Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63817

⸱

25 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathobiology, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji, oczyszczania i kwantyfikacji rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie. Protokół ten konsekwentnie daje > 6 × 109 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe/ml, zapewniając ilości wirusa odpowiednie do badań in vivo na zwierzętach. Opisano dodatkowe testy kontroli jakości w celu zapewnienia bezpieczeństwa in vivo.

Streszczenie

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV), znany również jako serotyp 1 ptasiego ortoawulawirusa, jest jednoniciowym wirusem RNA o negatywnym znaczeniu, który został opracowany zarówno jako wirus onkolityczny, jak i szczepionka wektorowa. NDV jest atrakcyjnym środkiem terapeutycznym i profilaktycznym ze względu na dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej, silne właściwości immunostymulujące i doskonały profil bezpieczeństwa. Podawany jako wirus onkolityczny lub szczepionka z wektorem wirusowym, NDV wywołuje silną odpowiedź immunologiczną swoistą przeciwnowotworowo lub antygenowo, aktywując zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne ramię układu odpornościowego.

Biorąc pod uwagę te pożądane cechy, NDV został oceniony w licznych badaniach klinicznych i jest jednym z najlepiej przebadanych wirusów onkolitycznych. Obecnie zarejestrowane są dwa badania kliniczne z udziałem NDV: jedno oceniające rekombinowaną szczepionkę wektorową NDV przeciwko SARS-CoV-2 (NCT04871737), a drugie oceniające rekombinowaną NDV kodującą interleukinę-12 w połączeniu z Durvalumabem, przeciwciałem antyPD-L1 (NCT04613492). Aby ułatwić dalszy rozwój tego wysoce obiecującego wektora wirusowego, potrzebne są uproszczone metody generowania rekombinowanego NDV (rNDV) o wysokim mianie in vivo.

Ten artykuł opisuje szczegółową procedurę amplifikacji rNDV w zarodkach jaj kurzych wolnych od określonych patogenów (SPF) oraz oczyszczania rNDV z płynu omoczniowego, z ulepszeniami w celu zmniejszenia strat podczas oczyszczania. Dołączono również opisy zalecanych testów kontroli jakości, które należy przeprowadzić w celu potwierdzenia braku zanieczyszczeń i integralności wirusa. Ogólnie rzecz biorąc, ta szczegółowa procedura umożliwia syntezę, oczyszczanie i przechowywanie NDV o wysokim mianie, in vivo, rekombinowanego, lentogennego i mezogenicznego NDV do wykorzystania w badaniach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Wirus rzekomego pomoru drobiu, znany również jako Ptasi Ortoawelwirus-1, jest otoczkowym paramyksowirusem ptaków, który może być stosowany zarówno jako wirus onkolityczny, jak i szczepionka wektorowa1,2,3,4,5,6,7. Ostatnio NDV zmodyfikowany do ekspresji białka kolca SARS-CoV-2 został scharakteryzowany jako skuteczna szczepionka donosowa w modelach prowokacyjnych myszy i chomików7,8,9. Stosowana jako immunoterapia nowotworów powoduje rekrutację wrodzonych komórek odpornościowych, w szczególności komórek NK naturalnych, produkcję interferonu typu I i wytwarzanie limfocytów T specyficznych dla nowotworu10,11,12,13. Oprócz tych silnych właściwości immunostymulujących, NDV ma silny profil bezpieczeństwa i dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej14,15. Te pożądane cechy skłoniły do oceny NDV w licznych badaniach przedklinicznych i klinicznych na ludziach (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Aby dalej rozwijać ten bardzo obiecujący, immunostymulujący wektor wirusowy, potrzebne są szczegółowe metody wytwarzania i oczyszczania ultraczystego NDV o wysokim mianie, który można bezpiecznie podawać in vivo.

Ponieważ NDV jest ptasim paramyksowirusem, najczęściej namnaża się w zarodkach jaj kurzych. Chociaż istnieją systemy komórkowe do rozmnażania NDV, większość z nich nie była w stanie wytworzyć mian podobnych do tych osiąganych w zarodkach jaj kurzych18. Niemniej jednak istnieją pewne wady produkcji NDV w jajach, w tym fakt, że produkcja na bazie jaj jest długotrwała i niełatwa do skalowania, pozyskiwanie dużych ilości jaj kurzych SPF może być problematyczne i istnieje możliwość zanieczyszczenia alergenami jaj13,18,19,20. Ostatnio jedna grupa wykazała, że komórki Vero hodowane w zawiesinie w pożywce bez surowicy mogą wspierać replikację NDV do mian porównywalnych do tych osiąganych w jajach, przed oczyszczaniem21. Wymagało to jednak seryjnego przenikania wirusa w celu adaptacji wirusa do komórek Vero, a optymalizacja metody oczyszczania NDV z zawiesinowych komórek Vero jest nadal wymagana21.

Jak podkreślono wcześniej, metody używane do oczyszczania wirusa in vivo różnią się w zależności od wirusa, o którym mowa22. Istnieje dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej dostępny do wytwarzania rekombinowanego NDV. Proces ten, obejmujący wykorzystanie klonu cDNA, plazmidów pomocniczych i wirusa pomocniczego eksprymującego polimerazę RNA T7, został wcześniej szczegółowo opisany15,23. Protokół ten może być stosowany zarówno do lentogennego, jak i mezogenicznego NDV. Wirus opisany w tym protokole jest rekombinowanym mezogenicznym NDV kodującym białko zielonej fluorescencji (GFP) z meduzy Aequorea victoria wstawione między geny wirusa P i M jako indywidualna jednostka transkrypcyjna, ponieważ zostało to wcześniej opisane jako optymalne miejsce dla insercji obcego transgenu24.

Zamknięte metody opisują oczyszczanie NDV na podstawie jego rozmiaru, od 100 do 500 nm, oraz jego gęstości15. Pozwoliło to na wytworzenie in vivo stad NDV o wysokim mianie w ciągu około 3 tygodni, począwszy od momentu otrzymania jaj do uzyskania ostatecznego miana. Opisano techniki często stosowane w produkcji wirusów na bazie jaj na dużą skalę, takie jak filtracja z przepływem stycznym, filtracja wgłębna i ultrawirowanie w gradionym gradieniu gęstości, co umożliwia zastosowanie tych metod w produkcji na większą skalę. Poprzednio opisane techniki oczyszczania NDV zostały ulepszone poprzez włączenie buforu stabilizującego wirusa, zastosowanie jodiksanolu podczas ultrawirowania w gradiacji gęstości oraz opis różnych środków kontroli jakości w celu zapewnienia jakości in vivo15. Pozwoliło to na oczyszczenie NDV in vivo, osiągając miana tak wysokie, jak 3 ×10 10 PFU/ml od 0,8 do 1,0 l płynu omoczniowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Guelph zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Canadian Council on Animal Care). Wszystkie prace są wykonywane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) w Kanadzie, gdzie mezogenny NDV jest patogenem grupy ryzyka 2. Wszystkie etapy amplifikacji i oczyszczania NDV powinny być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu IIA w celu zapewnienia bezpieczeństwa i sterylności.

1. Amplifikacja NDV z użyciem zarodników jaj kurzych wolnych od określonych patogenów

  1. Inokulacja zarodkowych jaj kurzych SPF
    UWAGA: Zazwyczaj do wytworzenia jednej partii wykorzystuje się 96 zarodkowych jaj kurzych SPF in vivopartia NDV o określonej czystości. Należy zamówić o jedną lub dwie tuziny jaj więcej, aby uwzględnić ewentualne uszkodzenia podczas transportu oraz zmienność żywotności. Zapłodnione jaja kurze są materiałem biologicznym i powinny być obsługiwane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Ponieważ jednak zarodki nie są wykluwane, nie wymagana jest zgoda instytucjonalnej Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami.
    1. Po otrzymaniu zarodkowych jaj kurzych SPF należy inkubować je w inkubatorze do jaj w temperaturze 37 °C, 60% wilgotności przez 9 dni. Należy upewnić się, że inkubator jest ustawiony na automatyczne kołysanie/obracanie jaj co godzinę.
      UWAGA: Jaja można przechowywać w temperaturze pokojowej do 24 h lub 4 °C przez maksymalnie 72 h; może to jednak obniżyć żywotność zarodków.
    2. Po 8–1 dniach inkubacji (idealnie w 9. dniu) przeprowadź świecenie jaj, aby ocenić żywotność zarodków. Poszukaj sieci naczyń krwionośnych (Rycina 1A) oraz ruchy embrionu jako wskaźniki żywotności zarodków. Utylizuj jaja, które nie wykazują tych cech (Rysunek 1B).
    3. Na żywotnych jajach zaznacz ołówkiem znak „X” na granicy między komorą powietrzną a embrionem (Rycina 1A). Należy upewnić się, że miejsce iniekcji nie spowoduje perforacji naczyń krwionośnych. Oznaczone jaja należy zwrócić do inkubatora na czas przygotowania inokulum.
    4. Oblicz ilość wirusa wymaganą do iniekcji we wszystkie zarodkowe jaja kurze SPF. Upewnij się, że każde jajo otrzyma 100 PFU wirusa w objętości 100 µLrozcieńczyć wirusa w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do stężenia 1 × 103 PFU/ml. Przygotować dodatkowe 20% inokulum, aby uwzględnić niedokładności podczas podawania wirusa.
    5. Za pomocą ściereczki antystatycznej oczyścić wierzchołki oznakowanych jaj 10% roztworem jodu rozcieńczonym w 70% etanolu. Odczekać około 1–2 min do wyschnięcia roztworu.
    6. Ostrożnie przebij skorupkę za pomocą sterylnej, ostrej pęsety. Pęsetę należy odkażać w 70% etanolu pomiędzy kolejnymi jajami.
    7. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25 G należy wstrzyknąć 100 µL szczepionki przygotowanej w kroku 1.1.4 do jamy chorioallantoicznej (Rycina 1C). Podejść z igłą pod kątem prawie 90° kąt względem jaja. Wprowadzić igłę tylko w górną część błony chorioallantoicznej.
    8. Po inokulacji należy pokryć miejsce nakłucia lakierem do paznokci i umieścić jaja z powrotem w inkubatorze. Należy upewnić się, że funkcja kołysania jest włączona (ON) do 24 godzin po inokulacji.
    9. Sprawdzić żywotność jaj 24 h po inokulacji. Odrzucić martwe jaja, w których nie stwierdzono unaczynienia błony chorioallantoicznej oraz ruchów embrionu (Rycina 1B).
      UWAGA: Jaja te obumarły w wyniku procesu inokulacji, a nie z powodu NDV.
    10. Wróć jaja do inkubatora, ustawiając funkcję kołysania (rocker) na OFF, aby zapobiec zanieczyszczeniu płynu alantois białkami jaja.
    11. Kontroluj jaja co 12–24 h zgodnie z opisem w kroku 1.1.9 w celu zidentyfikowania jaj martwych. Jaja, które obumrą po 24 h od inokulacji, przenieś do 4°C aby zminimalizować autolizę. Płyn allantois należy zebrać w ciągu 2–12 h od schłodzenia.
    12. Inkubować jaja przez co najmniej 72 h.
      UWAGA: W przypadku namnażania mezogennego szczepu NDV optymalny czas inkubacji wynosi 60–72 h, ponieważ przedłużone czasy inkubacji mogą utrudnić proces oczyszczania ze względu na zmniejszenie przejrzystości płynu alantoicznego. Kwestia ta nie jest tak istotna przy namnażaniu lentogennych szczepów NDV, ponieważ wymagają one znacznie więcej czasu na zabicie zarodka.
    13. Po odpowiednim czasie inkubacji przenieść pozostałe jaja do 4 °C przez 2–12 h przed pobraniem płynu alantoicznego.
  2. Pobieranie płynu alantoicznego zawierającego NDV
    1. Przenieś schłodzone jaja do komory bezpiecznej biologicznie. Oczyść górne części jaj 70% etanolem.
    2. Przy użyciu sterylnej pęsety i nożyczek chirurgicznych należy rozciąć stronę wierzchołkową jaja w miejscu, w którym znajduje się komora powietrzna.
    3. Usuń skorupkę, aby odsłonić błonę żółtkowo-płucną (Rysunek 1D).
    4. Ostrożnie nakłuj błonę i odważ ją, aby odsłonić jamę alantoiczną (Rysunek 1E). Należy upewnić się, aby nie przebić przypadkowo pęcherzyka żółtkowego, ponieważ spowoduje to zniszczenie jaja.
    5. Użyj pęsety tępej, aby chwycić zarodek i otworzyć pęcherzyk zarodkowy.
      UWAGA: Płyn wewnątrz pęcherzyka żółtkowego również zawiera NDV.
    6. Przytrzymaj zarodek pęsetą i pobierz płyn allantoisowy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
    7. Przechowywać płyn alantoiczny w temperaturze 0°C w 15 ml probówkach stożkowych do czasu klarowania.
      ​UWAGA: Jeśli płyn allantoiczny ma żółty kolor, oznacza to, że worek żółtkowy został uszkodzony i należy taki płyn usunąć.
    8. Odwiruj probówki stożkowe zawierające płyn allantois z prędkością 1 50 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    9. Punkt przerwania: Przenieść oczyszczony płyn allantois w aliquotach do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do przechowywania długoterminowego (np. od kilku tygodni do kilku miesięcy) należy uzupełnić płyn sacharozą do stężenia końcowego 5%, aby chronić wirusa przed szkodliwymi skutkami zamrażania i rozmrażania. Alternatywnie, do przechowywania krótkoterminowego (np. 1–3 dni), należy uzupełnić płyn allantoiczny sacharozą (stężenie końcowe 5%) lub 3x buforem mannitolowo-lizynowym (ML) (15% mannitolu, 3% lizyny; patrz Tabela uzupełniająca S1 (dla przepisów buforów), aby uzyskać stężenie końcowe 1x (5% mannitolu, 1% lizyny) przed przechowywaniem w 4 °C.

2. Oczyszczanie NDV z płynu alantoicznego

  1. Filtracja głęboka płynu alantoidowego
    1. Przechowywać klarowny płyn alantoisowy w temperaturze -80 °C i rozmrozić w temperaturze 4 °C wieczorem przed puryfikacją.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przygotować układ przewodów oraz pompę perystaltyczną zgodnie z rysunkiem w Rysunek 2.
    3. Jeśli nie zostało to wcześniej wykonane, połączyć płyn alantoiczny z buforem ML 3x do stężenia końcowego 1x.
    4. Przed podłączeniem filtra głębinowego należy wysterylizować przewody, przepuszczając przez system 50 ml 0,5 M NaOH do naczynia na odpady.
    5. Przepłucz rurki, przepuszczając 10 ml sterylnej wody klasy molekularnej przez system do naczynia z odpadami.
      UWAGA: Ponieważ NaOH dezaktywuje NDV, ważne jest, aby linie zostały odpowiednio przepłukane przed wprowadzeniem zawierającego wirusa płynu allantoicznego.
    6. Przygotuj system, przepuszczając przez niego 50 ml PBS; zatrzymaj pompę, gdy w probówce pozostanie około 5 ml PBS.
    7. Zamoczyć filtr głębokościowy o rozmiarze 1-3 µM stopień retencji rurek i zdejmij drugą zatyczkę po stronie apikalnej filtra głębokościowego, aby go odpowietrzyć. Przepuść przez system dodatkowe 50 mL PBS.
    8. Gdy PBS zacznie wypływać przez otwór odpowietrzający u góry filtra, zamknij port i kontynuuj przepływ PBS przez przewody.
      UWAGA: Niewielkie pęcherzyki powietrza są dopuszczalne, jednak obecność dużych ilości powietrza będzie wymagać ponownego odpowietrzenia filtra, zgodnie z opisem w krokach 2.1.7 i 2.1.8.
    9. Zatrzymaj pompę, gdy w probówce pozostanie około 5 ml PBS.
    10. Wymień naczynie na odpady na nowe, sterylne naczynie do zbierania i rozpocznij przepuszczanie płynu alantoisowego przez filtr głębinowy.
      UWAGA: Ciśnienie nie powinno przekraczać 10 psi, ponieważ może to doprowadzić do ścinania wirusa. Ciśnieniem można manipulować poprzez zmniejszenie lub zwiększenie szybkości przepływu pompy. Jeśli ciśnienie zaczyna przekraczać 10 psi, a szybkość przepływu nie może zostać już bardziej zmniejszona, należy zastosować nowy filtr wgłębny. W takim przypadku przed wznowieniem przepływu płynu alantoidowego należy wykonać kroki 2.1.6–2.1.8.
    11. Po przejściu całego płynu alantoicznego przez filtr, przepuść przez przewody 50 ml buforu 1x ML, aby zmaksymalizować odzysk wirusa.
    12. Zbierać ciecz do momentu całkowitego wycieczenia. Przechowywać wirusa przez noc lub do 36 h w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Po przeprowadzeniu filtracji głębokiej wirusa należy kontynuować proces oczyszczania w ciągu 36 h od zakończenia tej filtracji.
    13. Odłącz filtr głębinowy i zdezynfekuj przewody, przepuszczając 10 ml 0,5 M NaOH z dodatkiem 40 PPM wybielacza, uprzednio podgrzanego do 42 °C przez system przed przechowywaniem w 0,5 M NaOH.
  2. Filtracja przepływowa styczna do zagęszczania NDV
    1. Złożyć komponenty kasety zgodnie z przedstawionym schematem w Rycina 3A (oraz jak wykazano wcześniej25) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Kolektor i płyta końcowa powinny zostać umyte detergentem i wysuszone przed użyciem. Silikonowe uszczelki są wielorazowe i powinny być przechowywane wraz z kasetą w 0,5 M NaOH.
    2. Przygotuj system tangentialnej filtracji przepływowej (TFF) (znanej również jako filtracja przepływem krzyżowym) w konfiguracji „otwartej” (Rycina 3B).
      1. W przypadku pierwszego użycia kasety, należy złożyć kasetę TFF w konfiguracji elucyjnej i przepłukać ją 10 ml sterylnej wody klasy molekularnej (Rycina 3C).
      2. Gdy w zbiorniku zasilającym pozostanie tylko 5 ml wody, należy zatrzymać pompę i zmienić konfigurację systemu TFF na układ zamknięty (Rycina 3D).
      3. Dodać 10 ml 0,5 M NaOH i wybielacz o stężeniu 40 PPM, uprzednio podgrzanych do 42 °C do zbiornika i poddawać recyrkulacji w systemie przez 30–60 min.
      4. Przerwij przepływ i przywróć system TFF do konfiguracji elucyjnej, a następnie wznowij przepływ w celu elucji roztworu czyszczącego.
      5. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml cieczy, należy zatrzymać pompę i dodać 10 ml sterylnej wody klasy molekularnej w celu przepłukania systemu.
      6. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml cieczy, należy zatrzymać pompę i ustawić system TFF w konfiguracji otwartej (Rycina 3B). Kontynuuj krok 2.2.3.
    3. Przeprowadź sterylizację kasety i przewodów, przepuszczając przez układ 100 ml 0,5 M NaOH za pomocą pompy perystaltycznej. Należy dopilnować, aby ciśnienie nie przekroczyło 30 psi w celu zachowania integralności kasety.
    4. Zatrzymaj pompę, gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml 0,5 M NaOH.
    5. Do zbiornika należy dodać 10 ml sterylnej wody klasy molekularnej i wznowić przepływ płynu przez kasetę. Zbiornik należy delikatnie zamieszać, aby wypłukać NaOH ze ścianek, co zapobiegnie inaktywacji wirusa. Należy powtórzyć etap płukania zbiornika.
    6. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml sterylnej wody klasy molekularnej, należy zatrzymać pompę.
    7. Dodaj 10 ml PBS do zbiornika, delikatnie nim potrząsając, aby wypłukać sterylną wodę klasy molekularnej ze ścianek. Wznów przepływ cieczy przez kasetę.
    8. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml płynu, należy zatrzymać pompę, uzupełnić zbiornik przefiltrowanym przez filtr głębinowy płynem alantoicznym, a następnie wznowić przepływ pompy.
    9. Monitoruj manometr 1 (Rycina 3B), aby upewnić się, że ciśnienie nie przekroczy 10 psi, co zapobiegnie ścinaniu wirusa. Aby zwiększyć elucję do odpadów, należy zastosować kombinację prędkości pompy perystaltycznej oraz zacisków śrubowych (C-clamps).
      UWAGA: Połączenie prędkości pompy perystaltycznej i zastosowanie ścisków śrubowych spowoduje wzrost ciśnienia.
    10. Gdy w zbiorniku pozostanie 50–10 ml płynu allantoicznego, należy zatrzymać pompę, aby przeprowadzić wymianę buforu, dodając 150–20 ml buforu ML 1x.
    11. Wznowić przepływ pompy, ponownie monitorując manometr 1 (Rycina 3B), aby upewnić się, że nie przekroczy ona 10 psi.
    12. Gdy w zbiorniku pozostanie od 5 do 10 ml cieczy, należy zatrzymać pompę.
    13. Za pomocą dwóch ścisków śrubowych zamknij dwie linie odpływowe, jak pokazano na Rysunek 3C.
    14. Odłącz linię retentatu zasilającą zbiornik i umieść ją w probówce stożkowej o pojemności 50 mL (Rycina 3C).
    15. Wznowić przepływ pompy, zatrzymując ją, gdy w zbiorniku rezerwowym pozostaną tylko kilka kropli cieczy.
    16. Zdejmij ściski śrubowe z linii odpływowych i ponownie podłącz linię doprowadzającą retentat do zbiornika zbiorczego (Rysunek 3B).
    17. Dodać 20–25 ml buforu ML 1x i wznowić przepływ pompy, aż w zbiorniku pozostanie około 5 ml cieczy.
    18. Powtórz kroki od 2.2.13 do 2.2.16.
      UWAGA: A 3rd Elucję można przeprowadzić poprzez powtórzenie kroków 2.2.17 oraz od 2.2.13 do 2.2.16 w celu zwiększenia wydajności wirusa. Większość wirusa znajduje się jednak w dwóch pierwszych elucjach.
    19. Po zakończeniu elucji należy umieścić wirusa na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    20. Aby oczyścić linie, należy skonfigurować system w formie zamkniętej pętli (Rysunek 3D) z liniami odpływowymi prowadzącymi z powrotem do zbiornika, zgodnie z przedstawionym na Rycina 3D.
    21. Następnie należy oczyścić system, dodając 250 ml 0,5 M NaOH oraz podchlorynu sodu o stężeniu 40 PPM, uprzednio podgrzanego do 42 °C.
    22. Przepuszczać roztwór czyszczący przez system przez całą noc.
      UWAGA: Podczas recyrkulacji roztworu czyszczącego, przy prędkości pompowania 50 mL/min, ciśnienie powinno wynosić około 5 psi. Jeśli ciśnienie przekroczy tę wartość, oznacza to, że kaseta jest zabrudzona; należy wówczas wymienić roztwór czyszczący i powtórzyć proces.
    23. Wypłucz roztwór czyszczący, kierując obie linie odpływowe oraz linię retentatu do pojemnika na odpady.
    24. Dodać 40–50 ml sterylnej wody do zbiornika, a następnie przepuścić ją przez system do naczyń z odpadami.
    25. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml cieczy, należy zatrzymać pompę i dodać do zbiornika 10–20 ml 0,5 M NaOH, delikatnie mieszając roztwór w celu wypłukania wnętrza zbiornika.
    26. Gdy zbiornik będzie niemal pusty, powtórz krok 2.2.23 jeszcze dwa razy.
    27. Zdemontować układ TFF, przechowując kasetę TFF oraz uszczelki w niewielkiej objętości 0,5 M NaOH w szczelnej plastikowej torbie w 4 °C.
      UWAGA: Przewody można przechowywać w temperaturze pokojowej, zanurzone w 0,5 M NaOH.
  3. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jodiksanolu
    1. Włącz ultracentryfugę i ustaw ją w trybie schładzania wstępnego do 4 °CWstępnie schłodzić wybrany wirnik w temperaturze 4 °C także (patrz na Tabela materiałów).
      UWAGA: Rotory należy przechowywać w 4 °C.
    2. Należy wykorzystać roztwór stokowy jodiksanolu 60% (stężenie w momencie zakupu), aby przygotować roztwory jodiksanolu o stężeniach 40%, 20% i 10%, rozcieńczając go buforem PBS oraz buforem ML 3x do końcowego stężenia 1x buforu ML.
    3. Do otwartej, cienkościennej probówki do ultracentryfugi o objętości 13,2 ml nanieś warstwowo odpowiednio 0,5 ml, 2,5 ml i 2,5 ml roztworów jodiksanolu o stężeniach odpowiednio 40%, 20% i 10% (Rycina 4A).
      UWAGA: Przechylenie rurki do ultrawirówki na bok i powolne wypuszczanie roztworu znacznie zmniejszy ryzyko zmieszania dwóch warstw gradientu. Rozdzielenie każdej z warstw powinno być wyraźne, z "cześć" widoczne pomiędzy poszczególnymi warstwami gradientu.
    4. Użyj pisaka, aby zaznaczyć granice poszczególnych warstw gradientu.
    5. Nanieś 6–6,5 ml eluatów wirusa z procedury TFF na gradient gęstości. Dodawaj wirusa ostrożnie, zgodnie z opisem w punkcie 2.3.3, aby nie zakłócić gradientu gęstości.
    6. Włożyć probówki do ultrawirówki do wkładów rotora z koszami odchylanymi (patrz na Tabela materiałów) używając wagi z otwartą szalką, aby zrównoważyć wkładki z dokładnością do 0,01 g. W celu wyrównania różnic w wadze należy użyć PBS lub dodatkowego eluentu wirusowego.
    7. Po zrównoważeniu probówek należy je zakręcić i umieścić w rotorze.
    8. Wirować przez 1,5 h przy 125 00 g × g w 4 °C.
      UWAGA: Procedurę tę można przeprowadzić w ciągu nocy, jeżeli dostępna jest ultrawirówka z funkcją opóźnionego startu.
    9. Po ultrawirowaniu wyjmij probówki za pomocą sterylnej pęsety. Zlokalizuj docelowy prążek – szeroki prążek – pomiędzy gradientami 10% i 20% (Rysunek 4B).
    10. Zawiesić probówkę nad zlewką, wykorzystując statyw laboratoryjny.
    11. Do strzykawki o pojemności 5 ml należy przymocować igłę 18 G x 1,5 cala i przebić nią ściankę rurki do ultrawirówki.
      UWAGA: Probówkę należy przebić nieco poniżej prążka docelowego, wprowadzając igłę pod kątem w górę i z otworem skierowanym do góry, tak aby igła weszła w prążek docelowy.
    12. Powoli wysuń tłok, aby wyciąć docelowy prążek.
      UWAGA: Przesuwaj igłę w obrębie docelowego prążka, aby zmaksymalizować ilość wyekstrahowanego wirusa. Należy uważać, aby inne prążki lub zanieczyszczenia nie wymieszały się z prążkiem docelowym; należy również unikać pobierania nadmiaru roztworu, ponieważ spowoduje to konieczność użycia większej liczby kaset dializacyjnych.
    13. Po wyekstrahowaniu docelowego prążka należy wyjąć igłę i pozwolić pozostałej cieczy spłynąć do zlewki z odpadami. Przenieść docelowy prążek do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i powtarzać czynność, aż zostaną wyekstrahowane wszystkie prążki ze wszystkich pozostałych probórek do ultrawirówki.
    14. Powtórz kroki 2.3.10–2.3.13 do momentu, aż wszystkie docelowe prążki zostaną wyekstrahowane ze wszystkich probówek do ultrawirówki.
    15. Alternatywna metoda wycinania pasm docelowych opisana w krokach 2.3.10 do 2.3.13
      1. Powoli usuń ciecz znajdującą się nad pasmem docelowym za pomocą pipety. Po dotarciu do pasma docelowego pobierz je pipetą i przechowuj wirusa w probówce stożkowej o pojemności 50 ml.
        UWAGA: Pozwala to na ponowne wykorzystanie probówek do ultrawirowania.
  4. Usuwanie jodiksanolu z roztworu wirusów
    UWAGA: Prążek zawierający NDV pojawia się przy gęstości jodiksanolu między 15% a 16%. Stężenie jodiksanolu w roztworze można określić, mierząc absorbancję przy 340 nm w odniesieniu do krzywej wzorcowej (Rycina pomocnicza S1). Ten krok można pominąć, ponieważ nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych ani ostrej toksyczności po podaniu myszom C57BL/6 roztworów jodiksanolu o takim stężeniu.
    1. Wstępnie przygotuj kasetkę do dializy o objętości 0,5–3 ml i progu odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa, zanurzając ją w PBS na 1 min.
      UWAGA: Membrana dializacyjna powinna zmienić strukturę z gładkiej na pomarszczoną lub chropowatą. Jeśli objętość wyekstrahowanego wirusa przekracza 10 ml, należy zastosować dwie kasety dializacyjne o pojemności 0,5–3 ml lub jedną kasetę dializacyjną o pojemności 5–12 ml.
    2. W zależności od potrzeb należy użyć strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml oraz igły tępokadielnej 18 G x 1,5 cala, aby pobrać wirusa z probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    3. Używając strzykawki, wprowadź ją do kasety dializacyjnej, uważając, aby nie przebić membrany, a następnie wstrzyknij wirusa.
      UWAGA: Kaseta do dializy może być obracana w celu manipulowania położeniem pęcherzyka powietrza wewnątrz kasety. Przed wyjęciem igły z kasety należy usunąć pęcherzyk powietrza.
    4. Napełnić zlewkę o pojemności 1 l sterylnym 1x PBS, umieścić w niej mieszadełko magnetyczne oraz kasetę do dializy, a następnie przykryć. Inkubować w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu.
      UWAGA: Aby przymocować kasetę do dializy w taki sposób, aby unosiła się w PBS, należy użyć ekstrudowanego polistyrenu i gumki recepturki. Kaseta może lekko spęcznieć pod wpływem buforu ML.
    5. Po 1–2 h wymienić na świeży 1x PBS i kontynuować inkubację w temperaturze 4 °C przez kolejne 8–10 h przy lekkim mieszaniu.
      UWAGA: Można to również przeprowadzić w ciągu nocy.
    6. Ponownie wymień roztwór na świeży 1x PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1–2 h.
  5. Stężenie roztworu wirusa
    1. Wyjmij kasetę dializacyjną z buforu do dializy (Rycina 4C) i umieść ją w małej, szczelnej plastikowej torebce. Dodaj 15–25 ml 40% glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 20 00 MW, tak aby kaseta dializacyjna była całkowicie zanurzona.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Okresowo sprawdzać objętość wirusa w kasecie, używając strzykawki 5 lub 10 ml oraz tępok𝙤ńcówkowej igły do napełniania o rozmiarze 18 G x 1,5 cala.
      UWAGA: Czas wymagany do zagęszczenia wirusa będzie się różnić w zależności od objętości początkowej i pożądanej objętości końcowej. Zazwyczaj pożądana objętość końcowa wynosi od 1 do 1,5 ml, niezależnie od początkowej objętości płynu allantoicznego. Podczas sprawdzania objętości należy uważać, aby nie używać tego samego portu, ponieważ naruszy to jego szczelność i może doprowadzić do zmieszania się roztworu glikolu polietylenowego z wirusem.
    3. Przed usunięciem skoncentrowanego wirusa z kasety dializacyjnej należy krótko przepłukać kasetę w 1x PBS i napełnić powietrzem tępy needle (igła do napełniania) o rozmiarze 18 G x 1,5 cala.
    4. Wprowadź wypełnioną powietrzem strzykawkę do kasety dializacyjnej i wciśnij tłok. Obróć urządzenie tak, aby można było usunąć skoncentrowanego wirusa bez usuwania wprowadzonego powietrza.
    5. Przenieś skoncentrowany wirus do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, zapisując odmierzoną objętość.
    6. Używając tej samej strzykawki i igły, wstrzyknij do kasety dializacyjnej odpowiednią ilość 60% sacharozy, tak aby po połączeniu z wcześniej usuniętym wirusem stężenie końcowe sacharozy wynosiło 5%.
    7. Palcami w rękawiczkach delikatnie masować membranę, aby usunąć pozostałości wirusa, które mogły do niej przywrzeć, uważając przy tym, by jej nie uszkodzić. Usunąć część nadmiaru powietrza z kasety do dializy, aby ułatwić proces uwalniania wirusa.
    8. Połącz ten płuczak z wirusem znajdującym się już w probówce stożkowej o pojemności 50 ml.
      ​UWAGA: Wirus znajduje się obecnie w 5% sacharozie i jest gotowy do rozlania do 20 µL, 50 µL, 100 µLlub 200 µL alikwoty i przechowywane w temperaturze -80 °CEwentualnie, w celu długoterminowego przechowywania, NDV można liofilizować i przechowywać w temperaturze 4 °C zgodnie z opisem w rozdziale 2.6.
  6. Liofilizacja NDV
    1. Liofilizować wirusa podzielonego na alikwoty w 1,5 ml probówkach do wirowania lub 15 ml probówkach stożkowych w temperaturze 4 × 10-3 MBAR i -52 °C przez 16 h.
    2. Przechowywać liofilizowane próbki w temperaturze 4 °C bez istotnego obniżenia miana wirusa.

3. Analizy kontroli jakości

  1. Izolacja wirusowego RNA i PCR z odwrotną transkrypcją w celu potwierdzenia genomu
    1. Rozmrozić alikwot wirusa o objętości 20 µL. Postępować zgodnie z protokołem izolacji wirusowego RNA dostarczonym w zestawie.
    2. Wyizolowany RNA należy niezwłocznie wykorzystać jako matrycę do PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotować reakcje odwrotnej transkrypcji zgodnie z opisem w protokole dostarczonym przez producenta.
    4. Uzyskane cDNA należy wykorzystać jako matrycę do różnych reakcji PCR kontroli jakości w celu potwierdzenia patotypu NDV (Tabela 1, zestaw starterów dla białka F) oraz obecności wymaganych kontrolnych elementów genowych (Tabela 1, zestaw starterów dla transgenu).
      UWAGA: Startery powinny być zaprojektowane na podstawie szczepu NDV poddanego propagacji.
      1. W celu sekwencjonowania miejsca cięcia białka F, głównego determinantu patotypu, należy użyć zestawu starterów dla białka F (Tabela 1). Należy szukać produktu PCR o długości 435 par zasad.
        UWAGA: W tym przypadku startery zostały zaprojektowane na podstawie szczepu LaSota NDV (numer dostępu Genbank AF0761.1). Dobrze jest znane, że optymalna ekspresja transgenu zachodzi, gdy obcy transgen zostanie wstawiony pomiędzy geny P i M24.
      2. Użyć zestawu starterów dla transgenu, aby potwierdzić integralność elementów startowych i końcowych transgenu. Przeprowadzić sekwencjonowanie produktu PCR, aby potwierdzić integralność sekwencji startu i końca genu.
    5. Produkty PCR należy przekazać do sekwencjonowania DNA i porównać je z matrycą pod kątem homologii.
  2. SDS PAGE i barwienie Coomassie w celu wykrycia zanieczyszczających białek
    1. Odlać żel SDS PAGE z gradientem gęstości, przygotowując najpierw 6% i 15% roztwory poliakryloamidu (Tabela dodatkowa S1). Za pomocą pipety 10 mL pobrać 5 mL roztworu 15%, a następnie 5 mL roztworu 6%.
    2. Wyjąć pipetę z roztworu i utworzyć pęcherzyk powietrza, krótko zasysając powietrze.
      UWAGA: Przesuwając się w górę, pęcherzyk powietrza miesza roztwór, tworząc gradient SDS PAGE.
    3. Przenieść roztwór do urządzenia do odlewania i pozostawić do stężenia przez 30 min.
    4. W końcowej objętości 20 µL połączyć alikwot wirusa z 4-krotny bufor redukujący (Tabela dodatkowa S1) tak, aby stężenie końcowe wynosiło 1x, a następnie gotować przez 10 min w temperaturze 95 °C w termocyklerze. Nałożyć co najmniej 1 × 107 PFU wirusa.
    5. Zanurzyć żel SDS PAGE w buforze do elektroforezy (Tabela dodatkowa S1) i nałożyć próbki.
    6. Prowadzić elektroforezę przy 120 V przez 1-1,5 h.
    7. Wyjąć żel z buforu do elektroforezy i przenieść go do mniejszego pojemnika.
    8. Dodać roztwór barwiący Coomassie (Tabela dodatkowa S1), aby pokryć żel. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4-5 h.
    9. Usunąć roztwór barwiący i dodać roztwór odbarwiający (Tabela dodatkowa S1), inkubując przez 4-8 h w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Roztwór odbarwiający należy wymieniać trzy do czterech razy.
      UWAGA: Żel powinien być przezroczysty, a jego kolor powinien być taki sam, jak przed barwieniem.
    10. Wykonać obrazowanie żelu w ustawieniach kolorymetrycznych. Reprezentatywny obraz żelu SDS PAGE barwionego Coomassie zawierającego próbki z płynu allantoisowego i oczyszczonego wirusa przedstawiono na Rysunku 5.
  3. Ilościowe oznaczenie miana zakaźnego wirusa metodą mediany zakaźnej dawki dla hodowli tkankowej (TCID50) i testem immunofluorescencyjnym
    UWAGA: Alternatywnie do komórek DF1 można użyć komórek Vero; jednak efekt cytopatyczny (CPE) jest w komórkach Vero mniej wyraźny. W tym teście zastosowano NDV posiadający mutację L289A, która zwiększa fuzogenność, i wykazujący ekspresję GFP pomiędzy genami P i M.
    1. Wysiać komórki DF1 na płytkę 96-dołkową w zagęszczeniu 20 0 komórek/dołek w objętości 80 µL dzień wcześniej, używając DMEM uzupełnionego o 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 125 µg/mL trypsyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    2. Następnego dnia rozmrozić 20 µL alikwot wirusa na lodzie.
    3. Użyć probówek 1,5 mL do przygotowania rozcieńczeń seryjnych. Rozpocząć od rozcieńczenia 10 µL wirusa w 90 µL PBS, aby przygotować rozcieńczenie 10-2. Przygotować wszystkie pozostałe rozcieńczenia, co najmniej do 10-10, używając 90 µL PBS i dodając 10 µL poprzedniego rozcieńczenia.
      UWAGA: Przy przechodzeniu między rozcieńczeniami należy używać nowej końcówki do pipety.
    4. Użyć 20 µL każdego rozcieńczenia do zainfekowania każdego dołka płytki 96-dołkowej, jak pokazano na Rysunku 6.
      UWAGA: Końcowa objętość w każdym dołku wyniesie 10 µL.
    5. Inkubować płytkę przez co najmniej 48 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2, przed sprawdzeniem obecności CPE/GFP lub wykonaniem pośredniego testu immunofluorescencyjnego (IFA).
      UWAGA: W tych warunkach hodowli CPE jest widoczny po 10 h (Rysunek 7A-D) i nasila się w ciągu kolejnych 24 h (Rysunek 7E-H). Płytkę można inkubować dłużej, aby zwiększyć intensywność CPE w przypadku oceny za pomocą GFP lub CPE.
      1. Jeśli ocena odbywa się za pomocą CPE lub GFP i NIE wykonuje się IFA, należy przejść do kroku 3.3.18.1.
    6. W przypadku wykonywania IFA, wypłukać komórki dwukrotnie 10 µL 1x PBS.
    7. Dodać 10 µL 4% paraformaldehydu rozcieńczonego w PBS do każdego dołka i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    8. Przemyć komórki 3x przez 5 min każdorazowo 100 µL 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Przeprowadzić permeabilizację komórek poprzez dodanie 10 µL 0,1% NP-40 w PBS i inkubowanie w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    10. Przemyć komórki 3x przez 5 min 10 µL 0,1% PBS-T.
    11. Dodać 10 µL buforu blokującego składającego się z 5% (V/V) normalnej surowicy koziej rozcieńczonej w 0,1% PBS-T na 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    12. Dodać 10 µL na dołek pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko rybonukleoproteinie NDV pochodzenia mysiego rozcieńczonego w 0,1% PBS-T do stężenia 1 µg/mL, inkubując przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    13. Przemyć komórki 3x przez 5 min w 10 µL 0,1% PBS-T.
    14. Dodać 100 µL wtórnego przeciwciała anty-mysiego od kozy AlexaFluor 48 rozcieńczonego w 0,1% PBS-T do stężenia 2 µg/mL. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    15. Przemyć komórki 3x przez 5 min w 10 µL 0,1% PBS-T.
    16. Po ostatnim przemyciu pozostawić komórki w 10 µL 0,1% PBS-T.
    17. Wykonać obrazowanie dołków za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
    18. Podczas wykonywania IFA należy szukać fluorescencji silniejszej niż ta widoczna w dołkach kontroli negatywnej, co wskazuje, że dołek jest dodatni w kierunku NDV, jak pokazano na Rysunku 8.
      1. Szukać obecności syncytiów i dużych, zaokrąglonych komórek, które charakteryzują CPE NDV. W przypadku oceny dołków zainfekowanych wirusem wykazującym ekspresję GFP, należy szukać obecności GFP.
    19. Wprowadzić odpowiednie informacje do kalkulatora mian Spearman-Karber26, aby wyznaczyć PFU/mL wirusa (Tabela 2). Przykład płytki do oznaczania miana TCID50 przedstawiono na Rysunku 6.
  4. Ilościowe oznaczenie miana wirusa za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
    UWAGA: W celu oszczędności czasu i ograniczenia manipulacji próbkami zaleca się stosowanie zestawu do jednostopniowego qRT-PCR. W celu zwiększenia specyficzności wykrywania sekwencji wirusa stosuje się analizę opartą na sondach.
    1. Stworzyć krzywą wzorcową dla znanej ilości sekwencji wirusa (Rysunek dodatkowy S2A,B).
      UWAGA: Można to zrobić poprzez zakup syntetycznego, 50 bp dwuniciowego fragmentu DNA genu L wirusa NDV. Sekwencja 50 bp fragmentu genu L NDV przedstawiona jest na Rysunku dodatkowym S2C.
    2. Przeliczyć ilość fragmentu DNA wirusa (zazwyczaj podawaną przez producentów w nanogramach lub femtomolach) na liczbę cząsteczek lub kopii fragmentu DNA, korzystając z liczby Avogadra i wzoru przeliczania moli na cząsteczki (Równanie (1)).
      figure-protocol-1 (1)
    3. Przygotować próbki do krzywej wzorcowej, wykonując dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń znanych kopii fragmentu DNA wirusa, zaczynając od 1,00 × 1010 kopii w dół do 1,0 × 100 kopii.
    4. Aby określić ilość RNA NDV w nieznanych próbkach, wyekstrahować RNA NDV za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Postępować zgodnie z protokołem dostarczonym w zestawie. Po wyekstrahowaniu RNA przystąpić do zalecanego protokołu zawartego w zestawie do jednostopniowego qRT-PCR.
    5. Przeprowadzić reakcje w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym z następującymi warunkami temperatury i cykli: 1) jeden cykl odwrotnej transkrypcji w 5 °C przez 10 min; 2) jeden cykl początkowej denaturacji w 95 °C przez 1 min; oraz 3) 40 cykli denaturacji (95 °C przez 10 s), elongacji (60 °C przez 30 s) i akwizycji sygnału fluorescencyjnego.
    6. Po zakończeniu analizy qRT-PCR wygenerować krzywą wzorcową na podstawie próbek wzorcowych za pomocą oprogramowania urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek dodatkowy S2A,B).
      UWAGA: Oprogramowanie obliczy również ilość RNA NDV w nieznanych próbkach na podstawie krzywej wzorcowej.
  5. Badanie bezpieczeństwa pod kątem ostrej toksyczności u myszy
    1. Wstrzyknąć 1 × 108 PFU wirusa dożylnie przez żyłę ogonową trzem 8-tygodniowym myszom BALB/C w celu oceny ostrej toksyczności.
    2. Monitorować myszy pod kątem zdarzeń niepożądanych, takich jak utrata masy ciała (>20%), zgarbiona postawa, zmarszczone futro, letarg i zmiany w oddychaniu. Oceniać trzy do czterech razy dziennie w ciągu pierwszych 48 h. Ponieważ myszy powinny zacząć wracać do zdrowia po 48 h, monitorować je raz lub dwa razy dziennie do czasu pełnego powrotu do zdrowia.
      1. Podawać sól fizjologiczną podskórnie i zapewnić opiekę wspomagającą w razie potrzeby. Na przykład uzupełniać dietę żelem regeneracyjnym, masłem orzechowym lub stosować podgrzewacze. Eutanazować myszy, które osiągnęły kryteria końcowe, zgodnie z instytucyjnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, poprzez przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie karku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pozyskiwanie płynu alantoicznego
Płyn alantoiczny pozyskiwany z zarodkowych jaj kurzych powinien być klarowny i przezroczysty. Jeśli płyn jest mętny i żółty, wskazuje to na obecność zanieczyszczeń. Włączenie takiego płynu alantoicznego do procesu oczyszczania utrudni tę procedurę, ponieważ ciśnienie szybko wzrośnie i przekroczy 10 psi, co doprowadzi do ścinania wirusa i utraty jego zakaźności. Płyn alantoiczny o krwawym wyglądzie sugeruje, że jaja zostały inokulowane zbyt dużą liczbą PFU wirusa. Wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wirusy stosowane jako środki terapeutyczne w badaniach przedklinicznych muszą być wysoce oczyszczone, aby uniknąć toksyczności podczas podawania in vivo15. Jeśli czynniki przypadkowe lub zanieczyszczenia nie zostaną usunięte, może to prowadzić do poważnych działań niepożądanych negujących efekt terapeutyczny czynnika wirusowego28. Ponieważ NDV jest wytwarzany w zarodkach jaj kurzych, istnieje kilka zanieczyszczających białek jaj, takich jak albumina jaja kurzego, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

J.G.E.Y otrzymał stypendium doktoranckie Ontario Veterinary College oraz stypendium dla absolwentów Ontario. Praca ta została sfinansowana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants dla SKW (grant #304737) i LS (grant #401127).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% HyClone TrypsynySH30042,02
1 ml strzykawka z końcówką ślizgowąBD309659
10 ml strzykawka Luer-LokBD302995
10% roztwór jodu powidonuLORIS109-08
15 ml probówki stożkoweThermo-Fisher14955240
18G x 1 1/2 cala igła do napełnianiaBD305180
18G x 1 1/2 cala Igła do precyzyjnego ślizguBD305196
Igła 25 G x 5/8 calaBD305122
2-merkaptoetanolThermo-Fisher03446I-100
30% akrylamid/roztwór bis 37,5:1BioRad1610158
4% paraformaldehyd-PBSThermo-FisherJ19943-K2
5 ml Luer-Lok StrzykawkaBD309646
96 dołków Płytka do hodowli tkankowych - Płaskie dnoGreiner Bio One655180
Kwas octowy, lodowatyThermo-FisherA38-212
AgarozaFroggabioA87-500G
Alexa-Fluor 488 Kozia Anty-MyszInvitrogenA11001
Wirówka Allegra X-14Beckman RedlicaB08861
Nadsiarczan amonuBioRad161-0700
Wybielacz (5%)Thermo-Fisher36-102-0599
Kleszcze szeroko, nieząbkowaneThermo-Fisher09-753-50
Bromofenol BlueSigma-Aldrich114405-25G
Centramate Uchwyt kasetyPALLCM018V
ChemiDoc XRS+BioRad1708265
Inkubator CO2 Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259Thermo-FisherBP101-50
DF1 CellsATCCCRL-12203
Żel dietetyczny do odzyskiwaniaClearH2O, INC72-01-1062
Cyfrowy inkubator jaj Sportsman 1502Berry Hill1502W
D-MannitolSigma-AldrichM4125-500G
Świecznik do jajBerry HillA46
Etanol (70%)Thermo-FisherBP82031GAL
Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), pH 8,0, 0,5 M w H2OThermo-FisherBP2482-500
Trójnik z gwintem wewnętrznym, nylon, 1/8 cala NPT(F)Cole-Parmer06349-50
Surowica bydlęcapłodu Gibco12483-020
KleszczeFine Point Thermo-Fisher22-327379
Mikroskop fluorescencyjnyZEISS AXIONiekonieczne, jeśli nie wykonuje IFA lub jeśli NDV nie koduje białka fluorescencyjnego
System liofilizacji Freezone 4.5LABCONCO
GiBOX Gel ImagerObrazowanie syngenetyczneżeli agarozowych
GlicerolThermo-FisherG33-1
GlicynaThermo-FisherBP381-5
Zestaw odwrotnej transkryptazy cDNA o dużej pojemnościThermo-Fisher4368814
Zmodyfikowana pożywka eteryczna Dulbecco o wysokiej zawartości glukozySH30022.01
Zestaw wilgotnościBerry Hill3030
JodixanolSigma-AldrichD155660% (w/v) roztwór jodiksanolu w wodzie (sterylny)
Monochlorowodorek L-lizynySigma-Aldrich62929-100G-F
Męski i żeński Luer-Lok 1/8 cala krajowy gwint rurowy, NPTCole-Parmer41507-44
Masterflex L/S Cyfrowy napędCole-ParmerRK-07522-20Pompa perystaltyczna z wyświetlaczem cyfrowym
Masterflex L/S Łatwe ładowanie Głowica pompy do przewodów precyzyjnychCole-ParmerRK-07514-10
Rurka silikonowa Masterflex (platynowa) L/S 16Cole-Parmer96420-16BioPharm Silikon utwardzany platyną
MC Pro 5 TermocyklerEppendorfEP950040025
MetanolThermo-FisherA412-4
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDUSDS-PAGE cast i działający appartus
Mouse-Anti-NDVNovus BiologicalsNBP2-11633Klon 6H12
Normalna surowica koziaAbcamAB7481
NP-40Thermo-Fisher85124
Kaseta centramate z membraną Omega LV, 100KPALLOS100T02
Optima XE-90 UltrawirówkaBeckman CoulterA94471
OWL Easycast B1A Mini żelowy system elektroforetycznyThermo-FisherB1A
PBS 10X RoztwórThermo-FisherBP399-20
Poli(glikol etylenowy) Średnia Mn 20 000Sigma-Aldrich81300-1KG
PowePac 300BioRadModel 1655050 - do elektroforezy w żelu agarozowym
Q5 High Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0492S
QIA Amp Viral RNA Mini KitQiagen52904
RedSafeThermo-Fisher50999562
Kaseta do dializy Slide-a-lyzer (dodatkowa moc), 10 000 MWCO 0,5-3 mlThermo-Fisher66380
Dodecyl siarczan soduThermo-FisherBP166-500
Wodorotlenek sodu (granulki)Thermo-FisherS318-10
Jaja wolne od specyficznych patogenówDostawca CFIANAbędzie się różnić w zależności od lokalizacji
SacharozaThermo-FisherS5-3
Supracap 50 Filtr wgłębnyPALLSC050V100P
NożyczkichirurgiczneThermo-Fisher08-951-5
Sw41Ti RotorBeckman Coulter331362Używany w kroku protokołu 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 RotorBeckman Coulter369702
SxX4750 Adapter do rur z konspiracyjnym dnemBeckman Coulter359472
TEMEDInvitrogen15524-010
Cienkościenne probówki wirówkowe Ultraclear ( 9/16 cala x 3 1/2 cala)Beckman Coulter344059
Tris BaseThermo-FisherBP152-5
Zacisk śrubowy do rurekPALL88216
Tween 20Sigma-AldrichP1379-1L
Manometry uniwersalneCole-Parmer68355-06
precyzyjne

Bibliografia

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219(2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335(2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekombinowany NDVfiltracja stycznaultrawirowanie w gradiencie gęstościkaseta do dializytesty kontroli jakościtest TCID50test immunofluorescencjizarodowane jaja kurze
Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.