Lizaty płytkowe stanowią nowe narzędzie do leczenia chorób powierzchni oka. W tym miejscu proponujemy metodę przygotowania, dozowania, przechowywania i charakterystyki lizatu płytkowego pobranego od dawców płytek krwi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Lizaty płytkowe stanowią nowe narzędzie do leczenia chorób powierzchni oka. W tym miejscu proponujemy metodę przygotowania, dozowania, przechowywania i charakterystyki lizatu płytkowego pobranego od dawców płytek krwi.
Różne choroby powierzchni oka leczy się kroplami do oczu pochodzącymi z krwi. Ich stosowanie zostało wprowadzone do praktyki klinicznej ze względu na zawartość metabolitów i czynników wzrostu, które sprzyjają regeneracji powierzchni oka. Krople do oczu na bazie krwi mogą być przygotowywane z różnych źródeł (np. z oddawania krwi pełnej lub aferezy płytek krwi), a także z różnych protokołów (np. różne rozcieńczenia i cykle zamrażania/rozmrażania). Ta zmienność utrudnia standaryzację protokołów klinicznych, a co za tym idzie, ocenę ich skuteczności klinicznej. Uszczegółowienie i udostępnienie procedur metodologicznych może przyczynić się do określenia wspólnych wytycznych. W ciągu ostatnich lat produkty allogeniczne rozpowszechniły się jako alternatywa dla leczenia autologicznego, ponieważ gwarantują wyższe standardy skuteczności; wśród nich krople do oczu z lizatem osocza bogatopłytkowego (PRP-L) są przygotowywane przy użyciu prostych procedur produkcyjnych. Na oddziale medycyny transfuzjologicznej w AUSL-IRCCS di Reggio Emilia we Włoszech PRP-L jest pozyskiwany z dawstwa aferezy płytkowej. Ten produkt jest początkowo rozcieńczany do 0,3 x 109 płytek krwi/ml (zaczynając od średniego stężenia 1 x 109 płytek krwi/ml) w 0,9% NaCl. Rozcieńczone płytki krwi są zamrażane/rozmrażane, a następnie odwirowywane w celu usunięcia zanieczyszczeń. Końcową objętość dzieli się na podwielokrotności o pojemności 1,45 ml i przechowuje w temperaturze -80 °C. Przed wydaniem pacjentom krople do oczu są testowane pod kątem sterylności. Pacjenci mogą przechowywać lizaty płytek krwi w temperaturze -15 °C przez okres do 1 miesiąca. Skład czynnika wzrostu jest również oceniany na podstawie losowo wybranych podwielokrotności, a średnie wartości są tutaj podawane.
Produkty krwiopochodne są szeroko stosowane w leczeniu ran1, chirurgii szczękowo-twarzowej i ortopedycznej oraz w leczeniu różnych chorób powierzchni oka2 takich jak zespół suchego oka (DED)3. W DED homeostaza filmu łzowego jest zaburzona w wyniku nieprawidłowego funkcjonowania różnych czynników biorących udział w wytwarzaniu łez i integralności powierzchni oka4,5.
DED charakteryzuje się niejednorodnością przyczyn i nasilenia6,7,8 i może być konsekwencją różnych czynników, takich jak starzenie się, sex9, soczewki kontaktowe, leki miejscowe lub ogólnoustrojowe10, lub wcześniej istniejące schorzenia, takie jak zespół Sjögrena10. Pomimo łagodnych objawów, DED dotyka miliony ludzi na całym świecie, wpływając na jakość ich życia i system opieki zdrowotnej6.
Opisano wiele metod leczenia tej patologii, ale nadal nie ma zgody co do najskuteczniejszego rozwiązania12. Do tej pory sztuczne łzy są pierwszą linią terapii mającą na celu przywrócenie wodnego składu filmu łzowego, chociaż te substytuty nie zawierają głównych biologicznie aktywnych substancji rozpuszczonych naturalnych łez6,11. Produkty na bazie płytek krwi są uważane za ważną alternatywę12,13 dla sztucznych łez, chociaż ich skuteczność kliniczna, zalecenia dotyczące stosowania i metody przygotowania są nadal przedmiotem dyskusji3.
Produkty krwiopochodne dzielą z łzami podobny skład pod względem metabolitów14, białka, lipidy, witaminy, jony, czynniki wzrostu (GFs), związki przeciwutleniające11 i osmolarność (300 mOsm/L)11. Poprzez synergistyczne działanie ich składników wspomagają regenerację nabłonka rogówki, hamują uwalnianie cytokin zapalnych, a także zwiększają liczbę komórek kubkowych i ekspresję mucyn w spojówce2,3.
Do tej pory w literaturze udokumentowano niejednorodność produktów na bazie krwi okulistycznej; produkty te można sklasyfikować według pochodzenia dawcy krwi, tj. autologicznego lub allogenicznego, a także źródła krwi, tj. krwi obwodowej, krwi pępowinowej, surowicy lub płytek krwi.
Chociaż produkty autologiczne były najbardziej rozpowszechnione3, obecnie preferowanym wyborem stają się produkty allogeniczne, ponieważ zapewniają wyższą skuteczność i standardy bezpieczeństwa15, wraz ze znacznym obniżeniem kosztów16,17. Wcześniejsze badania rzeczywiście dowiodły, że produkty krwiopochodne uzyskane od pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi i/lub ogólnoustrojowymi mogą wykazywać zmienioną jakość i funkcjonalność6,16,17. Pomimo faktu, że krople do oczu na bazie serum są najbardziej rozpowszechnione, produkty na bazie płytek krwi są ostatnio uznawane za ważną alternatywę, ponieważ można je łatwo przygotować przy zachowaniu znacznego poziomu skuteczności3,11. Obecnie dostępne produkty na bazie płytek krwi można podzielić na osocze bogatopłytkowe (PRP), lizat osocza bogatopłytkowego (PRP-L) oraz osocze bogate w czynniki wzrostu (PRGF)3.
Wśród nich, PRP-L ma tę zaletę, że jest produktem mrożonym o długim okresie przydatności do spożycia. PRP-L może być przygotowany z aferezy, kożuchówki, a nawet z wygasających płytek krwi (PLT)18,19, co znacznie zmniejsza ich marnotrawstwo. Podwielokrotności mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w ośrodkach transfuzji krwi w temperaturze -80 °C lub nawet w domach pacjentów w temperaturze -15 °C przez krótszy okres.
PRP-L są wysoce wzbogacone w GFs, które, jak udowodniono, stymulują regenerację powierzchni oka12,20,21. Niemniej jednak istnieje tylko kilka doniesień o badaniach klinicznych w tej dziedzinie, a wszystkie z nich korzystały ze źródeł autologicznych3,22. PRP-L nadal wymaga dalszej walidacji i charakterystyki, zanim będzie mógł być rutynowo stosowany w leczeniu chorób powierzchni oka, ponieważ nie ma znormalizowanych wytycznych dotyczących jego przygotowania, wydawania i przechowywania3.
Niniejszym udostępniono szczegółowy protokół produkcji PRP-L używanego w Zakładzie Medycyny Transfuzjologicznej w AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Włochy, oraz wydawania leku pacjentom z DED. Naszym celem jest pomoc społeczności naukowej w opracowaniu standardowych metod przygotowania, które mogą zwiększyć jednorodność i spójność w badaniach i podejściach klinicznych na całym świecie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
PRP-L używane do ilościowej oceny czynników wzrostu zostały zebrane w ramach szerszego badania dotyczącego charakterystyki produktów PRP do celów regeneracyjnych, przeprowadzonego w AUSL-IRCCS di Reggio Emilia i zatwierdzonego przez Komitet Etyczny Area Vasta Emilia Nord w dniu 10 stycznia 2019 r. (numer protokołu 2019/0003319). Darczyńcy wyrazili świadomą zgodę zgodnie z Deklaracją Helsińską. Nie była wymagana etyczna zgoda na gromadzenie zagregowanych, anonimowych danych z kwestionariusza Indeksu Chorób Powierzchni Oka (OSDI), który jest rutynowo stosowany przez klinicystów do monitorowania objawów zespołu suchego oka. Rysunek 1A pokazuje zarys zastosowanego protokołu, podczas gdy zdjęcia w Rysunek 1B przedstawia główne etapy procedury.
1. Pobieranie osocza bogatopłytkowego (PRP)
2. Preparat lizatu osocza bogatopłytkowego (PRP-L)
3. Dyspensa PRP-L
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Uzasadnienie zastosowania kropli do oczu pochodnych surowicy (które są produktem opartym na krwi najczęściej stosowanym w leczeniu chorób powierzchni oka) wynika z zawartości czynników wzrostu (GFs), które pochodzą niemal w całości z krążących płytek krwi. PRP zawiera znacznie większą liczbę płytek krwi (a w konsekwencji więcej pochodnych od płytek czynników wzrostu) w porównaniu z surowicą krwi obwodowej, w zakresie od 0,15 x 109 do 0,45 x 109 PLTs/mL. Zgodnie z włoskimi przepisami, liczba płytek k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W ostatnich latach wzrosło kliniczne stosowanie produktów na bazie płytek krwi w patologiach powierzchni oka, ale ich dyfuzja jest utrudniona przez brak solidności naukowej. Jest to spowodowane głównie dużą różnorodnością źródeł dawców i protokołów przygotowania, które często nie są w pełni ujawnione lub nie są specjalnie zaprojektowane do celu, dla którego są wydawane. W szczególności wciąż brakuje informacji na temat produktów na bazie płytek krwi zbieranych metodą aferezy. W związku z tym celem niniejszej pracy było o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Autorzy pragną podziękować "Casa del Dono di Reggio Emilia" za dostarczenie koncentratów płytek krwi pochodzących od dawców.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Niemcy | zgrzewarka do worków | |
| Kaptur HeraSafe | Heraeus Instruments, Niemcy | Kaptur klasy II zagrożenia biologicznego | |
| MCS+ 9000 Mobilny system pobierania płytek | Haemonetics, Włochy | zautomatyzowany sprzęt do pobierania osocza i wieloskładnikowego do oddawania płytek krwi, krwinek czerwonych, osocza lub złożonych składników krwi | |
| Wytrząsarka płytek krwi, PF396i | Helmer, USA | Wytrząsarka płytek krwi | |
| Raycell X-ray Napromiennik krwi | MDS Nordion, Kanada | Promiennik rentgenowski krwi | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Niemcy | Szybka intrifuga | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Niemcy | Hemocytometr do oznaczania liczby płytek | |
| krwi Ciepła kąpiel, WB-M15 | Falc Instruments, Włochy | Ciepła kąpiel | |
| Materiały | |||
| Roztwór antykoagulantu ACD-A A Fenwal | Inc., Stany Zjednoczone | DIN 00788139 | roztwór przeciwzakrzepowy do aferezy płytek krwi (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Fiolki do hodowli | bydła BD Biosciences, USA | BD 442020 | Test sterylności |
| BD BACTEC Fiolki do hodowli peds Plus/F | BD Biosciences, USA | 442020 | Co najmniej 2 fiolki do testu sterylności |
| Strzykawka BD Luer Lok | BD Plastipack, USA | 300865 | Co najmniej 4 sterylne strzykawki (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standardowy panel do oceny |
| izoform PDGFBio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standardowy panel do oceny EGF |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | Ten instrument umożliwia wiele testów immunologicznych przy użyciu funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. |
| Test Bio-Plex Pro TGF-b | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Zestaw i standardy do oceny izoform TGFb |
| BioRet | ARIES s.r.l., Włochy | A2DH0020 | Co najmniej 4 kolce do przekłuwania worków na krew |
| Probówka do pobierania krwi | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 probówka, niezbędna do wykonywania liczby |
| płytek krwiZestaw kropli do oczu. Wyrób medyczny COL do aplikacji i konserwacji kropli do oczu z hemokomponentów | Biomed Device s.r.l., Włochy | do oczu COLC50 | . Co najmniej 2 zestawy dla każdej pobranej jednostki PRP |
| Rak u człowieka Zestaw PDGF-AB/BB 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Zestaw do oceny izoform PDGF |
| Rak u człowieka2 Zestaw EGF 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Zestaw do oceny EGF |
| NaCl 0,9% sterylny roztwór | Baxter S.p.A., Włochy | B05BB01 | 1000 ml |
| Kwestionariusz OSDI | Allergan Inc., Stany Zjednoczone | Kwestionariusz indeksu chorób powierzchni oka | OSDI |
| Kolec do przekłuwania | BioRet ARIES s.r.l., Włochy | BS051004 | |
| Spike Dodatek do płytek krwi A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Włochy | 40842 | roztwór konserwujący do koncentratów płytek krwi (1000 ml) |
| Oprogramowanie Excel | Microsoft, USA | Excel Oprogramowanie do | analizy danych |
| Teruflex Worek transferowy 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Włochy | BB*T100BM | 1 do rozcieńczania PRP |
| Teruflex Worek transferowy 300 ml | TERUMO BCT Inc., Włochy | BB*030CM | Co najmniej 6 na każdą zebraną jednostkę PRP |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.