Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Botanika strukturalna to niezbędna perspektywa, aby w pełni zrozumieć ekologię, fizjologię, rozwój i ewolucję roślin. Podczas badań nad roślinami mykoheterotroficznymi (tj. roślinami, które pozyskują węgiel z grzybów), niezwykłe aspekty ich adaptacji strukturalnych, wzorce kolonizacji tkanek przez grzyby i morfoanatomia podziemnych narządów mogą oświecić ich strategie rozwojowe i relacje ze strzępkami, źródłem składników odżywczych. Inna ważna rola grzybów symbiotycznych jest związana z kiełkowaniem nasion orchidei; wszystkie gatunki Orchidaceae są mykoheterotroficzne w fazie kiełkowania i siewki (początkowa mykoheterotrofia), nawet te, które fotosyntetyzują w stadiach dorosłych. Ze względu na brak rezerw odżywczych w nasionach orchidei, symbionty grzybów są niezbędne do zapewnienia substratów i umożliwienia kiełkowania. Analiza etapów kiełkowania z perspektywy strukturalnej może również odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące interakcji grzybów z nasionami. Różne techniki obrazowania można zastosować do odsłonięcia endofitów grzybów w tkankach roślinnych, jak zaproponowano w tym artykule. Odręczne i cienkie fragmenty organów roślinnych można barwić, a następnie obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Fluorochrom sprzężony z aglutyniną z kiełków pszenicy można nakładać na grzyby i inkubować razem z Calcofluor White w celu podkreślenia ścian komórkowych roślin w mikroskopii konfokalnej. Ponadto szczegółowo opisano metodologie skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla mykoheterotroficznych storczyków oraz zbadano możliwości zastosowania takich protokołów w pokrewnych roślinach. Symbiotyczne kiełkowanie nasion storczyków (tj. w obecności grzybów mikoryzowych) zostało szczegółowo opisane w protokole wraz z możliwościami przygotowania struktur otrzymanych z różnych etapów kiełkowania do analiz za pomocą mikroskopii świetlnej, konfokalnej i elektronowej.
Wprowadzenie
Badania strukturalne w botanice, obejmujące morfologię i anatomię roślin, są podstawowe dla zrozumienia całego organizmu1,2 oraz dostarczają niezbędnych perspektyw pozwalających na integrację i poszerzanie wiedzy dotyczącej ekologii, fizjologii, rozwoju i ewolucji roślin3. Metody morfologii i anatomii roślin obejmują obecnie protokoły, sprzęt i wiedzę opracowaną niedawno, jak i taką, która powstała ponad wiek temu2. Ciągłe stosowanie i adaptacja metod klasycznych (np. mikroskopii świetlnej) wraz z nowszymi technikami (np. mikroskopią konfokalną, mikrotomografią r....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie, utrwalanie i przechowywanie próbek
UWAGA: Rośliny całkowicie mikoheterotroficzne (MH) można zazwyczaj znaleźć w ciemnym podszycie leśnym12,13, głównie w obszarach wilgotnych i bogatych w ściółkę, podczas gdy rośliny częściowo MH występują w lasach bardziej otwartych12,13. Rośliny MH zazwyczaj posiadają dobrze rozwinięte organy podziemne o różnych kształtach i rozmiarach.
- Podczas zbierania gatunków MH należy przeszukać glebę wokół podstawy rośliny, uważając, aby nie uszkodzić organó....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeprowadzenie kluczowych etapów utrwalania tkanek roślinnych pozwala uzyskać struktury komórkowe jak najbliższe stanowi żywym, z uwzględnieniem morfologii, objętości oraz organizacji przestrzennej komponentów komórkowych i tkanek.16Obserwować takie cechy w próbkach po utrwaleniu chemicznym (Rycina 4). Rycina 4C-F przedstawia prawidłowo utrwalone próbki w mikroskopii świetlnej. Przeprowadzenie opisa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analizy obrazowe w zakresie anatomii i morfologii roślin mają istotny potencjał, aby spełnić cele i pomóc w zrozumieniu relacji między roślinami mykoheterotroficznymi a ich niezbędnymi endofitami grzybów, jak wykazano w badaniach podziemnych organów 6,40, analizach strukturalnych symbiotycznego kiełkowania nasion39 oraz struktur powietrznych i rozrodczych41. Botanika strukturalna, mimo że w ostatniej dekadzie straci.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za dofinansowanie od FAEPEX i FAPESP (2015/26479-6). MPP dziękuje Capesowi za stypendium magisterskie (proces 88887.600591/2021-00) i CNPq. JLSM dziękuje CNPq za granty na produktywność (303664/2020-7). Autorzy dziękują również za dostęp do sprzętu i pomocy zapewnionej przez LME (Laboratorium Mikroskopii Elektronowej - IB/Unicamp), INFABiC (Narodowy Instytut Nauki i Technologii Fotoniki Stosowanej w Biologii Komórki - Unicamp) oraz LaBiVasc (Laboratorium Biologii Naczyniowej - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) i Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) za wkład w protokół krioprotekcji; LME za wkład w protokół TEM.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aceton | Sigma-Aldrich | 179124 | (do montażu klocków SEM) |
| Agar-agar (AA) | Sigma-Aldrich | A1296 | (do testów kiełkowania nasion) |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909 | barwnik fluorescencyjny (wykrywa celulozę) |
| Roztwór buforowy cytrynianu, 0,09 M pH 4,8 | Sigma-Aldrich | C2488 | (do barwienia błękitem toluidyny O) |
| Przewodząca dwustronna taśma węglowa | Fisher Scientific | 50-285-81 | (dla SEM) |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | (dowolny model) | |
| Siatki miedziane | Sigma-Aldrich | G4776 | (dla TEM) |
| Suszarka punktu krytycznego | Balzers | (dowolny model) | |
| Kriostat | Leica Biosystems | (dowolny model) | |
| Mikroskop preparacyjny | Leica Biosystems | (= mikroskop stereoskopowy, dowolny model) | |
| Entellan | Sigma-Aldrich | 107960 | medium do szybkiego montażu do mikroskopii |
| Alkohol etylowy, czysty (≥ 99,5%) | Sigma-Aldrich | 459836 | (= etanol, do procesów odwadniania) |
| Roztwór formaldehydu, 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | (do przygotowania roztworu NBF) |
| Roztwór formaliny, obojętny buforowany, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | histologicznego utrwalacza tkanki |
| Kapsułki żelatynowe do TEM | Fisher Scientific | 50-248-71 | (do polimeryzacji żywicy w TEM) |
| Roztwór żelatyny, 2% w H2O | Sigma-Aldrich | G1393 | (rozcieńczony do przygotowania szkiełek - przyleganie OCT) |
| Roztwór aldehydu glutarowego, 25% | Sigma-Aldrich | G6257 | (dla Karnovsky' s przygotowanie roztworu) |
| HistoResin | Leica Biosystems | 14702231731 | zestaw do zatapiania metakrylanu glikolu (GMA) |
| Jod | Sigma-Aldrich | 207772 | (do przygotowania płynu Lugola) |
| Azotan ołowiu(II) | Sigma-Aldrich | 228621 | Pb(NO3)2 (do barwienia kontrastowego TEM) |
| Mikroskop świetlny | Olympus | (dowolny model) | |
| LR Biała żywica akrylowa | Sigma-Aldrich | L9774 | hydrofilowa żywica akrylowa do TEM |
| Lugol roztwór | Sigma-Aldrich | 62650 | (do barwienia) |
| Metalowe króćce do mocowania próbek | Rave Scientific | (dla SEM, różne modele) | |
| Mikrotom | Leica Biosystems | ręczny mikrotom obrotowy lub inny model | |
| Agar z płatków owsianych (OMA) | Millipore | O3506 | (do testów kiełkowania nasion) |
| Związek OCT, Tissue-Tek | Sakura Finetek USA | 4583 | pożywka do zatapiania tkanek mrożonych Tetratlenek |
| osmu | Sigma-Aldrich | 201030 | OsO4 (do postfiksacji TEM) |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | uszczelniająca folia |
| termoplastycznaParaformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | (dla Karnovsky'ego' s przygotowanie roztworu) |
| Roztwór poli-L-lizyny, 0,1% w H2O | Sigma-Aldrich | P8920 | (do przygotowania szkiełek - przyleganie OCT) |
| Szkiełka Poly-Prep | Sigma-Aldrich | P0425 | szkiełka powlekane poli-L-lizyną Tacki |
| kubki z polietylenu | Polysciences | 17177A-3 | (6x8x5 mm, do zanurzania próbek w żywicy GMA) |
| Formowanie polietylenu Tacki na kubki | Polysciences | 17177C-3 | (13x19x5 mm, do zanurzania próbek w żywicy GMA) |
| Jodek potasu | Sigma-Aldrich | 221945 | (do przygotowania roztworu Lugola) |
| Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) | Milipor | 70139 | (do testów kiełkowania nasion) |
| Skaningowy mikroskop elektronowy | Jeol | (dowolny model) | |
| Silan [(3-aminopropyl)trietoksysilan] | Sigma-Aldrich | A3648 | (do przygotowania preparatów - przyleganie OCT) |
| Preparaty silanowe Szkiełka | szklane Sigma-Aldrich | S4651 | pokryte silanem |
| Żel krzemionkowy pomarańczowy, granulowany | Supelco | 10087 | (do procesów osuszania) |
| Kakodylan sodu trójwodny | Sigma-Aldrich | C0250 | (do buforu kakodylanu aldehydu glutarowego) |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S5881 | NaOH (dla Karnovsky'ego' s przygotowanie roztworu i barwienie kontrastowe TEM) |
| Roztwór podchlorynu sodu | Sigma-Aldrich | 425044 | NaClO (do dezynfekcji powierzchni nasion) |
| Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodny | Sigma-Aldrich | 71640 | Na2HPO4 (do roztworu NBF i preparatu PB) |
| Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny | Sigma-Aldrich | S9638 | NaH2PO4· H2O (dla NBF i PB) |
| Powlekarka do napylania | Balzers | (dowolny model) | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | C12H22O11 (do krioprotekcji i testu kiełkowania) |
| Sudan III | Sigma-Aldrich | S4131 | (do barwienia) |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | 198102 | (do barwienia) |
| Sudan Black B | Sigma-Aldrich | 199664 | (do barwienia) |
| Strzykawka | (3 mL, dowolna marka, do barwienia kontrastowego TEM) | ||
| Filtr strzykawkowy, Millex-GV 0,22 i mikro; m | Millipore | SLGV033R | PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma (do barwienia kontrastowego TEM) |
| Tek Bond Super Glue 793 | Tek Bond Saint-Gobain | 78072720018 | płynny klej cyjanoakrylowy, średnia lepkość |
| Błękit toluidynowy O | Sigma-Aldrich | T3260 | (do barwienia) |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | Jeol | (dowolny model) | |
| Trifenylotetrazol chlorek | Sigma-Aldrich | T8877 | (do testu tetrazolowego w kiełkowaniu nasion) |
| Cytrynian trisodowy dwuwodny | Sigma-Aldrich | S1804 | Na3(C6H5O7)· 2H2O (do barwienia kontrastowego TEM) |
| Ultramikrotom | Leica Biosystems | (dowolny model) | |
| Octan uranylu | Fisher Scientific | 18-607-645 | UO2(CH3COO)2 (do barwienia kontrastowego TEM) |
| Pompa próżniowa | (dowolny model) | ||
| z kiełków pszenicy, Alexa Fluor 488 Conjugate | TermoFisher Scientific | W11261 | lektyna sprzężona z barwnikiem fluorescencyjnym (wykrywa pozostałości kwasu sjalowego i N-acetyloglukozaminylu) |
Bibliografia
- Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Sprin....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
