierającej enteroidy NHP przy stopniu rozcieńczenia 1:2.
    1. Usunąć pożywkę z enteroidami z każdego dołka, uważając, aby nie zniszczyć kopułki ECM zawierającej enteroidy, dodać 500 µL lodowatego odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka za pomocą pipety 1000 µL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min.
    2. Mechanicznie rozbić ECM poprzez pipetowanie w górę i w dół 8-12x. Przenieść zawartość 12 dołków do jednej probówki stożkowej 15 mL.
    3. Po zebraniu całego roztworu z płytki hodowlanej 24-dołkowej, dodać 250 µL odczynnika do rozbijania komórek do każdego dołka, aby upewnić się, że wszystkie enteroidy NHP zostały usunięte z każdego dołka, dodając to ostatnie płukanie do istniejących probówek stożkowych 15 mL.
    4. Umieścić na platformie kołyszącej przy 40 obr./min przez 15 min w temperaturze pokojowej (20 °C). Alternatywnie, wstrząsać probówkami ręcznie przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    5. Po 15 min odwirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C. Usunąć nadosad z probówek 15 mL, aż pozostanie tylko osad.
    6. Dodać 8 mL lodowatego DMEM + antybiotyków o szerokim spektrum działania do jednej probówki stożkowej 15 mL, upewniając się, że osad został wystarczająco rozbity. Odwirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C i odrzucić nadosad.
    7. Dodać 600 µL HOGMY i rozbić osad poprzez pipetowanie w górę i w dół pipetą 1000 µL. Umieścić probówkę w lodzie, aż roztwór osiągnie temperaturę lodową. Gdy roztwór będzie lodowaty, dodać 600 µL lodowatego ECM, aby zawiesić osad komórkowy i dobrze wymieszać pipetą 1000 µL. Powtórzyć kroki 1.3.2.-1.3.7. dla pozostałych 12 dołków.
      1. W pozostałych krokach należy odnieść się do kroków 1.2.11.-1.2.16.

2. Tworzenie monowarstwy enteroidów i testy gojenia rany (scratch assay)

  1. Przygotowanie mediów i substancji do traktowania
    1. Schłodzić 5 mL PBS bez wapnia i magnezu do temperatury lodowej.
    2. Przygotować bufor płuczący DMEM-F12, dodając 1 mL antybiotyków o szerokim spektrum działania (100 µg/mL) do 500 mL DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + bufor HEPES 15 mM). Przechowywać w temperaturze lodowej.
    3. Przygotować 100 mL HOGMY zgodnie z opisem w kroku 1.1.1. i ogrzać na blacie do temperatury pokojowej.
    4. Ogrzać 25 mL 0,25% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    5. Przygotować stężenia HA35 wynoszące 50 µg/mL, 100 µg/mL i 200 µg/mL do traktowania komórek, używając sterylnego PBS bez wapnia i magnezu jako rozpuszczalnika. Do końcowego rozcieńczenia HA35 należy użyć HOMGY jako rozpuszczalnika.
      UWAGA: Przygotowanie HA35 może wymagać kilku rozcieńczeń, ponieważ HA35 często wytrąca się z roztworu przy stężeniu wyższym niż 5 mg/mL.
  2. Tworzenie monowarstwy enteroidów
    UWAGA: Poniższa procedura podaje objętości wystarczające do wytworzenia monowarstw enteroidów na jednej płytce 24-dołkowej. Należy dostosować objętości do pożądanej liczby monowarstw.
    1. Rozmrozić 96 µL hydrożelu BME na bazie ECM (bez czerwieni fenolowej) przez noc na lodzie w temperaturze 2-8 °C. Rozcieńczyć hydrożel na bazie ECM w lodowatym PBS bez wapnia i magnezu w stosunku 1:50. Pokryć każdy dołek płytki hodowlanej 24-dołkowej 200 µL lodowatego rozcieńczonego hydrożelu na bazie ECM.
    2. Inkubować płytkę pokrytą hydrożelem na bazie ECM przez minimum 1 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Odessać medium z płytki hodowlanej 24-dołkowej zawierającej 3D enteroidy przeznaczone do monowarstw i zastąpić je 500 µL odczynnika do dysocjacji komórek na dołek.
    3. Ręcznie rozbić kopułki hydrożelu na bazie ECM poprzez 8-12 krotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść zawartość 12 dołków do probówki stożkowej 15 mL.
    4. Przepłukać 12 pustych dołków 250 µL odczynnika do dysocjacji komórek, aby upewnić się, że wszystkie enteroidy zostały usunięte, i przenieść zawartość do probówki stożkowej 15 mL. Powtórzyć kroki 2.2.5. i 2.2.6. dla pozostałych 12 dołków, używając drugiej probówki stożkowej 15 mL.
    5. Wirować probówki stożkowe przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i odrzucić nadsącz. Dodać 10 mL lodowatego buforu płuczącego DMEM-F12 do probówek stożkowych 15 mL i zawiesić osady enteroidów poprzez odwracanie probówek. Wirować przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć nadsącz i resuspendować osady komórkowe w 12 mL trypsyny-EDTA o temperaturze 37 °C. Umieścić probówki w łaźni wodnej 37 °C na 10 min lub do momentu, aż komórki wydadzą się rozpuszczalne. Dodać 3 mL buforu płuczącego DMEM-F12 do każdej probówki, aby rozcieńczyć trypsynę-EDTA, wymieszać poprzez odwracanie probówek i umieścić na lodzie.
    7. Przefiltrować zdysocjowane enteroidy przez sito komórkowe o oczkach 37 µM, zbierając zawartość do czystych probówek stożkowych 15 mL. Wirować probówki przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    8. Podczas wirowania komórek wyjąć z inkubatora płytkę pokrytą hydrożelem na bazie ECM i odessać nadmiar roztworu hydrożelu na bazie ECM, uważając, aby nie porysować pokrytej powierzchni i nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia płytki.
    9. Usunąć nadsącz z probówek stożkowych i resuspendować osady komórkowe w 6 mL HOMGY. Dodać 500 µL połączonej zawiesiny komórkowej w 12 mL HOMGY do każdego dołka płytki 24-dołkowej pokrytej hydrożelem na bazie ECM przy gęstości siewu wynoszącej około 3 x 105 komórek/dołek. Zakręcić płytkę z zamkniętą pokrywą, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek w dołkach.
    10. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wymieniając medium HOMGY co 2 dni, aż monowarstwy osiągną >90% konfluencji.
  3. Traktowanie monowarstwy i test rany zarysowanej
    1. Gdy monowarstwy osiągną >90% konfluencji, odessać medium, aby usunąć komórki, które nie przyrosły. Traktować komórki 500 µL HA35 (50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL) lub PBS rozpuszczonego w HOMGY przez 24 h.
    2. Po 24 h usunąć medium, uważając, aby nie naruszyć powierzchni monowarstwy. Używając końcówki do pipety 200 µL, wykonać liniowe zarysowanie przez całą średnicę powierzchni monowarstwy w każdym dołku, uważając, aby monowarstwy nie wyschły.
    3. Przepłukać zarysowane monowarstwy 1x 500 µL 1x PBS. Dodać 500 µL HA35 (50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL) lub PBS rozpuszczonego w HOMGY i przenieść płytkę do instrumentu do analizy żywych komórek (Tabela materiałów) w inkubatorze 37 °C i 5% CO2.
    4. Pod ikoną Schedule w oprogramowaniu do analizy żywych komórek (Tabela materiałów) kliknąć ikonę Launch Add New Vessel Wizard i ustawić częstotliwość skanowania na skanowanie harmonogramowane. Utworzyć nowe naczynie typu Whole Well w sekcji Scan Type, określić ustawienia skanowania (np. Phase dla Image Channels oraz 4x dla Objective) i kliknąć Next.
    5. Wybrać producenta płytki i numer katalogowy z dostarczonej listy. Pod ikoną Schedule wybrać symbol plus w miejscu, gdzie płytka zostanie umieszczona w instrumencie do analizy żywych komórek. Wybrać pożądany Scan Pattern, a następnie utworzyć mapę płytki, wybierając „+” na stronie Plate Layout. Wybrać Defer Analysis Until Later, a następnie ustawić Scanning Schedule co 4 h przez 24 h i zweryfikować ustawienia akwizycji na stronie Vessel Wizard Summary. Na koniec wybrać Add to Schedule.
    6. Po zakończeniu 24-godzinnego testu, pod ikoną View icon kliknąć dwukrotnie Vessel Name i wyeksportować obrazy oraz filmy. Wybrać dołki i serię obrazów do wyświetlenia i eksportu jako JPEG. Przeanalizować obrazy pod kątem procentowego gojenia rany, korzystając z wtyczki Wound Healing Size Plugin dla ImageJ21, zgodnie z krokiem 2.4. poniżej.
  4. Analiza rany zarysowanej
    1. Otworzyć oprogramowanie ImageJ. Przesłać obrazy z testu rany zarysowanej (.TIFF lub .JPG).
    2. Wybrać Image > Type > 8-bit, aby zmienić obraz z 24-bitowego RGB na 8-bitowy. Zainstalować wtyczkę Wound Healing Size Plugin, wybierając Plugins > Macros > Install > Wound Healing Size Plugin.
    3. Obrócić obraz tak, aby zarysowanie było pionowe, i zainicjować wtyczkę Wound Healing Size Tool.
    4. Wybrać parametry wtyczki w oknie dialogowym, aby jak najlepiej dopasować je do rany zarysowanej. Ustawić wartości parametrów dla opcji wielkości gojenia rany następująco: Variance Window Radius na 20, wartość Threshold na 100, Percentage of Saturated Pixels na 0.001 oraz wybrać Yes dla Set Scale Global. Zatwierdzić wybór, klikając przycisk OK . Sprawdzić, czy wybrany obszar jest obszarem rany. Powyższe parametry mogą wymagać standaryzacji w zależności od laboratorium.
    5. Powtórzyć kroki 2.4.2.-2.4.4. dla pozostałych punktów czasowych dla każdego zarysowania.
    6. Obliczyć procent gojenia powierzchni zarysowania przez migrujące lub proliferujące komórki w ciągu 24 h w następujący sposób:
      % Gojenia rany = Wzór obliczania zmiany temperatury, \(\frac{(T_0-T_C)}{T_0} \times 100\), równanie matematyczne.
      gdzie T0 = % powierzchni w czasie 0 h, a Tc = % powierzchni w 0 h, 4 h, 12 h lub 24 h.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ HA na naprawę tkanek i gojenie ran w różnych tkankach i narządach jest dobrze udokumentowany; jednak specyficzne działanie HA o masie cząsteczkowej 35 kDa na gojenie i regenerację jelita cienkiego płodu lub noworodka jest obecnie nieznane. Aby przetestować zdolność HA35 do promowania gojenia ran w modelu jelita cienkiego płodu lub noworodka, wygenerowano trójwymiarowe enteroidy jelitowe z tkanki jelita krętego NHP, a następnie dysocjowano tę tkankę do pojedynczych komórek w celu stworzenia dwuwymiarowych monowarstw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przewód pokarmowy wcześniaka znajduje się pod ciągłą presją regeneracyjną spowodowaną powtarzającym się narażeniem na czynniki środowiskowe związane z dysbiozą, zapalnymi metabolitami bakteryjnymi i toksynami oraz przerywanym niedotlenieniem23,24. Niestety, nabłonek jelitowy wcześniaka nie jest w stanie szybko ustanowić integralności funkcjonalnej23, co skutkuje dysfunkcją bariery, zwiększoną przepuszczalnością jelit, a w ciężkich przypadk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy National Institutes of Health. HC jest wspierany przez P20GM134973 grantowe z National Institutes of Health. KB jest wspierany przez granty Fundacji Szpitala Dziecięcego (CHF) i Fundacji Zdrowia Prezbiteriańskiego (PHF). Usługi obrazowania żywych komórek świadczone przez Cancer Functional Genomics były częściowo wspierane przez National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 oraz National Cancer Institute Grant P30CA225520 of the National Institutes of Health, przyznany University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 10 mlFisher Scientific13-675-49
Naczynie 100x21mm, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific172931
15 ml Rurka stożkowaVWR89039-666
24-dołkowa, z powłoką TC, płaska płytadenna Corning3524
37 µ M Odwracalne sitko komórkoweSTEMCELL Technologies27215
50 ml Rurka stożkowaVWR89039-658
70 µ m Sterylne sitka komórkoweFisher ScientificFB22-363-548
Albumina bydlęca (BSA)VWR0332-100G
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3DPromegaG9681
Zmodyfikowana mieszanka szynki Eagle's Modified Eagle's Medium / Nutrient F-12 (DMEM-F12) z 15 mM buforem HEPESSTEMCELL Technologies36254
Delikatna komórka Odczynnik dysocjacyjnySTEMCELL Technologies100-0485
ImageJNIHimagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Przyrząd do analizy żywych komórekSartorius4647
Moduł oprogramowania do analizy ran zadrapań IncucyteSartorius9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010To jest HOGMY, ale bez Y-27632 i antybiotyków. Stosowany również jako baza dla HOGM, ale wtedy brakuje tylko antybiotyków.
Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4, oczyszczone metodą chromatografii z filtracją żelowąMillipore SigmaL3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, Phenol Red-FreeCorning 356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, płaskodenna mikropłytkaThermoFisher Scientific136101
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 1X [-] Wapń, magnez, pH 7,4Corning21-040-CM
PrimocinInvivogenant-pm-1Jest to antybiotyk o szerokim spektrum działania
Hialuronian sodu, klasa badawcza, HA20KLifecore BiomedicalHA20K-1
TC20 Automatyczny licznik komórek Firma: Bio-Rad1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0,25% trypsynyFisher ScientificMT25053CI
Y-27632Technologie STEMCELL72302

Bibliografia

  1. Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
  2. Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550(2021).
  3. Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
  4. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
  5. Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
  6. He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
  7. Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
  8. Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
  9. vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
  10. Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
  11. Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
  12. Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
  13. Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14(2019).
  14. Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
  15. Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546(2020).
  16. Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030(2021).
  17. Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
  18. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  19. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).
  20. Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).
  21. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  22. Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
  23. de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).
  24. Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620(2013).
  25. Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
  26. Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
  27. Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
  28. Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
  29. Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).
  30. Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
  31. Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
  32. Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
  33. Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
  34. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  35. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).
  36. Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
  37. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  38. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monowarstwy enteroid wtest rany scratch assayregeneracja jelitmigracja kom rekproliferacja kom rekjelito przedwcze nie urodzonegojenie rananaliza w programie ImageJmacierz zewn trzkom rkowa
Wpływ kwasu hialuronowego 35 kDa na model in vitro przedwczesnego uszkodzenia jelita cienkiego i gojenie za pomocą monowarstw pochodzących z enteroidu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.