Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63791

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Streszczenie

Interakcje komórka-matryca pośredniczą w złożonych procesach fizjologicznych poprzez sygnały biochemiczne, mechaniczne i geometryczne, wpływając na zmiany patologiczne i reakcje terapeutyczne. Oczekuje się, że uwzględnienie efektów matrycy na wcześniejszym etapie opracowywania leków zwiększy prawdopodobieństwo sukcesu klinicznego nowych środków terapeutycznych. Istnieją strategie oparte na biomateriałach, które rekapitulują określone mikrośrodowiska tkankowe w hodowli komórkowej 3D, ale ich integracja z metodami hodowli 2D stosowanymi głównie do badań przesiewowych leków była wyzwaniem. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje rozwój metod hodowli 3D w zminiaturyzowanych matrycach biomateriałów w formacie płytki wielodołkowej, aby ułatwić integrację z istniejącymi rurociągami badań przesiewowych leków i konwencjonalnymi testami żywotności komórek. Ponieważ oczekuje się, że cechy matrycy kluczowe dla zachowania klinicznie istotnych fenotypów w hodowanych komórkach będą wysoce specyficzne dla tkanek i chorób, konieczne będzie kombinatoryczne badanie przesiewowe parametrów matrycy w celu określenia odpowiednich warunków dla określonych zastosowań. Opisane tutaj metody wykorzystują zminiaturyzowany format hodowli do oceny odpowiedzi komórek nowotworowych na ortogonalną zmienność mechaniki macierzy i prezentację ligandów. W szczególności badanie to demonstruje wykorzystanie tej platformy do zbadania wpływu parametrów matrycy na odpowiedzi komórek glejaka wielopostaciowego (GBM) pochodzących od pacjenta na chemioterapię.

Wprowadzenie

Oczekiwany koszt opracowania nowego leku stale rósł w ciągu ostatniej dekady, z ponad 1 miliardem dolarów według obecnych szacunków1. Częścią tego wydatku jest wysoki wskaźnik niepowodzeń leków wchodzących do badań klinicznych. Około 12% kandydatów na leki ostatecznie uzyskuje zgodę amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) w 2019 roku. Wiele leków nie przechodzi fazy I z powodu nieoczekiwanej toksyczności2, podczas gdy inne, które przejdą testy bezpieczeństwa, mogą nie przejść z powodu braku skuteczności3. To wyczerpanie z powodu braku skuteczności można częściowo wytłumaczyć faktem, że modele nowotworów używane podczas opracowywania leków notorycznie nie przewidują skuteczności klinicznej4.

Funkcjonalne rozbieżności między modelami in vitro i in vivo można przypisać usuwaniu komórek rakowych z ich rodzimego mikrośrodowiska, w tym komórek nienowotworowych i fizycznego ECM5,6. Zwykle grupy badawcze używają dostępnych na rynku matryc hodowlanych, takich jak Matrigel (białkowa macierz błony podstawnej pochodząca z mięsaków myszy), aby zapewnić hodowanym komórkom nowotworowym mikrośrodowisko macierzy 3D. W porównaniu z hodowlą 2D, hodowla 3D w matrycy błonowej poprawiła kliniczne znaczenie wyników in vitro7,8. Jednak biomateriały hodowlane z tkanek bezkomórkowych, w tym matrycy błonowej, zazwyczaj wykazują zmienność między partiami, która może zagrozić odtwarzalności9. Co więcej, matryce pochodzące z nowotworów o innym pochodzeniu tkankowym niż badane mogą nie dostarczać odpowiednich wskazówek fizjologicznych10. Wreszcie, nowotwory o wysokim stopniu niejednorodności wewnątrznowotworowej mają cechy mikrośrodowiskowe, które różnią się w skali submikronowej i których nie można dostroić do rekapitulacji matrycy błonowej11.

Glejak wielopostaciowy (GBM), jednolicie śmiertelny guz mózgu o medianie czasu przeżycia około 15 miesięcy, jest nowotworem, dla którego opracowanie leczenia było szczególnie trudne12,13. Obecny standard opieki nad GBM składa się z pierwotnej resekcji guza, następnie radioterapii, a następnie chemioterapii z użyciem temozolomidu (TMZ)14. Jednak ponad połowa klinicznych nowotworów GBM wykazuje oporność na leczenie poprzez różne mechanizmy15,16,17. Przewidywanie skuteczności schematu leczenia u konkretnego pacjenta jest niezwykle trudne. Standardowe modele przedkliniczne stosowane do przewidywania indywidualnych wyników składają się z komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta, ksenoprzeszczepowanych ortotopowo myszom z obniżoną odpornością. Podczas gdy ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów mogą podsumować wiele aspektów klinicznych nowotworów GBM i są cenne dla modeli przedklinicznych18, są one z natury drogie, mają niską przepustowość, są czasochłonne i wiążą się z problemami etycznymi19. Hodowle komórek pochodzących od pacjentów, na powierzchniach plastikowych 2D lub w postaci sferoid, w większości przypadków pozwalają uniknąć tych problemów. Podczas gdy komórki pochodzące od pacjentów zachowują aberracje genetyczne, ich hodowle w 2D lub jako zawieszone sferoidy były w dużej mierze słabymi reprezentacjami ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów u gryzoni i oryginalnych guzów pacjentów20. Wcześniej my i inni wykazaliśmy, że komórki GBM hodowane w 3D ECM, który naśladuje mechaniczne i biochemiczne właściwości tkanki mózgowej, mogą zachować fenotypy oporności na leki10,21,22,23.

Interakcje między kwasem hialuronowym (HA), polisacharydem występującym w dużych ilościach w mózgu ECM i nadmiernie eksprymowanym w nowotworach GBM, a jego receptorem CD44 modulują nabywanie oporności na leki in vitro21,24,25,26,27. Na przykład włączenie kwasu hialuronowego do miękkich kultur 3D zwiększyło zdolność komórek GBM pochodzących od pacjentów do nabywania oporności terapeutycznej. Ta mechano-responsywność była zależna od wiązania HA z receptorami CD44 na komórkach GBM21. Dodatkowo, wiązanie integryny z peptydami zawierającymi RGD, włączonymi do matryc kultur 3D, wzmacniały chemooporność za pośrednictwem CD44 w sposób zależny od sztywności21. Poza HA, ekspresja kilku białek ECM, z których wiele zawiera regiony RGD, różni się między normalnymi guzami mózgu a guzami GBM28. Na przykład jedno z badań wykazało, że 28 różnych białek ECM było regulowanych w górę w guzach GBM29. W tym złożonym mikrośrodowisku macierzy nowotworowej komórki rakowe integrują mechaniczne i biochemiczne wskazówki, aby uzyskać określony fenotyp oporności, który zależy od stosunkowo niewielkich różnic (np. mniej niż rząd wielkości) w module Younga lub gęstości peptydów wiążących integryny28,29,30.

Obecny protokół opisuje, w jaki sposób komórki nowotworowe interpretują unikalne kombinacje sygnałów matrycowych i identyfikują złożone, specyficzne dla pacjenta mikrośrodowiska matrycowe, które promują oporność na leczenie (Rysunek 1A). Fotochemiczna metoda generowania zminiaturyzowanych, precyzyjnie dostrojonych matryc do hodowli 3D zapewnia dużą, ortogonalną zmienną przestrzeń. Specjalnie zbudowany układ diod LED, obsługiwany przez mikrokontroler, został włączony do fotosieciowania hydrożeli w formacie płytki 384-dołkowej w celu zwiększenia automatyzacji i odtwarzalności. Intensywność ekspozycji była zróżnicowana w całym dołku, aby zmienić właściwości mikromechaniczne otrzymanych hydrożeli, jak oceniono za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Chociaż ten manuskrypt nie skupia się na konstruowaniu samej matrycy oświetleniowej, schemat obwodu (Rysunek 1B) i lista części (Tabela materiałów) są dostarczane jako pomoce w reprodukcji urządzenia.

Ten raport pokazuje szybkie generowanie szeregu komórek GBM hodowanych w unikalnych, 3D mikrośrodowiskach, w których moduł Younga (cztery poziomy w jednym rzędzie wielkości) i zawartość peptydu wiążącego integrynę (pochodzącego z czterech różnych białek ECM) były zmieniane ortogonalnie. Podejście to wykorzystano następnie do zbadania względnego wpływu mechaniki hydrożelu i zaangażowania integryny specyficznej dla ECM na żywotność i proliferację komórek GBM pochodzących od pacjenta, gdy nabywają one oporność na chemioterapię temozolomidem (TMZ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Linie komórkowe GBM pochodzące od pacjentów (GS122 i GS304) zostały udostępnione przez profesora Davida Nathansona (naszego współpracownika), który opracował te linie zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną UCLA (IRB# 10-000655). Komórki zostały dostarczone w formie zanonimizowanej, tak aby linie komórkowe nie mogły zostać powiązane z konkretnymi pacjentami.

1. Przygotowanie roztworu hydrożelu

  1. Przygotować roztwór buforowany HEPES, rozpuszczając proszek HEPES w stężeniu 20 mM w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS). Po pełnym rozpuszczeniu dostosować pH do wartości 7.
  2. W roztworze buforowanym HEPES rozpuścić tiolowany HA (nominalna masa cząsteczkowa 700 kDa, patrz Tabela materiałów), przygotowany zgodnie z poprzednim raportem31, w taki sposób, aby 6%-8% reszt kwasu karboksylowego w każdym kwasie glukuronowym było zmodyfikowanych tiolem, do stężenia 10 mg/mL w roztworze buforu.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie bursztynowych fiolek, aby zapobiec utlenianiu tioli przez światło otoczenia.
    1. Mieszać na magnetycznym mieszadle (<1 000 rpm) w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia, co zazwyczaj zajmuje około 45 min.
  3. Podczas rozpuszczania HA przygotować w probówkach do mikrocentryfugi oddzielne roztwory: (1) 100 mg/mL 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/mL 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM cysteiny lub peptydu zawierającego cysteinę (np. GCGYGRGDSPG) oraz (4) 4 mg/mL LAP (patrz Tabela materiałów).
    1. Każdy z tych czterech roztworów przygotować w roztworze buforowanym HEPES sporządzonym w kroku 1.1. Roztwory wymieszać w wortexie, aby zapewnić pełne rozpuszczenie każdego odczynnika przed przystąpieniem do kroku 4.
      UWAGA: W przypadku testowania wielu różnych peptydów, każdy z nich musi zawierać cysteinę lub inne źródło grupy tiolowej dla tej chemii sprzęgania.
    2. Na tym etapie przygotować roztwory (dostępny tiol 4 mM) wszystkich peptydów, które mają zostać przywiązane w obrębie jednego hydrożelu.
      UWAGA: Sekwencje peptydowe oraz białka ECM, z których zostały one wyprowadzone i które były stosowane w tym badaniu, wymieniono w Tabeli 1. N-acetylocysteinę (patrz Tabela materiałów), do której komórki nie przylegają, można zastosować zamiennie z bioaktywnym peptydem zawierającym tiol w celu miareczkowania stężenia peptydu adhezyjnego lub jako kontrolę negatywną31.
  4. Wymieszać poszczególne roztwory HA, PEG-Norbornene, PEG-thiol oraz cysteiny/peptydów zawierających tiol (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać stężenia końcowe dla macierzy hydrożelowych wymienionych w Tabeli 2. Mieszać (<1 000 rpm) na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 30 min do pełnego wymieszania.
    ​UWAGA: Roztwory HA są bardzo lepkie i najlepiej operować nimi za pomocą pipety wypierającej (patrz Tabela materiałów). Jeśli pipeta wypierająca jest niedostępna, lepkie roztwory można również dozować standardową mikropipetą, powoli pipetując przy użyciu końcówek o szerokim otworze.

2. Naświetlanie i fotoutwardzanie hydrożeli poprzez matryca LED

UWAGA: Należy nosić okulary ochronne z filtrem UV i osłonić pole naświetlania materiałem absorbującym promieniowanie UV.

UWAGA: Macierz LED opisana w niniejszym protokole składa się z sześciu zestawów po osiem diod LED połączonych szeregowo, co zilustrowano na dołączonym schemacie obwodu (Rysunek 1A). Każdy zestaw diod LED może być zasilany niezależnie, co pozwala na uzyskanie do sześciu różnych poziomów natężenia promieniowania w jednej serii pomiarowej. Plik uzupełniający 1 zawiera zrzuty ekranu odpowiadające poniższym instrukcjom, które służą jako dodatkowa pomoc.

  1. Pobierz plik Illumination Device.zip z Uzupełniające pliki z kodemTen katalog zawiera następujące pliki: Arduino.zip (Uzupełniający plik z kodem 1), Sterowniki.zip (Uzupełniający plik z kodem 2), GUI.zip (Uzupełniający plik z kodem 3), oraz Holder.zip (Uzupełniający plik z kodem 4).
    UWAGA: Wydrukuj w technologii druku 3D górną i dolną część służące do unieruchomienia płytki drukowanej (patrz Uzupełniające pliki z kodem po szczegóły).
  2. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie mikrokontrolera (patrz Tabela materiałów).
  3. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie GUI (patrz Tabela materiałów). Należy odwołać się do Plik uzupełniający 1 instrukcja obsługi oprogramowania
  4. Otwórz Przetwarzanie oraz zainstaluj bibliotekę controlIP5 poprzez kliknięcie w Szkic > Importowanie biblioteki > Dodaj bibliotekęNastępnie wyszukaj controlIP5 w bibliotekach i kliknij InstalacjaWykonaj tę procedurę po raz pierwszy.
  5. Włącz urządzenie oświetleniowe (patrz Tabela materiałów) przy użyciu zasilacza 36 V i podłącz urządzenie do komputera za pomocą kabla micro-USB.
    UWAGA: Niektóre urządzenia nie zainstalują automatycznie sterowników dla różnych płytek Arduino nano. Jeden zestaw sterowników znajduje się w pliku zip urządzenia.
  6. Otwórz plik Arduino.ino, znajdujący się w folderze Adruino.zip, za pomocą środowiska Arduino IDE.
  7. Skompiluj plik Arduino.ino, klikając w Znak wyboru Prześlij skompilowany kod, klikając przycisk. Strzałka przycisk
  8. Otwórz plik GUI.pde, znajdujący się w folderze GUI.zip, za pomocą programu Processing.
  9. Kliknij w Uruchom w programie Processing, aby uruchomić graficzny interfejs użytkownika do sterowania urządzeniem oświetleniowym.
  10. W oknie graficznego interfejsu użytkownika kliknij Intensywność dla kolumny zawierającej roztwór prekursora hydrożelu do sieciowania i wprowadź żądaną intensywność. Kliknij w Czas pole i wprowadź żądany czas. Dla roztworu dostarczonego w Tabela 2trwa to 15 s.
    UWAGA: Użytkownicy końcowi muszą skalibrować cyfrowe wartości natężenia do natężenia promieniowania za pomocą radiometru. Przykłady typowych natężeń podano w Rycina 2A.
  11. Ustaw próbki w osi urządzenia oświetlającego (Rysunek 2B) z co drugą diodą LED w jednej kolumnie form silikonowych (patrz Tabela materiałów) lub płytkę 384-dołkową. Kliknij w Zakończ aby rozpocząć naświetlanie. Powtarzaj ten proces w razie potrzeby w celu naświetlenia wielu szkiełek lub innych studzienek płytki 384-dołkowej.
    UWAGA: Uchwyt jest zaprojektowany w taki sposób, aby płytka 384-dołkowa przylegała do jednego z narożników wewnętrznej komory podczas oświetlania.
    1. Po naświetleniu, gdy płytka znajduje się w jednym z narożników, należy przesunąć ją do kolejnego narożnika i powtórzyć czynność. Aby naświetlić studzienki w drugiej połowie płytki, należy wyjąć ją z uchwytu i obrócić. 180°.
  12. W celu przeprowadzenia charakterystyki mechanicznej należy wytworzyć hydrożele o zróżnicowanych właściwościach mechanicznych, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Oczyścić szkiełka przedmiotowe i formy silikonowe za pomocą taśmy, aby usunąć zanieczyszczenia. Przytwierdzić formy silikonowe do szkiełka przedmiotowego, docisnąć, aby zapewnić szczelność i usunąć pęcherzyki powietrza.
    2. Pipeta 80 µL roztworu prekursora hydrożelu, przygotowanego w kroku 1.4, do każdej formy silikonowej na szkiełku przedmiotowym.
    3. Umieść szkiełko przedmiotowe na urządzeniu oświetleniowym, wyrównując je z co drugą diodą LED w jednej kolumnie. Naświetl prekursory hydrożelu światłem UV przez 15 s, zgodnie z opisem w kroku 2, w celu przeprowadzenia fotousieciowania.
    4. Po zakończeniu naświetlania należy wyjąć slajdy i oddzielić żele od form, prowadząc cienkim narzędziem wzdłuż wewnętrznej krawędzi formy (10 µL końcówka do pipety, igła 30 G itp.). Formy silikonowe usunąć pęsetą.
    5. Przenieść sieciowane hydrożele do poszczególnych dołków płytki 12-dołkowej, zwilżając szpatułkę i delikatnie zsuwając je z podstawki szklanej. Wypełnić każdy dołek 2 ml DPBS (patrz Tabela materiałów) przed dodaniem hydrożelu. Namoczyć żele w roztworze DPBS przez co najmniej 12 h (zazwyczaj przez noc) w temperaturze pokojowej (w celu przeprowadzenia charakterystyki mechanicznej następnego dnia).

3. Pomiary za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych (AFM)

  1. Włącz mikroskop sił atomowych (AFM) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów). Niniejszy protokół zawiera zwięzłe instrukcje dotyczące obsługi instrumentu oraz powiązanego oprogramowania.
  2. Zainstaluj sondę AFM (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: W niniejszym badaniu trójkątna belka z azotku krzemu o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m została zmodyfikowana za pomocą sferycznej cząsteczki dwutlenku krzemu o rozmiarze 2,5 µm.
  3. Po instalacji ustaw wiązkę lasera na wierzchołek trójkątnej sondy, a następnie wyreguluj lustro i odchylenie lasera, aby zmaksymalizować sumę sygnałów (zazwyczaj w zakresie 1,5-2,2 V).
  4. Zanurz sondę w DPBS i odczekaj do 15 min w celu uzyskania równowagi termicznej. Kliknij przycisk Calibration i wybierz kalibrację Contact-Dependent. Kliknij przycisk Collect Thermal Tuning, a po zebraniu danych wybierz pik w okolicy 3 kHz do kalibracji.
    UWAGA: Po zanurzeniu w cieczy może być konieczna niewielka korekta lustra i deflektorów lasera ze względu na zmiany współczynnika załamania światła.
  5. Zbliż sondę do powierzchni szalki Petriego (plastikowej), ustawiając Approach Parameters na Constant Velocity, wysokość docelową na 7,5 µm oraz prędkość zbliżania na 15 µm/s. Włącz funkcję Baseline Measurement Per Run for Approach, aby zbliżanie przebiegało w sposób ciągły i nie zostało przedwcześnie przerwane z powodu dryftu deflektora.
  6. Po zbliżeniu ustaw parametry akwizycji mapowania sił na punkty zwrotne 4 nN, dystans wgłębienia 2 µm, prędkość 1 µm/s i czas kontaktu 0 s. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć zbieranie krzywej siły na powierzchni plastiku (np. płytce wielodołkowej).
  7. Powróć do okna kalibracji i zaznacz fragment krzywej siły odpowiadający kontaktowi i wgłębieniu w plastiku. Zaakceptuj obliczone wartości czułości i sztywności sondy, aby zakończyć kalibrację.
  8. Po kalibracji unieś sondę AFM i umieść próbkę hydrożelu do analizy. Zbliż sondę do hydrożelu zgodnie z ustawieniami podanymi w kroku 5.
    UWAGA: Podczas procedury zbliżania do powierzchni hydrożelu urządzenie może błędnie zasygnalizować stan zbliżenia. Aby zweryfikować faktyczne zbliżenie, uzyskaj krzywą siły zgodnie z krokiem 4.6. Powtórz procedurę zbliżania, jeśli wynikowa krzywa nie wykazuje kontaktu i powstałego wgłębienia.
  9. Po pomyślnym zbliżeniu do powierzchni przełącz się w tryb Force Mapping i ustaw parametry akwizycji na mapę o rozmiarze 8 x 8 z długością 40 µm na oś. Uzyskaj mapy sił w różnych obszarach, aby ocenić jednorodność pomiarów sztywności.
    1. Zinterpretuj krzywe siły za pomocą programu JPK SPM Data Processing poprzez dopasowanie modelu Hertza/Sneddona (Równania 1 i 2, definicje wszystkich zmiennych znajdują się w Tabeli 3) przy wybranej geometrii sferycznej32,33,34.
      Równanie do obliczania siły kontaktu, formuła używana w analizie naprężeń mechanicznych.   Równanie 132
      Formuła równowagi statycznej δ=(a/2)ln[(Rs+a)/(Rs-a)]; równanie do analizy naukowej.   Równanie 232

4. Przygotowanie i traktowanie lekami kultur 3D osadzonych w macierzy

  1. Przygotować wybrane komórki w postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
    UWAGA: Różne typy komórek mogą wymagać różnych metod pasażowania. Typowy protokół pasażowania hodowli zawiesinowej sferoidów GBM z kolby T-75 opisano w odniesieniu31.
  2. Zebrać sferoidy GBM (o średnicy około 150 µm) z hodowli zawiesinowej w kolbie T-75 do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Przepłukać kolbę hodowlaną 5 mL DPBS, aby usunąć pozostałe komórki i pożywkę, a następnie dodać tę objętość do probówki stożkowej.
  3. Wirować probówkę stożkową z komórkami z prędkością 200 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu usunąć nadosad za pomocą pipety serologicznej 5 mL, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie resuspendować w 5 mL DPBS.
  4. Wirować z prędkością 200 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu przemycia komórek. Odssać nadosad pipetą serologiczną 5 mL, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie resuspendować komórki w 2 mL odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela materiałów).
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 min. Dodać 3 mL pożywki kompletnej (patrz Tabela materiałów) i delikatnie pipetować 3-5 razy, aby rozbić sferoidy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek31.
  6. Wirować zawiesinę pojedynczych komórek z prędkością 400 x g (zawiesiny pojedynczych komórek można wirować szybciej w celu utworzenia osadu) przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Odssać nadosad pipetą serologiczną 5 mL, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Resuspendować komórki w 1 mL pożywki kompletnej.
    UWAGA: Jeśli po pasażowaniu komórki pozostają w grudkach, a nie w formie pojedynczych komórek w zawiesinie, można je przepuścić przez sitko komórkowe 40 µm w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
  7. Pobrać część komórek do policzenia za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć tę część dwukrotnie błękitem trypanu, który przenika do komórek o obniżonej żywotności. Liczyć tylko żywe, bezbarwne komórki. Typowo, kolba T-75 zasiewana w ilości 800 000 komórek na kolbę daje 2-3 miliony komórek po tygodniu hodowli.
  8. Określić liczbę komórek niezbędną do enkapsulacji. Przenieść objętość pożywki zawierającą całkowitą wymaganą liczbę komórek do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Wirować z prędkością 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Na przykład, aby enkapsulować komórki w zagęszczeniu 2,5 miliona komórek/mL, potrzeba minimum 2,5 miliona komórek resuspendowanych w 1 mL żelu. Objętość żelu 1 mL pozwala użytkownikowi na naniesienie 100 kropli żelu, gdzie każda kropla ma objętość 10 µL. Zaleca się przygotowanie dodatkowych ~20% objętości komórek zawieszonych w roztworze hydrożelu, aby zrekompensować straty podczas przenoszenia pipetą. Zatem w tym przykładzie należy przygotować 3 miliony komórek i 1,2 mL roztworu prekursora hydrożelu. Zalecane jest minimalne zagęszczenie 500 tysięcy komórek/mL.
  9. Odssać nadosad mikropipetą, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Resuspendować osad komórkowy w roztworze prekursora hydrożelu, przygotowanym w kroku 1.4, mieszając dokładnie poprzez pipetowanie w górę i w dół mikropipetą 1 000 µL 4-5 razy.
  10. Nanieść komórki do pipety wielokrotnej (patrz Tabela materiałów) ustawionej na dozowanie 10 µL. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza i nierównego dozowania, przygotować pipetę wielokrotną, dozując dodatkowo 1-2 razy do pojemnika na odpady.
  11. Do każdego dołka płytki 384-dołkowej nanieść 10 µL komórek zawieszonych w roztworze hydrożelu za pomocą pipety wielokrotnej. Używając matrycy LED, naświetlać każdy dołek zawierający komórki (krok 2) przez 15 s z intensywnościami (przykładowe wyniki na Rysunku 2A wykorzystywały intensywności 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2), aby uzyskać pożądane właściwości mechaniczne.
    UWAGA: Sugeruje się rozpoczęcie od pięciu powtórzeń na warunek eksperymentalny i zwiększenie lub zmniejszenie tej liczby w zależności od pożądanej przepustowości i wariancji testu końcowego.
  12. Dodać 40 µL pożywki kompletnej do każdego dołka zawierającego komórki. Dodać 50 µL DPBS do nieeksperymentalnych, suchych dołków otaczających żele, aby zminimalizować straty wynikające z parowania.
  13. W przypadku komórek GBM dodać 40 µL pożywki zawierającej lek (np. TMZ, patrz Tabela materiałów), aby uzyskać końcowe pożądane stężenie (odpowiednio 10 µM-100 µM w dimetylosulfoksydzie (DMSO) lub nośniku (DMSO)), rozpoczynając 3 dni po enkapsulacji.

5. Test proliferacji CCK8

  1. Do każdego dołka zawierającego komórki dodaj 10 µL odczynnika CCK8 (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Jeśli przeprowadzany jest ten test po raz pierwszy, należy uwzględnić dołki kontrolne negatywne, takie jak same medium lub hydrożel bez komórek w medium.
  2. Inkubuj przez 1-4 h zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Czas ten może się różnić w zależności od typu i gęstości komórek, dlatego czasy inkubacji należy przetestować dla każdego zastosowania, aby wartości absorbancji mieściły się w zakresie liniowym, co jest wymogiem stosowania prawa Beera35.
  3. Po inkubacji odczytaj absorbancję przy 450 nm dla wszystkich dołków.
  4. Oblicz średnią absorbancję przy 450 nm uzyskaną w kroku 3 dla warunku kontrolnego (vehicle) dla każdej grupy. Wartość dla każdego dołka traktowanego lekiem podziel przez średnią z kontroli vehicle dla danej grupy.
  5. Oblicz przedziały ufności, generując rozkłady bootstrapowe (N = 10 000) za pomocą metody percentylowej36.
    UWAGA: Zazwyczaj można stosować 95% przedziały ufności i interpretować warunki, których przedziały ufności nie przecinają wartości 1, jako istotne i wymagające dalszych badań. Ustawienie przedziałów ufności na poziomie 95% jest spójne z ustaleniem progu istotności p = 0,05. W przypadku danych przedstawionych w wynikach przydatne jest rozróżnienie warunków, które albo promują, albo hamują oporność na leki indukowaną przez macierz, co wymaga analizy dwustronnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiary AFM potwierdziły precyzyjną kontrolę właściwości mechanicznych hydrożelu w zależności od natężenia promieniowania UV (mW/cm2) podczas sieciowania światłem przy użyciu zbudowanej na zamówienie matrycy LED sterowanej przez Arduino (Rycina 2A). Skład hydrożelu użytego w niniejszym protokole znajduje się w Tabeli 2. Rozstaw diod LED na dostarczonym szablonie odpowiada rozstawowi co drugiej studni płytki 384-dołkowej, co umożliwia formowanie żeli bezpośrednio w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecna praca przedstawia metody generowania 3D, zminiaturyzowanych kultur w oparciu o HA, przy jednoczesnej zmianie sztywności matrycy i peptydów dostępnych do angażowania integryn. Technika ta umożliwia systematyczne badanie, w jaki sposób parametry macierzy wpływają na fenotypy komórkowe (np. żywotność komórek nowotworowych narażonych na chemioterapię) ze zwiększoną przepustowością. Poprzednie podejścia, w tym przedstawione w niniejszym dokumencie, dostosowały sztywność hydrożelu poprzez zmianę procentowej zawartości c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby szczególnie podziękować Carolyn Kim, Amelii Lao, Ryanowi Stoutamore'owi i Itayowi Solomonowi za ich wkład we wcześniejsze wersje schematu fotożelowania. Linie komórkowe GS122 i GS304 zostały hojnie dostarczone przez Davida Nathansona. Wszystkie figury zostały stworzone z BioRender.com. Kluczowe znaczenie w pracach miały główne obiekty UCLA, Molecular Screening Shared Resources oraz Laboratorium Charakterystyki Nano i Pico. Chen Chia-Chun był wspierany przez UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan był wspierany przez Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rezystory 1,1 kOhm, 6 WDigikey35601k1ft
1,7 mL rurka mikrowirówkowaGenesse Scientific21-108
15 mL rurka stożkowaFisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyLTPL-c034uvh365
384 well plateBio Greiner One781090
40 µ m filtr siatkowyMTC bioC4040
4-ramienny glikol polietylenowy zakończony tiolem (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsRezystory Digikey2n5550ta
80 Ohm, 0,125 WDigikeyerjj-6ENF80R6V
8-Armed glikol polietylenowy zakończony norbornenem (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
Innowacyjne technologie komórkoweAccutaseAT104500  Dysocjacja komórek  odczynnik
AFM SondyNovascan0,01 N/m Nominalna stała sprężystości, 2,5 i mikro; m Cząstka SiO2
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P Płytka
bFGFPeprotech100-18B20 ng / mL
CCK8Abcamab228554
WirówkaThermoscientificsorvall legend xtr
CP100STGilsonF148415Końcówki do pipet wyporowych
Cubis Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/ml
Etanol, bezwodnyFisher ScientificA405PDodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 70%
Fiolki z gwintem Fisherbrand Class B ze szkła bursztynowegoFisher Scientific03-339-23C
Fisherbrand Papier do ważeniaFisher Scientific09-898-12B
G21 SuplementGemini Bio400-16050x
Hanks Zrównoważony roztwór soliThermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838ADodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 1 M
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma AldrichH3149-100Ku25 µ g / mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
Pistolet na gorące powietrzeWagnerHT1000
Peptyd sialoproteiny wiążącej integrynę (IBSP)GenscriptZamówienie niestandardoweGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
litu (LAP), >95%Sigma Aldrich900889-1G
Magnetyczna płyta mieszającaThermo ScientificSP194715
MikrowirówkaThermo ScientificSorvall legend micro 21R
Pipeta jednokanałowa Microman EGilsonFD10004Pipeta wyporowa
Końcówki do mikropipetRóżni producenciRóżne rozmiary
Sigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4Mikroskop BrukerAFM
NaOHFisher Scientificss255-1Dodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Peptyd osteopontynyGenscriptZamówienie niestandardoweGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet AidDrummond4000102
Zwykłe szkiełka mikroskopoweIzolator silikonowy Globe Scientific1301
Press-To-Seal, średnica 12-4,5 mm x głębokość 2 mmGrace Bio Labs664201-AWytnij tak, aby z jednego arkusza wykonano 8 pojedynczych form
PrzetwarzaniePrzetwarzanie 3.5.4
Repeater M4Eppendorf4982000322
Repeater Końcówkido pipetSartorious30089430Rozmiary 1 mL
Peptyd RGD GenscriptGCGYGRGDSPG
Taśma Scoth Pipety
serologiczneGenesse Scientific12-102,12-1045,10 mL
Pasta lutowniczaDigikey315-NC191LT15T5-ND
Drut
prosty kleszcze preparacyjneVWR Scientific82027-408
Synergy H1 Czytnik płytekBiotek
T-75 Kolba poddana hodowli komórkowejGenesee Scientific25-209
TemozolomidSigma AldrichT2577Zwykle używany od 10 &mikro; M do 100 i mikro; M
Tenascin-C PeptideGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Tiolowany kwas hialuronowy (700 kDa), 6-8% modyfikowanyLifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar, Flea MicroVWR58948-375
mikrokontroleraTrimetylobenzoilofosfinianmikropipet mLine Sartorious N-acetylocysteina lutowniczy

Bibliografia

  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  3. Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
  4. Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology's trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
  5. Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879(2018).
  6. Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
  7. Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
  8. Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
  9. Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
  10. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  11. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  12. Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144(2018).
  13. Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
  14. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  15. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  16. Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
  17. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
  18. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  19. Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
  20. Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396(2022).
  21. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
  22. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  23. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  24. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176(2018).
  25. Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
  26. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  27. Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549(2021).
  28. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
  29. Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
  30. Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840(2018).
  31. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176(2018).
  32. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  33. Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
  34. Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
  35. Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
  36. Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
  37. Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
  38. Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
  39. da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177(2019).
  40. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  41. Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowe modele nowotworówprzesiewanie lekówoddziaływania komórka-macierzkomórki glejaka wielopostaciowegozminiaturyzowana hodowla 3Dmechanika macierzytest żywotności komóreksieciowanie fotochemiczne
Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.