Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Streszczenie

Botanika strukturalna to niezbędna perspektywa, aby w pełni zrozumieć ekologię, fizjologię, rozwój i ewolucję roślin. Podczas badań nad roślinami mykoheterotroficznymi (tj. roślinami, które pozyskują węgiel z grzybów), niezwykłe aspekty ich adaptacji strukturalnych, wzorce kolonizacji tkanek przez grzyby i morfoanatomia podziemnych narządów mogą oświecić ich strategie rozwojowe i relacje ze strzępkami, źródłem składników odżywczych. Inna ważna rola grzybów symbiotycznych jest związana z kiełkowaniem nasion orchidei; wszystkie gatunki Orchidaceae są mykoheterotroficzne w fazie kiełkowania i siewki (początkowa mykoheterotrofia), nawet te, które fotosyntetyzują w stadiach dorosłych. Ze względu na brak rezerw odżywczych w nasionach orchidei, symbionty grzybów są niezbędne do zapewnienia substratów i umożliwienia kiełkowania. Analiza etapów kiełkowania z perspektywy strukturalnej może również odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące interakcji grzybów z nasionami. Różne techniki obrazowania można zastosować do odsłonięcia endofitów grzybów w tkankach roślinnych, jak zaproponowano w tym artykule. Odręczne i cienkie fragmenty organów roślinnych można barwić, a następnie obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Fluorochrom sprzężony z aglutyniną z kiełków pszenicy można nakładać na grzyby i inkubować razem z Calcofluor White w celu podkreślenia ścian komórkowych roślin w mikroskopii konfokalnej. Ponadto szczegółowo opisano metodologie skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla mykoheterotroficznych storczyków oraz zbadano możliwości zastosowania takich protokołów w pokrewnych roślinach. Symbiotyczne kiełkowanie nasion storczyków (tj. w obecności grzybów mikoryzowych) zostało szczegółowo opisane w protokole wraz z możliwościami przygotowania struktur otrzymanych z różnych etapów kiełkowania do analiz za pomocą mikroskopii świetlnej, konfokalnej i elektronowej.

Wprowadzenie

Badania strukturalne w botanice, obejmujące morfologię i anatomię roślin, są podstawą do zrozumienia całego organizmu^1,2, i dostarcza niezbędnych perspektyw do integracji i wkładu w wiedzę dotyczącą ekologii, fizjologii, rozwoju i ewolucji roślin³. Metody w morfologii i anatomii roślin obejmują obecnie protokoły, sprzęt i wiedzę opracowaną niedawno, a także ponad sto lat temu². Ciągłe stosowanie i adaptacja metod klasycznych (np. mikroskopii świetlnej) wraz z nowszymi technikami (np. mikroskopia konfokalna, mikrotomografia rentgenowska) mają tę samą zasadniczą podstawę: wiedzę teoretyczną umożliwiającą opracowanie metodologii.

Głównym narzędziem w anatomii i morfologii roślin jest obraz. Pomimo błędnego przekonania, że takie analizy są prostymi obserwacjami, dającymi przestrzeń do subiektywnych interpretacji², analiza i zrozumienie obrazów w tym obszarze wymaga znajomości zastosowanych metod (sprzętu, rodzaju analizy, procedur metodologicznych), składników komórkowych, histochemii i ciała rośliny (organizacja i funkcja tkanki, ontogeneza, adaptacje morfologiczne). Interpretacja obrazów uzyskanych za pomocą różnych metod może prowadzić do skorelowania formy i funkcji, rozszyfrowania składu chemicznego struktury, potwierdzenia w opisie taksonów, zrozumienia infekcji fitopatogenami i innych tego typu ocen.

Podczas badania roślin mykoheterotroficznych (MH) (tj. roślin niefotosyntetycznych, które pozyskują węgiel z grzybów mikoryzowych^4,5), niezwykłe aspekty ich adaptacji strukturalnych, wzorce kolonizacji tkanek przez grzyby oraz morfoanatomia podziemnych organów mogą wyjaśnić ich strategie rozwoju i relacje z strzępkami, które są źródłem składników odżywczych. Podziemne organy roślin MH zwykle wykazują ważne adaptacje związane z ich związkiem z grzybami glebowymi, dlatego konieczne jest przeprowadzenie tych badań anatomicznych i morfologicznych⁶. Nie należy ignorować narządów powietrznych gatunków MH, ponieważ endofity mogą być również obecne w tych tkankach, nawet jeśli nie są grzybami mikoryzowymi (obserwacje osobiste, jeszcze nieopublikowane).

Oprócz dobrze ugruntowanej istotności związku grzybów mikoryzowych z gatunkami MH podczas całego ich cyklu życia⁷, każdy gatunek storczyków, nawet autotroficzny, ma początkowy obowiązkowy etap mykoheterotroficzny w naturalnym środowisku. Dzieje się tak, ponieważ zarodek storczyków jest niezróżnicowany i nie ma bielma ani liścieni, przez co nie jest w stanie rozwijać się i osiedlać w naturalnym środowisku bez wsparcia żywieniowego partnerów grzybów^4,8. Biorąc to pod uwagę, protokoły kiełkowania symbiotycznego mogą być stosowane nie tylko do gatunków MH, ale także do fotosyntetyzujących storczyków, mając na celu zbadanie specyficzności storczyka i grzyba w kiełkowaniu i rozwoju protokormu, co jest szeroko stosowaną metodologią w inicjatywach na rzecz ochrony zagrożonych gatunków^9,10,11.

W tym zestawie metod opisujemy ważne kroki związane z zbieraniem, utrwalaniem i przechowywaniem próbek roślin MH do badań anatomicznych (sekcja 1), analiza powierzchni i wybór próbki (sekcja 2), metody cięcia (odręcznie: sekcja 3, mikrotomia: sekcja 4, kriomikrotomia: sekcja 5), barwienie i montaż (sekcja 6), fluorescencja i mikroskopia konfokalna endofitów grzybów (sekcja 7), skaningowa mikroskopia elektronowa (sekcja 8), i transmisyjna mikroskopia elektronowa (sekcja 9). Dodatkowo opisujemy symbiotyczną metodę kiełkowania nasion storczyków (MH i autotroficznych, sekcja 10), ponieważ wspomniane wcześniej metody obrazowania mogą być z powodzeniem stosowane do analizy kolonizacji grzybów nasion, protokormów i siewek w procesie kiełkowania.

Rysunek 1: Schematyczne podsumowanie metod obrazowania. Schematy zawierają wskazówki dotyczące kroków protokołu, w których są one szczegółowo opisane. Skróty: GMA = metakrylan glikolu, OCT = związek o optymalnej temperaturze skrawania, SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Techniki mikroskopowe opisane tutaj szczegółowo (Rysunek 1) są poprzedzone następującymi niezbędnymi krokami: zbieranie, utrwalanie, odwadnianie, osadzanie i cięcie próbek. Ponieważ kroki są zmienne (Rysunek 1) w zależności od wybranej techniki (technik), ważne jest, aby myśleć z wyprzedzeniem, biorąc pod uwagę utrwalacze, które mają być przygotowane i przetransportowane do miejsca pobrania, w jaki sposób próbki muszą być przygotowane przed utrwaleniem, procesy odwadniania, które należy zastosować (sekcja 1) oraz różne możliwości osadzania i metody cięcia (sekcje 4, 5, oraz 9). Rysunek 1 podsumowuje kolejno wszystkie kroki wymagane dla każdej techniki mikroskopowej, dokładnie opisane poniżej.

Protokół

1. Zbieranie, naprawianie i utrzymywanie próbek

UWAGA: Rośliny w pełni MH można zwykle znaleźć w podszycie ciemnego lasu^12,13, głównie w obszarach wilgotnych i obfitujących w śmieci, podczas gdy częściowo rośliny MH można znaleźć w bardziej otwartych lasach^12,13. Rośliny MH mają zwykle dobrze rozwinięte podziemne organy w różnych kształtach i rozmiarach.

1. Podczas zbierania gatunków MH należy zbadać glebę wokół podstawy rośliny, uważając, aby nie uszkodzić podziemnych organów i unikać wyciągania roślin z ziemi, aby zapobiec odłączeniu organów powietrznych od podziemnych.
2. Ostrożnie kop wokół konstrukcji powietrznych za pomocą kielni ogrodniczej, badając podziemne organy, takie jak korzenie, łodygi, kłącza i organy spichrzowe, nie uszkadzając tych struktur.
3. Usuń cząstki gleby, aby zachować delikatne struktury, i delikatnie umyj te narządy wodą z kranu, aby spłukać pozostałe cząstki gleby przed utrwaleniem próbek.
4. Rośliny MH związane ze ściółką z liści wymagają szczególnej uwagi; ostrożnie zbieraj narządy połączone z rozkładającym się materiałem przez ich strzępki, unikaj wyciągania tych organów z połączonych struktur i zbieraj je ostrożnie, ponieważ te części są bardzo delikatne. Zachowaj struktury z takimi połączeniami i zbierz śmieci również do analizy.
5. Jeśli zdecydujesz się na analizę świeżego materiału przy użyciu technik obrazowania, utrzymuj próbki w zamkniętych plastikowych torbach o odpowiedniej wilgotności, wystarczającej ilości wody odparowującej i nawilżającej roślinę, zapobiegając nadmiernemu kontaktowi wody z próbkami. Natychmiast przetransportuj je do laboratorium i przeanalizuj próbki tego samego dnia, w którym zostały pobrane, zwracając uwagę, czy próbki są nadal zachowane podczas ich analizy.
6. Zanieść utrwalacze do miejsca zbiórki w dobrze zamkniętych pojemnikach. Próbki należy szybko utrwalić szybko po pobraniu do mikroskopii świetlnej (LM) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w jednym z następujących utrwalaczy: 10% neutralna buforowana formalina (NBF¹⁴, Tabela 1) lub roztwór Karnovsky'ego (modified¹⁵, Tabela 2). Roztwór Karnovsky'ego można przygotować z 0,2 M buforem fosforanowym ¹⁵, którego receptura jest opisana w tabeli 3.
7. Do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) należy podzielić próbki o grubości 4-3 mm wewnątrz kropli buforu kakodylanu aldehydu glutarowego i sodu (zmodyfikowany¹⁶, Tabela 4) na mniejsze odcinki o grubości 1-2 mm. Odrzuć krawędzie wycięte poza kroplą. Natychmiast przenieś skrawki do probówki zbiorczej o objętości utrwalacza ponad 10 razy większej niż objętość próbek, ponieważ jest to utrwalacz addytywny (tj. jego cząsteczki są chemicznie dodawane do białek fix¹⁶).
   UWAGA: Trzy opisane utrwalacze są wysoce toksyczne. Unikaj wdychania, zwłaszcza podczas ich używania w terenie. Przygotuj wszystkie utrwalacze w dygestorium za pomocą rękawiczek. Nie mieszaj kakodylanu i kwasów, ponieważ może powstać arsen¹⁶.
8. Jeśli utrwalone próbki unoszą się w utrwalaczu, oznacza to obecność gazu w tkankach roślinnych. Powietrze i inne gazy zapobiegają przenikaniu utrwalacza przez całą próbkę². Usuń gaz z tkanek, pobierając z nich ponowne próbki w mniejszych częściach i używając pompy próżniowej (ciśnienie od -300 do -400 inHg), aż wszystkie próbki opadną na dno roztworu¹⁷. Zachowaj ostrożność, ponieważ nadmierne ciśnienie wywierane przez pompę może uszkodzić próbki.
9. Po co najmniej 48 godzinach w roztworze Karnovsky'ego lub 10% NBF, przemyć próbki w 0,2 M PB (tabela 3) i odwodnić je serią 10%, 30%, 50% i na koniec 70% etanolu. W przypadku delikatnych próbek odwadniać przez 30 minut w każdym stężeniu; W przypadku większych próbek odwadniać przez 1 godzinę lub dłużej.
   UWAGA: 70% roztwór etanolu jest idealnym podłożem do przechowywania próbek. Próbki w 70% etanolu mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez lata. Nie przechowuj materiału roślinnego przez długi czas w utrwalaczach, ponieważ usunięcie środków utrwalających jest niezbędnym krokiem po utrwaleniu².
10. Przechowywać próbki w kakodylanu aldehydu glutarowego w temperaturze 4 °C przed przystąpieniem do postfiksacji (etap 9.1).

10% neutralna buforowana formalina (NBF)14
Krok 1	dodać 10 ml 37-40% roztworu formaldehydu do 80 ml wody destylowanej
Krok 2	dodać 0,4 g jednowodnego fosforanu sodu jednowodnego (NaH2PO4·H2O) do roztworu
Krok 3	dodać 0,65 g dwuzasadowego fosforanu sodu bezwodnego (Na2HPO4)
Krok 4	uzupełnić objętość do 100 ml

Tabela 1: 10% neutralny buforowany przepis na formalinę¹⁴.

Rozwiązanie Karnovsky'ego (zmodyfikowane15)
Krok 1	w 20 ml wody destylowanej o temperaturze 60-70 °C
Krok 2	Dodać 0,8 g paraformaldehydu (do uzyskania 4% m/v), mieszając
Krok 3	dodać 1-4 krople 40% NaOH i mieszać, aż roztwór stanie się klarowny
Krok 4	schłodzić i dodać 30 ml 0,2 M buforu fosforanowego o pH 7,2 (Tabela 3)
Krok 5	rozcieńczyć 25% aldehydu glutarowego w 0,1 M PB (pH 7,2) do uzyskania 1% aldehydu glutarowego (objętość końcowa: ~60 mL)
Krok 6	dodać 1% aldehydu glutarowego (krok 5) do roztworu otrzymanego w kroku 4, aż do uzyskania 100 ml utrwalacza

Tabela 2: Receptura rozwiązania Karnovsky'ego (modified¹⁵).

0,2 M bufor fosforanowy (PB) pH 7,2
Krok 1	dodać 14,196 g dwuzasadowego, bezwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4) do 400 ml wody destylowanej
Krok 2	dodać 13,8 g sodu fosforanu jednozasadowego jednowodnego (NaH2PO4·H2O)
Krok 3	Mieszaj, aż roztwór będzie klarowny
Krok 4	dostosować końcową objętość do 500 ml wodą destylowaną
Krok 5	dostosować pH do 7,2
Krok 6	dla 0,1 M PB rozcieńczyć 1:1

Tabela 3: Przepis na bufor fosforanowy 0,2 M.

3% aldehydu glutarowego 0,2 M bufor kakodylanu sodu (zmodyfikowany16)
Krok 1	0,2 M bufor kakodylowy: dodać 4,28 g trójwodnego kakodylanu sodu do 100 ml wody destylowanej
Krok 2	dostosować pH do 7,2
Krok 3	dodać 12 ml 25% aldehydu glutarowego do 25 ml roztworu w kroku 2 (0,2 M bufor kakodylowy, pH 7,2)
Krok 4	uzupełnić objętość do 100 ml wodą destylowaną

Tabela 4: Przepis na 3% aldehyd glutarowy 0,2 M buforu kakodylanu sodu (zmodyfikowany¹⁶).

2. Analiza powierzchni organów w materiale stałym i nieustalonym

1. Aby przeanalizować powierzchowne strzępki w narządach, zwłaszcza podziemnych, oraz mających kontakt ze ściółką z liści, obserwuj stały lub świeży materiał w mikroskopie preparacyjnym (stereomikroskopie) pod powiększeniem 7,5x lub większym, w zależności od analizowanych próbek.
   1. Wizualizuj próbki zanurzone w utrwalaczu, 70% etanolu (jeśli jest w nim przechowywany) lub wodzie z kranu w przypadku świeżego materiału. Zapobiegaj bezpośredniemu światłu z mikroskopu preparacyjnego, ponieważ może ono wysuszyć i uszkodzić próbki.
   2. Szukaj obszarów zainteresowania w próbkach, kierując się powierzchownymi strzępkami i ryzomorfami. Wybierz próbki, które zawierają obszary z powierzchownymi ryzomorfami, ponieważ można je podzielić na sekcje, aby uwidocznić peletony i cewki strzępek w komórkach korowych w korzeniach i łodygach.
   3. Po dokonaniu selekcji wykonaj kroki 1.6 i 1.9, jeśli próbki nie są jeszcze zamocowane. W razie potrzeby należy sfotografować świeże próbki za pomocą mikroskopu świetlnego bez mocowania, jak opisano w sekcji 3.
   4. Użyj kamery sprzężonej z mikroskopem stereoskopowym, aby zebrać obrazy z powierzchni narządów, ryzomorfów i innych obserwowanych struktur. W takich przypadkach zadbaj o odpowiedni kolor tła, aby dobrze kontrastował z materiałem i, jeśli to możliwe, wybierz materiał tła o mniej szorstkiej powierzchni (np. papier).

3. Odręczne sekcje organów roślinnych

UWAGA: Odręczne sekcje organów roślinnych mogą być wyzwaniem, szczególnie dla małych i cienkich struktur. Jednak te odcinki tkanek z endofitami grzybów mogą w niektórych przypadkach lepiej wykazywać strzępki i inne cechy w porównaniu z cienkimi skrawkami.

1. Świeże lub utrwalone próbki należy przeciąć ostrym ostrzem, krojąc je tak cienko, jak to możliwe i natychmiast umieszczając na małej szalce Petriego z wodą (jeśli jest świeża) lub 70% etanolem (jeśli jest utrwalona). Użyj małego pędzla, aby manipulować sekcjami bez ich uszkadzania.
2. Aby ułatwić cięcie trudniejszych materiałów (np. małych, cienkich, elastycznych narządów), należy otoczyć próbkę strukturą, na przykład polistyrenem lub ogonkiem liściowym Cecropia. Wytnij podporę, aby pomieścić próbkę i wykonaj cienki przekrój próbki i podpory razem.
3. Zabarwić i zamontować próbki zgodnie z opisem w rozdziale 6.

4. Osadzanie próbek roślin w żywicy i dzielenie na sekcje

1. Następnie odwadniać próbki przechowywane w 70% etanolu w 80%, 96% i 2x w 100% etanolu, przez 30 minut do 2 godzin, w zależności od wielkości i składu próbek.
2. Użyj zestawu żywicy glikolowo-metakrylanowej (GMA) zgodnie z instrukcjami producenta. Sprawdź Gerrits and Horobin (1996)¹⁸ w celu dalszych rozważań. Postępuj zgodnie z instrukcjami infiltracji i osadzania.
   UWAGA: Żywica GMA jest toksyczna, może powodować reakcję alergiczną oraz podrażnienie skóry, oczu i błon śluzowych. Używaj odczynników w dygestoriach i używaj rękawiczek.
3. Do zatapiania należy używać tacek do formowania z polietylenu, wybranych według wielkości próbek (np. 13 mm x 19 mm x 5 mm dla większych próbek, 6 mm x 8 mm x 5 mm dla mniejszych). Zwróć uwagę na pożądaną orientację próbki wewnątrz formy i użyj igły, aby pomóc w orientacji.
4. Pozostawić do polimeryzacji, najlepiej w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego zestalenia. Proces utwardzania trwa zwykle kilka godzin, choć zaleca się rozformowanie bloczków następnego dnia. Po polimeryzacji ostrożnie odłącz bloki żywicy od form i przystąp do mocowania bloków tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zakrzywienia bloków.
5. Przeszlifuj powierzchnię bloku żywicy, który zostanie przymocowany, tworząc płaską powierzchnię. Przyklej blok żywicy do drewnianego prostopadłościanu (zalecane 2 cm x 2 cm x 3 cm) za pomocą płynnego kleju cyjanoakrylowego o średniej lepkości (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że żywica jest całkowicie przymocowana, aby uniknąć pogorszenia sekcji.
6. Wykonaj cięcie w mikrotomie obrotowym, jak opisano poniżej.
   UWAGA: Ostrza noży do mikrotomów są bardzo ostre i mogą powodować wypadki. Pamiętaj, aby obchodzić się z nimi zgodnie ze wszystkimi środkami bezpieczeństwa. Przed zbliżeniem się do noża (np. w celu wymiany bloku, zwilżenia żywicy) zablokuj szorstkie pokrętło i załóż osłonę zabezpieczającą ostrze. Przechowuj jednorazowe ostrza w odpowiednich etui. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wymiany ostrzy.
   UWAGA: Różne rodzaje noży (np. jednorazowe lub stałe; szklane lub stalowe) mogą być używane do sekcji GMA resin¹⁸. Jakość sekcji zależy od tego, jak ostry jest nóż. Upewnij się, że nóż jest dobrze przymocowany i nie może się poruszać. Noże jednorazowe mogą wymagać regularnej wymiany, aby uzyskać lepsze cięcie.
   1. Mocno przymocuj drewniany prostopadłościan do uchwytu bloku. Wyreguluj orientację cięcia za pomocą orientacyjnych i zapewnij odpowiedni kąt noża za pomocą kąta nachylenia noża. Wybierz grubość przekrojów; użyj grubszego ustawienia do przycinania i cieńszego ustawienia dla wybranych sekcji, ponieważ sekcje GMA lepiej przylegają do szkiełka, gdy są cieńsze; Sugerowana grubość dla tkanek roślinnych to 5-8 μm.
   2. Przed rozpoczęciem schłodzić pomieszczenie, jeśli to konieczne, ponieważ wyższe temperatury pogarszają jakość sekcji. Do krojenia należy przygotować następujące elementy: zlewkę z wodą destylowaną, płytę grzejną, pędzle malarskie (co najmniej dwa), pęsetę z drobnym czubkiem, pipetę Pasteura, szkiełka podstawowe, bibułę filtracyjną (lub bibułkę) i ołówek (w celu identyfikacji próbek, które są dzielone).
   3. Ustawić temperaturę płyty grzejnej na 50 °C i umieścić na niej zlewkę. Zwróć uwagę na różnice w ogrzewaniu w zależności od obszaru płyty grzejnej (zwykle środkowy obszar nagrzewa się bardziej niż krawędzie; najlepiej podgrzej wodę w środku).
   4. Wybierz szklane szkiełko, zidentyfikuj je ołówkiem i odpipetuj ciepłą wodą destylowaną na całą powierzchnię szkiełka. W razie potrzeby użyj roztworu (np. detergentu i wody lub 70% etanolu), aby przełamać napięcie między wodą a szkłem, tak aby cała szkiełko było równomiernie pokryte. Niektóre typy prowadnic muszą być wstępnie oczyszczone 70% etanolem, aby uzyskać odpowiednią przyczepność sekcji.
   5. Zacznij od stopniowego przesuwania czoła bloku żywicy w kierunku ostrza noża. Nie próbuj ciąć bez uprzedniego przesunięcia bloku, w przeciwnym razie sprzęt i blok mogą zostać uszkodzone. W razie potrzeby przyciąć blok o większej grubości (10 μm i więcej).
   6. Zbliżając się do odpowiedniej sekcji, wykonaj zdecydowany ruch w jedną stronę za pomocą pokrętła, tak aby sekcja została wykonana od razu. Sprawdzaj wilgotność żywicy. Podczas krojenia regularnie nawilżaj powierzchnię wycinanego bloku za pomocą pędzla zamoczonego w wodzie destylowanej, jeśli występuje problem z zwijającymi się sekcjami. Usuń nadmiar wody za pomocą bibuły.
   7. Za pomocą pęsety z drobnym czubkiem umieść uzyskany fragment w wodzie nad szkiełkiem. W kontakcie z wodą żywica GMA rozciąga się. W razie potrzeby użyj pędzla, aby delikatnie rozłożyć i rozciągnąć sekcje. Użyj innego pędzla, aby stale utrzymywać ostrze wolne od resztek żywicy. Nie przełączaj się między pędzlami, aby uniknąć zamoczenia ostrza.
   8. Po ustawieniu w kolejce wszystkich żądanych sekcji w szkiełku, osusz dolną powierzchnię zjeżdżalni i umieść ją nad płytą grzejną. Usuń nadmiar wody z górnej części szkiełka, delikatnie przecierając bibułą filtracyjną (opcjonalnie). Sekcje będą przylegać, gdy woda wyparuje ze zjeżdżalni. Nie pozostawiaj prowadnic zbyt długich, aby zapobiec uszkodzeniu sekcji przez nadmierne ciepło.
   9. Przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka, z dala od kurzu i słońca, i używaj ich do barwienia i innych zabiegów. Preparaty można przechowywać przez kilka lat.

5. Zamrażanie próbek roślin i dzielenie ich na sekcje za pomocą kriostatu

UWAGA: Podstawowym założeniem w kriosekcji tkanki biologicznej jest zmniejszenie uszkodzeń spowodowanych tworzeniem się kryształków lodu podczas zamrażania próbek. Krioprotekcja jest zwykle wykonywana przez podawanie chemicznie obojętnych roztworów, takich jak glicerol lub sacharoza^19,20.

1. Na dzień przed podziałem próbki należy wykonać następujące czynności.
   1. Rozcieńczyć 100 ml 0,2 M PB (Tabela 3) w 100 ml wody destylowanej, aby uzyskać 200 ml 0,1 M PB. Przygotować 10%, 20% i 30% roztwory sacharozy w 0,1 M PB (np. dla 10% roztworu dodać 2 g sacharozy do 20 ml buforu).
   2. W przypadku świeżych próbek należy je myć w 0,1 M PB przez 30 minut. W przypadku próbek w utrwalaczu myć je w tym samym buforze, który jest używany do przygotowania utrwalacza przez 30 minut. W przypadku próbek w 70% etanolu należy je uwodnić w 50% i 30% etanolu i przemyć w 0,1 M PB przez 1 godzinę w każdym roztworze.
   3. Próbki inkubować przez 2 godziny w 10% sacharozy, 2 godziny w 20% sacharozie i 2 godziny w 30% sacharozy, w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować przez noc w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C (lub przynajmniej przez 3 godziny; maksymalny czas to 48 godzin).
2. W dniu krojenia przygotować 40% i 50% sacharozy w 0,1 M PB; nie należy przygotowywać roztworów sacharozy wcześniej niż 12 godzin wcześniej. Inkubować przez 2 godziny w każdym stężeniu sacharozy, w temperaturze 4 °C.
3. Do zatapiania, w małych formach, należy wykonać warstwę związku OCT (medium o optymalnej temperaturze cięcia, używane do zatapiania i zamrażania próbek) i utrzymywać go w temperaturze -20 °C do zamrożenia. Formy mogą być zwykłymi formami histologicznymi, chociaż dla ułatwienia rozformowywania bloków, można wykonać papierowe lub foliowe przy użyciu małego prostopadłościanu jako ramy i taśmy klejącej.
4. Po zamrożeniu dolnej warstwy związku OCT w formach należy pracować w komorze kriostatu (ok. -27 °C). Próbki inkubowane w 50% sacharozie umieścić w formach, w orientacji, w jakiej zostaną podzielone na sekcje. Górna powierzchnia bloku prostopadłościanu jest zwykle lepszą powierzchnią przekroju. Zaznacz w formie, w której umieszczane są próbki, aby blok można było łatwo przyciąć i zachować prawidłową orientację.
5. Otocz próbki związkiem OCT i rozerwij wszelkie pęcherzyki powietrza stykające się z próbkami. Zamrozić je w temperaturze -20 °C. Po całkowitym zamrożeniu bloków umieścić je w komorze kriostatu (ok. -27 °C). Wyjmij każdy z nich tylko przed użyciem i zwróć uwagę na oznaczenia, które wskazują lokalizację próbki wewnątrz bloku.
6. Ponieważ związek OCT można łatwo ciąć ostrzem, odpowiednio przytnij bloki przed umieszczeniem ich na uchwytach. Umieść trochę związku OCT w uchwycie kriostatu i ustaw blok tak, aby górna powierzchnia była podzielona na sekcje. Ściany z mniejszymi obszarami zapewniają lepsze przekroje. Poczekaj, aż blok zostanie dobrze przymocowany do uchwytu i przetestuj go przed rozpoczęciem cięcia.
7. Umieść uchwyt mocno w uchwycie uchwytu. Dostosuj orientację sekcji za pomocą orientacyjnych. Wyreguluj kąt nachylenia noża za pomocą kąta nachylenia noża. Wybierz grubość przekrojów. Próbki mogą być cięte na sekcje grubsze niż zwykłe sekcje żywicy. Z powodzeniem uzyskuje się skrawki w zakresie 5-20 μm, przy czym grubsze odcinki są łatwiejsze do wykonania (mniej zwijania się i mniejsze uszkodzenia konstrukcji).
8. Przesuń powierzchnię zamrożonego bloku w kierunku ostrza noża. Nie próbuj ciąć bez tego, w przeciwnym razie blok może zostać odłączony od uchwytu i uszkodzony. W razie potrzeby przyciąć blok o większej grubości (10 μm i więcej).
9. Zbliżając się do odpowiedniej sekcji, umieść płytkę przeciwprzechylającą się (tj. przezroczystą płytkę, która utrzyma sekcję) nad nożem i wykonaj zdecydowany ruch w jedną stronę pokrętłem, tak aby sekcja została wykonana od razu. Problemy z kręceniem się mogą wystąpić, jeśli płyta zapobiegająca przewróceniu się musi zostać wyregulowana (zwykle jest regulowana w odniesieniu do ostrza) lub jeśli w ostrzu znajdują się zanieczyszczenia. Stale czyść ostrze pędzlem, aby usunąć zanieczyszczenia.
10. Użyj specjalnych szkiełek, aby sekcje łatwo się przymocowały, takich jak szkiełka silanizowane (dostępne w handlu lub przygotowane z 2% aminoalkilosilanu w acetonie²¹) lub szkiełka przygotowane z 500 μg/ml poli-L-lizyny w wodzie destylowanej²¹ lub 0,2% żelatyny (patrz szczegóły²¹). Utrzymuj szkiełka w temperaturze pokojowej.
11. Aby przykleić sekcję do prowadnicy, podnieś płytkę stabilizującą przechylanie się i szybko dotknij prowadnicy sekcji. Gdy szkiełko ma temperaturę pokojową, sekcja natychmiast topi się i przylega do szkiełka. Zwróć uwagę, aby obrócić obrabianą powierzchnię prowadnicy do sekcji, która może pozostać nad nożem lub na wewnętrznej powierzchni płytki zabezpieczającej. Aby uniknąć zwijania się sekcji, wykonaj ten krok szybko, gdy tylko płyta zostanie podniesiona i uważaj, aby nie wykrzywić sekcji.
12. Pozostawić szkiełko na zewnątrz komory kriostatu (w temperaturze pokojowej), jeśli mają być do niego dodane nowe sekcje. Po przyklejeniu wszystkich żądanych sekcji do szkiełka, należy je przechowywać w komorze kriostatu lub w zamrażarce (-20 °C lub poniżej). Nie wystawiaj szkiełek na działanie wilgoci. Przechowuj je w pudełku na slajdy i pamiętaj, aby zidentyfikować je ołówkiem.
    UWAGA: Szkiełka i bloki OCT można przechowywać w temperaturze -20 °C, choć nie za długo. Aby osiągnąć lepsze wyniki, korzystaj ze zjeżdżalni i klocków w ciągu kilku dni.

6. Barwienie sekcji roślin i endofitów do mikroskopii świetlnej

UWAGA: Wiele rodzajów plam może być używanych do sekcji roślin. Trudno jest w różny sposób zabarwić grzyby endofityczne i tkanki roślinne. Chociaż nie jest to procedura barwienia, metoda oznaczania struktur grzybowych została przedstawiona w sekcji 7 (fluorescencja z koniugatem aglutyniny z kiełków pszenicy). Skrawki odręczne (wyjaśnione w sekcji 3), skrawki żywicy (sekcja 4) i kriosekcje (sekcja 5) mogą być barwione, chociaż plamy na bazie fenolu i alkoholu są trudne dla tych próbek, ponieważ żywica GMA i OCT tracą przyczepność do szkiełka w takich przypadkach.

1. Użyj jednej lub połącz następujące zwykłe metody barwienia dla próbek roślin.
   1. Błękit toluidynowy O^22,23, szeroko stosowana metoda ogólnego barwienia sekcji roślin. Przygotować roztwór 0,05% błękitu toluidynowego O w 0,1 M fosforanie (pH 6,8) lub 0,09 M buforze cytrynianowym (pH 4,5-4,8), w zależności od gatunku i rodzaju tkanki. Inkubuj sekcje żywicy GMA przez 2-10 minut za pomocą słoika do barwienia szkiełek lub umieszczając kilka kropli nad sekcjami, jeśli kilka szkiełek jest poplamionych. Po inkubacji dokładnie umyć wodą destylowaną lub buforem i zalać szkiełka wodą lub wysuszyć je na płycie grzejnej, aby uzyskać trwałe szkiełka, jak opisano w kroku 6.3.
   2. Odczynnik Lugol² wskazuje na obecność skrobi. Przygotować 5% roztwór jodu (_I2) i 10% jodku potasu (KI) w wodzie destylowanej. Plamić skrawki przez 2 min, dodając kilka kropel nad szkiełkiem, a następnie zmyć wodą destylowaną. Ten test histochemiczny jest zwykle stosowany do preparatów tymczasowych.
   3. Sudan III, IV, i B^24,25 barwnik dla różnych lipidów. Przygotuj roztwór 0,3% Sudanu (III, IV lub B) w 70% etanolu, podgrzej go do wrzenia i ostudź. Użyć supernatantu, przefiltrować go i inkubować sekcje przez 15-30 minut na zamkniętej szalce Petriego. Dokładnie umyj sekcje 70% etanolem i wodą destylowaną. Zamontuj zjeżdżalnie z wodą (zwykle stosuje się je tylko do zjeżdżalni tymczasowych).
      UWAGA: Ponieważ Sudan jest barwnikiem na bazie alkoholu, bardziej nadaje się do sekcji odręcznych. Ostrożnie przeprowadź barwienie sekcji żywicy GMA, ponieważ zwykle odrywają się one od szkiełka.
2. W przypadku tymczasowych zjeżdżalni zamontuj sekcje w wodzie lub glicerynie, a następnie obserwuj. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować je trochę dłużej.
3. W przypadku prowadnic stałych należy zamontować sekcje za pomocą żywic syntetycznych (np. medium do szybkiego montażu, patrz Tabela materiałów). Skrop kilka kropli podłoża montażowego (może przelać się przez szkiełko nakrywkowe), ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i użyj spinaczy do bielizny, aby docisnąć szkiełko do szkiełka nakrywkowego, aż całkowicie wyschnie. Nadmiar wysuszonego podłoża montażowego usunąć żyletką.

7. Zastosowanie fluorochromu sprzężonego z aglutyniną z kiełków pszenicy w mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej

UWAGA: Ta metoda może być stosowana do sekcji odręcznych (wyjaśnionych w sekcji 3), sekcji żywicy (sekcja 4) i kriosekcji (sekcja 5). Kriosekcje mogą być odpowiednie do celów mikroskopii konfokalnej, ponieważ można dostarczyć grubsze próbki w porównaniu z sekcjami żywicy, ale nie tak grube jak te odręczne. Fluorochrom sprzężony z aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA, patrz tabela materiałów) stosuje się do obrazowania grzybów w mikroskopii fluorescencyjnej²⁶. Mikroskop konfokalny nie jest niezbędny, chociaż może dostarczyć wyraźnych trójwymiarowych obrazów struktur roślinnych²⁷.

1. Przygotować roztwór 0,2 mg/ml koniugatu WGA-fluorochromu w 0,1 M PB²⁸ (pH 7,2, sprawdź krok 5.1.1 i tabelę 3). Przygotować roztwór 1% Calcofluor White w 0,1 M PB (pH 7,2). Przygotuj niewielkie ilości tych roztworów, ponieważ sekcje są z nimi bezpośrednio inkubowane.
2. Inkubować skrawki na szkiełkach przez 30 minut w roztworze sprzężonym WGA-fluorochrom²⁹, używając wystarczającej objętości, aby pokryć sekcje, a następnie przemyć w 0,1 M PB.
3. Inkubować skrawki w roztworze kalkofluoru, używając wystarczającej objętości jako podłoża montażowego. Roztwór może być utrzymywany w okresie obserwacji.
4. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i obserwuj w mikroskopie konfokalnym lub mikroskopie fluorescencyjnym przy użyciu następujących filtrów: TC/GFP (wzbudzenie: 470-440, emisja: 525-550, dla WGA-fluorochromu w Tabeli Materiałów - ściana komórkowa grzyba fluoryzuje na zielono pod tym filtrem²⁹) i DAPI (wzbudzenie: 358, emisja: 463, dla Calcofluor White)³⁰.
   UWAGA: Obrazy trójwymiarowe można uzyskać za pomocą funkcji serii Z w mikroskopie konfokalnym²⁷.

8. Skaningowa mikroskopia elektronowa organów roślinnych

1. Po utrwaleniu próbek, wykonaniu odwodnienia i przechowywaniu w 70% etanolu (sekcja 1), jedną z możliwości jest cięcie próbek w celu odsłonięcia dowolnej pożądanej powierzchni do analizy SEM, jeśli to konieczne (np. Tkanki wewnętrzne, struktura jajników). Użyj ostrej i nowej żyletki i wykonuj cięcia ruchem jednokierunkowym, unikając uszkodzonego wyglądu tych obszarów w SEM. W razie potrzeby użyj mikroskopu stereoskopowego, aby wybrać próbki i weź pod uwagę obszar metalowych króćców, aby określić rozmiary próbek.
2. Kolejne próbki odwadniane na SEM w serii etanolowej: 80%, 96% i 2x w bezwzględnym alkoholu etylowym (≥99,8%). Małe i delikatne próbki należy przechowywać przez 30 minut w każdym stężeniu, a większe i gęstsze próbki przez 1 godzinę.
3. Złóż małe koperty za pomocą bibuły, aby uporządkować próbki do kolejnych kroków, większe próbki można obsługiwać bez koperty. Zidentyfikuj koperty ołówkiem, pisząc literę lub cyfrę, i prowadź dziennik wszystkich próbek w każdej z nich. Próbki należy przechowywać w absolutnym alkoholu etylowym, choć nie przez długi czas, i jak najszybciej przejść do kroku 8.4.
4. Przejdź do suszenia w punkcie krytycznym (CP). Eksploatuj osuszacz CP zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. Umieścić próbki w absolutnym etanolu (płynie pośrednim) w komorze ciśnieniowej. W punkcie krytycznym CO₂ (31 °C, 7,3 x 10⁶ Pa) płyn pośredni rozpuszcza się w płynie przejściowym (ciekły dwutlenek węgla), a próbki są suszone³¹.
5. Po wysuszeniu CP należy jak najszybciej przechowywać próbki w pojemniku osuszającym, na przykład w szczelnie zamkniętej kolbie zawierającej żel krzemionkowy. Wilgotność atmosferyczna może zniszczyć próbki, jeśli zostaną ponownie wchłonięte³¹.
6. Użyj metalowych króćców do zamontowania próbek. Przed montażem załóż rękawice, aby manipulować klockami, zanurz je w acetonie na 5 minut, aby usunąć tłuszcz i pozostaw do wyschnięcia. Użyj przewodzącej dwustronnej taśmy samoprzylepnej węglowej, aby przymocować próbki do króćca, oraz mikroskopu stereoskopowego, aby pomóc w ustawieniu próbek, pamiętając, że widok z góry jest jedyną możliwą perspektywą na obrazach SEM.
7. Manipuluj próbkami za pomocą pęsety z drobnym czubkiem, zachowując ostrożność, ponieważ część próbki dotykana pęsetą jest zwykle uszkodzona, więc spróbuj dotknąć części znajdujących się z dala od obszarów zainteresowania (np. obszarów stykających się z taśmą). Utrzymać kikuty z próbkami na szczelnie zamkniętej szalce Petriego z żelem krzemionkowym. Przejdź do kroku 8.8 tak szybko, jak to możliwe.
8. Za pomocą napylarki napylającej naniesiono warstwę metalu, zwykle złota lub platyny, na powierzchnię próbek w atmosferze gazu obojętnego pod niskim ciśnieniem, często argon³¹. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi podczas korzystania z powlekarki napylającej. Grubość powłoki zależy od topografii próbek, zwykle od 15 do 40 nm³².
9. Pokryte kikuty należy przechowywać na szczelnie zamkniętej szalce Petriego z żelem krzemionkowym i pod warunkiem, że żel krzemionkowy zatrzymuje wilgoć, próbki można przechowywać w ten sposób przez tygodnie. Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego do analizy próbek. Na próbki w próżni uderza wiązka elektronów, a emisja sygnałów z takiego oddziaływania jest interpretowana jako images³¹. Szczegółowe informacje na temat obsługi skaningowego mikroskopu elektronowego można znaleźć w artykułach Jeffree i Read (1991)³¹ oraz Bozzola i Russell (1999)³².
10. Aby ponownie użyć odcinków, pociągnij za taśmę klejącą i wyszoruj je wełną drucianą. Umyć w wodzie z kranu, zanurzyć w absolutnym etanolu i odpowiednio wysuszyć, zapobiegając utlenianiu metalu składowego.

9. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

1. Próbki należy poprzedzić buforem glutaraldehydowo-kakodylowym, jak wyjaśniono w krokach 1.7 i 1.10. Po 12-24 godzinach wstępnego fiksowania przemyć próbki 3x w 0,2 M buforze kakodylowym (pH 7,25) przez 10 minut. Przeprowadzić postfiksację z 1% tetratlenkiem osmu (OsO₄) w 0,2 M buforze kakodylowym, przez 12 godzin w ciemności, w temperaturze pokojowej. Myć 3x wodą destylowaną przez 5 min.
   UWAGA: Kakodylan i tetratlenek osmu są wysoce toksyczne i nie powinny być wdychane. Stosować je w dygestoriach, postępując zgodnie z odpowiednimi kartami charakterystyki.
2. Odwodnić próbki etanolem o stężeniu 30%, 50%, 70% i 96%, 2x w każdym stężeniu, przez 10 minut. Następnie odwodnić 3x w alkoholu bezwodnym, za każdym razem przez 15 minut.
3. Próbki infiltrować w hydrofilowych żywicach akrylowych (patrz Tabela materiałów), raz żywicą 1:1 + absolutnym etanolem i 3x czystą żywicą przez 8-12 godzin każda. Polimeryzację w kapsułkach żelatynowych należy przeprowadzić w temperaturze 60 °C aż do całkowitego zestalenia (maksymalnie 12 godzin17).
4. Dokładnie oceń orientację próbek wewnątrz bloku żywicy; odetnij górną część bloku żyletką, tworząc kształt piramidy, który koncentruje próbkę w obszarze cięcia. Uzyskać półcienkie przekroje (250-500 nm)³³ w ultramikrotomie za pomocą diamentowego noża i umieścić na szkiełkach w kilku kroplach wody.
5. Przechowywać szkiełka na gorącej płycie w temperaturze 60 °C. Zabarwić skrawki błękitem toluidynowym O, jak w kroku 6.1.1 i pozostawić plamę do całkowitego wyschnięcia. Dokładnie umyj wodą z kranu. Oceń uzyskany przekrój, rysując cztery ćwiartki i wybierając najbardziej odpowiedni kwadrant do analizy.
6. Przytnij blok tak, aby kształt piramidy koncentrował wybrany kwadrant na górnej powierzchni bloku. Produkcja ultracienkich przekrojów (50-100 nm)^33,34. Grubość jest oceniana zgodnie z kolorem interferencyjnym sekcji: przekroje o długości około 70 nm wydają się srebrno-złote, przy około 100 nm wydają się złote, a przy około 200 nm wydają się niebieskie³⁴.
7. Zebrać ultracienkie skrawki z wody za pomocą miedzianych siatek i przejść do metody barwienia kontrastowego octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, jak opisano poniżej.
   1. Przygotować roztwór cytrynianu ołowiu (Tabela 5) i zamrozić końcowy roztwór w probówkach do mikrowirówek z 1 ml roztworu w każdej, rozmrażając go tylko tuż przed użyciem.
   2. Przygotować roztwór octanu uranylu: rozpuścić 0,625 g octanu uranylu [UO₂(CH₃COO)₂] w 25 ml niedawno przegotowanej i schłodzonej wody destylowanej. Przechowywać w ciemnej kolbie w zamrażarce.
      UWAGA: Azotan ołowiu jest toksyczny w przypadku spożycia. 1 N NaOH jest silnie. Octan uranylu jest radioaktywny i toksyczny. Nie wolno go połykać, wdychać ani wchodzić w kontakt ze skórą.
   3. Podczas barwienia oba przygotowane odczynniki należy umieścić w oddzielnych strzykawkach o pojemności 3 ml z jednostkami filtrującymi (pory 0,22 μm, patrz tabela materiałów). Przygotuj szalkę Petriego odwróconą do góry nogami z uszczelniającą folią termoplastyczną na niej (patrz Tabela Materiałów) i wewnątrz szerszego naczynia, z granulkami NaOH na krawędziach jako pułapką na CO₂³² (patrz Rysunek 2).
   4. Wyrzuć pierwszą kroplę, a na folii umieść kroplę octanu uranylu i trzy krople wody destylowanej na każdą poplamioną siatkę. Zrób to samo z cytrynianem ołowiu i dodaj jeszcze trzy krople wody destylowanej.
   5. Inkubować siatkę (nieprzezroczystą stroną do dołu, w miejscu, gdzie znajdują się sekcje) w uranylu przez 30 minut (zmienny czas). Umyj 3x w kroplach wody destylowanej, za każdym razem delikatnie osuszając kratkę bibułą filtracyjną po stronie brylantowej. Powtórz z kroplą cytrynianu ołowiu (30 min) i umyj ją.
8. Po upływie co najmniej 4 godzin przeanalizować siatki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. W tym mikroskopie wiązka elektronów przechodzi przez sekcje w próżni, a obraz jest wyświetlany na ekranie fluorescencyjnym. Szczegółowe informacje na temat obsługi transmisyjnego mikroskopu elektronowego można znaleźć w artykule Bozzola and Russell (1999)³².

roztwór cytrynianu ołowiu (do barwienia kontrastowego TEM)
Krok 1	Otocz zlewkę folią aluminiową
Krok 2	rozpuścić 0,266 g azotanu ołowiu [Pb(NO3)2] w 6 ml niedawno przegotowanej i schłodzonej wody destylowanej
Krok 3	mieszać przez 2 minuty
Krok 4	dodać 0,352 g cytrynianu trisodowego [Na3(C6H5O7).2H2O] (roztwór musi uzyskać mleczny wygląd)
Krok 5	Mieszać przez 15 minut, zamknąć zlewkę folią aluminiową i przenieść roztwór do zlewki o pojemności 10 ml
Krok 6	dodać 1,6 ml 1N NaOH i 2,4 ml wody destylowanej (roztwór musi być półprzezroczysty)
Krok 7	w razie potrzeby dostosuj pH do blisko 12

Tabela 5: Przepis na roztwór cytrynianu ołowiu.

Rysunek 2: Kontrastowy schemat barwienia roztworami cytrynianu ołowiu i octanu uranylu. (A) Przygotuj szalki Petriego, jedną odwróconą do góry nogami (w środku) z folią termoplastyczną, aby krople można było umieścić nad nią, wewnątrz szerszej. Granulki NaOH są umieszczane wokół centralnej naczynia. (B) Krople octanu uranylu umieszcza się w okręgach z literą U, a krople cytrynianu ołowiu w okręgach oznaczonych L. DW oznaczają krople wody destylowanej. Siatki są barwione sekwencyjnie w kolumnie, więc pięć siatek może być barwionych jednocześnie, jak pokazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

10. Symbiotyczne kiełkowanie nasion orchidei

1. Upewnij się, że roztwory i wszystkie materiały używane w symbiotycznym kiełkowaniu nasion są sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia. Zacznij od autoklawowania ich przez 20 minut w temperaturze 121 °C. Etapy kiełkowania symbiotycznego są podsumowane w Rysunek 3.
2. Owoce i nasiona należy zdezynfekować powierzchniowo, zanurzając je w roztworze podchlorynu sodu zawierającym 2% aktywnego chloru na 10-15 minut w przypadku owoców i 7-10 minut w przypadku nasion, biorąc pod uwagę sztywność i grubość okrywy nasiennej⁹. Smukłe i kruche nasiona można zanurzyć w rozcieńczonym w 1:1 roztworze podchlorynu sodu. Następnie przemyć 3x w autoklalawowanej wodzie destylowanej, aby usunąć roztwór podchlorynu.
3. Odzyskaj nasiona, filtrując w tkaninie serigraficznej i użyj nasion do przeprowadzenia testów kiełkowania (najlepiej). W razie potrzeby przechowywać je w kopertach z bibuły filtracyjnej wewnątrz szklanych kolb z żelem krzemionkowym, w temperaturze 4 °C, hermetycznie zamknąć kolby i uszczelnić folią spożywczą. Przenieś kilka kropli wody z ostatniego prania na agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, 39 g/l), aby ocenić skuteczność procesu mycia.
4. Przed wysianiem nasion w pożywce hodowlanej oceń ich żywotność za pomocą testu tetrazolowego (opcjonalnie), jak opisano poniżej³⁵.
   1. Inkubować około 10 mg nasion w probówce mikrowirówkowej z 1 ml 10% sacharozy w wodzie destylowanej, przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (ok. 25 °C), w świetle.
   2. Usunąć roztwór sacharozy za pomocą mikropipety i dodać 1 ml 1% roztworu tetrazolu (chlorek trifenylotetrazolu) do wody destylowanej. Inkubować w temperaturze 40 °C w termobloku przez 24 godziny w ciemności.
   3. Usuń roztwór tetrazolu za pomocą mikropipety i umyj nasiona wodą destylowaną 2x lub do momentu usunięcia roztworu. Usuń wszystkie płyny. W razie potrzeby nasiona można przechowywać w zamrażarce do tygodnia (jak w kroku 10.3) przed analizą.
   4. Ponownie zawiesić nasiona w wodzie destylowanej i przeanalizować je pod mikroskopem świetlnym. Żywotne nasiona uzyskują kolor od jasnoczerwonego do ciemnoczerwonego, podczas gdy nasiona niezdolne do życia zachowują swój naturalny kolor.
5. Wykonaj następujący protokół adapted⁹ dla symbiotycznego kiełkowania nasion orchidei.
   1. Nasiona inkubować na autoklawowanych krążkach z bibuły filtracyjnej (o średnicy 1-2 cm) umieszczonych na szalkach Petriego z pożywką hodowlaną z agaru owsianego (OMA) (2,5 g/l płatków owsianych i 7 g/l agaru, pH 6).
   2. W środku szalki Petriego zaszczepić fragment pożywki hodowlanej (ok. 1^cm2) zawierającej grzybnię z wybranego wyizolowanego grzyba do procedury kiełkowania. Uszczelnić szalki Petriego folią spożywczą i inkubować je w ciemności w temperaturze około 25 °C lub pokojowej, ponieważ jest ona bardziej odpowiednia dla rozwoju grzybów.
   3. Przygotuj kilka potraw z nasionami i bez zaszczepiania grzybów, jako kontrolę negatywną dla testu kiełkowania.
6. Analizuj wyniki kiełkowania co tydzień, zbierając dane ilościowe i jakościowe oraz fotografując protokormy i siewki. Obserwację nasion i protokorm należy przeprowadzić przy użyciu stereomikroskopu w celu dokładniejszej oceny kiełkowania. Użyj źródła światła pochodzącego od dołu, ponieważ pozwala to na większy kontrast, co umożliwia łatwiejsze odróżnienie grzybni od protokormów.
   1. Pobrać próbki w różnych stadiach rozwojowych i przygotować je do analiz anatomicznych (sekcja 1). Zastosuj wszystkie opisane wcześniej analizy obrazowe do zbadania endofitów grzybów w nasionach, protokormach i siewkach podczas kiełkowania (mikroskopia świetlna - sekcje 4, 5 i 6; konfokalna i fluorescencyjna - sekcja 7; SEM i TEM - sekcje 8 i 9).
   2. Generowanie wyników ilościowych zgodnie z klasyfikacją etapów zgodnie z tabelą 6. Etapy opisują zwykły rozwój nasion mykoheterotroficznych storczyków. Zbieraj dane co tydzień i tabelę z początkowymi datami każdego obserwowanego etapu.
   3. Dodatkowo zbierz dane ilościowe szacujące procent i szybkość kiełkowania. Policz co najmniej 100 nasion lub zdefiniuj pola zliczania³⁵. Wyznacz trzy lub więcej pól zliczających na szalkę Petriego, składających się z ustalonych obszarów o znormalizowanym obszarze, i oceniaj co tydzień. Oblicz zebrane dane zgodnie z równaniem wskaźnika wzrostu (GI):
      
      gdzie N₀ to liczba zliczonych nasion w etapie 0, N₁ odnosi się do etapu 1 i następuje aż do etapu 6 (zarejestrowanego jako N₆)³⁶.

Rysunek 3: Schematyczne podsumowanie metodologii symbiotycznego kiełkowania nasion. Schematy zawierają wskazówki dotyczące szczegółowych kroków w protokole. Skróty: OMA = agar z płatków owsianych, PDA = agar z dekstrozą ziemniaczaną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Etap kiełkowania	opis
0	Brak kiełkowania
1	Obrzęk zarodka
cyfra arabska	Pęknięcie Testa
3	Rozwijają się chłonne włoski
4	Rozwija się projekcja pnia
5	Rozwijają się łuski ochronne (przylistki)
6	Rozwijają się pierwsze korzenie

Tabela 6: Opis etapów rozwoju protokormu stosowany do okresowych analiz testów kiełkowania. Zmodyfikowano z etapów opisanych w Otero et al.³⁶.

Wyniki

Przestrzeganie podstawowych etapów utrwalania tkanki roślinnej daje struktury komórkowe jak najbardziej zbliżone do stanu żywego, biorąc pod uwagę morfologię, objętość i organizację przestrzenną składników komórkowych i tkanek¹⁶. Obserwuj takie cechy w próbkach po utrwaleniu chemicznym (Rysunek 4). Rysunek 4C-F przedstawia odpowiednio utrwalone próbki pod mikroskopem świetlnym. Postępowanie zgodnie z opisanymi procedurami fi...

Dyskusja

Analizy obrazowe w zakresie anatomii i morfologii roślin mają istotny potencjał, aby spełnić cele i pomóc w zrozumieniu relacji między roślinami mykoheterotroficznymi a ich niezbędnymi endofitami grzybów, jak wykazano w badaniach podziemnych organów ^6,40, analizach strukturalnych symbiotycznego kiełkowania nasion³⁹ oraz struktur powietrznych i rozrodczych⁴¹. Botanika strukturalna, mimo że w ostatniej dekadzie straci...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton	Sigma-Aldrich	179124	(do montażu klocków SEM)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(do testów kiełkowania nasion)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	barwnik fluorescencyjny (wykrywa celulozę)
Roztwór buforowy cytrynianu, 0,09 M pH 4,8	Sigma-Aldrich	C2488	(do barwienia błękitem toluidyny O)
Przewodząca dwustronna taśma węglowa	Fisher Scientific	50-285-81	(dla SEM)
Mikroskop konfokalny	Zeiss		(dowolny model)
Siatki miedziane	Sigma-Aldrich	G4776	(dla TEM)
Suszarka punktu krytycznego	Balzers		(dowolny model)
Kriostat	Leica Biosystems		(dowolny model)
Mikroskop preparacyjny	Leica Biosystems		(= mikroskop stereoskopowy, dowolny model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	medium do szybkiego montażu do mikroskopii
Alkohol etylowy, czysty (≥ 99,5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= etanol, do procesów odwadniania)
Roztwór formaldehydu, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(do przygotowania roztworu NBF)
Roztwór formaliny, obojętny buforowany, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histologicznego utrwalacza tkanki
Kapsułki żelatynowe do TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(do polimeryzacji żywicy w TEM)
Roztwór żelatyny, 2% w H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(rozcieńczony do przygotowania szkiełek - przyleganie OCT)
Roztwór aldehydu glutarowego, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(dla Karnovsky' s przygotowanie roztworu)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	zestaw do zatapiania metakrylanu glikolu (GMA)
Jod	Sigma-Aldrich	207772	(do przygotowania płynu Lugola)
Azotan ołowiu(II)	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (do barwienia kontrastowego TEM)
Mikroskop świetlny	Olympus		(dowolny model)
LR Biała żywica akrylowa	Sigma-Aldrich	L9774	hydrofilowa żywica akrylowa do TEM
Lugol roztwór	Sigma-Aldrich	62650	(do barwienia)
Metalowe króćce do mocowania próbek	Rave Scientific		(dla SEM, różne modele)
Mikrotom	Leica Biosystems		ręczny mikrotom obrotowy lub inny model
Agar z płatków owsianych (OMA)	Millipore	O3506	(do testów kiełkowania nasion)
Związek OCT, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	pożywka do zatapiania tkanek mrożonych Tetratlenek
osmu	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (do postfiksacji TEM)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	uszczelniająca folia
termoplastycznaParaformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127	(dla Karnovsky'ego' s przygotowanie roztworu)
Roztwór poli-L-lizyny, 0,1% w H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(do przygotowania szkiełek - przyleganie OCT)
Szkiełka Poly-Prep	Sigma-Aldrich	P0425	szkiełka powlekane poli-L-lizyną Tacki
kubki z polietylenu	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, do zanurzania próbek w żywicy GMA)
Formowanie polietylenu Tacki na kubki	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, do zanurzania próbek w żywicy GMA)
Jodek potasu	Sigma-Aldrich	221945	(do przygotowania roztworu Lugola)
Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)	Milipor	70139	(do testów kiełkowania nasion)
Skaningowy mikroskop elektronowy	Jeol		(dowolny model)
Silan [(3-aminopropyl)trietoksysilan]	Sigma-Aldrich	A3648	(do przygotowania preparatów - przyleganie OCT)
Preparaty silanowe Szkiełka	szklane Sigma-Aldrich	S4651	pokryte silanem
Żel krzemionkowy pomarańczowy, granulowany	Supelco	10087	(do procesów osuszania)
Kakodylan sodu trójwodny	Sigma-Aldrich	C0250	(do buforu kakodylanu aldehydu glutarowego)
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (dla Karnovsky'ego' s przygotowanie roztworu i barwienie kontrastowe TEM)
Roztwór podchlorynu sodu	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (do dezynfekcji powierzchni nasion)
Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodny	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (do roztworu NBF i preparatu PB)
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (dla NBF i PB)
Powlekarka do napylania	Balzers		(dowolny model)
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (do krioprotekcji i testu kiełkowania)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(do barwienia)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(do barwienia)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(do barwienia)
Strzykawka			(3 mL, dowolna marka, do barwienia kontrastowego TEM)
Filtr strzykawkowy, Millex-GV 0,22 i mikro; m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma (do barwienia kontrastowego TEM)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	płynny klej cyjanoakrylowy, średnia lepkość
Błękit toluidynowy O	Sigma-Aldrich	T3260	(do barwienia)
Transmisyjny mikroskop elektronowy	Jeol		(dowolny model)
Trifenylotetrazol chlorek	Sigma-Aldrich	T8877	(do testu tetrazolowego w kiełkowaniu nasion)
Cytrynian trisodowy dwuwodny	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)· 2H2O (do barwienia kontrastowego TEM)
Ultramikrotom	Leica Biosystems		(dowolny model)
Octan uranylu	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (do barwienia kontrastowego TEM)
Pompa próżniowa	(dowolny model)
z kiełków pszenicy, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	lektyna sprzężona z barwnikiem fluorescencyjnym (wykrywa pozostałości kwasu sjalowego i N-acetyloglukozaminylu)