Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z ludzkiej żuchwy

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63811

⸱

13 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2College of Life Sciences, Northwest University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje efektywną procedurę izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego żuchwy przy użyciu metody przylegania całego szpiku kostnego. Hodowane komórki zidentyfikowano za pomocą testów proliferacji komórek, cytometrii przepływowej i indukcji różnicowania wieloliniowego.

Streszczenie

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) wykazały duży potencjał w regeneracji kości, modulacji immunologicznej i leczeniu opornych na leczenie chorób przewlekłych. Ostatnio odkryto, że hMSC są pozyskiwane w różny sposób, podczas gdy szpik kostny był nadal uważany za główne źródło. MSCs pochodzące ze szpiku kostnego (BMSC) z różnych miejsc kości dawczej mają różne cechy wynikające z czynników mikrośrodowiskowych. Badania wykazały, że BMSC z kości szczękowo-twarzowej mogą mieć większe zdolności proliferacyjne i osteogenne niż BMSC z kości długich lub grzebienia biodrowego. A BMSC szczękowo-twarzowe uznano za bardziej odpowiednie do terapii komórkami macierzystymi w tkankach szczękowo-twarzowych. Żuchwa, a zwłaszcza wznoszący się obszar ramalny z wystarczającą ilością szpiku, była możliwym miejscem dawstwa do zbierania BMSC. W badaniu tym opisano protokół pobierania, izolowania i hodowli MSC pochodzących ze szpiku kostnego ludzkiej żuchwy (hmBMSC). Ponadto przeprowadzono immunofenotypowanie hmBMSC, testy proliferacji oraz indukcję in vitro różnicowania osteogennego, adipogennego i chondrogennego w celu identyfikacji hodowanych komórek. Zastosowanie tego protokołu może pomóc naukowcom w pomyślnym uzyskaniu wystarczającej ilości wysokiej jakości hmBMSC, co jest niezbędne do dalszych badań funkcji biologicznych, skutków mikrośrodowiskowych i zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) to komórki multipotencjalne, które mogą być różnicowane na różne typy komórek, takie jak osteocyty, adipocyty i chondrocyty z linii mezodermalnej, hepatocyty i pankreocyty z linii endodermalnej oraz neurocyty z linii ektodermalnej1. W związku z tym hMSC wykazały ogromny potencjał w regeneracji tkanek. Co więcej, hMSC są silnymi immunomodulatorami, które mogą regulować mikrośrodowisko w tkankach gospodarza i skutecznie leczyć przewlekłe choroby oporne na leczenie2. Dlatego hMSCs są szeroko stosowane w terapii komórkowej w badaniach klinicznych. W związku z tym ważne jest, aby w wygodny sposób skutecznie uzyskać wystarczającą ilość hMSC o wysokiej jakości.

Od kiedy po raz pierwszy stwierdzono obecność hMSC w szpiku kostnym, znaleziono wiele alternatywnych źródeł MSC, takich jak tkanka tłuszczowa, płyn maziowy, mięśnie szkieletowe, płyn owodniowy, endometrium, tkanki zębowe i pępowina1,3. Jednak szpik kostny pozostaje głównym źródłem hMSC w większości badań przedklinicznych i klinicznych, a MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BMSC) są traktowane jako standard do porównywania MSC z innych źródeł4. Przez lata grzebień biodrowy lub kości długie (piszczel i kość udowa) były najpopularniejszymi miejscami anatomicznymi do pozyskiwania szpiku kostnego1,5. Jednak grzebień biodrowy lub kości długie mają inne pochodzenie embrionalne i wzorce rozwoju w porównaniu z kośćmi szczękowo-twarzowymi5,6. Wiele badań klinicznych, laboratoryjnych i rozwojowych dowiodło, że BMSC różnego pochodzenia wykazywały właściwości specyficzne dla miejsca, a szczepione BMSC zachowują właściwości miejsca dawczego po implantacji w miejscu biorczym5,6,7,8,9. Z punktu widzenia pochodzenia rozwojowego tkanki szczękowo-twarzowe, takie jak szczęka, żuchwa, zębina, kość wyrostka zębodołowego, miazga i więzadło przyzębia, powstają wyłącznie z komórek grzebienia nerwowego. Natomiast grzebień biodrowy i kości długie są tworzone przez mezodermę. Ponadto żuchwy powstają w wyniku kostnienia śródbłoniastego, podczas gdy szkielety osiowe i wyrostka robaczkowego ulegają kostnieniu śródchrzęstnemu. Co więcej, w porównaniu z grzebieniem biodrowym i kośćmi długimi, niektóre badania kliniczne wykazały, że hMSC pochodzące ze szpiku kostnego szczękowo-twarzowego miały lepszą aktywność proliferacyjną komórkową i zdolność różnicowania6,8. Dlatego oczekuje się, że BMSC z obszarów szczękowo-twarzowych będą lepszym wyborem do regeneracji tkanek szczękowo-twarzowych i terapii przewlekłych chorób opornych na leczenie szczękowo-twarzowej.

Żuchwa składa się z dwuwarstwowych grubych kości korowych z gąbczastym szpikiem kostnym pomiędzy nimi, dzięki czemu może ładować moc żucia. W związku z tym żuchwa, a zwłaszcza wznoszący się obszar ramalny, jest zwykle używana jako miejsce dawcze do uzyskania autologicznych przeszczepów kostnych w operacjach czaszkowo-szczękowo-twarzowych10. A w operacjach, takich jak strzałkowa osteotomia rozszczepienia żuchwy i plastyka redukcji kąta żuchwy, części kory żuchwy i kości gąbczastej muszą zostać usunięte, aby uzyskać przyjemny kontur twarzy. Te wyrzucone kości gąbczaste mogą być potencjalnym źródłem dla hMSC. Jednak niewiele opublikowanych badań opisało protokół szybkiej izolacji i hodowli wysokiej jakości MSC pochodzących ze szpiku kostnego ludzkiej żuchwy (hmBMSC).

Niniejsze badanie wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przylegania całego szpiku kostnego do wprowadzenia niezawodnego i powtarzalnego protokołu izolacji i hodowli hmBMSC. Komórki macierzyste zidentyfikowano za pomocą immunofenotypowania MSC metodą cytometrii przepływowej, testów proliferacji i indukcji różnicowania wieloliniowego. Zastosowanie tej standardowej procedury może pomóc naukowcom w uzyskaniu wysokiej jakości MSC pochodzących ze szpiku kostnego ludzkiej żuchwy, co jest ważne w dalszych badaniach funkcji biologicznych, skutków mikrośrodowiskowych i zastosowań klinicznych.

Protokół

Procedura pobierania próbek ludzkiej kości żuchwy została zatwierdzona przez Komisję Etyki Szkoły Stomatologii, Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. Badanie było zgodne z wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej z 1975 roku. Wszyscy dawcy biorący udział w niniejszym badaniu zostali poinformowani o możliwym ryzyku i celach badania. Wiek dawców wahał się od 18 do 40 lat i nie było uprzedzeń ze względu na płeć. Uzyskano pisemną zgodę od wszystkich uczestników.

1. Przygotowanie do operacji

  1. Wybierz odpowiedniego dawcę.
    1. Wybierz pacjentów jako dawców, którzy planują poddać się zabiegom chirurgicznym, takim jak cofnięcie żuchwy po strzałkowej osteotomii rozszczepienia ramusa i plastyka zmniejszająca kąt żuchwy.
  2. Przygotuj roztwór konserwujący.
    1. Uzupełnij 30 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (1x PBS) z 1% penicyliną i streptomycyną w sterylnej i wolnej od enzymów probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w dniu poprzedzającym zabieg. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
    2. W dniu zabiegu należy umieścić probówkę wirówkową z roztworem konserwującym w zamrażalniku i przechowywać ją na sali operacyjnej 1 godzinę przed zabiegiem.
  3. Sterylizuj narzędzia do izolacji szpiku kostnego w dniu poprzedzającym zabieg, w tym nożyczki, pęsetę i noże, w temperaturze 120 °C i ciśnieniu 0,27 MPa przez 20 minut.
  4. Przygotować pożywkę hodowlaną α-MEM, mieszając minimalną ilość niezbędnej pożywki alfa (α-MEM) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny.
  5. Przygotować pożywkę do różnicowania osteogennego, mieszając pożywkę hodowlaną α-MEM z 50 mM kwasu askorbinowego, 10 mM fosforanu β-glicerolu i 0,1 mM deksametazonu (patrz tabela materiałów).
  6. Przygotować pożywkę do różnicowania adipogennego A, mieszając pożywkę hodowlaną α-MEM z 1 mM deksametazonem, 0,2 mM indometacyny, 10 μg/ml insuliny i 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) (patrz tabela materiałów).
  7. Przygotować pożywkę do różnicowania adipogennego B, mieszając pożywkę hodowlaną α-MEM z 10 μg/ml insuliny.
  8. Przygotować chondrogenne podłoże różnicujące, mieszając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco z wysokim poziomem glukozy (HG-DMEM) i 100 nM deksametazonu, 100 g/ml pirogronianu sodu, 25 mg/ml witaminy C, 40 mg/ml proliny, 10 ng/ml TGF-β3 i 1% ITS (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Pożywkę do różnicowania osteogennego, adipogennego i chondrogennego można przygotować we własnym zakresie, jak wspomniano powyżej. Jednak w niniejszym badaniu wykorzystano dostępne na rynku zestawy do tego samego (patrz tabela materiałów).

2. Pobieranie próbki ludzkiej kości żuchwy

  1. Przed zabiegiem należy dokładnie zapoznać się z trójwymiarowymi komputerowymi obrazami tomograficznymi i planowaniem symulacji chirurgicznej dawców (Ryc. 1).
  2. Wybierz miejsce żuchwy, które dawca planuje usunąć podczas operacji i jest bogate w kość gąbczastą ze szpikiem kostnym jako miejsce dawcze.
  3. Zdezynfekuj i ułóż pacjenta przed operacją.
  4. Wyciąć wybrane miejsce dawcze żuchwy za pomocą ultradźwiękowej ostrza osteotomu (patrz tabela materiałów), unikając uszkodzenia nerwu zębodołowego dolnego i upośledzenia kości dawczej.
  5. Próbki kości żuchwy należy jak najszybciej umieścić w roztworze konserwującym (krok 1.2).
  6. Roztwór konserwujący z próbkami kości należy umieścić w zamrażalniku do czasu rozpoczęcia izolacji MSCs w laboratorium.
    UWAGA: Izolację MSCs należy rozpocząć jak najszybciej po pobraniu, aby zachować żywotność komórek. Jeżeli nie można natychmiast wyizolować MSC, roztwór konserwujący z próbkami kości można przechowywać w zamrażalni lub przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 godziny.

3. Izolacja i hodowla ludzkich mBMSC

  1. Wyjmij próbki kości z roztworu konserwującego i zanurz je w 1x PBS z 1% penicyliną i streptomycyną na 5 minut na czystej ławce komory laminarnej.
    UWAGA: Ten krok ma na celu zmycie skrzepu krwi i resztek płynów ustnych oraz dalsze wyeliminowanie mikroorganizmów, ponieważ jama ustna nie jest całkowicie sterylnym środowiskiem. Przed izolacją i hodowlą komórek umyj i zdezynfekuj ręce alkoholem oraz załóż jednorazowe sterylne rękawiczki i maski.
  2. Oczyść przylegającą tkankę miękką i plamę krwi na powierzchni kości za pomocą sterylnej mokrej gazy.
  3. Napełnij sterylne naczynie hodowlane o średnicy 6 cm 5 ml pożywki hodowlanej α-MEM.
  4. Włóż kość do sterylnego naczynia hodowlanego i pokrój ją na małe kawałki (prawie 2-3 mm3 objętość) za pomocą wysterylizowanego noża lub nożyczek.
    UWAGA: Przytrzymaj próbki kości pęsetą, aby uniknąć skaleczenia palcami.
  5. Odessać pożywkę hodowlaną α-MEM do naczynia hodowlanego za pomocą jednorazowej sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml.
  6. Wprowadzić igłę strzykawki z pożywką hodowlaną α-MEM głęboko do jamy szpiku kostnego fragmentów próbki kości gąbczastej.
  7. Przepłukać szpik kostny do naczynia hodowlanego za pomocą strzykawki ze wszystkich stron kawałków próbki kości, co najmniej 5-10 razy z każdej strony.
  8. Powtarzaj kroki 3.5-3.7, aż wszystkie fragmenty próbki kości zmienią kolor na czysto biały, aby upewnić się, że jak najwięcej szpiku kostnego zostanie spłukiwane do pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Całkowity czas operacji powyższych kroków z 3.1-3.8 musi być kontrolowany w ciągu 30 minut na lodzie.
  9. Usuń i wyrzuć wszystkie kawałki próbki kości za pomocą pęsety. Usuń inne małe fragmenty za pomocą filtra komórkowego o wielkości porów 70 μm.
  10. Delikatnie potrząśnij naczyniem hodowlanym, aby zaczerwienione komórki były równomiernie rozprowadzone.
  11. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze komórkowym i hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
  12. W trzecim dniu hodowli sprawdź morfologię komórek i stan wzrostu pod mikroskopem świetlnym. Usunąć połowę pożywki hodowlanej bez przylegających komórek i fragmentu tkanki; dodać 3 ml świeżej pożywki hodowlanej α-MEM.
  13. W 7. dniu hodowli usuń całą pożywkę hodowlaną i dodaj 5 ml świeżej pożywki α-MEM.
  14. Następnie odświeżaj pożywkę hodowlaną α-MEM co 3 dni.
  15. Codziennie sprawdzaj morfologię i wzrost komórek.
    UWAGA: Gdy pierwotne hodowle komórkowe (P0) osiągną 70%-80% konfluencji po 7-10 dniach hodowli, przeprowadź pasaż komórkowy.

4. Przejście komórki

  1. Przy zbiegu 70%-80% usuń całą pożywkę hodowlaną komórek P0. Delikatnie umyj naczynie hodowlane dwukrotnie 1x PBS, aby wyczyścić pozostałą pożywkę hodowlaną.
  2. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny z 0,02% EDTA do naczynia hodowlanego, aby strawić komórki. Delikatnie wstrząśnij naczyniem hodowlanym, aby upewnić się, że trypsyna jest równomiernie rozprowadzona. Umieścić naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C na 3 minuty.
  3. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Kiedy 70%-80% komórek zostanie skurczonych i zaokrąglonych, dodaj 2 ml pożywki hodowlanej α-MEM, aby zatrzymać reakcję trawienną.
  4. Delikatnie przedmuchaj powierzchnię naczynia kilka razy pipetą, aby zdmuchnąć komórki.
  5. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki hodowlanej α-MEM. Komórki P0 należy zasiać w kolbach hodowlanych (25 cm) w celu rozdwojenia w stosunku rozszczepienia 1:2. Pierwsze komórki pasażowe nazywano komórkami P1.
  7. Gdy komórki P1 osiągną zbieg 70%-80%, powtórz przejście komórki, wykonując kroki od 4.1-4.6. Komórki drugiej generacji nazwano komórkami P2.
  8. Zmień współczynnik podziału ekspansji na 1:3 po przejściu komórki trzeciej generacji.
  9. Użyj komórek od P3 do P5 do przeprowadzenia eksperymentów identyfikacyjnych.

5. Analiza cytometryczna przepływowa

  1. Trawić MSCs P3 do P5 za pomocą 0,25% trypsyny z 0,02% EDTA, wykonując kroki 4.1-4.5.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1x PBS w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
  3. Przenieść komórki do probówek do mikrowirówek zawierających 100 μl zawiesiny komórek na probówkę.
  4. Dodać znakowane immunologicznie mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludziom do probówek do mikrowirówek.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano przeciwciało sprzężone z fikoerytryną (PE) przeciwko CD45, przeciwciało sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przeciwko CD90, CD34 i CD44 4,11 (patrz tabela materiałów), a rozcieńczenia przeciwciał wynosiły 1:100. Rozcieńczenia przeciwciał muszą być zgodne z instrukcjami producenta. PBS będzie służył jako kontrola.
  5. Inkubować przeciwciała i kontrolę PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
  6. Odwirować probówki o masie 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić zawiesinę i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml 1x PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  7. Załaduj probówki do cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów). Policz liczbę komórek znakowanych fluorescencją za pomocą cytometru przepływowego z co najmniej 10 000 zdarzeń.
    UWAGA: Lepiej jest rozpocząć proces zliczania komórek za pomocą cytometru przepływowego natychmiast po procedurze znakowania immunofluorescencyjnego. Jeśli nie, komórki należy utrwalić w 1% paraformaldehydzie, przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności i zakończyć proces w ciągu 24 godzin.

6. Test proliferacji komórek

  1. Użyj komórek P3 do przeprowadzenia testu proliferacji komórek. Trawić P3 MSCs z 0,25% trypsyną, wykonując kroki 4.1-4.5.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki hodowlanej α-MEM.
  3. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i zasiej komórki na 96-dołkowych płytkach hodowlanych o gęstości 3 x 103 komórki na dołek, w sumie 35 dołków, 5 dołków na każdy dzień liczenia (w dniu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Odświeżaj pożywkę hodowlaną komórek co 3 dni.
  4. W każdym dniu liczenia należy odrzucić pożywkę α-MEM z określonych pięciu studzienek na określony dzień liczenia, a następnie dodać 100 μl pożywki hodowlanej i 10 μl roztworu CCK-8 (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  5. Umieścić płytki hodowlane w spektrofotometrze do mikropłytek (patrz tabela materiałów) i zmierzyć wartość gęstości optycznej pięciu studzienek na każdy dzień liczenia (łącznie 7 dni zliczania) przy długości fali 450 nm. Użyć pięciu studzienek pożywki hodowlanej bez komórek jako ślepych prób.
  6. Zapisz wartość gęstości optycznej każdego dołka, oblicz średnią wartość i odchylenie standardowe pięciu studzienek dla każdego dnia liczenia, a następnie wykreśl krzywą wzrostu komórki5,12.

7. Różnicowanie wieloliniowe

  1. Wykonaj indukcję różnicowania osteogennego, wykonując poniższe czynności.
    1. Trawić komórki P3 trypsyną, wykonując kroki 4.1-4.5. Wysiewaj komórki w proporcjach 2 x 105 komórek/cm2 na płytce 6-dołkowej. Dodać 2,5 ml pożywki hodowlanej α-MEM do dołka.
    2. Gdy komórki osiągną zbieżność 60%-70%, zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę do indukcji osteogennej (krok 1.5). Następnie zmieniaj pożywkę indukcyjną co 3 dni.
    3. Sprawdzaj komórki pod mikroskopem co 3 dni po indukcji. Obserwuj morfologię komórki i szukaj oczywistych węzłów mineralizacji.
    4. Po 7 dniach od indukcji wykonaj barwienie fosfatazą alkaliczną (ALP), aby ocenić zwapnienie komórek.
    5. Użyj 1x PBS, aby delikatnie umyć komórki dwukrotnie. Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj 1x PBS, aby dwukrotnie umyć komórki.
    6. Dodać roztwór barwiący ALP (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      UWAGA: Różne rodzaje roztworów barwiących ALP mogą barwić komórki różnymi kolorami, takimi jak ciemnoszary, czerwony i niebieski. W tym protokole komórki zostały zabarwione na niebiesko. Czas inkubacji można wydłużyć, jeśli kolor barwienia nie jest oczywisty. Niektóre zestawy do barwienia roztworem ALP mogą być trujące; Przeczytaj uważnie instrukcję przed użyciem, noś rękawiczki i maskę podczas eksperymentu, a po użyciu dokładnie umyj ręce.
    7. Umyj komórki wodą, aby zatrzymać reakcję barwienia ALP. Obserwuj niebieskie pigmentowane granulki w komórkach pod mikroskopem świetlnym i zrób zdjęcia. Użyj oprogramowania Image J, aby ilościowo przeanalizować stopień zabarwienia.
    8. Wykonaj barwienie czerwienią alizarynową (patrz Tabela materiałów), aby ocenić zdolność mineralizacji komórek.
      UWAGA: Oczywiste tworzenie się węzłów mineralizacji zróżnicowanych komórek można zwykle zaobserwować po 21 dniach od indukcji.
    9. Użyj 1x PBS, aby delikatnie umyć komórki dwukrotnie. Następnie dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    10. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS, dodaj 0,1% roztworu barwiącego czerwień alizarynową (patrz tabela materiałów) i inkubuj przez 20 minut. Ponownie umyj komórki dwukrotnie 1x PBS.
    11. Obserwuj czerwone guzki między utrwalonymi komórkami pod mikroskopem świetlnym, wskazujące na złogi wapnia w osteogennym różnicowaniu hodowanych komórek, i zrób zdjęcia.
    12. Aby określić ilościowo ilość czerwieni alizarynowej, dodać 10% chlorku cetylopirydyniowego (CPC, patrz tabela materiałów) do komórek zabarwionych na czerwono alizaryną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    13. Zassać 50 μl roztworu CPC i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy długości fali 540 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami.
  2. Przeprowadzić indukcję różnicowania adipogennego.
    1. Wysiewać komórki P3 na płytce 6-dołkowej, stosując procedurę opisaną powyżej (krok 7.1).
    2. Gdy komórki osiągną konfluencję 80%-90%, zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę do różnicowania adipogennego A (krok 1.6).
    3. Inkubować komórki z pożywką różnicującą adipogenną A w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 3 dni.
    4. Zmienić pożywkę indukcyjną na pożywkę do różnicowania adipogennego B (krok 1.7) i inkubować przez 1 dzień.
    5. Zmienić pożywkę z powrotem na pożywkę do różnicowania adipogennego A i inkubować przez 3 dni. Następnie zastąp pożywką B na 1 dzień. Powtórz ten cykl 3-5 razy, aż pod mikroskopem będzie można zobaczyć kropelki lipidów.
      UWAGA: Kropelki lipidów można zobaczyć po około 21 dniach od indukcji.
    6. Użyj pożywki do różnicowania adipogennego B, aby hodować komórki przez dodatkowe 7 dni, a następnie pod mikroskopem można zobaczyć duże i okrągłe kropelki lipidów. Odświeżaj podłoże B co 3 dni.
    7. Usuń pożywkę indukcyjną i użyj 1x PBS, aby delikatnie umyć komórki. Następnie dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    8. Przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS, a następnie inkubować komórki w roztworze barwiącym O o barwieniu czerwienią olejową (1 ml na studzienkę, patrz Tabela Materiałów) przez 15 minut. Ponownie umyj komórki dwukrotnie 1x PBS.
    9. Umieść komórki pod mikroskopem i obserwuj czerwone kropelki lipidów, aby ocenić adipogenezę zróżnicowanych komórek.
  3. Przeprowadź indukcję różnicowania chondrogennego.
    1. Trawić i przenosić komórki P3 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml o numerach komórek 5 x 105.
    2. Odwirować probówkę o masie 250 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ostrożnie dekantując górny roztwór.
    3. Dodać 0,5 ml chondrogennej pożywki różnicującej (krok 1.8) do probówki w celu ponownego zawieszenia komórek i ponownie odwirować probówkę przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    4. Poluzuj nasadkę probówki wirówki, aby ułatwić wymianę powietrza. Umieścić probówkę w inkubatorze i indukować komórki 0,5 ml chondrogennej pożywki różnicującej w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .
    5. Utrzymuj probówkę wirówkową stabilnie, nie wyjmując jej ani nie potrząsając nią w ciągu 24 lub 48 godzin, aż komórki zaczną się granulować. Przesuń dno probówki wirówkowej, aby zawiesić osad komórkowy w pożywce różnicującej (krok 1.5).
    6. Odnawiać chondrogenne podłoże różnicujące pipetą co 3 dni. Unikaj zasysania osadu komórkowego.
    7. Indukować komórki przez co najmniej 21 dni, aż osad osiągnie średnicę 2 mm.
    8. Umyj granulkę 1x PBS i utrwal ją 4% paraformaldehydem przez 30 minut. Po odwodnieniu i zatopieniu parafiny13, należy podzielić granulkę na sekcje o grubości 3 μm za pomocą mikrotomu (patrz Tabela Materiałów).
    9. Umieść sekcje na szkiełkach podstawowych. Szkiełka należy zabarwić roztworem błękitu Alcian (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Poplamione szkiełka należy umyć wodą. Umieść szkiełka pod mikroskopem świetlnym i zrób zdjęcia zabarwionego na niebiesko kwaśnego mukopolisacharydu wskazującego na tkanki chrzęstne.

Wyniki

Od pacjenta pomyślnie pobrano próbkę kości żuchwy. Czas od momentu przecięcia za pomocą ostrza ultrasonicznego osteotomu do umieszczenia fragmentu kości w probówce do wirówki wynosi około 5 min. W trakcie i po procedurze resekcji nie wystąpiły żadne z potencjalnych powikłań, w tym uszkodzenie nerwu zębodołowego dolnego lub korzenia zęba, zakażenie, rozerwanie naczyń i krwawienie, uraz błony śluzowej czy przypadkowe złamanie kości. hmBMSCs zostały pomyślnie wyhodowane, pasażowane i zróżnicowane bez wystąpienia kontaminacji.

W niniejszym badaniu w trzeciej dobie po rozpoczęciu hodowli pod mikroskopem zaobserwowano wiele komórek przylegających. W siódmej dobie większość komórek adherentnych była już przytwierdzona do naczynia hodowlanego. Zazwyczaj hodowane komórki osiągały 70%-80% konfluencji po 7-9 dniach od rozpoczęcia hodowli. Po pasażowaniu uznano, że komórki P3 są oczyszczonymi MSC, które wykazywały wrzecionowaty kształt, zdolność do przylegania do tworzywa sztucznego oraz morfologię fibroblastopodobną (Rycina 2). Eksperymenty identyfikacyjne przeprowadzono na komórkach od P3 do P5. W teście proliferacji komórek tempo wzrostu gwałtownie wzrosło od trzeciego dnia hodowli, a tempo wzrostu spowolniło w szóstym dniu (Rycina 2).

Zgodnie z definicją podaną przez International Society for Cellular Therapy, MSC wykazują pozytywną i negatywną ekspresję określonych cząsteczek powierzchniowych. W niniejszym badaniu analiza cytometryczna hodowli komórkowych wykazała pozytywną ekspresję CD44 i CD90 oraz negatywną ekspresję CD45 i CD34, co jest zgodne z definicją4,11 (Rycina 3). W eksperymentach dotyczących zdolności do różnicowania wieloliniowego hodowane komórki wykazały silną zdolność do różnicowania osteogenicznego, adipogenicznego i chondrogenicznego. Po 7 dniach indukcji osteogenicznej pod mikroskopem pojawiły się złogi wapnia w macierzy zewnątrzkomórkowej. Po 21 dniach indukcji osteogenicznej hodowane komórki wykazały wyraźne guzki mineralizacji, które zostały zabarwione na czerwono za pomocą barwienia alizaryną czerwoną (Rycina 4). W przypadku adipogenezy, po 21 dniach indukcji adipogenicznej w cytoplazmie zaobserwowano liczne nagromadzone okrągłe krople lipidów zabarwione na czerwono metodą Oil-red-O (Rycina 4). Po 21 dniach indukcji różnicowania chondrogenicznego preparaty z pelletów komórkowych wykazujące tkankę przypominającą chrząstkę z lakunami chrzęstnymi można zabarwić na niebiesko (Rycina 4).

figure-results-1
Rycina 1: Wybór miejsca pobrania przeszczepu na obrazie CT 3D. (A) Obraz CT 3D żuchwy dawcy u 21-letniej pacjentki. (B) Symulacja chirurgiczna obustronnej osteotomii strzałkowej gałęzi żuchwy. (C) Planowanie chirurgiczne przedstawiające cofnięcie rozszczepionej żuchwy. (D) Obraz CT 3D przedstawiający kość korową (część półprzezroczysta), kość gąbczastą bogatą w szpik kostny oraz nerw zębodołowy dolny (czerwony) na podstawie różnych wartości CT, co pozwala chirurgom wybrać miejsce pobrania przeszczepu i uniknąć uszkodzenia nerwu. Odłamki kości gąbczastej pobrano z obszaru zaznaczonego czarnym prostokątem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Morfologia mikroskopowa i krzywa wzrostu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy (hmBMSCs) w pasażu P3. (A-C) Wrzecionowata, przylegająca do tworzywa i fibroblastopodobna morfologia hmBMSCs P3 (Pasek skali = odpowiednio 200 µm, 100 µm, 50 µm dla A, B, C). (D) Krzywa wzrostu komórek wykazała, że tempo wzrostu hmBMSCs gwałtownie zwiększyło się od trzeciego dnia hodowli, a tempo wzrostu spowolniło w szóstym dniu hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Ekspresja antygenów powierzchniowych komórek hmBMSC została wykryta metodą cytometrii przepływowej. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że hmBMSCs były ujemne dla CD45 (A) i CD44 (C), a dodatnie dla CD44 (B) oraz CD90 (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Różnicowanie osteogeniczne, adipogeniczne i chondrogeniczne hmBMSC. (A) Barwienie ALP hmBMSC po 7 dniach hodowli bez indukcji różnicowania osteogenicznego (Pasek skali = 100 µm). (B) Barwienie ALP hmBMSC po 7 dniach indukcji różnicowania osteogenicznego (Pasek skali = 100 µm). (C) Wyniki ilościowe powierzchni pozytywnej w barwieniu ALP (***P < 0.001). (D) Barwienie alizaryną czerwoną hmBMSC bez różnicowania osteogenicznego (Pasek skali = 100 µm). (E) Po 21 dniach różnicowania osteogenicznego hmBMSC widoczne jest tworzenie wyraźnych węzłów mineralizacji, które można zabarwić na czerwono za pomocą barwienia alizaryną czerwoną (Pasek skali = 100 µm). (F) Wyniki ilościowe barwienia alizaryną czerwoną (***P < 0.001). (G) Barwienie Oil Red O hmBMSC bez różnicowania adipogenicznego (Pasek skali = 50 µm); (H) Po 21 dniach różnicowania adipogenicznego hmBMSC zaobserwowano okrągłe krople lipidów, które zostały zabarwione na czerwono za pomocą barwienia Oil Red O (Pasek skali = 50 µm). (I) Barwienie błękitem Alcianem było pozytywne po 21 dniach indukcji różnicowania chondrogenicznego (Pasek skali = 50 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W ostatnim czasie terapia hMSCs okazała się bardzo obiecująca w regeneracji tkanek i leczeniu wielu chorób opornych na leczenie, takich jak choroby dysfunkcji układu odpornościowego, ogólnoustrojowe choroby hematologiczne, nowotwory czy urazy, w licznych badaniach klinicznych 1,14,15,16,17. Spośród różnych źródeł MSCs, szpik kostny pozostaje najczęściej stosowanym i najłatwiej dostępnym źródłem. Użyliśmy ludzkich chipów kości gąbczastej żuchwy, aby z powodzeniem wyhodować BMSC przy użyciu metody przylegania całego szpiku kostnego opisanej w niniejszym protokole. Do tej pory istnieją cztery główne podejścia do izolowania komórek macierzystych ze szpiku kostnego, w tym metoda przylegania całego szpiku kostnego, metoda wirowania w gradionym gradieniu gęstości, metoda fluorescencyjnego sortowania komórek i metoda sortowania komórek aktywowanych magnetycznie10. Cała metoda przylegania szpiku kostnego jest prosta, łatwa w obsłudze, tania i może uzyskać duże ilości przylegających komórek. Ograniczeniem tej metody była jednak niska czystość pierwotnych hodowlanych BMSC, które mieszano z komórkami krwiotwórczymi i fibroblastami. Po regularnym odświeżaniu pożywki hodowlanej komórek pierwotnych, nieprzylegające komórki krwiotwórcze zostały wyrzucone wraz z odrzuconą pożywką. Ponadto fibroblasty mogą być usuwane przez pasaż komórkowy, a komórki P3 były wysoce oczyszczonymi BMSC. Tak więc komórki P0 do P2 nie mogą być używane do terapii komórkowej, co oznacza, że potrzeba było dodatkowego czasu na oczyszczenie komórek macierzystych. Stosując metody fluorescencyjnego sortowania komórek i sortowania komórek aktywowanych magnetycznie, można uzyskać bardziej oczyszczone BMSC, podczas gdy te dwie metody są drogie, a długi czas selekcji może pogorszyć żywotność komórek11. Aby udowodnić, że hodowane komórki były MSC, odnieśliśmy się do definicji ludzkich MSCs zaproponowanej przez Komitet ds. Mezenchymalnych i Tkankowych Komórek Macierzystych Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej, która obejmowała charakter przylegający do tworzywa sztucznego, pozytywną i negatywną ekspresję niektórych fenotypów, takich jak CD45, CD90 i tak dalej, oraz zdolność do różnicowania wieloliniowego18.

W większości badań kości udowe i grzebień biodrowy były głównymi źródłami BMSC, w porównaniu z kośćmi szczękowo-twarzowymi, takimi jak żuchwa i szczęka 9,16. Jednak specyficzna dla miejsca teoria charakterystyki hBMSC w ostatnich badaniach wykazała, że hBMSC z różnych kości miały różne cechy w zdolności różnicowania, aktywności proliferacyjnej, osteogenezie i odporności 6,8. Różnica specyficzna dla danego miejsca może być związana z różnym pochodzeniem embrionalnym, przystosowaniem do wymagań funkcjonalnych w każdym miejscu szkieletu, mikrośrodowiskiem, miejscowym zaopatrzeniem w naczynia krwionośne, efektami hormonalnymi itp. Ponadto badania wykazały, że przeszczepiona kość biodrowa wykazywała szybszy ubytek pionowy niż kość szczęki w ciągu 6 miesięcy po przeszczepie kości8. Poza tym badania wykazały, że aktywność proliferacyjna MSCs ze szpiku żuchwy była lepsza niż ze szpiku biodrowego 5,8,19,20. I ta różnica w aktywności proliferacyjnej została przypisana cechom, że żuchwa miała większy dopływ krwi i szybsze tempo obrotu kostnego niż kość biodrowa 5,6,8. Badania wykazały również, że BMSC z żuchwy wyrażały wyższy poziom Runx-2 i OCN niż te z kości udowych, a zdolność osteogenna BMSC z żuchwy była równa lub wyższa niż tych z kości udoweji kości biodrowej 5,19,21. Stwierdzono również, że przyleganie do zdolności hmBMSC do tytanu jest silniejsze niż BMSC z kości udowych, co sugeruje, że hmBMSC są bardziej odpowiednie do stosowania w implantologii jamy ustnej5. Ponadto 3-letnie badanie kliniczne mające na celu rekonstrukcję ubytku wyrostka zębodołowego wykazało, że zregenerowana kość MSCs z miazgi zębowej składała się z w pełni zwartej kości o większej gęstości macierzy, podczas gdy hm BMSC regenerowały kość gąbczastą podobną do normalnej struktury kości wyrostka zębodołowegoczłowieka 22. Podsumowując, hmBMSC były idealnymi terapeutycznymi komórkami macierzystymi do regeneracji szczękowo-twarzowej i innych chorób ze względu na to samo pochodzenie embriologiczne i ich lepsze cechy.

Jednak żuchwa ma mniej szpiku kostnego niż kości udowe i biodrowe, dlatego ważne jest, aby uzyskać wystarczającą ilość szpiku kostnego i BMSC z żuchwy do użytku klinicznego. Ludzkie aspiracje biodrowe mogą pozyskiwać duże ilości szpiku kostnego w celu wyizolowania MSC. Naukowcy wykorzystali również aspiraty żuchwy do uzyskania MSC, podczas gdy początkowa wydajność MSCs z aspiratów żuchwy była trzykrotnie niższa niż w przypadku aspiratów biodrowych21. Potrzebne były dodatkowe nacięcia, aby pobrać wystarczającą ilość aspiratów szpiku żuchwy, dodając dodatkowy uraz chirurgiczny. Ponadto badania wykazały, że potencjał proliferacyjny MSCs z wiórów kostnych żuchwy może być większy niż z aspiratów szpiku żuchwowego 8,21. Dlatego w tym badaniu do wyizolowania MSC wykorzystano odrzucone wióry kości gąbczastej żuchwy. Ponieważ obie strony żuchwy zostały objęte strzałkową osteotomią rozszczepioną ramus lub plastyką redukcji kąta żuchwy, możemy uzyskać wystarczającą ilość szpiku żuchwy od pacjentów bez żadnych dodatkowych szkód. Ostatnio technologia wspomagana komputerowo jest szeroko stosowana w chirurgii jamy ustnej i szczękowo-twarzowej w celu poprawy efektu chirurgicznego i zmniejszenia liczby powikłań chirurgicznych23. Aby uniknąć uszkodzenia żuchwy i nerwu podczas pobierania szpiku kostnego żuchwy, uzyskano obraz 3D CT żuchwy dawców i przeanalizowano planowanie chirurgiczne dawców w celu określenia miejsc dawczych i wdrożenia symulacji chirurgicznej w badaniu; W związku z tym nie doszło do żadnych powikłań chirurgicznych. Ultradźwiękowe ostrze osteotomu, urządzenie specyficzne dla tkanki, umożliwiające chirurgom wykonywanie precyzyjnych osteotomii przy jednoczesnej ochronie sąsiednich tkanek miękkich24, zostało również użyte w celu uniknięcia uszkodzenia tkanek miękkich i zachowania uzyskanej aktywności szpiku kostnego.

Podsumowując, badanie to opisało niezawodny, prosty, bezpieczny i tani protokół izolacji i hodowli odpowiednich MSCs ludzkiej żuchwy, który może być stosowany w terapiach komórkowych tkanek zębów i szczękowo-twarzowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (No.81903249) oraz Natural Science Basic Research Program prowincji Shaanxi (No.2019JQ-701, No.2022JZ-50).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% ParaformaldehydPlantChemMedPC-00005
Adipogenne podłoże różnicująceOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90031
Niebieski roztwór AlcianOriCell, Cyagen BiosciencesALCB-10001
AlkoholMackline809056
Czerwony roztwór barwiący alizarynęSolarbioG1452
Roztwór barwiący ALPBeijing ComWin Biotech Co., Ltd.
AutoklawALP Co., Ltd., JaponiaCL-40L
CCK-8 rozwiązanieYeasen Biotech Co., Ltd.40203ES80
Filtr komórkowy (70 μ m wielkość porów)BD Biosciences352350
Inkubator komórekThermo Fisher Scientific41334177
WirówkaEppendorf5805ZP761456
Probówka wirówkowa (50 mL, 15 mL)Sangon BiotechF600888-9001
Chlorek cetylopirydyniowyAladdinH108696
Pożywka różnicująca chondrogenezęOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90041
Czysta ławka/komora laminarnaBIOBASEBBS-DDS00030
Naczynie hodowlane (6 cm)Termo150462 Termo Termo 156367
Płytki
hodowlane (96-dołkowe, 6-dołkowe)Corning-Costar352350
Jednorazowe sterylne rękawiczki i maskiSangon BiotechF516018-9001; F516038-9001
Jednorazowa sterylna strzykawka (1 ml)Shaanxi longkangxin Medical Instrument Co., Ltd1.00009E+11
Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco z wysokim poziomem glukozy (HG-DMEM)HyklonSH30022.01B
EDTASolarbioE8040-500g
Surowica bydlęca płodu (FBS)PlantChemMedPC-00001
Cytometr przepływowyBeckman CoulterEPICS XL
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD34 sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)Biolegend343503
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD44Biolegend338804
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko mysiej przeciwciału monoklonalnej przeciwko ludzkiemu koniugowanemu z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przeciwko CD90Biolegend328108
HemocytometrKoraba30119480698
IceboxSangon BiotechF615002-0001
Oprogramowanie Image JNarodowy Instytut Zdrowia
Mikroskop świetlnyOLYMPUSIX71-2L20944
Probówki do mikrowirówekSangon BiotechF601620-0010
Spektrofotometr mikropłytkowyBioTek-EPOCH259091
Oprogramowanie MicrotomeFeica1003001
MimicsMaterialise
Minimum niezbędne podłoże alfa (α-MEM)HyclonSH30265.01
Czerwony olejowy roztwór barwiącyO SolarbioG1261
Pożywka do różnicowania kościotwórczegoOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMA-90021
Penicylina i streptomycynaPlantChemMedPC-86115
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)PlantChemMedPC-00003
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciw CD45 sprzężone z fikoerytryną (PE) przeciwko CD45Pipeta Biolegend304008
SORFA
ProPlan CMF 3.0Materialise
Nożyczki, pęsety i nożeShanghai Jinzhong Instrument chirurgiczny Co., LtdZJA030,YAA110,J11010
Sterylna mokra gazaHENAN PIAOAN GROUP Co., Ltd
TrypsynaGibco17075029
Ultradźwiękowe ostrze osteotomuStryker Instruments5450-815-107
CW0051S przeciwko mysiemu przeciwciału monoklonalnemu przeciwko CD34 Psychicznego320511

Bibliografia

  1. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), 1-8 (2015).
  2. Brown, C., et al. Mesenchymal stem cells: Cell therapy and regeneration potential. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (9), 1738-1755 (2019).
  3. Trohatou, O., Maria, G. R. Mesenchymal stem/stromal cells in regenerative medicine: Past, present, and future. Cellular Reprogramming. 19 (4), 217-224 (2017).
  4. Heo, J. S., Choi, Y., Kim, H. S., Kim, H. O. Comparison of molecular profiles of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, placenta and adipose tissue. International Journal of Molecular Medicine. 37 (1), 115-125 (2016).
  5. Li, C. J., Wang, F. F., Zhang, R., Qiao, P. Y., Liu, H. C. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells and Development. 29 (11), 728-736 (2020).
  6. Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives of Oral Biology. 77 (5), 1-11 (2017).
  7. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. Journal of Dental Research. 90 (3), 317-324 (2011).
  8. Akintoye, S. O., et al. Skeletal site-specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals. Bone. 38 (6), 758-768 (2006).
  9. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Stem Yılmaz, D. cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11 (44), 101-121 (2019).
  10. Hong, Y. Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. Journal of Visualized Experiments. (162), e61532(2020).
  11. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708(2020).
  12. Yu, Y. J., et al. Activation of mesenchymal stem cells promotes new bone formation within dentigerous cyst. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 476(2020).
  13. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  14. Mathiasen, A. B., et al. marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment in patients with ischaemic heart failure: final 4-year follow-up of the MSC-HF trial. European Journal of Heart Failure. 22 (5), 884-892 (2020).
  15. Maqsood, M., et al. Adult mesenchymal stem cells and their exosomes: Sources, characteristics, and application in regenerative medicine. Life Sciences. 01 (256), 118002(2020).
  16. Reinders, M. J., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cell therapy with early tacrolimus withdrawal: The randomized prospective, single-center, open-label TRITON study. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 21 (9), 3055-3065 (2021).
  17. Shi, H. Y., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells promote Helicobacter pylori-associated gastric cancer progression by secreting thrombospondin-2. Cell Proliferation. 54 (10), 13114(2021).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  20. Dong, W. J., et al. Phenotypic characterization of craniofacial bone marrow stromal cells: unique properties of enhanced osteogenesis, cell recruitment, autophagy, and apoptosis resistance. Cell and Tissue Research. 358 (1), 165-175 (2014).
  21. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 112 (6), 86-93 (2011).
  22. Giuliani, A., et al. Three years after transplants in human mandibles, histological and in-line holotomography revealed that stem cells regenerated a compact rather than a spongy bone: biological and clinical implications. Stem Cells Translational Medicine. 2 (4), 316-324 (2013).
  23. Chen, Y. W., et al. Computer-assisted surgery in medical and dental applications. Expert Review of Medical Devices. 18 (7), 669-696 (2021).
  24. Gilles, R., Couvreur, T., Dammous, S. Ultrasonic orthognathic surgery: enhancements to established osteotomies. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (8), 981-987 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MSC szpiku kostnegoszpik kostny uchwyizolacja kom rek macierzystychhodowla kom rek macierzystychimmunofenotypowanier nicowanie osteogenner nicowanie adipogenner nicowanie chondrogennekom rki macierzyste szcz kowo twarzowe
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.