Artykuł metodologiczny

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

DOI:

10.3791/63790

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Toxicology, College of Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), 2Department of Chemical Defense Medicine, College of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalna analiza parametrów nasienia jest powszechnie stosowana do oceny męskiej płodności. Jednak badania wykazały, że ~15% niepłodnych pacjentów nie wykazuje żadnych nieprawidłowości w konwencjonalnych parametrach nasienia. Potrzebne są dodatkowe technologie, aby wyjaśnić niepłodność idiopatyczną i wykryć subtelne defekty nasienia. Obecnie biomarkery funkcji plemników, w tym apoptoza plemników, potencjał błony mitochondrialnej (MMP) i uszkodzenie DNA, ujawniają fizjologię plemników na poziomie molekularnym i są w stanie przewidzieć męską płodność.

Dzięki technikom cytometrii przepływowej (FCM), każdy z tych markerów może być szybko, dokładnie i precyzyjnie zmierzony w próbkach ludzkiego nasienia, ale koszty czasu znacznie wzrosną, a wyniki mogą być utrudnione, jeśli wszystkie biomarkery muszą być testowane za pomocą jednego cytometru. W tym protokole, po pobraniu i natychmiastowej inkubacji w temperaturze 37 °C w celu skroplenia, próbki nasienia poddano dalszej analizie pod kątem apoptozy plemników przy użyciu barwienia izotiocyjanianem V-fluoresceiny aneksyny (FITC)/jodkiem propidyny (PI). MMP znakowano sondą 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraetylo-benzimidazolylokarbocyjaniny (JC-1), a uszkodzenie DNA oceniano za pomocą testu struktury chromatyny plemników (SCSA) z barwieniem pomarańczą akrydynową (AO). W ten sposób analiza cytometryczna przepływowa markerów funkcji plemników może być praktycznym i niezawodnym zestawem narzędzi do diagnozowania niepłodności i oceny funkcji plemników zarówno na stole, jak i w łóżku.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niepłodność stała się problemem zdrowia publicznego, a niepłodność męska przyczynia się do 40%-50% wszystkich przypadków1,2. Chociaż konwencjonalna analiza jakości nasienia odgrywa ważną rolę w określaniu potencjału płodności mężczyzn, około 15% pacjentów z niepłodnością ma prawidłowe parametry plemników, takie jak liczba plemników, ruchliwość i morfologia3. Co więcej, rutynowe badania nasienia mają słabą powtarzalność, dostarczają ograniczonych informacji na temat funkcji plemników i nie mogą dać dokładnej oceny męskiej płodności ani odzwierciedlić subtelnych wad plemników. Opracowano wiele technik badania funkcji plemników, takich jak test hemizony (HZA), test penetracji plemników, test obrzęku hipoosmotycznego, test przeciwciał przeciwplemnikowych, ale metody te są czasochłonne i podatne na subiektywne wpływy operatorów. Dlatego konieczne jest opracowanie szybkich i dokładnych metod analizy funkcji nasienia.

FCM to technologia szybkiej analizy pojedynczych komórek, opracowana w latach siedemdziesiątych, która jest szeroko stosowana w różnych dziedzinach biologii komórki i medycyny. FCM to solidne narzędzie do oceny funkcji plemników, które analizuje plemniki znakowane za pomocą specyficznej sondy fluorescencyjnej4. Plemniki przechodzą przez lasery jedno- lub wielokanałowe, a światło rozproszone i emitowana fluorescencja są wytwarzane przez wiązkę laserową. Światło rozproszone obejmuje światło rozproszone do przodu (FSC) i światło rozproszone bocznie (SSC), które odzwierciedla wielkość badanej komórki oraz ziarnistość komórki lub strukturę wewnętrzną. Sygnały te są zbierane, wyświetlane i analizowane przez system komputerowy, w wyniku czego szybko i dokładnie mierzy się szereg cech plemników. Dlatego FCM jest szybką, obiektywną, wielowymiarową i wysokoprzepustową techniką, która cieszy się coraz większym zainteresowaniem w dziedzinie analizy nasienia. Zastosowanie FCM może zrekompensować braki w tradycyjnych metodach i zapewnia nowe podejście do wykrywania wewnętrznej struktury i funkcji plemników.

Apoptoza plemników jest ściśle związana z męską płodnością5. Wykrywanie apoptozy plemników jest ważnym wskaźnikiem oceny funkcji plemników na poziomie molekularnym. FCM jest powszechnie uznawana za niezawodną i czułą metodę wykrywania apoptozy plemników za pomocą barwienia aneksyną V-FITC/PI. Podstawową zasadą jest to, że fosfatydyloseryna (PS) jest przenoszona z wewnętrznej warstwy błony komórkowej do jej zewnętrznej warstwy we wczesnym stadium apoptozy. Aneksyna V jest białkiem fosfolipidowym zależnym od Ca2 + (zwykle znakowanym przez FITC), które ma wysokie powinowactwo do PS, a zatem wykrywa PS wystawione na zewnętrzną powierzchnię błony komórkowej 6. Nekrozę i apoptozę można rozróżnić w połączeniu z barwieniem Pl. Dlatego metoda podwójnego barwienia Annexin V-FITC/PI jest szeroko stosowana, ponieważ jest szybka, prosta i łatwa do wykrycia różnych apoptotycznych plemników.

Dojrzałe plemniki ssaków zawierają około 72-80 mitochondriów7, co sugeruje biologiczny powód zatrzymywania mitochondriów plemników8. Stwierdzono, że mitochondria plemników odgrywają ważną rolę w utrzymaniu ruchliwości i płodności plemników9. Barwienie JC-1, które może być używane jako wskaźnik MMP w różnych typach komórek, jest jednym z najpopularniejszych fluorochromów do oceny aktywności mitochondriów plemników10. JC-1 jest barwnikiem kationowym, który w zależności od potencjału gromadzi się w mitochondriach. JC-1 ma maksymalną emisję fluorescencji przy 525 nm (zielony) i tworzy J-aggregates11 podczas wiązania z membranami o wysokim potencjale (ΔΨm, 80-100 mV), co powoduje przesunięcie emisji fluorescencji do ~590 nm (pomarańczowo-czerwony). W związku z tym depolaryzacja mitochondriów plemników jest wskazywana przez spadek stosunku intensywności fluorescencji czerwonej / zielonej, a FCM można wykorzystać do wykrywania poziomów MMP w próbkach nasienia ludzkiego.

Metodologia SCSA została wynaleziona przez Evenson et al.12, i jest uważana za precyzyjny i powtarzalny test z unikalnymi danymi dwuparametrowymi (czerwona i zielona fluorescencja) na skali kanałów 1,024 × 1,02413. W uszkodzonych plemnikach DNA i zmienione białka w jądrach plemników są znakowane przez AO, a pęknięcia nici DNA są mierzone za pomocą czerwonej fluorescencji, podczas gdy nienaruszone podwójne nici emitują zieloną fluorescencję w FCM14. Obecnie opracowano wiele metod oceny integralności DNA plemników. Jednak w przeciwieństwie do SCSA, testy te są często pracochłonne i nie dają możliwości rozpoznania niepłodności męskiej. Wyniki testu SCSA istotnie korelują z ciążą i poronieniem w ludzkim DNA, dostarczają przekonujących dowodów na to, że SCSA może być przydatny w analizie ludzkiego nasienia i może służyć jako cenne narzędzie dla klinicystów zajmujących się niepłodnością15.

Integralność chromatyny, MMP i apoptoza odzwierciedlają różne aspekty funkcji plemników, a zatem połączenie tych biomarkerów może dostarczyć bardziej wszechstronnego wglądu w status plemników. FCM może być używany do oddzielnych pomiarów integralności chromatyny, MMP lub apoptozy w próbkach nasienia ludzkiego. Chociaż koszt FCM i koszt barwników ograniczyły szerokie zastosowanie tych technik w laboratoriach klinicznych w zakresie zdrowia reprodukcyjnego, ich wartość dla oszacowania płodności jest akceptowana.

Jednakże, ponieważ każdy z eksperymentów wymaga wstępnej obróbki próbek nasienia, a wszystkie próbki muszą być testowane tak szybko, jak to możliwe, jednoczesny pomiar wszystkich trzech biomarkerów dla próbki z pojedynczym FCM może prowadzić do długiego czasu oczekiwania na niektóre eksperymenty i utrudniać wiarygodność wyników. Dzieje się tak dlatego, że plemniki doznają dodatkowych uszkodzeń podczas procesu oczekiwania, jeśli protokół nie jest prawidłowo ułożony, biorąc pod uwagę wszystkie trzy eksperymenty. W artykule przedstawiono protokół, który umożliwia płynny pomiar wszystkich trzech biomarkerów w jednej cytometrii bez znacznego uszczerbku dla jakości eksperymentu wywołanego wydłużonym czasem oczekiwania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Proces wykrywania biomarkerów uszkodzenia funkcji plemników za pomocą cytometrii przepływowej obejmuje (1) przygotowanie komórek, (2) barwienie odczynnikami fluorescencyjnymi oraz (3) analizę cytometryczną przepływową i interpretację danych (Rysunek 1). Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Bioetycznych Wojskowego Uniwersytetu Medycznego (1.0/2013.4-12).

1. Przygotowanie komórek

  1. Próbki ludzkiego nasienia należy pobierać poprzez masturbację w plastikowych słoikach z próbkami klinicznymi, najlepiej po 3-5 dniach abstynencji.
  2. Próbki nasienia należy natychmiast inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i całkowicie upłynnić próbki (do 1 godziny).

2. Plemniki zliczone za pomocą komputerowej analizy nasienia (CASA)

  1. Dokładnie wymieszaj próbki skroplonego nasienia.
  2. Dodać 10 μl nasienia do komory do liczenia plemników (patrz tabela materiałów).
  3. Zeskanuj szkiełka w Analizatorze Klas Plemników (patrz Tabela Materiałów) i policz co najmniej sześć obszarów i 400 plemników w celu oszacowania stężenia plemników.
    UWAGA: Próbki nasienia muszą być świeże, a nie zamrożone, do apoptozy plemników i analizy MMP.

3. Barwienie plemników

  1. Wykrywanie apoptozy plemników za pomocą barwienia aneksyną V-FITC/PI
    1. Dodaj 1 × 106 plemników do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Przemyć komórki 500 μl soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (PBS).
    3. Odwirować zawiesinę plemników o stężeniu 300 × g przez 7 minut i odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawiesić plemniki w 200 μl 1x buforu wiążącego.
    5. Dodać 2 μl załącznika V FITC i 2 μl PI (patrz tabela materiałów).
    6. Delikatnie zawirować komórki, inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (25 °C) w ciemności i natychmiast umieścić je w cytometrze przepływowym w celu analizy.
  2. Analiza potencjału błony mitochondrialnej za pomocą sondy JC-1
    1. Dodać 2 × 106 plemników do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 600 × g przez 5 minut.
    2. Zawiesić zawiesinę plemników w 1 ml roztworu roboczego JC-1 (patrz tabela materiałów).
    3. Delikatnie zawirować komórki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
    4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 600 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    5. Przemyć granulkę dwukrotnie 1 ml PBS z prędkością 600 × g przez 5 minut każdy.
    6. Ponownie zawiesić barwione plemniki w 1 ml PBS w probówkach cytometru przepływowego i natychmiast umieścić probówki w cytometrze przepływowym w celu analizy.
    7. Stosować cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon (CCCP) jako kontrolę pozytywną. Zawiesić plemniki (jak opisano wcześniej w kroku 3.2.1) w 1 ml roztworu roboczego CCCP (patrz tabela materiałów), a następnie delikatnie zagiąć komórki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować zawiesinę o stężeniu 600 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Powtórz kroki 3.2.2-3.2.6.
  3. Test struktury chromatyny plemników
    1. Umieścić podwielokrotność skroplonego surowego nasienia (0,25 ml) w krioprobówce i natychmiast zamrozić próbki nasienia w ciekłym azocie (-196 °C) do momentu, gdy będą gotowe do SCSA.
    2. Próbki nasienia rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i rozcieńczyć je buforem TNE (patrz tabela materiałów) do stężenia 1-2 × 10,6 komórek/ml.
    3. Dodać 200 μl rozcieńczonej próbki do probówki z cytometrem przepływowym i mieszać z 400 μl roztworu kwasu (patrz tabela materiałów) przez 30 s.
    4. Wybarwić próbki 1,2 ml roztworu barwiącego AO (patrz tabela materiałów) i natychmiast umieścić w cytometrze przepływowym w celu analizy.
    5. Użyj próbki referencyjnej jako wzorca wewnętrznego do konfiguracji cytometru przepływowego i kalibracji. Rozcieńczyć próbkę referencyjną buforem TNE o temperaturze 4 °C do stężenia 1-2 × 10,6 komórek/ml. Powtórz kroki 3.3.1-3.3.4.
      UWAGI: Wszystkie roztwory i bufory są przechowywane w temperaturze 4 °C. (1) Nie należy rozcieńczać nasienia przed błyskawicznym zamrożeniem. Surowe próbki nasienia należy rozmrozić i rozcieńczyć buforem TNE w czasie pomiarów cytometrii przepływowej. (2) W przypadku klinik leczenia niepłodności ~ 0,25 ml surowego nasienia należy zamrozić błyskawicznie w ultrazimnej zamrażarce lub zbiorniku LN2. Te zamrożone porcje mogą być następnie wysłane do laboratorium diagnostycznego SCSA na suchym lodzie lub w suchym transporterze LN2. (3) Jako wewnętrzny wzorzec wykorzystano próbkę ludzkiego ejakulatu, która wykazuje niejednorodność integralności DNA (np. 15% wskaźnik fragmentacji DNA [DFI]).

4. Konfiguracja cytometru przepływowego

UWAGA: Przed uruchomieniem cytometru przepływowego należy przeprowadzić kontrolę systemu przyrządu w celu sprawdzenia wydajności analitycznej. Uruchom próbki po zakończeniu i zaliczeniu wszystkich testów.

  1. Otwórz oprogramowanie cytometru przepływowego i uruchom cytometr.
  2. Zbierz przykładowe dane.
    1. Najpierw załaduj próbkę kontrolną do cytometru przepływowego i kliknij URUCHOM, aby rozpocząć zbieranie danych (w razie potrzeby dostosuj ustawienia). Poczekaj, aż urządzenie zacznie zasysać próbkę i zapewni podgląd wykrytych zdarzeń w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Próbka kontrolna: kontrola ujemna (niebarwione plemniki) pod kątem apoptozy plemników; kontrola pozytywna (komórki poddane działaniu CCCP) w kierunku MMP; próbka referencyjna dla SCSA.
    2. Utwórz wykresy punktowe do przeglądania danych i wybierz parametry osi x/y (takie jak FSC, SSC) oraz liniowe, aby określić wyświetlane dane. Wybierz i zastosuj bramkę wielokątną, aby wyznaczyć populację plemników do analizy i tak, aby instrument wykreślał wykryte zdarzenia w czasie rzeczywistym.
    3. Przeanalizuj zdarzenia plemników w regionie.
      1. W przypadku apoptozy plemników ustaw FL1 jako oś x, a FL2 jako oś x. Aby wyizolować żywe, apoptotyczne lub martwicze komórki, dotknij i przeciągnij bramkę kwadrantową, aby podzbiór populacji plemników w dół do czterech określonych populacji.
      2. W przypadku MMP ustaw FL1 jako oś x, a FL2 jako oś y. Utwórz bramę wielokątną, aby podzielić populacje plemników na dwie określone populacje.
      3. W przypadku SCSA ustaw FL4 jako oś x (czerwona fluorescencja, kanały cytometrii przepływowej 125/1,024), a FL1 jako oś y (zielona fluorescencja, kanały cytometrii przepływowej 475/1,024). Narysuj bramki pod kątem 45°, aby wykluczyć sygnały zanieczyszczeń komórkowych.
    4. Ustaw limit przebiegu, aby wskazać, kiedy zatrzymać zbieranie danych. Oblicz łącznie 10 000 plemników dla każdej próbki do analiz apoptozy plemników, MMP i SCSA.
    5. Ustawianie szybkości przepływu płynów (niska, średnia i szybka lub niestandardowa szybkość przepływu płynów) w zależności od liczby komórek.
      UWAGI: W przypadku analizy SCSA, aby określić stężenie plemników, rozmrozić zamrożoną surową próbkę i uruchomić ją na FCM. Jeśli natężenie przepływu wynosi >250/s, rozcieńczyć próbkę do odpowiedniego natężenia przepływu. Zmierz wszystkie próbki niezależnie dwa razy i oblicz wartości średnie. Próbka referencyjna została przetestowana, gdy co 10-15 próbek było mierzonych, aby zapewnić standaryzację i stabilność urządzenia z dnia na dzień.
    6. Ustaw próg, aby wyeliminować zanieczyszczenia i szumy z próbek komórek. Zastosuj te ustawienia do wszystkich próbek w eksperymencie.
    7. W razie potrzeby ustaw kompensację kolorów, aby skorygować rozlewanie się fluorescencji.
    8. Delikatnie odpipetować próbki przed załadowaniem ich do cytometru przepływowego, nazwać próbkę i uruchomić próbki.
    9. Po uruchomieniu wszystkich próbek zapisz przykładowe dane jako pliki FCS, nadając im nazwę pliku w celu dalszej analizy oprogramowania. Zapisz szablon pracy bieżącego eksperymentu do pobrania w przyszłych przebiegach (opcjonalnie).

5. Analiza danych

  1. Zaimportuj dane do oprogramowania do analizy danych cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów).
  2. Kliknij dwukrotnie pierwszą próbkę w obszarze roboczym. Poczekaj, aż otworzy się okno Wykres, pokazujące wykres zdarzeń wzdłuż parametrów FSC i SSC. Utwórz bramkę, która izoluje populację plemników zawartą w bramce, tworząc populację "dziecięcą" z nadrzędnego zestawu zdarzeń.
  3. Kliknij dwukrotnie w obszarze bramkowanym i otwórz nowe okno Graph zawierające tylko zdarzenia plemników. Ustaw parametry osi x i y, aby wybrać kanał fluorescencyjny.
  4. Wybierz narzędzie Brama. Kliknij na wykresie, aby pojawiły się bramki, tak aby utworzone bramki izolowały różne populacje komórek.
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy (lub kliknij z wciśniętym Control) dowolny z wyróżnionych wierszy i wybierz polecenie Kopiuj analizę do grupy. Zastosuj drzewo bramkowania do wszystkich próbek w grupie.
  6. Zapisz i wyeksportuj tabelę danych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje pomiar apoptozy plemników za pomocą barwienia Annexin V-FITC/PI. Sygnał FITC (fluorescencja zielona) mierzono w kanale FL1, a sygnał PI (fluorescencja czerwona) mierzono w kanale FL2. W analizie dwuwymiarowej Aneksyny V/PI twórcy kwadrantów zidentyfikowali cztery charakterystyczne populacje plemników. Wyniki wyrażono jako procentową zawartość plemników aneksyny V-/PI (żywe komórki), plemników aneksyny V+/PI− (wczesne komórki apoptotyczne lub komórki apoptotyczne), plemników aneksyny V+/PI+ (późne komórki apoptotyczne) i plemników aneksyny V−/PI+ (komórki martwicze)16,17 (Rysunek 2B). Kontrola negatywna (niebarwione plemniki) została również wykorzystana do ustawienia kompensacji i kwadrantów (Rysunek 2A).

Rysunek 3 pokazuje pomiar MMP za pomocą sondy JC-1 w nasieniu ludzkim. MMP % jest przedstawiony jako stosunek fluorescencji pomarańczowo-czerwony/(zielony + pomarańczowo-czerwony) poprzez analizę cytogramu. Dobrej jakości próbka nasienia zwykle wykazuje wysoką fluorescencję pomarańczowo-czerwoną i niską fluorescencję zieloną (aktywne mitochondria, lewy górny kwadrant) (ryc. 3A). I odwrotnie, próbka nasienia niskiej jakości zwykle wykazuje niską fluorescencję pomarańczowo-czerwoną i wysoką fluorescencję zieloną (nieaktywne mitochondria, prawy dolny kwadrant), prawdopodobnie z powodu zakłócenia mitochondriów (Figura 3B).

Rysunek 4 pokazuje dane SCSA13,14. Te typowe cytogramy SCSA uzyskano z dwóch pojedynczych próbek. Próbka A pochodziła od płodnego mężczyzny, a próbka B od niepłodnego mężczyzny. Analizę danych cytometrii przepływowej przeprowadzono za pomocą oprogramowania FlowJo. Cytogramy pokazują źródło każdego składnika danych SCSA. Oś x (czerwona fluorescencja z 1,024 gradacjami czerwonej fluorescencji) wskazuje na fragmentaryczne DNA; oś y (zielona fluorescencja z gradacją 1,024) wskazuje na natywną barwielność DNA. Przerywana linia w punkcie y = 750 reprezentuje granicę normalnych plemników. Powyżej tej linii y = 750 znajdują się plemniki z częściowo nieskondensowaną chromatyną, które określono jako niedojrzałe plemniki.

figure-results-1
Rysunek 1: Procedura wykrywania biomarkerów uszkodzenia funkcji plemników za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki nasienia pobrano i poddano wstępnej obróbce zgodnie z opisem w kroku 1 protokołu. (1) Przygotowanie komórek, (2) barwienie odczynnikami fluorescencyjnymi oraz (3) analiza cytometrii przepływowej i interpretacja danych. Skróty: MMP = mitochondrialny potencjał błonowy; SCSA = test struktury chromatyny plemników; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; AO = pomarańcza akrydynowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki apoptozy plemników przy użyciu barwienia Annexin V-FITC/PI. Dolny lewy kwadrant zawiera plemniki anoksyny V-/PI− (żywe komórki), dolny prawy ćwiartka zawiera plemniki anoksyny V+/PI− (wczesne komórki apoptotyczne lub komórki apoptotyczne), prawy górny ćwiartka reprezentuje plemniki aneksyny V+/PI+ (późne komórki apoptotyczne), a lewy górny ćwiartka zawiera plemniki anoksyny V−/PI+ (komórki martwicze). A) kontrola ujemna (niebarwione plemniki); (B) próbkę z apoptozą plemników. Skróty: FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PI = jodek propidyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Pomiar potencjału błony mitochondrialnej za pomocą sondy JC-1. (A) Subpopulacja plemników z wysokim MMP. (B) Subpopulacja plemników z niskim MMP. Ustaw FL1-A i FL2-A odpowiednio jako oś x (fluorescencja zielona) i oś y (fluorescencja pomarańczowo-czerwona). Skróty: MMP = mitochondrialny potencjał błonowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wykrywanie uszkodzeń DNA w ludzkich plemnikach za pomocą testu struktury chromatyny plemników. (A) Próbka nasienia o normalnej strukturze chromatyny. (B) Próbka nasienia z dużym udziałem plemników o nieprawidłowej strukturze chromatyny. Oprogramowanie FlowJo zostało użyte do stworzenia bramek komputerowych wokół populacji komórek zidentyfikowanych jako: 1) normalne plemniki, 2) plemniki HDS, 3) plemniki DFI i 4) szczątki komórek, a następnie obliczono procenty plemników HDS i DFI. Skrót: SCSA = test struktury chromatyny plemników; HDS = wysoka barwność DNA; DFI = wskaźnik fragmentacji DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwierdzono, że integralność chromatyny, MMP i apoptoza ludzkich plemników są cennymi predyktorami wyników reprodukcyjnych. W najnowszym podręczniku laboratoryjnym WHO dotyczącym badania i przetwarzania ludzkiego nasienia (wydanie szóste) podkreślono również niektóre z tych wskaźników (integralność chromatyny i apoptoza) jako rozszerzone badania wykraczające poza podstawowe badanie rutynowych parametrów, takichjak liczba plemników. Ostatnie publikacje sugerują również, że wskaźniki te mogą być bardziej czułymi markerami reakcji na zewnętrzne niebezpieczne narażenie, co wskazuje na ich potencjał do identyfikacji uszkodzeń układu rozrodczego na wcześniejszym etapie19,20. Połączenie tych wskaźników z rutynowymi badaniami może również zapewnić bardziej kompleksowe zrozumienie profilu dysfunkcji plemników i złożoności uszkodzeń męskiego układu rozrodczego w populacji.

Istnieje kilka kluczowych kwestii, które w znacznym stopniu decydują o powodzeniu analizy nasienia za pomocą FCM. Po pierwsze, pomiar MMP plemników i apoptozy wymaga natychmiastowego zbadania po upłynnieniu nasienia. Aby zminimalizować koszty czasu, dwóch techników może oddzielnie przejąć kontrolę nad wstępną obróbką MMP i analizą apoptozy próbki. Ponieważ wstępne leczenie apoptozy jest prostsze, przejdzie ona do etapu cytometrii przepływowej szybciej niż analiza MMP. Do analizy SCSA świeże próbki nasienia powinny być kriokonserwowane natychmiast po ich udostępnieniu po upłynnieniu. Próbki nasienia mogą być następnie przechowywane w ciekłym azocie przez stosunkowo długi okres i nie wymagają natychmiastowego badania.

W związku z tym koszt eksperymentu w miejscu pracy można skompresować do 40 minut, co odpowiada czasowi trwania analizy MMP oraz etapowi cytometrii przepływowej analizy nasienia. Po drugie, ustawienie bramkowania na platformie cytometrii przepływowej musi być określone osobno dla każdej partii próbek. Próbki plemników z przezroczystymi podgrupami komórek na wykresie punktowym można wybrać jako odniesienie do narysowania obszaru bramkowania. Po trzecie, ponieważ nie ma powszechnie akceptowanych klinicznych wartości referencyjnych dla wskaźników tego eksperymentu, wyniki historyczne mogą być wykorzystane jako ważne narzędzie kontroli jakości. Zachęca się również do ustanawiania kontroli dodatnich i ujemnych w każdej serii pomiarów, zwłaszcza w odniesieniu do SCSA i MMP.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki badania nasienia uzyskano przy użyciu Accuri C6. Technikę tę można jednak zastosować do innych platform komercyjnych z niewielkimi modyfikacjami. Zwykle potrzeba w sumie 5 × 106 plemników, aby spełnić wymóg pomiaru wszystkich wskaźników. Jeśli stężenie plemników w próbce jest znacznie niższe niż średni poziom, zapotrzebowanie na objętość nasienia wzrośnie.

Podobnie jak w przypadku rutynowych parametrów nasienia, zauważalna jest również wewnątrzosobnicza zmienność integralności chromatyny, MMP i apoptozy plemników ludzkich21. W związku z tym wielokrotne testy próbek pobranych w różnym czasie mogą zapewnić dokładniejsze oszacowanie poziomu uszkodzenia funkcji plemników. Chociaż nie ma zalecanego okresu abstynencji przed pobraniem plemników do analizy cytometrii przepływowej, można przyjąć 2-7 dni abstynencji ejaulacyjnej, sugerowaną przez WHO do rutynowej analizy nasienia. Może to przyczynić się do poprawy porównywalności wyników między laboratoriami i między różnymi próbkami pobranymi od tych samych mężczyzn.

Głównym ograniczeniem tej metody jest to, że dwa z trzech badanych biomarkerów - apoptoza i potencjał błony mitochondrialnej - wymagają świeżych próbek nasienia. Może to ograniczyć ich zastosowanie do mężczyzn, którzy mogą dostarczyć próbki nasienia do laboratorium. Do badania uszkodzeń DNA (SCSA) przed eksperymentem należy przygotować próbki referencyjne w celu kalibracji cytometru przepływowego. Warto zauważyć, że zastosowanie obecnego protokołu wymaga urządzenia FCM w laboratorium, co nadal stanowi spore wyzwanie dla wielu laboratoriów klinicznych, chociaż w niektórych regionach alternatywnym wyborem może być współpraca z usługą strony trzeciej.

Dodatkowo koszt barwników i innych odczynników jest również czynnikiem finansowym dla mężczyzn, którzy mogą potrzebować badania. Wreszcie, protokół może wymagać modyfikacji, jeśli do badania biomarkerów używane są różne marki lub wersje FCM. Podsumowując, w pracy przedstawiono praktyczne podejście do oszacowania trzech biomarkerów uszkodzenia plemników u ludzi za pomocą cytometrii jednoprzepływowej. Może to dostarczyć cennych informacji na temat zdrowia reprodukcyjnego mężczyzn i uzupełnić rutynowe badanie nasienia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim pracownikom terenowym za pomoc, a rozmówcom za współpracę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 M bufor kwasu cytrynowegoSigma-Aldrich Chemical Co., USA251275-5GDodać 21,01 g/L monohydratu kwasu cytrynowego (FW = 210,14; 0,10 M) do 1,0 l H2O. Przechowywać do kilku miesięcy w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
0,2 M Na2PO4 buforSigma-Aldrich Chemical Co., USAV900061-500GDodać 28,4 g dwuzasadowego fosforanu sodu (FW = 141,96; 0,2 M) do 1,0 l H2O. Przechowywać do kilku miesięcy w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
10 mM roztwór podstawowy CCCPSigma-Aldrich Chemical Co., USAC2759Dodać 20,46 mg CCCP do 10,0 ml DMSO, uzupełniając do końcowego CCCP w stężeniu 10 mM, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze − 80 stopni Celsjusza.
10 &mikro; MDodać 10 ml PBS do 15 ml polipropylenowej probówki wirówkowej i dodać 10 μ L roztwór podstawowy CCCP, uzupełniający do końcowego roztworu CCCP w stężeniu 10 μmm.
1 mM roztwór podstawowy JC-1Sigma-Aldrich Chemical Co., USAT4069JC-1 jest kupowany w postaci liofilizowanej. Dodaj niewielką ilość DMSO do fiolki i wiruj przez kilka minut, aż cały barwnik się rozpuści. Przenieść roztwór do światłoszczelnej probówki i przepłukać fiolkę odpowiednią objętością DMSO, uzupełniając do końca JC-1 w stężeniu 1 mg/ml  aliquot i przechowywać w − 20 stopni Celsjusza.
37 &stopnie; C inkubatorThermo Scientific, USA
5 & mikro; Roztwór roboczy M JC-1 L z rozmrożonej podwielokrotności zapasów JC-1. Delikatnie wymieszać, aby zapewnić jednorodne rozcieńczenie. Roztwór ten należy przechowywać w ciemności i niezwłocznie zużyć.
Cytometr przepływowy Accuri C6BD Pharmingen, San Diego, CA, Stany Zjednoczone
Kwaśny roztwór, pH 1,2Połącz 20,0 ml 2,0 N HCl (0,08 N), 4,39 g NaCl (0,15 M) i 0,5 ml Triton X-100 (0,1%) w H2O, aby uzyskać końcową objętość 500 ml. Dostosuj pH do 1,2 za pomocą 5 mol/l HCl.
Roztwór podstawowy pomarańczy akrydynowej (AO), 1,0 mg/mlPolysciences, Inc, Warrington, Pa65-61-2Rozpuścić chromatograficznie oczyszczony AO w dd-H2O w stężeniu 1,0 mg/ml.
Roztwór barwiący AO (roztwór roboczy)Dodać 600 μ L roztworu podstawowego AO na każde 100 ml buforu barwiącego.
Kaptur bezpieczeństwa biologicznegoAirtech, USA
System komputerowego wspomagania analizy nasienia (CASA)Microptic, Barcelona, HiszpaniaAnalizator klasy plemników 5.3.00
Komora do liczenia plemnikówGoldcyto, Hiszpania
Equipments
FITC Annexin V Zestaw do wykrywania apoptozy IBD Biosciences, San Jose, CA556547W zestawie: (1) FITC Annexin V jest butelkowany o stężeniu 100 ng / & mikro; L; (2) Jodek propidyny (PI): Roztwór do barwienia PI składa się z 50 &mikro; g PI/ml w PBS (pH 7,4) i wynosi 0,2 &mikro; M sterylne z filtrem; (3) 10x bufor wiążący: 0,1 M Hepes (pH 7,4), 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2. Aby uzyskać 1x roztwór roboczy, rozcieńczyć 1 część 10x buforu wiążącego Annexin V na 9 częściach wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C i chronione przed długotrwałym działaniem światła. Nie zamrażać.
FlowJo  10Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA
Wirówka poziomaThermo Scientific, USA
zbiornik ciekłego azotuThermolyne, USA
strong>Materials
PBSBeyotime, Szanghaj, ChinyC0221AGotowe do użycia PBS są kupowane i przechowywane w temperaturze pokojowej
Bufor barwiący, pH 6,0Połącz 370 ml 0,10 M buforu kwasu cytrynowego, 630 ml 0,20 M buforu Na2PO4, 372 mg EDTA (disód, FW = 372,24; 1 mM) i 8,77 g NaC1 (0,15 M). Mieszaj przez noc na talerzu mieszającym, aby upewnić się, że EDTA jest całkowicie w roztworze. pH do 6,0 z nasyconym roztworem NaOH.
Próbka referencyjna do analizyPróbkę referencyjną rozcieńczono zimnym (4 ° C) Bufor TNE do stężenia roboczego 1– 2 i razy; 106< / sup> komórek/ml i służy do ustawiania koloru zielonego na 475/1,024 kanałów cytometrii przepływowej i ustawiania czerwonego na 125/1,024 kanałów cytometrii przepływowej.
Bufor TNE, 1x, pH 7,4 (roztwór roboczy)Połączyć 60 ml 10x TNE i 540 ml H2O. Sprawdź pH (7.4).
Bufor TNE, 10x, pH 7,4Perfemiker, Szanghaj, ChinyPM11733Gotowe do użycia są kupowane i przechowywane w temperaturze 4 °C.
roztwór roboczy CCCP Dodać 10 ml PBS do 15 ml polipropylenowej probówki wirówkowej i dodać 50 μ< SCSA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
  2. Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
  3. Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
  4. Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
  5. Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
  6. Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
  7. Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
  8. Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
  9. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666(2021).
  10. Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
  11. Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
  12. Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
  13. Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
  14. Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, Clifton, N.J. 147-164 (2013).
  15. Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
  16. Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
  17. Zhang, H. -B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
  18. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022).
  19. Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
  20. Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
  21. Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

cytometria przep ywowaapoptoza plemnik wpotencja b ony mitochondrialnejuszkodzenia DNAstruktura chromatyny plemnik wbarwienie aneksyn Vsonda JC 1barwienie pomara czow akrydyndiagnostyka m skiej niep odno ci

Powiązane artykuły