Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63776

⸱

23 marca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Streszczenie

Ten protokół opisuje metody izolacji, warunki hodowli i charakterystykę ludzkich komórek pierwotnych o wysokiej wydajności i żywotności przy użyciu szybkiej dysocjacji enzymatycznej skóry. Pierwotne keratynocyty, fibroblasty i komórki Schwanna są pobierane z ludzkiego napletka noworodka, który jest dostępny zgodnie ze standardowymi procedurami pielęgnacyjnymi. Usunięta skóra jest dezynfekowana, a podskórny tłuszcz i mięśnie są usuwane za pomocą skalpela. Metoda polega na enzymatycznym i mechanicznym rozdzieleniu warstwy naskórka i skóry właściwej, a następnie dodatkowym trawieniu enzymatycznym w celu uzyskania zawiesin jednokomórkowych z każdej z tych warstw skóry. Wreszcie, pojedyncze komórki są hodowane w odpowiednich pożywkach do hodowli komórkowych zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, aby utrzymać wzrost i żywotność przez tygodnie. Razem ten prosty protokół umożliwia izolację, hodowlę i charakterystykę wszystkich trzech typów komórek z jednego kawałka skóry w celu oceny in vitro modeli skórno-nerwowych. Ponadto komórki te mogą być używane razem w kokulturach w celu oceny ich wpływu na siebie nawzajem i ich reakcji na traumę in vitro w postaci zadrapań wykonanych metodą robotyczną w hodowli związanej z gojeniem się ran.

Wprowadzenie

Pierwotne komórki pochodzące z żywej tkanki i hodowane w warunkach in vitro bardzo przypominają stan fizjologiczny1, co czyni je idealnym modelem do badania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych. Skóra zawiera wiele typów komórek, w tym keratynocyty, fibroblasty, sebocyty, melanocyty i komórki Schwanna (SC), które można izolować i hodować do eksperymentów in vitro. Metody izolacji i hodowli keratynocytów, fibroblastów i SC z pojedynczego fragmentu skóry nie zostały opisane. Cel tego protokołu jest dwojaki: 1) ustanowienie wiarygodnej i powtarzalnej metody izolacji i hodowli skórnych SC oraz 2) zastosowanie skutecznej, solidnej metody izolacji keratynocytów, fibroblastów i SC z pojedynczego ludzkiego napletka.

Obecnie istnieją ustalone protokoły izolacji keratynocytów skóry2,3,4 i fibroblasty5,6. Badania te opisują izolację keratynocytów, fibroblastów lub obu tych elementów ze skóry, ale żaden protokół nie określa, w jaki sposób ustalić hodowle pierwotnych SC ze skóry ludzkiej. Ostatnie badania sugerują, że neuronalne SC modulują procesy komórkowe keratynocytów i fibroblastów oraz regulują normalne funkcje fizjologiczne skóry7. SC mają zatem kluczowe znaczenie dla homeostazy skóry i w znacznym stopniu przyczyniają się do regulacji fizjologii, która wpływa na zachowanie sąsiednich typów komórek skóry8. Dlatego protokół, który pozwala na izolację każdego z tych typów komórek, jest idealny do eksperymentów in vitro obejmujących komunikację komórka-komórka lub wzajemne rozmowy między typami komórek.

Ten protokół opisuje tworzenie indywidualnych kultur komórkowych komórek pierwotnych z pojedynczego kawałka skóry. Protokół ten jest szczególnie przydatny, gdy ilość dostępnej tkanki jest ograniczona. Co więcej, izolacja wszystkich trzech typów komórek od jednego dawcy pozwala na rzetelne porównania między typami komórek lub eksperymenty z kokulturą, jednocześnie łagodząc wpływ genetyki podczas pożądanego eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pozyskiwanie i używanie pozbawionej elementów identyfikujących ludzkiej tkanki napletka do celów badawczych zostało sprawdzone i otrzymało ocenę "nie badania na ludziach" przez Institutional Review Board (IRB #17574).

UWAGA: Postępując zgodnie z poniższym protokołem, z pojedynczego napletka uzyskuje się 2,4 x 106 keratynocytów, 4,4 x 106 fibroblastów i 1,1 x 106 SC. Ogólnie rzecz biorąc, te pierwotne komórki mogą być używane do 3 pasaży, w zależności od warunków eksperymentalnych.

1. Izolacja komórek pierwotnych i warunki hodowli

  1. Procedura separacji naskórka i skóry właściwej
    1. Zdobądź napletek noworodka zgodnie ze standardowymi procedurami pielęgnacyjnymi przez lekarza zgodnie z zatwierdzonymi szpitalnymi protokołami regulacyjnymi. Lekarz określa czas obrzezania po porodzie i ilość usuniętej skóry.
    2. Umieść wycięty napletek w probówce mikrowirówkowej zawierającej 8-10 ml lodowatej pożywki podstawowej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) i natychmiast przetransportuj napletek do laboratorium hodowli komórkowych w celu izolacji komórek. Spłucz skórę dwukrotnie 20-25 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającej 1x antybiotyk/antybiotyk.
      UWAGA: Aby uzyskać maksymalną żywotność komórek, wycięty napletek należy umieścić w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia, a komórki należy pobrać w ciągu 24 godzin.
    3. Po spłukaniu w DPBS/antybiotykach namocz napletek w 25-30 ml lodowatego podłoża podstawowego DMEM przez 10-15 minut w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. Wykonaj wszystkie etapy przetwarzania w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.
    4. Za pomocą skalpela ostrożnie rozetnij napletek i odsłoń skórę właściwą oraz podskórną tkankę tłuszczową.
    5. W razie potrzeby usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą kleszczy, ostrza skalpela i nożyczek. Wyrzuć tkankę tłuszczową. Oczyszczony napletek pokrój na trzy do pięciu mniejszych kawałków.
    6. Przenieść kawałki skóry do sterylnej stożkowej probówki zawierającej 16-20 ml pożywki dispase-I/DMEM (4 mg/ml w pożywce podstawowej DMEM).
    7. Wymieszać kawałki skóry w stożkowej probówce przez inwersję, z przerwami, podczas pierwszych 30 minut inkubacji z dyspazą-I. Następnie umieścić stożkową rurkę w temperaturze 4 °C na 16-18 godzin, pamiętając o zanurzeniu kawałków skóry w dispase-I/media.
      UWAGA: Roztwór Dispase-I należy przygotować tuż przed dodaniem przy użyciu zimnego podłoża podstawowego DMEM, przefiltrowanego sitkiem o wielkości 0,22 μm i utrzymywanego w temperaturze 4 °C.
    8. Po całonocnym trawieniu za pomocą dispasy-I, usuń kawałki skóry i umieść je na suchym, sterylnym naczyniu hodowlanym. Rozwiń każdy kawałek skóry tak, aby zewnętrzna warstwa naskórka dotykała naczynia hodowlanego.
    9. Za pomocą dwóch zestawów kleszczy ostrożnie oddziel naskórek od skóry właściwej. Zacznij od krawędzi tkanki i oderwij naskórek od skóry właściwej.
      UWAGA: Jeśli warstwa naskórka jest trudna do oddzielenia od skóry właściwej, trawienie dispazy-I nie było wystarczające. Możliwości rozwiązywania problemów: 1) umieścić kawałki skóry z powrotem w roztworze dispazy-I/DMEM i inkubować przez dodatkowe 2-3 godziny w temperaturze 4 °C; 2) umieścić kawałki skóry w świeżej dyspazie-I/DMEM i inkubować w temperaturze 4 °C przez kolejne 2-3 godziny.
    10. Użyj oddzielonego naskórka i skóry właściwej do wyizolowania keratynocytów (naskórka) i fibroblastów oraz komórek Schwanna (skóry właściwej).
      UWAGA: Postępuj zgodnie z poniższymi krokami dla określonych typów komórek, izolacji i warunków hodowli.
  2. Izolacja keratynocytów od naskórka
    1. Dodać 5 ml soli fizjologicznej z buforem HEPES (HBS) do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i dodać oddzielone fragmenty naskórka. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
    2. Po inkubacji HBS zebrać roztwór HBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 5 ml buforu neutralizującego trypsynę (TNB) (tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odstawić.
    3. Dodaj 3 ml roztworu trypsyny do fragmentów naskórka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    4. Delikatnie mieszaj fragmenty naskórka za pomocą kleszczy, aż roztwór trypsyny stanie się mętny.
    5. Dodać roztwór trypsyny/keratynocyty do probówki zawierającej HBS i TNB w kroku 1.2.2.
    6. W przypadku pozostałych fragmentów naskórka, które nie rozpuściły się w początkowym trawieniu trypsyny, dodaj 3 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut i powtórzyć czynności opisane w pkt 1.2.4 i 1.2.5.
    7. Dodać 2 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do roztworu trypsyny/EDTA zawierającego probówki z roztworem HBS i TNB.
    8. Odwirować probówkę zbiorczą zawierającą HBS/TNB/trypsynę i keratynocyty w temperaturze 870 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml kompletnej pożywki wzrostowej keratynocytów (tabela materiałów).
    10. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sterylnego filtra 100 μM do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia zanieczyszczeń.
    11. Określ ilościowo liczbę komórek i żywotność komórek.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano specjalistyczne urządzenie do pobierania próbek i barwienia komórek (Tabela materiałów) do ilościowego określenia liczby komórek i żywotności zgodnie z instrukcjami producenta.
    12. Płytki do hodowli nasion w razie potrzeby do eksperymentów. Zalecana gęstość wysiewu to ~45 000 komórek/cm2.
    13. Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO2 na 2 dni, aby keratynocyty przylgnęły do naczynia.
    14. Po 2 dniach odessać wszystkie nieprzylegające komórki. Odświeżaj pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień, aż keratynocyty osiągną pożądaną konfluencję do pasażu lub dalszych eksperymentów (50%-80% konfluencji).
  3. Izolacja komórek Schwanna (SC) i fibroblastów ze skóry właściwej
    1. Wstępnie pokryj kolby T25 poli-L-lizyną (PLL, 0,01 μg/μL) przy użyciu 5 ml 1x DPBS. Umieścić wstępnie powlekane kolby w temperaturze 37 °C na 3 godziny. Umyć matrycę powłoki PLL dwukrotnie za pomocą 1x DPBS (5 ml).
      UWAGA: Kolby T25 można przygotować z wyprzedzeniem.
    2. Przepłukać izolowane kawałki skóry właściwej 5 ml podłoża bazowego DMEM.
    3. Zmiel skórę właściwą na małe kawałki nożyczkami lub skalpelem.
    4. Rozdrobnioną skórę właściwą trawić 5 ml kolagenazy (2 mg/ml w podłożu podstawowym DMEM) w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny. Delikatnie rozcierać zmieloną skórę właściwą końcówką pipety co 30 minut, aż do całkowitego dysocjacji skóry właściwej.
    5. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o pojemności 70 μM. Konieczne jest przyłożenie siły mechanicznej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aby całkowicie przefiltrować zawiesinę.
    6. Rozcieńczyć przefiltrowaną zawiesinę komórkową 5 ml kompletnej pożywki DMEM (pożywka podstawowa DMEM + 5% FBS + 1x antybiotyku), aby zatrzymać aktywność enzymatyczną kolagenazy.
    7. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 870 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
    8. Z tej osadki komórkowej zostaną uzyskane zarówno fibroblasty, jak i SC. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnej pożywki DMEM w celu podzielenia komórek (1 ml zawiesiny komórek/probówka) i odwirować przy 870 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. W przypadku hodowli SC wykonaj kroki 1.3.10-1.3.17, a w przypadku hodowli fibroblastów wykonaj kroki 1.3.18-1.3.22.
    10. Począwszy od kroku 1.3.8, odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej kompletnej pożywki DMEM.
    11. Określ ilościowo liczbę komórek i żywotność.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano specjalistyczne urządzenie do pobierania próbek i barwienia komórek (Tabela materiałów) do ilościowego określenia liczby komórek i żywotności zgodnie z instrukcjami producenta.
    12. Wysiewać wstępnie powlekane kolby T25 5 ml zawieszonych komórek o gęstości 4,0 x 103 komórki/ml. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez noc (~12-16 godzin inkubacji).
    13. Po 16 godzinach potwierdź adhezję komórek za pomocą mikroskopii (tabela materiałów) przy 10-krotnym powiększeniu.
    14. Usunąć nieprzylegające komórki i umyć kolbę 3x 5 ml 1x DPBS.
    15. Dodać 5 ml 10 μM arabinozydu cytozyny (środek przeciwmitotyczny, zabija fibroblasty) w kompletnym pożywce DMEM. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 24 godziny.
    16. Odessać pożywkę zawierającą arabinozyd cytozyny z kolby. Przepłukać kolbę 3x 5 ml 1x DPBS.
    17. Ponownie napełnić kolbę hodowlaną 5 ml pożywki kompletnej pożywki SC (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 48 godzin. Odświeżać pożywkę SC complete culture co drugi dzień, aż SC osiągną 80% zbieżności.
    18. Odessać supernatant ze zdysocjowanej warstwy skóry właściwej (krok 1.3.8) i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml kompletnej pożywki fibroblastów (podłoże podstawowe fibroblastów + 5% FBS + 1x antybiotyk).
    19. Określ ilościowo liczbę komórek i żywotność komórek.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano specjalistyczne urządzenie do pobierania próbek i barwienia komórek (Tabela materiałów) do ilościowego określenia liczby komórek i żywotności zgodnie z instrukcjami producenta.
    20. Płytkę z fibroblastami o gęstości komórek 4,0 x 103 komórek/ml w kolbach hodowlanych T25 (niepokrytych wcześniej) przy użyciu 5 ml kompletnej pożywki fibroblastów. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez noc (~12-16 h inkubacji).
    21. Po 16-24 godzinach potwierdź adhezję komórek za pomocą mikroskopii (tabela materiałów) przy 10-krotnym powiększeniu. Odessać nieprzylegające komórki z kolby i przemyć kolbę dwukrotnie 5 ml 1x DPBS.
    22. Dodać 5 ml świeżej kompletnej pożywki fibroblastów i inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 48 godzin. Odświeżać pożywkę hodowlaną co drugi dzień, aż fibroblasty osiągną pożądane zbieganie do pasażowania lub dalszych testów (50%-80% konfluencji).

2. Weryfikacja keratynocytów naskórka, skórnych SC i markera białkowego fibroblastów za pomocą immunofluorescencji

  1. Dzień 1 - Szkiełka do komory obsypowej i odłączane komórki
    1. Wstępnie pokryj 4-dołkowe szkiełka szklane kolagenem-I dla keratynocytów lub PLL dla SC lub tylko 1x DPBS dla fibroblastów (0,5 ml dla każdego dołka). Upewnij się, że pokryłeś całą powierzchnię. Szkiełka w komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Podczas inkubacji przygotuj komórki.
    2. Po osiągnięciu przez hodowane komórki 50%-80% konfluencji, umyj kolby 1x DPBS 3x (1 ml na każdą studzienkę).
    3. Odłączyć przylegające komórki za pomocą 5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA (TE) przez inkubację w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 2 minuty, aż komórki zaczną się zaokrąglać. Wizualizacja oderwania komórek za pomocą mikroskopii (tabela materiałów) w 10-krotnym powiększeniu.
    4. Po inkubacji przenieść roztwór TE zawierający komórki do stożkowej probówki z 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    5. Dodać 5 ml buforu neutralizującego trypsynę (TNB) do kolby hodowlanej, a następnie przenieść zawartość do wyżej wymienionej probówki wirówkowej (komórki z TE i FBS). Wizualizacja oderwania komórek za pomocą mikroskopii (tabela materiałów) przy 10-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: TNB lub FBS lub oba mogą być używane do neutralizacji aktywności trypsyny.
    6. Odwirować stożkową probówkę zawierającą komórki/TE/TNB przy 870 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do innej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiednim kompletnym pożywce hodowlanej. Zmierz żywotność komórek, jak wspomniano w kroku 1.2.11.
    7. Przepłukać wstępnie powlekane szkiełka szklane komory (krok 2.1.1) 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) 3x.
    8. Półsuche szkiełka wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej i keratynocyty nasienne, SC lub fibroblasty o odpowiedniej gęstości (30 000 komórek/0,5 ml/komorę) w odpowiedniej kompletnej pożywce do hodowli komórkowych.
    9. Inkubować szkiełka w komorze w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić przyleganie komórek.
  2. Dzień 2- Zablokowanie szkiełka komory za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych
    1. Odessać pożywkę komórkową ze szkiełek komory i przemyć 3x 1 ml 1x DPBS.
    2. Utrwalić przylegające komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej.
    3. Odessać 4% paraformaldehydu ze szkiełek komorowych i umyć szkiełka 3x 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę).
    4. Przeniknąć błony komórkowe 1% TritonX-100 w 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać roztwór blokujący ze szkiełek komory, przemyć 3x 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) przez 30 s, a następnie odessać 1x DPBS ze studzienki.
    6. Zablokuj szkiełka komory 5% BSA (0,5 ml na każdą studzienkę) i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać roztwór blokujący ze szkiełek komory, przemyć 3x 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) przez 30 s każdy, a następnie odessać 1x DPBS z dołka.
    8. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe 5% BSA (0,2 ml na każdą studzienkę) (Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych: Keratynocyty: mysie przeciwciało cytokeratyny 14 (1:100) i przeciwciało cytokeratyny 10 (1:100); Komórki Schwanna: mysie przeciwciało S100 (1:200) i przeciwciało przeciwko receptorowi czynnika wzrostu nerwów królika (p75-NTR) (1:500); Fibroblasty: przeciwciało przeciwko wimentynie królika (1:200) i przeciwciało alfa-aktyny mięśni gładkich myszy (α-SMA) (1:200)).
    9. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do odpowiednich komórek na szkiełku podstawowym i inkubować przez około 15-16 godzin (przez noc) w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    10. Odessać przeciwciała pierwszorzędowe ze szkiełek komory, przemyć 3 razy 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) przez 30 s każdy, a następnie odessać 1x DPBS z dołka.
    11. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze IgG drugorzędowe - Alexa Fluor 488 (1:500) i kozie przeciwciało anty-mysie IgG - Alexa Fluor 594 (1:500)) 0,5% BSA. Dodaj odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do każdej studzienki (0,2 ml na każdą studzienkę). Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Odessać przeciwciało wtórne ze szkiełek komorowych, przemyć 3x 1x DPBS (1 ml na każdą studzienkę) przez 30 s każdy, a następnie odessać 1x DBPS z dołka.
    13. Usuń uszczelkę z 4-dołkowego suwaka komorowego za pomocą zmywacza do uszczelek. Staraj się nie pozostawiać kleju na szkiełku, ponieważ przeszkadza to w nakładaniu szkiełka nakrywkowego. Dodaj kroplę podłoża montażowego z 4',6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI). Alternatywnie, przeciw barwieniu studzienek za pomocą DAPI i użyciu nośnika montażowego niezawierającego etykiety.
    14. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, unikając pęcherzyków powietrza, i uszczelnij koniec szkiełka nakrywkowego klejem. Obserwuj wzorce barwienia immunofluorescencyjnego za pomocą mikroskopii (tabela materiałów) przy 10-krotnym i/lub 20-krotnym powiększeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do izolacji pierwotnych keratynocytów naskórka oraz komórek macierzystych (SCs) skóry i fibroblastów wykorzystano prawidłową skórkę napletka noworodka. Izolowane komórki pierwotne hodowano w odpowiednich mediach do hodowli komórkowych zawierających czynniki wzrostu. Po wysianiu SCs i fibroblastów do kolb hodowlanych, większość komórek przylgnęła do dna kolby w ciągu 2 h. W przypadku keratynocytów, większość z nich przylgnęła do dna w ciągu 24 h. Izolowane pierwotne keratynocyty naskórka osiągnęły 85% konfluencji do 7. dn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę izolowania trzech odrębnych populacji komórek z jednego fragmentu napletka, a mianowicie keratynocytów, fibroblastów i komórek Schwanna. Dostępnych jest kilka protokołów izolacji keratynocytów i fibroblastów 2,3,5,6, ale żaden z nich nie opisuje izolacji SC. Oprócz kluczowych komórek strukturalnych skóry, keratynocytów i fibroblastów, skóra jest również silnie unerwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy pozostali autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Fadii Kamal i dr Reyad Elbarbary za umożliwienie nam korzystania z urządzeń laboratoryjnych i wsparcia technicznego. Praca ta była wspierana przez granty z NIH (K08 AR060164-01A) i DOD (W81XWH-16-1-0725) dla J. C. E., oprócz wsparcia instytucjonalnego z Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; Filtry sterylne M (Millex-GP Filtr strzykawkowy, polieterosulfon)MilliporeSigmaSLGPR33RS
70 µ Sitka komórkoweM CELLTREAT229483
100 & Sitka do komórek MCELLTREAT229485
Strzykawki jednorazowe 1 mlBD Luer-LokBD-309659
Strzykawki jednorazowe 5 ml (Strzykawka sterylna, jednorazowego użytku)BD Luer-LokBD309646
10 mL Strzykawki jednorazoweBD Luer-LokBD305462
1% TritonX-100SigmaX100-1LPrzygotowane w momencie użycia
4% roztwór paraformaldehyduThermoFisher ScientificJ19943. K2Gotowy do użycia i przechowywania w temperaturze 4 stopni; C
5% BSASigma A7906-100GPrzygotowany w momencie użycia
70% etanolPharmco111000200
AntybiotykScienCell Research503
Chemometec Vial1-CassetteFisher ScientificNC1420193
CollagenaseGibco17018-029
Szkiełko nakrywkoweFisherbrand12544D 22*50-1,5
Dispase ISigma-AldrichD46693
DMEM podłoże bazoweScienCell Research9221
Buforowana fosforanem sól fizjologiczna firmy Dulbecco wolna od Ca2+ i Mg2+ (DPBS)Corning  21-031-CV)
Nunc 15 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenuThermoFisher Scientific339651
Nunc 50 mL stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenuThermoFisher Scientific339653
1,5 ml mikroprobówkiFisherbrand02-681-5
Surowica bydlęca płodu (FBS)ThermoFisher Scientific10082147
Fibroblast kompletna pożywkaScienCell Research2331
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032Rozcieńczenie (1:500)
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488InvitrogenA11008Rozcieńczenie (1:500)
Buforowany roztwór soli fizjologicznej Hanksa (bufor HBSS)LonzaCC-5022
Ludzki napletekPozbawiona identyfikacji ludzka tkanka napletka do celów badawczych (Instytucjonalna Komisja Rewizyjna- IRB #17574).
Pożywka keratynocytów KGM-GOLD (złoto KGM i suplementy)Lonza00192151 i 00192152
Mysie przeciwciało aktynowe alfa-mięśni gładkichThermoFisher Scientific14-9760-82Rozcieńczenie (1:200)
Mysz Przeciwciało Cytokeratyna14Abcamab7800Rozcieńczenie (1:100)
Przeciwciało S100 myszyThermoFisher ScientificMA5-12969Rozcieńczenie (1:200)
Wielokomorowy (4-dołkowy szkiełko podstawowe)Tab-Tek154526
NucleoCounter -Via1-CassetteChemometec941-0012
Poli-L-Lizyna (PLL)ScienCell Research32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant z DAPIInvitrogenP36935
Rabbit K10Sigma-AldrichSAB4501656Rozcieńczenie (1:100)
Przeciwciało królika p75-NTRMilliporeAB1554Rozcieńczenie (1:500)
Wimentyna króliczaProteinTech10366-1-APRozcieńczenie (1:200)
Pożywka do hodowli komórek SchwannaScienCell Research1701
Pęseta precyzyjna DUMONT prosta z bardzo cienkimi końcówkami Dumostar, 5ROTHLH75.1Przed użyciem
wysterylizuj 70% alkoholemNożyczki IRIS ostre/ostre. Długość 4– 3/8 "(111mm)Codman54-6500Sterylizuj 70% alkoholem przed użyciem
Sterylizowane chirurgiczne - ostre ostrze (Duro Edge Economy Single Edge Blades)Żyletka firmy94-0120Przed użyciem wysterylizuj 70% alkoholem Kolba
hodowlana T25Corning353109
Bufor neutralizujący trypsynę (TNS)LonzaCC-5002
Trypsyna/EDTALonzaCC-5012
Mikroskop odwróconyZEISSAxio Observer 7- Axiocam 506 mono – Mikroskop Apotome.2Do immunofluorescencji szkiełka komorowego zawierającego barwione komórki
Mikroskop odwróconyZEISSPrimovertDo widzenia/obserwacji przyczepiania lub odłączania komórek
wirówkowe przeciwciało

Bibliografia

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033(2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629(2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487(2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442(2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pierwotne keratynocytypierwotne fibroblastyludzkie kom rki napletkaprotok izolacji kom rekdysocjacja enzymatycznametody hodowli kom rkowychbarwienie immunofluorescencyjnecharakterystyka typ w kom rekin vitro modele sk ry

Powiązane artykuły