Method Article

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

DOI:

10.3791/63791

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje komórka-matryca pośredniczą w złożonych procesach fizjologicznych poprzez sygnały biochemiczne, mechaniczne i geometryczne, wpływając na zmiany patologiczne i reakcje terapeutyczne. Oczekuje się, że uwzględnienie efektów matrycy na wcześniejszym etapie opracowywania leków zwiększy prawdopodobieństwo sukcesu klinicznego nowych środków terapeutycznych. Istnieją strategie oparte na biomateriałach, które rekapitulują określone mikrośrodowiska tkankowe w hodowli komórkowej 3D, ale ich integracja z metodami hodowli 2D stosowanymi głównie do badań przesiewowych leków była wyzwaniem. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje rozwój metod hodowli 3D w zminiaturyzowanych matrycach biomateriałów w formacie płytki wielodołkowej, aby ułatwić integrację z istniejącymi rurociągami badań przesiewowych leków i konwencjonalnymi testami żywotności komórek. Ponieważ oczekuje się, że cechy matrycy kluczowe dla zachowania klinicznie istotnych fenotypów w hodowanych komórkach będą wysoce specyficzne dla tkanek i chorób, konieczne będzie kombinatoryczne badanie przesiewowe parametrów matrycy w celu określenia odpowiednich warunków dla określonych zastosowań. Opisane tutaj metody wykorzystują zminiaturyzowany format hodowli do oceny odpowiedzi komórek nowotworowych na ortogonalną zmienność mechaniki macierzy i prezentację ligandów. W szczególności badanie to demonstruje wykorzystanie tej platformy do zbadania wpływu parametrów matrycy na odpowiedzi komórek glejaka wielopostaciowego (GBM) pochodzących od pacjenta na chemioterapię.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekiwany koszt opracowania nowego leku stale rósł w ciągu ostatniej dekady, z ponad 1 miliardem dolarów według obecnych szacunków1. Częścią tego wydatku jest wysoki wskaźnik niepowodzeń leków wchodzących do badań klinicznych. Około 12% kandydatów na leki ostatecznie uzyskuje zgodę amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) w 2019 roku. Wiele leków nie przechodzi fazy I z powodu nieoczekiwanej toksyczności2, podczas gdy inne, które przejdą testy bezpieczeństwa, mogą nie przejść z powodu braku skuteczności3. To wyczerpanie z powodu braku skuteczności można częściowo wytłumaczyć faktem, że modele nowotworów używane podczas opracowywania leków notorycznie nie przewidują skuteczności klinicznej4.

Funkcjonalne rozbieżności między modelami in vitro i in vivo można przypisać usuwaniu komórek rakowych z ich rodzimego mikrośrodowiska, w tym komórek nienowotworowych i fizycznego ECM5,6. Zwykle grupy badawcze używają dostępnych na rynku matryc hodowlanych, takich jak Matrigel (białkowa macierz błony podstawnej pochodząca z mięsaków myszy), aby zapewnić hodowanym komórkom nowotworowym mikrośrodowisko macierzy 3D. W porównaniu z hodowlą 2D, hodowla 3D w matrycy błonowej poprawiła kliniczne znaczenie wyników in vitro7,8. Jednak biomateriały hodowlane z tkanek bezkomórkowych, w tym matrycy błonowej, zazwyczaj wykazują zmienność między partiami, która może zagrozić odtwarzalności9. Co więcej, matryce pochodzące z nowotworów o innym pochodzeniu tkankowym niż badane mogą nie dostarczać odpowiednich wskazówek fizjologicznych10. Wreszcie, nowotwory o wysokim stopniu niejednorodności wewnątrznowotworowej mają cechy mikrośrodowiskowe, które różnią się w skali submikronowej i których nie można dostroić do rekapitulacji matrycy błonowej11.

Glejak wielopostaciowy (GBM), jednolicie śmiertelny guz mózgu o medianie czasu przeżycia około 15 miesięcy, jest nowotworem, dla którego opracowanie leczenia było szczególnie trudne12,13. Obecny standard opieki nad GBM składa się z pierwotnej resekcji guza, następnie radioterapii, a następnie chemioterapii z użyciem temozolomidu (TMZ)14. Jednak ponad połowa klinicznych nowotworów GBM wykazuje oporność na leczenie poprzez różne mechanizmy15,16,17. Przewidywanie skuteczności schematu leczenia u konkretnego pacjenta jest niezwykle trudne. Standardowe modele przedkliniczne stosowane do przewidywania indywidualnych wyników składają się z komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta, ksenoprzeszczepowanych ortotopowo myszom z obniżoną odpornością. Podczas gdy ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów mogą podsumować wiele aspektów klinicznych nowotworów GBM i są cenne dla modeli przedklinicznych18, są one z natury drogie, mają niską przepustowość, są czasochłonne i wiążą się z problemami etycznymi19. Hodowle komórek pochodzących od pacjentów, na powierzchniach plastikowych 2D lub w postaci sferoid, w większości przypadków pozwalają uniknąć tych problemów. Podczas gdy komórki pochodzące od pacjentów zachowują aberracje genetyczne, ich hodowle w 2D lub jako zawieszone sferoidy były w dużej mierze słabymi reprezentacjami ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów u gryzoni i oryginalnych guzów pacjentów20. Wcześniej my i inni wykazaliśmy, że komórki GBM hodowane w 3D ECM, który naśladuje mechaniczne i biochemiczne właściwości tkanki mózgowej, mogą zachować fenotypy oporności na leki10,21,22,23.

Interakcje między kwasem hialuronowym (HA), polisacharydem występującym w dużych ilościach w mózgu ECM i nadmiernie eksprymowanym w nowotworach GBM, a jego receptorem CD44 modulują nabywanie oporności na leki in vitro21,24,25,26,27. Na przykład włączenie kwasu hialuronowego do miękkich kultur 3D zwiększyło zdolność komórek GBM pochodzących od pacjentów do nabywania oporności terapeutycznej. Ta mechano-responsywność była zależna od wiązania HA z receptorami CD44 na komórkach GBM21. Dodatkowo, wiązanie integryny z peptydami zawierającymi RGD, włączonymi do matryc kultur 3D, wzmacniały chemooporność za pośrednictwem CD44 w sposób zależny od sztywności21. Poza HA, ekspresja kilku białek ECM, z których wiele zawiera regiony RGD, różni się między normalnymi guzami mózgu a guzami GBM28. Na przykład jedno z badań wykazało, że 28 różnych białek ECM było regulowanych w górę w guzach GBM29. W tym złożonym mikrośrodowisku macierzy nowotworowej komórki rakowe integrują mechaniczne i biochemiczne wskazówki, aby uzyskać określony fenotyp oporności, który zależy od stosunkowo niewielkich różnic (np. mniej niż rząd wielkości) w module Younga lub gęstości peptydów wiążących integryny28,29,30.

Obecny protokół opisuje, w jaki sposób komórki nowotworowe interpretują unikalne kombinacje sygnałów matrycowych i identyfikują złożone, specyficzne dla pacjenta mikrośrodowiska matrycowe, które promują oporność na leczenie (Rysunek 1A). Fotochemiczna metoda generowania zminiaturyzowanych, precyzyjnie dostrojonych matryc do hodowli 3D zapewnia dużą, ortogonalną zmienną przestrzeń. Specjalnie zbudowany układ diod LED, obsługiwany przez mikrokontroler, został włączony do fotosieciowania hydrożeli w formacie płytki 384-dołkowej w celu zwiększenia automatyzacji i odtwarzalności. Intensywność ekspozycji była zróżnicowana w całym dołku, aby zmienić właściwości mikromechaniczne otrzymanych hydrożeli, jak oceniono za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Chociaż ten manuskrypt nie skupia się na konstruowaniu samej matrycy oświetleniowej, schemat obwodu (Rysunek 1B) i lista części (Tabela materiałów) są dostarczane jako pomoce w reprodukcji urządzenia.

Ten raport pokazuje szybkie generowanie szeregu komórek GBM hodowanych w unikalnych, 3D mikrośrodowiskach, w których moduł Younga (cztery poziomy w jednym rzędzie wielkości) i zawartość peptydu wiążącego integrynę (pochodzącego z czterech różnych białek ECM) były zmieniane ortogonalnie. Podejście to wykorzystano następnie do zbadania względnego wpływu mechaniki hydrożelu i zaangażowania integryny specyficznej dla ECM na żywotność i proliferację komórek GBM pochodzących od pacjenta, gdy nabywają one oporność na chemioterapię temozolomidem (TMZ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linie komórkowe GBM pochodzące od pacjentów (GS122 i GS304) zostały dostarczone przez profesora Davida Nathansona (naszego współpracownika), który rozwinął te linie zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez UCLA Institutional Review Board (IRB# 10-000655). Komórki zostały dostarczone w stanie pozbawionym elementów pozwalających na identyfikację, tak aby nie można było powiązać linii komórkowych z poszczególnymi pacjentami.

1. Przygotowanie roztworu hydrożelu

  1. Przygotować roztwór buforowany przez HEPES, rozpuszczając proszek HEPES w temperaturze 20 mM w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Dostosuj pH do 7 po pełnej solwatacji.
  2. W roztworze buforowanym przez HEPES rozpuścić tiolowany kwas hiolowany (nominalna masa cząsteczkowa 700 kDa, patrz tabela materiałów), przygotowany zgodnie z poprzednim raportem31, tak aby 6%-8% reszt kwasu karboksylowego na każdym kwasie glukuronowym zostało zmodyfikowane tiolem o stężeniu 10 mg/ml w roztworze buforowym.
    UWAGA: Zalecana jest bursztynowa fiolka, aby zapobiec utlenianiu tiolu przez światło otoczenia.
    1. Mieszać za pomocą magnetycznej płytki mieszającej (<1,000 obr./min) w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia, zwykle około 45 minut.
  3. Podczas rozpuszczania HA należy przygotować oddzielne roztwory (1) 100 mg/ml 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/ml 4-ramiennego PEG-tiolu (20 kDa), (3) 4 mM cysteiny lub peptydu zawierającego cysteinę (np. GCGYGRGDSPG) i (4) 4 mg/ml LAP w probówkach do mikrowirówek (patrz tabela materiałów).
    1. Przygotuj każdy z tych czterech roztworów w roztworze buforowanym przez HEPES przygotowanym w kroku 1.1. Sprowadzić roztwory do wirów, aby zapewnić pełne rozpuszczenie każdego odczynnika przed wykonaniem kroku 4.
      UWAGA: W przypadku testowania wielu różnych peptydów, każdy z nich musi zawierać cysteinę lub inne źródło ugrupowania tiolowego dla tej chemii koniugacji.
    2. Przygotować roztwory (4 mM dostępnego tiolu) wszystkich peptydów, które mają być w tym momencie uwiązane w jednym hydrożelu.
      UWAGA: Sekwencje peptydowe i białka ECM, z których zostały one uzyskane i wykorzystane w tym badaniu, wymieniono w Tabeli 1. N-acetylocysteina (patrz tabela materiałów), z którą komórki się nie wiążą, może być zastąpiona bioaktywnym peptydem zawierającym tiol w celu miareczkowania stężenia peptydu adhezyjnego lub działać jako kontrola ujemna31.
  4. Zmieszać poszczególne roztwory HA, PEG-Norbornen, PEG-tiol i peptydów zawierających cysteinę/tiol (patrz tabela materiałów), aby uzyskać końcowe stężenia dla końcowych matryc hydrożelowych wymienionych w tabeli 2. Mieszać (<1,000 obr./min) na magnetycznej płytce mieszającej przez co najmniej 30 minut, aby w pełni wymieszać.
    UWAGA: Roztwory HA mają wysoką lepkość i najlepiej obsługiwać je za pomocą pipety wyporowej (patrz Tabela materiałów). Jeśli pipeta wyporowa nie jest dostępna, lepkie roztwory można również dozować za pomocą standardowej mikropipety, powoli pipetując za pomocą końcówek o szerokich otworach.

2. Oświetlenie i fotosieciowanie hydrożeli za pomocą matrycy LED

UWAGA: Nosić okulary chroniące przed promieniowaniem UV i zakrywać pole świetlne materiałem pochłaniającym promieniowanie UV.

UWAGA: Tablica LED opisana w tym protokole składa się z sześciu zestawów po osiem diod LED umieszczonych szeregowo, jak ilustruje dostarczony schemat obwodu (Rysunek 1A). Każdy zestaw diod LED może być zasilany niezależnie, co pozwala na uzyskanie do sześciu różnych natężeń promieniowania na bieg. Plik uzupełniający 1 zawiera zrzuty ekranu odpowiadające poniższym wskazówkom w celu uzyskania dalszych wskazówek.

  1. Pobierz plik Illumination Device.zip z dodatkowych plików kodowania. Ten katalog zawiera następujące pliki: Arduino.zip (Dodatkowy plik kodowania 1), Drivers.zip (Uzupełniający plik kodowania 2), GUI.zip (Uzupełniający plik kodowania 3) i Holder.zip (Uzupełniający plik kodowania 4).
    UWAGA: Wydrukuj 3D górną i dolną część, aby utrzymać płytkę drukowaną na miejscu (szczegółowe informacje można znaleźć w Dodatkowych plikach kodowania).
  2. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie mikrokontrolera (patrz tabela materiałów).
  3. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie GUI (patrz Spis materiałów). Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 1, aby uzyskać instrukcję obsługi oprogramowania.
  4. Otwórz Przetwarzanie i zainstaluj bibliotekę controlIP5, klikając Sketch > Importuj bibliotekę > Dodaj bibliotekę. Następnie wyszukaj controlIP5 w bibliotekach i kliknij Zainstaluj. Wykonaj to po raz pierwszy.
  5. Zasil urządzenie oświetleniowe (patrz tabela materiałów) za pomocą zasilacza 36 V i podłącz je do komputera za pomocą micro-USB.
    UWAGA: Niektóre urządzenia nie zainstalują automatycznie sterowników dla różnych płytek nano Arduino. Jeden zestaw sterowników znajduje się w pliku zip urządzenia.
  6. Otwórz plik Arduino.ino, znajdujący się w folderze Adruino.zip, za pomocą Arduino IDE.
  7. Skompiluj plik Arduino.ino, klikając przycisk Znacznik wyboru. Prześlij skompilowany kod, klikając przycisk strzałki.
  8. Otwórz plik GUI.pde znajdujący się w folderze GUI.zip za pomocą polecenia Przetwarzanie.
  9. Kliknij Uruchom w programie przetwarzającym, aby uruchomić graficzny interfejs użytkownika do sterowania urządzeniem oświetleniowym.
  10. W oknie graficznego interfejsu użytkownika kliknij Intensywność, aby kolumna zawierająca roztwór prekursora hydrożelu została usieciowana i wprowadź żądaną intensywność. Kliknij pole Czas i wprowadź żądany czas. Dla roztworu podanego w tabeli 2 będzie to 15 s.
    UWAGA: Użytkownicy końcowi muszą skalibrować cyfrowe wartości intensywności do natężenia promieniowania za pomocą radiometru. Przykłady typowych intensywności znajdują się w Rysunek 2A.
  11. Wyrównaj próbki z urządzeniem oświetleniowym (Rysunek 2B) z każdą inną diodą LED w jednej kolumnie form silikonowych (patrz Tabela materiałów) lub płytce 384-dołkowej. Kliknij Zakończ, aby rozpocząć oświetlenie. Powtórz ten proces, jeśli jest to konieczne do oświetlenia wielu szkiełek lub innych studzienek płytki 384-dołkowej.
    UWAGA: Uchwyt jest zaprojektowany w taki sposób, że płytka 384-dołkowa przylega do jednego rogu komory wewnętrznej podczas oświetlenia.
    1. Po oświetleniu, po umieszczeniu w jednym rogu, przesuń płytkę studzienki do następnego rogu i powtórz. Aby oświetlić dołki na drugiej połowie płyty, wyjmij płytkę z uchwytu i obróć o 180°.
  12. Wygeneruj hydrożele o różnej mechanice do charakterystyki mechanicznej, wykonując poniższe czynności.
    1. Wyczyść szklane szkiełka i silikonowe foremki za pomocą taśmy, aby usunąć zanieczyszczenia. Przyklej silikonowe formy do szkiełka szklanego, dociśnij, aby zapewnić dobre uszczelnienie i wypiernij wszelkie pęcherzyki powietrza.
    2. Odpipetować 80 μl roztworu prekursora hydrożelu, przygotowanego w kroku 1.4, do każdej formy silikonowej na szkiełku podstawowym.
    3. Umieść szklaną szkiełko na urządzeniu oświetleniowym wyrównanym z każdą inną diodą LED w jednej kolumnie. Wystaw prekursory hydrożelu na działanie światła UV przez 15 sekund, jak opisano w kroku 2, na fotousieciowanie.
    4. Po ustaniu oświetlenia wyjmij szkiełka i poluzuj żele z form, śledząc wewnętrzny obwód formy cienką końcówką (końcówka do pipety 10 μl, igła 30 G itp.). Usuń silikonowe foremki za pomocą pęsety/kleszczy.
    5. Przenieś usieciowane hydrożele do pojedynczych dołków 12-dołkowej płytki, zwilżając szpatułkę i delikatnie spychając je ze szkiełka. Napełnij każdą studzienkę 2 ml DPBS (patrz Tabela materiałów) przed dodaniem hydrożelu. Pęcznieć żele w roztworze DPBS przez co najmniej 12 godzin (zwykle przez noc) w temperaturze pokojowej (do charakterystyki mechanicznej następnego dnia).

3. Pomiary mikroskopii sił atomowych (AFM)

  1. Włączyć mikroskop sił atomowych (AFM) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Protokół ten zawiera krótkie instrukcje dotyczące korzystania z przyrządu i związanego z nim oprogramowania.
  2. Zainstaluj sondę AFM (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: W niniejszym badaniu trójkątny wspornik z azotku krzemu o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m został zmodyfikowany kulistą cząstką dwutlenku krzemu o wielkości 2,5 μm.
  3. Po instalacji ustaw laser na wierzchołku trójkątnej sondy, a następnie wyreguluj odchylenie lustra i lasera, aby zmaksymalizować sumę sygnału (zwykle w zakresie 1.5-2.2 wolta).
  4. Zanurz sondę w DPBS i odczekaj do 15 minut, aby uzyskać równowagę termiczną. Kliknij przycisk Kalibracja i wybierz kalibrację zależną od kontaktu. Kliknij przycisk Collect Thermal Tuning i po zebraniu danych wybierz szczyt około 3 kHz do kalibracji.
    UWAGA: Po zanurzeniu w cieczy z powodu zmian współczynnika załamania światła może być konieczna niewielka regulacja lustra i deflektorów laserowych.
  5. Zbliżyć się do powierzchni szalki Petriego (plastikowej), ustawiając parametry podejścia na stałą prędkość, wysokość celu 7,5 μm i prędkość podejścia 15 μm/s. Włącz pomiar linii bazowej na przebieg dla podejścia, aby podejście przebiegało w sposób ciągły i nie kończyło się wcześnie z powodu dryftu deflektora.
  6. Po zbliżeniu ustaw parametry akwizycji do mapowania siły na 4 nN, odległość wcięcia 2 μm, prędkość 1 μm/s i czas kontaktu 0 s. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć zbieranie krzywej siły na plastikowej powierzchni (np. płytce studzienki).
  7. Wróć do okna kalibracji i wybierz część krzywej siły odpowiadającą kontaktowi i wcięciu tworzywa sztucznego. Zaakceptuj obliczone wartości czułości i sztywności sondy, aby zakończyć kalibrację.
  8. Po kalibracji podnieś sondę AFM i umieść próbkę hydrożelu do badania. Zbliż się do hydrożelu zgodnie z ustawieniami podanymi w kroku 5.
    UWAGA: Podczas procedury zbliżania się w kierunku powierzchni hydrożelu urządzenie może omyłkowo wyzwolić stan zbliżania się. Aby zweryfikować rzeczywiste podejście, należy uzyskać krzywą siły jak w kroku 4.6. Powtórz procedurę podejścia, jeśli wynikowa krzywa nie wykazuje kontaktu i wynikowego wcięcia.
  9. Gdy podejście do powierzchni zakończy się pomyślnie, przełącz się w tryb mapowania siły i ustaw parametry akwizycji na mapę o rozmiarze 8 x 8 z długością 40 μm na oś. Uzyskaj mapy sił w różnych regionach, aby ocenić jednorodność pomiarów sztywności.
    1. Interpretacja krzywych sił za pomocą oprogramowania JPK SPM Data Processing poprzez dopasowanie modelu Hertz/Sneddon (równania 1 i 2, patrz tabela 3 w celu zdefiniowania wszystkich zmiennych) z wybraną geometrią sferyczną32,33,34.
      figure-protocol-1 Równanie 132
      figure-protocol-2 Równanie 232

4. Konfiguracja i leczenie farmakologiczne kultur 3D, osadzonych w matrycy

  1. Przygotuj żądane komórki jako roztwór jednokomórkowy.
    UWAGA: Różne typy komórek mogą wymagać różnych metod pasażowania. Typowy protokół pasażowania kultury zawiesinowej sferoid GBM z kolby T-75 jest opisany w reference31.
  2. Zebrać sferoidy GBM (o średnicy około 150 μm) z kultury zawiesiny kolby T-75 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać kolbę hodowlaną 5 ml DPBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek i pożywki i dodać tę objętość do stożkowej probówki.
  3. Odwirować stożkową probówkę zawierającą komórki o masie 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu usunąć sklarowany osad za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml DPBS.
  4. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu umycia komórek. Odessać supernatant pipetą serologiczną o pojemności 5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2 ml odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów).
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut. Dodać 3 ml kompletnej pożywki (patrz Tabela Materiałów) i delikatnie pipetować 3-5 razy, aby rozbić sferoidy na zawiesinę jednokomórkową31.
  6. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 400 x g (zawiesiny jednokomórkowe mogą być szybciej wirowane w celu utworzenia osadu) przez 5 minut, aby osadzać komórki w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant pipetą serologiczną o pojemności 5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża.
    UWAGA: Jeśli komórki pozostają w kępkach, a nie jako pojedyncze komórki w zawiesinie, po pasażowaniu komórki można przepuścić przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
  7. Usuń część komórek do liczenia za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć tę porcję dwukrotnie błękitem trypanowym, który przenika do komórek z upośledzoną żywotnością. Policz tylko żywe, bezbarwne komórki. Zazwyczaj T-75 wysiewany przy 800 000 komórek na kolbę daje 2-3 miliony komórek po tygodniu hodowli.
  8. Określ liczbę komórek niezbędnych do enkapsulacji. Przenieść objętość pożywki zawierającej całkowitą liczbę potrzebnych komórek do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Na przykład do zamknięcia komórek w objętości 2,5 miliona komórek/ml potrzebne jest co najmniej 2,5 miliona komórek zawieszonych w 1 ml objętości żelu. Objętość żelu wynosząca 1 ml pozwala użytkownikom na dozowanie 100 kropli żelu, przy czym każda kropla żelu ma objętość 10 μl. Zaleca się przygotowanie dodatkowej ~20% objętości komórek zawieszonych w roztworze hydrożelu, aby uwzględnić straty podczas przenoszenia pipety. W ten sposób w tym przykładzie należy przygotować 3 miliony komórek i 1,2 ml roztworu prekursora hydrożelu. Zalecana jest minimalna gęstość 500 tys. komórek/ml.
  9. Odessać supernatant za pomocą mikropipety, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w roztworze prekursora hydrożelu, jak przygotowano w kroku 1.4, dobrze mieszając, pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl 4-5 razy.
  10. Załaduj komórki do pipetora wielokrotnego (patrz tabela materiałów) ustawionego na dozowanie 10 μl. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza i nierównomiernego dozowania, należy zalać powtórny pipetor, dozując dodatkowe 1-2 razy do pojemnika na odpady.
  11. Do każdego dołka na płytce 384-dołkowej należy dozować 10 μl komórek zawieszonych w roztworze hydrożelu z powtórnego pipetora. Korzystając z tablicy LED, oświetl każdą studzienkę zawierającą komórki (krok 2) przez 15 s intensywnościami (przykładowe wyniki to Rysunek 2A wykorzystuje intensywności 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2), aby osiągnąć pożądane właściwości mechaniczne.
    UWAGA: Sugeruje się, aby rozpocząć od pięciu powtórzeń na warunki eksperymentalne i skalować w górę lub w dół w zależności od pożądanej przepustowości i wariancji testu końcowego.
  12. Dodać 40 μl kompletnej pożywki do każdej studzienki zawierającej komórki. Dodaj 50 μl DPBS do nieeksperymentalnych, suchych studzienek otaczających żele, aby zminimalizować straty spowodowane parowaniem.
  13. W przypadku komórek GBM dodać 40 μl leku zawierającego pożywkę (np. TMZ, patrz Tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe pożądane stężenie (10 μM-100 μM w dimetylosulfotlenku (DMSO) lub nośniku (DMSO), odpowiednio, rozpoczynając 3 dni po kapsułkowaniu.

5. Test proliferacji CCK8

  1. Dodać 10 μl odczynnika CCK8 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki zawierającej komórki.
    UWAGA: Jeśli wykonujesz ten test po raz pierwszy, uwzględnij w pożywce studzienki kontroli ujemnej, takie jak tylko pożywka lub hydrożel bezkomórkowy.
  2. Inkubować przez 1-4 godziny zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: Czas ten może się różnić w zależności od typu i gęstości komórek, dlatego czasy inkubacji muszą być testowane dla każdego zastosowania, aby wartości absorbancji mieściły się w zakresie liniowym, co jest wymogiem zastosowania prawa Beera35.
  3. Odczytać absorbancje przy 450 nm dla wszystkich studzienek po inkubacji.
  4. Obliczyć średnią absorbancję przy 450 nm otrzymaną w kroku 3 dla stanu pojazdu dla każdej grupy. Podzielić każdą dobrze leczoną lek przez średnią z kontroli nośnika na grupę.
  5. Obliczanie przedziałów ufności przez generowanie rozkładów bootstrap (N = 10 000) za pomocą metody percentylowej36.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, można wykorzystać 95% przedziały ufności i interpretować warunki, których przedziały ufności nie przekraczają 1, jako znaczące i uzasadniające dalsze badania. Ustawienie przedziałów ufności na 95% jest zgodne z ustawieniem punktu odcięcia istotności p = 0,05. W przypadku danych przedstawionych w wynikach użyteczne jest rozróżnianie stanów, które albo promują, albo hamują oporność na leki za pośrednictwem macierzy, co wymaga analizy dwustronnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiary AFM potwierdziły precyzyjną kontrolę mechaniki hydrożelu jako funkcji natężenia promieniowania UV (mW/cm2) podczas sieciowania fotograficznego za pomocą specjalnie zbudowanej, sterowanej przez Arduino matrycy LED (Rysunek 2A). Preparat hydrożelowy zastosowany w tym protokole znajduje się w tabeli 2. Odstępy między diodami LED na dostarczonym szablonie są zgodne z odstępami dla każdej innej studzienki płytki 384-dołkowej, co pozwala na tworzenie się żeli wewnątrz pły...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna praca przedstawia metody generowania 3D, zminiaturyzowanych kultur w oparciu o HA, przy jednoczesnej zmianie sztywności matrycy i peptydów dostępnych do angażowania integryn. Technika ta umożliwia systematyczne badanie, w jaki sposób parametry macierzy wpływają na fenotypy komórkowe (np. żywotność komórek nowotworowych narażonych na chemioterapię) ze zwiększoną przepustowością. Poprzednie podejścia, w tym przedstawione w niniejszym dokumencie, dostosowały sztywność hydrożelu poprzez zmianę procentowej zawartości c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby szczególnie podziękować Carolyn Kim, Amelii Lao, Ryanowi Stoutamore'owi i Itayowi Solomonowi za ich wkład we wcześniejsze wersje schematu fotożelowania. Linie komórkowe GS122 i GS304 zostały hojnie dostarczone przez Davida Nathansona. Wszystkie figury zostały stworzone z BioRender.com. Kluczowe znaczenie w pracach miały główne obiekty UCLA, Molecular Screening Shared Resources oraz Laboratorium Charakterystyki Nano i Pico. Chen Chia-Chun był wspierany przez UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan był wspierany przez Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rezystory 1,1 kOhm, 6 WDigikey35601k1ft
1,7 mL rurka mikrowirówkowaGenesse Scientific21-108
15 mL rurka stożkowaFisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyLTPL-c034uvh365
384 well plateBio Greiner One781090
40 µ m filtr siatkowyMTC bioC4040
4-ramienny glikol polietylenowy zakończony tiolem (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsRezystory Digikey2n5550ta
80 Ohm, 0,125 WDigikeyerjj-6ENF80R6V
8-Armed glikol polietylenowy zakończony norbornenem (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
Innowacyjne technologie komórkoweAccutaseAT104500  Dysocjacja komórek  odczynnik
AFM SondyNovascan0,01 N/m Nominalna stała sprężystości, 2,5 i mikro; m Cząstka SiO2
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P Płytka
bFGFPeprotech100-18B20 ng / mL
CCK8Abcamab228554
WirówkaThermoscientificsorvall legend xtr
CP100STGilsonF148415Końcówki do pipet wyporowych
Cubis Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/ml
Etanol, bezwodnyFisher ScientificA405PDodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 70%
Fiolki z gwintem Fisherbrand Class B ze szkła bursztynowegoFisher Scientific03-339-23C
Fisherbrand Papier do ważeniaFisher Scientific09-898-12B
G21 SuplementGemini Bio400-16050x
Hanks Zrównoważony roztwór soliThermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838ADodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 1 M
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma AldrichH3149-100Ku25 µ g / mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
Pistolet na gorące powietrzeWagnerHT1000
Peptyd sialoproteiny wiążącej integrynę (IBSP)GenscriptZamówienie niestandardoweGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
litu (LAP), >95%Sigma Aldrich900889-1G
Magnetyczna płyta mieszającaThermo ScientificSP194715
MikrowirówkaThermo ScientificSorvall legend micro 21R
Pipeta jednokanałowa Microman EGilsonFD10004Pipeta wyporowa
Końcówki do mikropipetRóżni producenciRóżne rozmiary
Sigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4Mikroskop BrukerAFM
NaOHFisher Scientificss255-1Dodaj wodę DI, aby rozcieńczyć do 1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Peptyd osteopontynyGenscriptZamówienie niestandardoweGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet AidDrummond4000102
Zwykłe szkiełka mikroskopoweIzolator silikonowy Globe Scientific1301
Press-To-Seal, średnica 12-4,5 mm x głębokość 2 mmGrace Bio Labs664201-AWytnij tak, aby z jednego arkusza wykonano 8 pojedynczych form
PrzetwarzaniePrzetwarzanie 3.5.4
Repeater M4Eppendorf4982000322
Repeater Końcówkido pipetSartorious30089430Rozmiary 1 mL
Peptyd RGD GenscriptGCGYGRGDSPG
Taśma Scoth Pipety
serologiczneGenesse Scientific12-102,12-1045,10 mL
Pasta lutowniczaDigikey315-NC191LT15T5-ND
Drut
prosty kleszcze preparacyjneVWR Scientific82027-408
Synergy H1 Czytnik płytekBiotek
T-75 Kolba poddana hodowli komórkowejGenesee Scientific25-209
TemozolomidSigma AldrichT2577Zwykle używany od 10 &mikro; M do 100 i mikro; M
Tenascin-C PeptideGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Tiolowany kwas hialuronowy (700 kDa), 6-8% modyfikowanyLifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar, Flea MicroVWR58948-375
mikrokontroleraTrimetylobenzoilofosfinianmikropipet mLine Sartorious N-acetylocysteina lutowniczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  3. Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
  4. Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology's trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
  5. Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879(2018).
  6. Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
  7. Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
  8. Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
  9. Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
  10. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  11. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  12. Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144(2018).
  13. Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
  14. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  15. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  16. Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
  17. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
  18. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  19. Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
  20. Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396(2022).
  21. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
  22. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  23. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  24. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176(2018).
  25. Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
  26. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  27. Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549(2021).
  28. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
  29. Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
  30. Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840(2018).
  31. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176(2018).
  32. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  33. Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
  34. Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
  35. Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
  36. Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
  37. Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
  38. Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
  39. da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177(2019).
  40. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  41. Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogel Arrays3D Tumor ModelsMatrix ComponentsDrug ScreeningCell Matrix InteractionsGlioblastoma CellsMiniaturized 3D CultureMatrix MechanicsCell Viability AssayPhoto Cross Linking

Related Articles