Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Wirus rzekomego pomoru drobiu, znany również jako Ptasi Ortoawelwirus-1, jest otoczkowym paramyksowirusem ptaków, który może być stosowany zarówno jako wirus onkolityczny, jak i szczepionka wektorowa1^,2,3,4,5,6,7. Ostatnio NDV zmodyfikowany do ekspresji białka kolca SARS-CoV-2 został scharakteryzowany jako skuteczna szczepionka donosowa w modelach prowokacyjnych myszy i chomików^7,8,9. Stosowana jako immunoterapia nowotworów powoduje rekrutację wrodzonych komórek odpornościowych, w szczególności komórek NK naturalnych, produkcję interferonu typu I i wytwarzanie limfocytów T specyficznych dla nowotworu^10,11,12,13. Oprócz tych silnych właściwości immunostymulujących, NDV ma silny profil bezpieczeństwa i dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej^14,15. Te pożądane cechy skłoniły do oceny NDV w licznych badaniach przedklinicznych i klinicznych na ludziach (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Aby dalej rozwijać ten bardzo obiecujący, immunostymulujący wektor wirusowy, potrzebne są szczegółowe metody wytwarzania i oczyszczania ultraczystego NDV o wysokim mianie, który można bezpiecznie podawać in vivo.

Ponieważ NDV jest ptasim paramyksowirusem, najczęściej namnaża się w zarodkach jaj kurzych. Chociaż istnieją systemy komórkowe do rozmnażania NDV, większość z nich nie była w stanie wytworzyć mian podobnych do tych osiąganych w zarodkach jaj kurzych¹⁸. Niemniej jednak istnieją pewne wady produkcji NDV w jajach, w tym fakt, że produkcja na bazie jaj jest długotrwała i niełatwa do skalowania, pozyskiwanie dużych ilości jaj kurzych SPF może być problematyczne i istnieje możliwość zanieczyszczenia alergenami jaj^13,18,19,20. Ostatnio jedna grupa wykazała, że komórki Vero hodowane w zawiesinie w pożywce bez surowicy mogą wspierać replikację NDV do mian porównywalnych do tych osiąganych w jajach, przed oczyszczaniem²¹. Wymagało to jednak seryjnego przenikania wirusa w celu adaptacji wirusa do komórek Vero, a optymalizacja metody oczyszczania NDV z zawiesinowych komórek Vero jest nadal wymagana²¹.

Jak podkreślono wcześniej, metody używane do oczyszczania wirusa in vivo różnią się w zależności od wirusa, o którym mowa²². Istnieje dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej dostępny do wytwarzania rekombinowanego NDV. Proces ten, obejmujący wykorzystanie klonu cDNA, plazmidów pomocniczych i wirusa pomocniczego eksprymującego polimerazę RNA T7, został wcześniej szczegółowo opisany^15,23. Protokół ten może być stosowany zarówno do lentogennego, jak i mezogenicznego NDV. Wirus opisany w tym protokole jest rekombinowanym mezogenicznym NDV kodującym białko zielonej fluorescencji (GFP) z meduzy Aequorea victoria wstawione między geny wirusa P i M jako indywidualna jednostka transkrypcyjna, ponieważ zostało to wcześniej opisane jako optymalne miejsce dla insercji obcego transgenu²⁴.

Zamknięte metody opisują oczyszczanie NDV na podstawie jego rozmiaru, od 100 do 500 nm, oraz jego gęstości¹⁵. Pozwoliło to na wytworzenie in vivo stad NDV o wysokim mianie w ciągu około 3 tygodni, począwszy od momentu otrzymania jaj do uzyskania ostatecznego miana. Opisano techniki często stosowane w produkcji wirusów na bazie jaj na dużą skalę, takie jak filtracja z przepływem stycznym, filtracja wgłębna i ultrawirowanie w gradionym gradieniu gęstości, co umożliwia zastosowanie tych metod w produkcji na większą skalę. Poprzednio opisane techniki oczyszczania NDV zostały ulepszone poprzez włączenie buforu stabilizującego wirusa, zastosowanie jodiksanolu podczas ultrawirowania w gradiacji gęstości oraz opis różnych środków kontroli jakości w celu zapewnienia jakości in vivo¹⁵. Pozwoliło to na oczyszczenie NDV in vivo, osiągając miana tak wysokie, jak 3 ×^{10 10} PFU/ml od 0,8 do 1,0 l płynu omoczniowego.

Wszystkie prace związane z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Guelph zgodnie z Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami. Wszystkie prace wykonywane są w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) w Kanadzie, gdzie mezogeniczny NDV jest patogenem grupy ryzyka 2. Wszystkie kroki związane z amplifikacją i oczyszczaniem NDV powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu IIA ze względów bezpieczeństwa i sterylności.

1. Amplifikacja NDV przy użyciu zarodków jajowych wolnych od określonych patogenów

1. Inokulacja jaj kurzych z zarodkami SPF
   UWAGA: Zazwyczaj osiem tuzinów jaj kurzych z zarodkami SPF wykorzystuje się do wytworzenia jednej partii NDV klasy in vivo. Zamów jeden lub dwa tuziny dodatkowych jaj, aby uwzględnić uszkodzenia podczas transportu, a także zmienność żywotności. Zarodki kurze są materiałem biologicznym i należy z nimi obchodzić się zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Ponieważ jednak zarodki nie są wykluwane, zgoda instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami nie jest wymagana.
   1. Po otrzymaniu zarodków kurzych SPF inkubować w inkubatorze jaj w temperaturze 37 °C, wilgotności 60% przez 9 dni. Upewnij się, że inkubator jest ustawiony na automatyczne kołysanie/obracanie jaj co godzinę.
      UWAGA: Jaja można przechowywać w temperaturze pokojowej do 24 godzin lub w temperaturze 4 °C do 72 godzin; Może to jednak zmniejszyć żywotność zarodka.
   2. Po 8-11 dniach inkubacji (najlepiej w 9 dniu) należy zświecić jaja, aby określić żywotność zarodka. Szukaj unaczynienia przypominającego pajęczynę (Rysunek 1A) i ruchu zarodków jako wskaźników żywotnych zarodków. Pozbądź się jaj pozbawionych tych cech (Rysunek 1B).
   3. Na żywotnych jajach zaznacz ołówkiem granicę między workiem powietrznym a zarodkiem za pomocą znaku "X" (Ryc. 1A). Należy upewnić się, że to miejsce wstrzyknięcia nie spowoduje perforacji układu krwionośnego. Umieść oznaczone jaja z powrotem w inkubatorze na czas przygotowywania inokulum.
   4. Obliczyć ilość wirusa potrzebną do wstrzyknięcia wszystkich zarodków SPF jaj kurzych. zapewnić, aby każde jajo otrzymało 100 PFU wirusa w objętości 100 μl; rozcieńczyć wirusa w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stężenia 1 ×^{10 3} PFU/ml. Przygotuj dodatkowe 20% inokulum, aby uwzględnić niedokładności w podawaniu wirusa.
   5. Za pomocą chusteczki antystatycznej oczyść wierzchy oznaczonych jaj 10% roztworem jodu, rozcieńczonym w 70% etanolu. Odczekaj około 1-2 minuty, aż roztwór wyschnie.
   6. Ostrożnie przekłuj skorupę za pomocą sterylnej ostrej pęsety. Zdezynfekuj pęsetę w 70% etanolu między jajkami.
   7. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25 G wstrzyknąć 100 μl inokulum przygotowanego w kroku 1.1.4 do jamy kosmówkowo-omoczniowej (Rysunek 1C). Podejdź z igłą pod kątem prawie 90° do jajka. Wbić igłę tylko w górną część błony kosmówkowo-omoczniowej.
   8. Po zaszczepieniu użyj lakieru do paznokci, aby zakryć miejsce wkłucia i włóż jaja z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że ustawienie bujania jest włączone do 24 godzin po zaszczepieniu.
   9. Sprawdź żywotność jaj 24 godziny po inokulacji. Wyrzuć martwe jaja, które nie mają unaczynienia w błonie kosmówkowo-omoczniowej i ruchu zarodka (Rysunek 1B).
      UWAGA: Te jaja obumarły w wyniku procesu zaszczepiania, a nie z powodu NDV.
   10. Włóż jaja z powrotem do inkubatora, tak aby był wyłączony, aby zapobiec zanieczyszczeniu płynu omoczniowego białkami jaj.
   11. Sprawdzaj jaja co 12-24 godziny, jak opisano w kroku 1.1.9, aby zidentyfikować martwe jaja. Przenieś jaja, które umrą po 24 godzinach od inokulacji, do 4°C, aby zminimalizować autolizę. Zbierz płyn omoczniowy w ciągu 2-12 godzin od schłodzenia.
   12. Inkubować jaja przez co najmniej 72 godz.
       UWAGA: W przypadku rozmnażania mezogenicznego szczepu NDV optymalny czas inkubacji wynosi 60-72 godziny, ponieważ wydłużony czas inkubacji może pogorszyć proces oczyszczania ze względu na zmniejszoną klarowność płynu omoczniowego. Ta kwestia nie jest tak istotna w przypadku rozmnażania lentogennych szczepów NDV, ponieważ zabijanie zarodka zajmuje znacznie więcej czasu.
   13. Po odpowiednim okresie inkubacji przenieść pozostałe jaja do temperatury 4 °C na 2-12 godzin przed zbiorem płynu omoczniowego.
2. Zbieranie płynu omoczniowego zawierającego NDV
   1. Przenieś schłodzone jaja do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Oczyść wierzch jaj 70% etanolem.
   2. Użyj sterylnej pęsety i nożyczek chirurgicznych, aby rozbić wierzchołkową stronę jajka, w której znajduje się worek powietrzny.
   3. Zdejmij powłokę, aby odsłonić błonę kosmówkowo-omoczniową (Rysunek 1D).
   4. Ostrożnie przebij membranę i oderwij ją z powrotem, aby odsłonić jamę omocznikową (Rysunek 1E). Upewnij się, że woreczek żółtkowy nie zostanie przypadkowo przebity, ponieważ spowoduje to zepsucie jajka.
   5. Użyj kleszczy, aby chwycić zarodek i otworzyć worek embrionalny.
      UWAGA: Płyn wewnątrz worka embrionalnego zawiera również NDV.
   6. Wciśnij zarodek kleszczami i zbierz płyn omoczniowy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
   7. Płyn omoczniowy należy przechowywać na lodzie w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml do czasu klarowania.
      UWAGA: Jeśli płyn omoczniowy jest żółty, woreczek żółtkowy został naruszony i płyn omoczniowy należy wyrzucić.
   8. Odwirować stożkowe probówki zawierające płyn omoczniowy o stężeniu 1 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Punkt pauzy: Podwielokrotność oczyszczonego płynu omoczniowego rozlać do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania (np. tygodni do miesięcy), uzupełniając płyn sacharozą do końcowego stężenia 5% w celu ochrony wirusa przed ostrymi skutkami zamrażania i rozmrażania. Alternatywnie, w przypadku krótkotrwałego przechowywania (np. 1-3 dni), należy uzupełnić płyn omoczniowy sacharozą (końcowe 5%) lub 3x buforem mannitol-lizyna (ML) (15% mannitol, 3% lizyna; patrz tabela uzupełniająca S1 w celu uzyskania końcowego stężenia 1x (5% mannitolu, 1% lizyny) przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.

2. Oczyszczanie NDV z płynu omoczniowego

1. Filtracja wgłębna płynu omoczniowego
   1. Oczyszczony płyn omoczniowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić w temperaturze 4 °C na noc poprzedzającą oczyszczanie.
   2. W szafie bezpieczeństwa biologicznego ustaw rurkę i pompę perystaltyczną, jak pokazano na Rysunek 2.
   3. Jeśli jeszcze tego nie wykonano, połącz płyn omoczniowy z 3x ML buforu do końcowego stężenia 1x.
   4. Przed podłączeniem filtra wgłębnego należy wysterylizować rurkę, przepuszczając 50 ml 0,5 M NaOH przez system do naczynia na odpady.
   5. Przepłukać rurkę, przepuszczając 100 ml sterylnej wody molekularnej przez system i trafiając do naczynia na odpady.
      UWAGA: Ponieważ NaOH dezaktywuje NDV, ważne jest, aby linie zostały odpowiednio umyte przed wprowadzeniem płynu omoczniowego zawierającego wirusa.
   6. Zalać system, przepuszczając przez niego 50 ml PBS, zatrzymując pompę, gdy w probówce pozostało około 5 ml PBS.
   7. Przymocuj filtr wgłębny o współczynniku retencji 1-3 μM do rurki i zdejmij drugą nasadkę po wierzchołkowej stronie filtra wgłębnego, aby odpowietrzyć filtr. Rozpocznij przepuszczanie dodatkowych 50 ml PBS przez system.
   8. Gdy PBS zacznie przepływać przez otwór wentylacyjny w górnej części filtra, zamknij port i kontynuuj przepływ PBS przez przewody.
      UWAGA: Dopuszczalne są niewielkie pęcherzyki powietrza, ale obecność dużych ilości powietrza będzie wymagała ponownego odpowietrzenia filtra, jak opisano w krokach 2.1.7 i 2.1.8.
   9. Zatrzymać pompę, gdy w probówce pozostało około 5 ml PBS.
   10. Wymień naczynie na odpady na nowe sterylne naczynie zbiorcze i rozpocznij przepuszczanie płynu omoczniowego przez filtr wgłębny.
       UWAGA: Ciśnienie nie powinno przekraczać 10 psi, ponieważ powoduje to ścinanie wirusa. Ciśnieniem można manipulować, zmniejszając lub zwiększając natężenie przepływu pompy. Jeśli ciśnienie zacznie przekraczać 10 psi, a natężenie przepływu nie może być już zmniejszone, należy użyć nowego filtra wgłębnego. W takim przypadku kroki 2.1.6-2.1.8 należy wykonać przed wznowieniem przepływu płynu omoczniowego.
   11. Gdy cały płyn omoczniowy przejdzie przez filtr, przepuść 50 ml buforu 1x ML przez przewody, aby zmaksymalizować odzyskiwanie wirusa.
   12. Zbieraj płyn, aż linie wyschną. Wirusa należy przechowywać przez noc lub do 36 godzin w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: Po przefiltrowaniu wgłębnym wirusa kontynuuj proces oczyszczania w ciągu 36 godzin od zakończenia filtracji wgłębnej.
   13. Odłącz filtr wgłębny i zdezynfekuj rurkę, przepuszczając 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM wybielacza wstępnie podgrzanego do 42 °C przez system przed przechowywaniem w 0,5 M NaOH.
2. Filtracja o przepływie stycznym dla stężenia NDV
   1. Zmontuj elementy kasety, jak pokazano na Rysunek 3A (i jak pokazano wcześniej²⁵) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Kolektor i płytę końcową należy umyć w detergencie i wysuszyć przed użyciem. Uszczelki silikonowe są wielokrotnego użytku i powinny być przechowywane w 0,5 M NaOH wraz z kasetą.
   2. Ustaw system filtracji z przepływem stycznym (TFF) (znany również jako filtracja krzyżowa) w konformacji "otwartej" (Rysunek 3B).
      1. Jeśli używasz kasety po raz pierwszy, zmontuj kasetę TFF w konformacji elucyjnej i przepłucz 100 ml sterylnej wody molekularnej (Rysunek 3C).
      2. Gdy w zbiorniku pozostało tylko 5 ml wody, zatrzymaj pompę i zmień konfigurację systemu TFF na konformację zamkniętą (Rysunek 3D).
      3. Dodać 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM wybielacza podgrzanego do 42 °C do zbiornika i przechodzić przez system przez 30-60 minut.
      4. Wstrzymaj przepływ i przywróć system TFF do konfiguracji elucji, wznawiając przepływ w celu elucji roztworu czyszczącego.
      5. Gdy w zbiorniku pozostało około 5 ml, wstrzymaj pompę i dodaj 100 ml sterylnej wody molekularnej w celu przepłukania systemu.
      6. Gdy w zbiorniku pozostało około 5 ml, wstrzymaj pompę i umieść system TFF w otwartej konfiguracji (Rysunek 3B). Przejdź do kroku 2.2.3.
   3. Wysterylizuj kasetę i rurkę, przepuszczając 100 ml 0,5 M NaOH przez system za pomocą pompy perystaltycznej. Upewnij się, że ciśnienie nie przekracza 30 psi, aby zachować integralność kasety.
   4. Wstrzymaj pompę, gdy w zbiorniku pozostało około 5 ml 0,5 M NaOH
   .
   5. Dodaj 100 ml sterylnej wody molekularnej do zbiornika i wznów przepuszczanie płynu przez kasetę. Zakręć zbiornikiem, aby zmyć cały NaOH z boków zbiornika, aby zapobiec inaktywacji wirusa. Powtórz krok mycia zbiornika.
   6. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml sterylnej wody molekularnej, wstrzymaj pompę.
   7. Dodaj 100 ml PBS do zbiornika, mieszając, aby upewnić się, że sterylna, molekularna woda została zmyta z boków. Wznów przepływ cieczy przez kasetę.
   8. Gdy w zbiorniku pozostało około 5 ml, wstrzymaj pompę, dodaj do zbiornika przefiltrowany wgłębnie płyn omoczniowy i wznów przepływ pompy.
   9. Monitoruj manometr 1 (Rysunek 3B), aby upewnić się, że nie przekracza 10 psi, aby zapobiec ścinaniu wirusa. Użyj kombinacji prędkości pompy perystaltycznej i użycia zacisków C, aby zwiększyć elucję do odpadów.
      UWAGA: Połączenie prędkości pompy perystaltycznej i zacisków C spowoduje wzrost ciśnienia.
   10. Gdy w zbiorniku pozostanie 50-100 ml płynu omoczniowego, zatrzymaj pompę, aby przeprowadzić wymianę buforu, dodając 150-200 ml 1x ml buforu.
   11. Wznów przepływ pompy, ponownie monitorując manometr 1 (Rysunek 3B), aby upewnić się, że nie przekracza 10 psi.
   12. Gdy w zbiorniku pozostanie 5-10 ml, wstrzymaj pompę.
   13. Za pomocą dwóch zacisków C zamknij dwie linie odpływowe, jak pokazano na Rysunek 3C.
   14. Odłącz przewód retentatu zasilający zbiornik i włóż go do stożkowej rurki o pojemności 50 ml (Rysunek 3C).
   15. Wznów przepływ pompy, zatrzymując się, gdy w zbiorniku pozostanie kilka kropel płynu.
   16. Usuń zaciski C z przewodów odpływowych i ponownie podłącz przewód zasilający retentat do zbiornika (Rysunek 3B).
   17. Dodaj 20-25 ml buforu 1x ML i wznów przepływ pompy, aż w zbiorniku pozostanie około 5 ml.
   18. Powtórz kroki od 2.2.13 do 2.2.16.
       UWAGA:^{Trzecią elucję} można przeprowadzić, powtarzając kroki 2.2.17 i 2.2.13 do 2.2.16 w celu zwiększenia wydajności wirusa. Jednak większość wirusa jest obecna w pierwszych dwóch elucjach.
   19. Po zakończeniu elucji umieścić wirusa na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
   20. Aby oczyścić linie, skonfiguruj system tak, aby był to format zamkniętej pętli ( Rysunek 3D) z liniami odpływowymi odprowadzanymi z powrotem do zbiornika, jak pokazano na Rysunek 3D.
   21. Kontynuuj czyszczenie systemu, dodając 250 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM wybielacza podgrzanego do 42 °C.
   22. Przepuść roztwór czyszczący przez system przez noc.
       UWAGA: Podczas recyrkulacji roztworu czyszczącego, jeśli pompa pracuje z prędkością 50 ml/min, należy przestrzegać ciśnienia około 5 psi. Jeśli ciśnienie przekroczy to, kaseta jest brudna, a roztwór czyszczący należy wymienić i powtórzyć proces.
   23. Eluować roztwór czyszczący, kierując zarówno przewody odpływowe, jak i przewód retentatu do pojemnika na odpady.
   24. Dodać 400-500 ml sterylnej wody do zbiornika i przepuścić ją przez system do pojemników na odpady.
   25. Gdy w zbiorniku pozostanie około 5 ml, wstrzymaj pompę i dodaj 100-200 ml 0,5 M NaOH do zbiornika zbiornika, mieszając roztwór w celu umycia pojemnika zbiornika.
   26. Gdy zbiornik jest prawie pusty, powtórz krok 2.2.23 dodatkowo dwa razy.
   27. Zdemontuj zestaw TFF, przechowując kasetę TFF i uszczelki w małej objętości 0,5 M NaOH w zamykanej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: Rurki można przechowywać w temperaturze pokojowej zanurzone w 0,5 M NaOH.
3. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jodixanolu
   1. Włączyć ultrawirówkę i ustawić ją na wstępne schłodzenie do 4 °C. Wstępnie schłodzić również żądany wirnik w temperaturze 4 °C (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Wirniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Użyj podstawowego 60% roztworu jodiksanolu (stężenie w momencie zakupu), aby wytworzyć 40%, 20% i 10% roztwory jodiksanolu, rozcieńczając PBS i 3x ML Buffer do 1x końcowego stężenia buforu ML.
   3. W cienkościennej probówce ultrawirówki o pojemności 13,2 ml z otwartą górą nałóż 0,5 ml, 2,5 ml i 2,5 ml odpowiednio 40%, 20% i 10% roztworów jodiksanolu (Rysunek 4A).
      UWAGA: Przechylenie probówki ultrawirówki na bok i powolne wyrzucanie roztworu znacznie zmniejszy ryzyko wymieszania dwóch warstw gradientu. Separacja każdej warstwy powinna być widoczna, z widocznym "halo" pomiędzy każdą warstwą gradientu.
   4. Użyj markera, aby zaznaczyć interfejsy różnych warstw gradientu.
   5. Nałożyć warstwę 6-6,5 ml eluowanego wirusa z procedury TFF na gradieniu gęstości. Dodaj wirusa ostrożnie, jak opisano w kroku 2.3.3, aby uniknąć zakłócenia gradientu gęstości.
   6. Załaduj probówki ultrawirówki do wkładek do wahliwego wirnika kubełkowego (patrz Tabela materiałów) za pomocą skali otwartej, aby zrównoważyć wkładki w odległości 0,01 g od siebie. Użyj PBS lub dodatkowego eluentu wirusa, aby uwzględnić różnice w masie.
   7. Po wyważeniu rurek przykryj je i załaduj do wirnika.
   8. Wirować przez 1,5 h w temperaturze 125 000 × g w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Można to wykonać w nocy, jeśli dostępna jest ultrawirówka z funkcją opóźnionego startu.
   9. Po ultraodwirowaniu wyjmij probówki za pomocą sterylnych kleszczyków. Poszukaj pasma docelowego - dużego pasma - między gradientami od 10% do 20% (Rysunek 4B).
   10. Zawieś rurkę nad zlewką za pomocą stojaka na retortę.
   11. Podłącz igłę 18 G x 1,5 cala do strzykawki o pojemności 5 ml i nakłuj bok probówki ultrawirówki.
       UWAGA: Rurkę należy przebić nieco poniżej pasma docelowego, z igłą ustawioną pod kątem do góry i skosem do góry tak, aby wchodziła w pasmo docelowe.
   12. Powoli wysunąć tłok, aby usunąć pasmo docelowe.
       UWAGA: Przesuwaj igłę w paśmie docelowym, aby zmaksymalizować wyekstrahowany wirus. Należy uważać, aby inne pasma lub zanieczyszczenia nie zmieszały się z pasmem docelowym i należy unikać przyjmowania nadmiaru roztworu, ponieważ doprowadzi to do użycia większej liczby kaset do dializy.
   13. Po wyjęciu pasma docelowego wyjąć igłę i pozwolić, aby pozostały roztwór spłynął do zlewki na odpady. Dozuj pasmo docelowe do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aż wszystkie pasma ze wszystkich innych probówek ultrawirówek zostaną wyekstrahowane.
   14. Powtarzać kroki 2.3.10-2.3.13, aż wszystkie pasma docelowe zostaną wyekstrahowane ze wszystkich probówek ultrawirówek.
   15. Alternatywne podejście do wyodrębniania pasm docelowych zgodnie z opisem w krokach od 2.3.10 do 2.3.13
       1. Powoli usuń płyn pokrywający pasmo docelowe za pomocą pipety. Po dotarciu do pasma docelowego wyekstrahować za pomocą pipety i przechowywać wirusa w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
          UWAGA: Pozwala to na ponowne użycie probówek ultrawirówek.
4. Usunięcie jodiksanolu z roztworu wirusa
   UWAGA: Pasmo zawierające NDV pojawia się przy gęstości jodiksanolu między 15% a 16%. Stężenie jodeksanolu w roztworze można oznaczyć, mierząc absorbancję przy 340 nm w odniesieniu do krzywej wzorcowej (rysunek uzupełniający S1). Ten etap można pominąć, ponieważ nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych ani ostrej toksyczności po podaniu myszom C57BL/6 roztworów jodiksanolu o tym stężeniu.
   1. Wstępnie zwilż kasetę dializacyjną o masie cząsteczkowej 0,5-3 ml 10 kDa, zanurzając ją w PBS na 1 min.
      UWAGA: Membrana dializy powinna zmienić kolor z gładkiego na pomarszczony lub wyboisty. Jeśli objętość wyekstrahowanego wirusa przekracza 10 ml, należy użyć dwóch kaset dializacyjnych o pojemności 0,5-3 ml lub kasety dializacyjnej o pojemności 5-12 ml.
   2. W razie potrzeby należy użyć strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml i igły o wymiarach 18 G x 1,5 cala, aby pobrać wirusa ze stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   3. Za pomocą strzykawki wprowadzić do kasety dializy, uważając, aby nie przebić błony, i wstrzyknąć wirusa.
      UWAGA: Kasetę do dializy można obracać, aby manipulować położeniem kieszeni powietrznej w kasecie. Kieszeń powietrzną należy usunąć przed wyjęciem igły z kasety.
   4. Napełnij zlewkę o pojemności 1 l sterylnym 1x PBS, umieść w niej mieszadło i kasetę do dializy i przykryj. Inkubować w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
      UWAGA: Użyj ekstrudowanej pianki polistyrenowej i elastycznej opaski, aby przymocować kasetę do dializy, tak aby unosiła się w PBS. Kaseta może nieznacznie pęcznieć z powodu bufora ML.
   5. Po 1-2 godzinach zastąpić świeżym 1x PBS i kontynuować inkubację w temperaturze 4 °C przez kolejne 8-10 godzin, lekko mieszając.
      UWAGA: Można to również zrobić w nocy.
   6. Zastąp ponownie świeżym 1x PBS, inkubując w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny.
5. Stężenie roztworu wirusa
   1. Wyjmij kasetę dializacyjną z bufora do dializy (Rysunek 4C) i umieść ją w małej, zamykanej plastikowej torbie. Dodaj 15-25 ml 40% glikolu polietylenowego o mocy 20 000 MW, aby kaseta dializy była całkowicie zanurzona.
   2. Inkubować w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Okresowo sprawdzaj objętość wirusa w kasecie za pomocą strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml i igły o wymiarach 18 G x 1,5 cala.
      UWAGA: Czas potrzebny do skoncentrowania wirusa będzie się różnić w zależności od objętości początkowej i pożądanej objętości końcowej. Zazwyczaj ostateczna pożądana objętość wynosi od 1 do 1,5 ml, niezależnie od początkowej objętości płynu omoczniowego. Podczas sprawdzania woluminu należy uważać, aby nie używać tego samego portu, ponieważ naruszy to integralność portu i może spowodować zmieszanie roztworu glikolu polietylenowego z wirusem.
   3. Przed usunięciem skoncentrowanego wirusa z kasety dializacyjnej należy krótko przepłukać kasetę w 1x PBS i napełnić igłę o wymiarach 18 G x 1,5 cala powietrzem.
   4. Włożyć strzykawkę wypełnioną powietrzem do kasety dializacyjnej i wcisnąć tłok. Obrócić aparat tak, aby skoncentrowany wirus mógł zostać usunięty bez usuwania wprowadzanego powietrza.
   5. Dozować skoncentrowany wirus do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, zwracając uwagę na dozowaną objętość.
   6. Za pomocą tej samej strzykawki i igły wstrzyknąć odpowiednią ilość 60% sacharozy do kasety dializy, tak aby w połączeniu z wcześniej usuniętym wirusem osiągnął końcowe stężenie 5% sacharozy.
   7. Palcami w rękawiczkach masuj błonę, aby usunąć resztki wirusa, które mogły przylgnąć do membrany, uważając, aby jej nie uszkodzić. Usuń część nadmiaru powietrza z kasety dializycznej, aby ułatwić proces usuwania.
   8. Połączyć ten płyn z wirusem znajdującym się już w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Wirus jest obecnie w 5% sacharozie i jest gotowy do dozowania w podwielokrotnościach 20 μl, 50 μl, 100 μl lub 200 μl i przechowywany w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, w przypadku długotrwałego przechowywania, NDV może być liofilizowany i przechowywany w temperaturze 4 °C, jak opisano w sekcji 2.6.
6. Liofilizacja NDV
   1. Liofilizować wirusa w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml lub stożkowych probówkach o pojemności 15 ml w temperaturze 44 × ^10-3 MBAR i temperaturze -52 °C przez 16 godzin.
   2. Przechowywać liofilizowane próbki w temperaturze 4 °C bez znacznego obniżenia miana wirusa.

3. Testy kontroli jakości

1. Izolacja wirusowego RNA i PCR z odwrotną transkrypcją w celu potwierdzenia genomu
   1. Rozmrozić 20 μl podwielokrotności wirusa. Postępuj zgodnie z protokołem izolacji wirusowego RNA dostarczonym z zestawem.
   2. Wyizolowany RNA należy natychmiast użyć jako matrycy do PCR Z ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR) lub przechowywać go w temperaturze -80 °C.
   3. Przygotować reakcje odwrotnej transkrypcji zgodnie z opisem w protokole dostarczonym przez producenta.
   4. Otrzymany cDNA należy wykorzystać jako matrycę do różnych reakcji PCR kontroli jakości w celu potwierdzenia patotypu NDV (tabela 1, zestaw starterów białka F) i obecności wymaganych elementów kontroli genów (tabela 1, zestaw starterów transgenicznych).
      UWAGA: Podkłady powinny być projektowane w oparciu o rozmnażany szczep NDV.
      1. Aby zsekwencjonować miejsce rozszczepienia białka F, główne wyznacznik patotypu, należy użyć zestawu starterów białka F (Tabela 1). Poszukaj produktu PCR o długości 435 par zasad.
         UWAGA: W tym przypadku startery zostały zaprojektowane w oparciu o szczep LaSota NDV (akcesja Genbank AF077761.1). Powszechnie wiadomo, że optymalna ekspresja transgenu zachodzi, gdy obcy transgen jest wstawiany między geny P i M²⁴.
      2. Użyj zestawu starterów transgenu, aby potwierdzić integralność elementów początkowych i końcowych genu transgenu. Sekwencjonuj produkt PCR, aby potwierdzić integralność sekwencji początkowej i końcowej genu.
   5. Wyślij produkty PCR do sekwencjonowania DNA i porównaj je z matrycą do homologii.
2. SDS PAGE i barwienie Coomassie w celu wykrycia zanieczyszczających białek
   1. Odlewać żel SDS PAGE z gradientem gęstości, przygotowując najpierw 6% i 15% roztwory poliakrylamidu (tabela uzupełniająca S1). Za pomocą pipety o pojemności 10 ml pobrać 5 ml 15% roztworu, a następnie 5 ml 6% roztworu.
   2. Wyjąć pipetę z roztworu i wytworzyć pęcherzyk powietrza, krótko wciągając powietrze.
      UWAGA: Gdy pęcherzyk powietrza przemieszcza się w górę, roztwór miesza się, tworząc gradient SDS PAGE.
   3. Dozować roztwór do aparatu odlewniczego i pozostawić do zestalenia się przez 30 minut.
   4. W końcowej objętości 20 μl połączyć podwielokrotność wirusa z 4x buforem redukującym (tabela uzupełniająca S1) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1x, i gotować przez 10 minut w temperaturze 95 °C w termocyklerze. Załaduj co najmniej 1 ×^{10 7} PFU wirusa.
   5. Zanurz SDS PAGE w uruchomionym buforze (tabela uzupełniająca S1) i załaduj próbki.
   6. Uruchom żel pod napięciem 120 V przez 1-1,5 godziny.
   7. Wyjąć żel z buforu do pracy i przenieść go do mniejszego pojemnika.
   8. Dodaj roztwór barwiący Coomassie (tabela uzupełniająca S1), aby pokryć żel. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4-5 godzin.
   9. Usunąć roztwór barwiący i dodać roztwór odbarwiający (tabela uzupełniająca S1), inkubując przez 4-8 godzin w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Zmień roztwór do usuwania plam trzy do czterech razy.
      UWAGA: Żel powinien być przezroczysty, a jego kolor powinien być taki, jaki był przed barwieniem.
   10. Wyobraź sobie żel na ustawieniu kolorymetrycznym. Zobacz Rysunek 5 dla reprezentatywnego obrazu poplamionego Coomassie żelu SDS PAGE zawierającego próbki płynu omoczniowego i oczyszczonego wirusa.
3. Oznaczanie ilościowe miana wirusa zakaźnego na podstawie mediany dawki zakaźnej w hodowli tkankowej (TCID₅₀) i testu immunofluorescencyjnego
   UWAGA: Ogniwa Vero mogą być używane jako alternatywa dla komórek DF1; jednak efekt cytopatyczny (CPE) jest mniej wyraźny w komórkach Vero. NDV zawierający mutację L289A, która zwiększa fuzogeniczność, i ekspresję GFP między genami P i M jest stosowany w tym teście.
   1. Wysiewaj 96-dołkową płytkę komórek DF1 w 20 000 komórek / basenie w objętości 80 μl dzień przed użyciem DMEM uzupełnionego 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 125 μg / ml trypsyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Następnego dnia rozmrozić na lodzie 20 μl porcji wirusa.
   3. Użyj probówek o pojemności 1,5 ml do przygotowania seryjnych rozcieńczeń. Rozpocząć od rozcieńczenia 10 μl wirusa 990 μl PBS w celu przygotowania rozcieńczenia ^10-2. Przygotować wszystkie inne rozcieńczenia, co najmniej do ^10-10, sporządzone z 900 μl PBS i dodatkiem 100 μl poprzedniego rozcieńczenia.
      UWAGA: Używaj nowej końcówki do pipet podczas przechodzenia między rozcieńczeniami.
   4. Użyj 20 μl każdego rozcieńczenia, aby zainfekować każdą studzienkę 96-dołkowej płytki, jak pokazano na Rysunek 6.
      UWAGA: Ostateczna objętość w każdej studzience wyniesie 100 μL.
   5. Inkubować płytkę przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed badaniem na obecność CPE/GFP lub przeprowadzaniem pośredniego testu immunofluorescencyjnego (IFA).
      UWAGA: W tych warunkach hodowli CPE jest widoczne po 10 godzinach (Rysunek 7A-D), wzrastając w ciągu następnych 24 godzin (Rysunek 7E-H). Płytka może być inkubowana dłużej, aby poprawić intensywność CPE, jeśli punktacja za pomocą GFP lub CPE.
      1. Jeśli punktacja według CPE lub GFP i NIE wykonujesz IFA, przejdź do kroku 3.3.18.1.
   6. W przypadku wykonywania IFA przepłucz komórki dwukrotnie 100 μl 1x PBS.
   7. Do każdej studzienki dodać 100 μl 4% paraformaldehydu rozcieńczonego w PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Umyj komórki 3x 5 min każda 100 μL 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
   9. Przepuszczalność komórek przez dodanie 100 μl 0,1% NP-40 do PBS i inkubację w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   10. Umyj komórki 3x 5 min 100 μl 0,1% PBS-T.
   11. Dodać 100 μl buforu blokującego składającego się z 5% (V/V) normalnej surowicy koziej rozcieńczonej w 0,1% PBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   12. Dodać 100 μl na studzienkę pierwotnego mysiego przeciwciała anty-NDV przeciwko rybonukleoproteinie rozcieńczonego w 0,1% PBS-T do 1 μg/ml, inkubując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   13. Myj komórki 3x przez 5 min w 100 μL 0,1% PBS-T.
   14. Dodać 100 μl drugorzędowego przeciwciała przeciw mysim przeciwciału przeciw mysim AlexaFluor 488 rozcieńczonym w 0,1% PBS-T do 2 μg/ml. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   15. Myj komórki 3x przez 5 min w 100 μL 0,1% PBS-T.
   16. Po ostatnim umyciu pozostaw komórki w 100 μL 0,1% PBS-T.
   17. Zobrazuj studnie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
   18. Podczas wykonywania IFA należy zwrócić uwagę na fluorescencję większą niż obserwowana w studzienkach kontroli ujemnej, co wskazuje, że studnia jest dodatnia dla NDV, jak pokazano na Rysunek 8.
       1. Szukaj obecności syncytii i dużych, zaokrąglonych komórek, które charakteryzują NDV CPE. W przypadku punktacji studzienek zakażonych wirusem wykazującym ekspresję GFP, należy zwrócić uwagę na obecność GFP.
   19. Wprowadź odpowiednie informacje do kalkulatora miana Spearmana-Karbera²⁶, aby określić PFU/ml wirusa (Tabela 2). Zobacz Rysunek 6 dla przykładowej płytki mianowania TCID₅₀.
4. Kwantyfikacja miana wirusa metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
   UWAGA: Zalecany jest jednoetapowy zestaw qRT-PCR, aby zaoszczędzić czas i ograniczyć manipulację próbkami. Test oparty na sondzie służy do zwiększenia swoistości wykrywania sekwencji wirusa.
   1. Utwórz krzywą wzorcową dla znanej ilości sekwencji wirusa (rysunek uzupełniający S2A,B).
      UWAGA: Można to zrobić, kupując syntetyczny dwuniciowy fragment DNA genu NDV L o długości 500 pz. Sekwencję dla 500 pz fragmentu genu NDV L można zobaczyć na rysunku uzupełniającym S2C.
   2. Przelicz ilość fragmentu DNA wirusa (zwykle podawanego przez producentów w postaci nanogramów lub femtomoli) na liczbę cząsteczek lub kopii fragmentu DNA, używając wzoru na liczbę Avogadro i liczbę moli na cząsteczki (Równanie (1)).
      (1)
   3. Przygotować próbki krzywej wzorcowej, przygotowując dziesięciokrotną serię rozcieńczeń kopii znanych fragmentów DNA wirusa, zaczynając od 1,00 × 10 kopii do 1,00 × 10 0 kopii.
   4. Aby określić ilość RNA NDV w nieznanych próbkach, należy wyekstrahować RNA NDV za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Postępuj zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawem. Po ekstrakcji RNA postępuj zgodnie z zalecanym protokołem zawartym w jednoetapowym zestawie qRT-PCR.
   5. Przeprowadź reakcje w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym z następującą temperaturą i warunkami cyklicznymi: 1) jeden cykl odwrotnej transkrypcji w temperaturze 55 °C przez 10 minut; 2) jeden cykl wstępnej denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 min; oraz 3) 40 cykli denaturacji (95 °C przez 10 s), przedłużenia (60 °C przez 30 s) i akwizycji sygnału fluorescencyjnego.
   6. Po zakończeniu testu qRT-PCR wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie próbek z krzywej wzorcowej za pomocą oprogramowania przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym (rysunek uzupełniający S2A,B).
      UWAGA: Oprogramowanie obliczy również ilość RNA NDV w nieznanych próbkach na podstawie krzywej standardowej.
5. Badania bezpieczeństwa toksyczności ostrej u myszy
   1. Wstrzyknąć 1 × 10⁸ PFU wirusa dożylnie przez żyłę ogonową trzem 8-tygodniowym myszom BALB/C w celu oceny ostrej toksyczności.
   2. Monitoruj myszy pod kątem zdarzeń niepożądanych, takich jak utrata masy ciała (>20%), zgarbiona postawa, potargana sierść, letarg i zmiany w oddychaniu. Oceniaj trzy do czterech razy dziennie przez pierwsze 48 godzin. Ponieważ myszy powinny zacząć wracać do zdrowia po 48 godzinach, monitoruj je od jednego do dwóch razy dziennie, aż do całkowitego wyzdrowienia.
      1. W razie potrzeby podawać sól fizjologiczną podskórnie i leczenie wspomagające. Na przykład uzupełnij żelem dietetycznym regeneracyjnym, masłem orzechowym lub użyj krążków rozgrzewających. Eutanazja myszy, które osiągnęły kryteria punktu końcowego, określone w wytycznych instytucjonalnych dotyczących opieki nad zwierzętami, poprzez przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

Zbieranie płynu omoczniowego
Ponieważ płyn omoczniowy jest pobierany z zarodków jaj kurzych, powinien wydawać się klarowny i przezroczysty. Jeśli płyn wydaje się nieprzezroczysty i żółty, oznacza to obecność zanieczyszczeń. Włączenie tego płynu omoczniowego podczas oczyszczania utrudni proces oczyszczania, ponieważ ciśnienie szybko wzrośnie i przekroczy 10 psi, co spowoduje ścinanie wirusa i utratę zakaźnego wirusa. Płyn omocznikowy, który wydaje się krwawy, sugeruje, że jaja zostały zaszczepione zbyt dużą ilością PFU wirusa. Wydajność z tej partii jaj będzie znacznie niższa niż oczekiwano i jest mało prawdopodobne, aby wirus ten mógł być wykorzystany in vivo. Jaja zaszczepione lentogennym NDV powinny nadal mieć widoczne unaczynienie po 72 godzinach, a zarodki nie powinny były umrzeć, jak pokazano na Rycina 1. Jeśli tak, sugeruje to, że zarodek został w jakiś sposób uszkodzony lub zanieczyszczony.

Ultrawirowanie w gradimencie gęstości jodixanolu
Po ultrawirowaniu między gradientami od 10% do 20% powinno znajdować się białe pasmo o wysokim mianie, zawierające NDV (Rysunek 4B).

Coomassie plama żeli SDS-PAGE
Rysunek 5 pokazuje różnicę między nieoczyszczonym (Tor 2) a oczyszczonym wirusem (Tor 3). Porównanie tych dwóch zjawisk wskazuje na znaczny spadek intensywności zanieczyszczających prążków białkowych i pojawienie się dominujących prążków NDV w oczyszczonym wirusie.

Kwantyfikacja miana wirusa za pomocą TCID50
W przypadku stosowania zalecanych warunków podczas mianowania skoncentrowanego stada NDV, CPE powinno być widoczne po 24 godzinach (Rysunek 6). W porównaniu ze szczepem lentogenicznym NDV o podobnym mianie, CPE jest bardziej wyraźny w szczepie mezogenicznym w tym samym punkcie czasowym.

Analiza toksyczności ostrej u 8-tygodniowych myszy BALB/C
Gdy 1 ×10 8 PFU podawano dożylnie, myszy powinny być monitorowane pod kątem działań niepożądanych, takich jak utrata masy ciała >20%, potargana sierść, zgarbiona postawa i nieprawidłowe oddychanie. W ciągu pierwszych 24-36 godzin myszy zaczną tracić na wadze i prawdopodobnie rozwiną potarganą sierść i zgarbioną postawę. Jeśli jednak wirus jest wystarczająco czysty, myszy zaczynają wracać do zdrowia, co obserwuje się po przybraniu na wadze oraz poprawie postawy i stanu sierści po 36 godzinach. Myszy, które nie wykazują tych oznak powrotu do zdrowia w ciągu 36 godzin, powinny być nadal ściśle monitorowane pod kątem kryteriów punktu końcowego. Zazwyczaj dzieje się tak z powodu niedokładnego titteringu, potencjalnie z powodu agregacji cząsteczek wirusa.

Rysunek 1: Zakażenie i zbiór NDV z określonych zarodków jaj kurzych wolnych od patogenów. (A) Pajęczynopodobne unaczynienie (strzałki), które powinno być widoczne po 9 dniach inkubacji oprócz ruchu zarodka. "X" oznacza granicę faz między błoną kosmówkowo-omoczniową a jamą powietrzną oraz miejsce, w którym powinien zostać utworzony otwór do zaszczepienia komórki jajowej. (B) Obraz przedstawiający martwy embrion. Zwróć uwagę na brak unaczynienia przypominającego pajęczynę. Zaobserwuje się również brak ruchu zarodka. (C) Schemat składników zarodka jaja kurzego przedstawiający położenie jamy powietrznej, woreczka żółtkowego, worka owodniowego, błony kosmówkowo-omoczniowej i płynu omoczniowego. (D) Usunięcie skorupy w celu odsłonięcia błony kosmówkowej. (E) Ilustruje, jak powinien wyglądać płyn omoczniowy i zarodek po otwarciu błony kosmówkowej omoczniowej. Skrót: NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat przedstawiający ogólny montaż urządzenia używanego do filtracji wgłębnej. Upewnij się, że manometr jest zainstalowany przed filtrem wgłębnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Konfiguracja filtracji o przepływie stycznym w różnych konfiguracjach. Strzałki wskazują kierunek przepływu płynu. (A) Ilustracja przedstawiająca sposób montażu kasety TFF. (B) Schemat układu TFF w jego "otwartej" konfiguracji używanej podczas oczyszczania i zagęszczania płynu. (C) Schemat konfiguracji TFF, gdy płyn jest eluowany z układu, jak podczas elucji wirusa i roztworu czyszczącego. (D) Schemat systemu TFF w jego "zamkniętej" konfiguracji, który jest używany podczas czyszczenia systemu TFF. Skrót: TFF = filtracja o przepływie stycznym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ultrawirowanie i dializa skoncentrowanego wirusa z TFF za pomocą gradientu gęstości. (A) Schemat przedstawiający skład gradientu gęstości jodoksanalu. (B) Wzór pasmowania wirusa po ultrawirowaniu wirusa wytworzonego przy użyciu bufora ML podczas procesu oczyszczania. Główne pasmo zawierające wirusa jest oznaczone czarnym owalem. (C) Typowy rozmiar kasety dializacyjnej wypełnionej 10 ml wirusa przygotowanego za pomocą gradientu jodiksanolu na końcu procedury dializy. Skrót: TFF = filtracja z przepływem stycznym; ML = mannitol-lizyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Żel SDS-PAGE barwiony Coomassie. Żel porównuje obecność białek zanieczyszczających między nieoczyszczonymi (tor 2) i oczyszczonymi (tor 3) mezogenicznymi stadami NDV, gdy załadowano 1 × 105 PFU. Pasy 1 i 4 = drabina masy cząsteczkowej (MW). NDV HN, F0 i jego podjednostki po rozszczepieniu, F1 i F2, wraz z ich odpowiednimi masami cząsteczkowymi27 są pokazane białą czcionką. Skróty: SDS-PAGE = elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu; NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu; PFU = jednostki tworzące płytkę nazębną; HN = hemaglutynina; F0 = Fuzja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykład układu płytki 96-dołkowej użytej do określenia miana wirusa na podstawie TCID50. Płytka jest podzielona na 12 kolumn, z których każda reprezentuje inne rozcieńczenie szeregowe. Dołki dodatnie (określone przez CPE, ekspresję transgenu lub IFA) są oznaczone kolorem szarym. Biorąc pod uwagę liczbę dołków dodatnich w tym przykładzie, oczekiwane miano po użyciu kalkulatora miana Spearmana-Karbera (tabela 2) jest wymienione zarówno w TCID50/mL, jak i PFU/ml. Skróty: TCID50 = mediana dawki zakaźnej w hodowli tkankowej; CPE = efekt cytopatyczny; IFA = test immunofluorescencyjny; PFU = jednostki tworzące płytkę nazębną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Porównanie CPE po zakażeniu komórek DF1 lentogenicznym lub mezogennym NDV. MOI 0,5 zastosowano po 10 godzinach inkubacji (A-D) lub 24 godzinach inkubacji (E-H) w różnych warunkach hodowli DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% płynu omoczniowego lub DMEM + 2% FBS + 125 μg / ml trypsyny. Podziałka = 200 μm. Skróty: CPE = efekt cytopatyczny; NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu; MOI = mnogość infekcji; FBS = płodowa surowica bydlęca; DMEM = Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Przykład sytuacji, w której IFA jest potrzebne do mianowania lentogenicznego NDV bez transgenu GFP. Komórki Vero hodowano w DMEM zawierającym 2% FBS i 125 μg/ml trypsyny. Zdjęcia zostały wykonane z rozcieńczenia szeregowego 10-7. (A) Obraz zainfekowanych komórek w jasnym polu. (B) Ilustruje typowy wygląd barwionych komórek, gdy IFA jest używany do wykrywania wirusa. (C) Scalony obraz (A) i (B). Podziałka = 100 μm. Skróty: IFA = test immunofluorescencyjny; NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu; GFP = białko zielonej fluorescencji; FBS = płodowa surowica bydlęca; DMEM = Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Startery PCR i RT-qPCR do wykrywania segmentów genów wirusa rzekomego pomoru drobiu. Zestawy starterów używane do specyficznej amplifikacji dwóch regionów genomu NDV. Zestaw starterów białka F powoduje amplifikację regionu białka F, który obejmuje miejsce cięcia białka F. Zestaw starterów transgenicznych amplifikuje region międzygenowy między genami fosfoproteiny a genami macierzy, optymalnym miejscem insercji transgenu. Poniższa tabela zawiera również sekwencje starterów, które są ukierunkowane na wirusowy gen L21 oraz sondę genu L używaną w teście qRT-PCR. Skróty: PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; RT-qPCR = ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją; NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kalkulator miana Spearmanna-Karbera. Ten interaktywny arkusz kalkulacyjny zawiera odpowiedni przepływ pracy i równania do określania stężenia wirusa na podstawie wyników TCID50 w oparciu o inokulum studzienne w ml, schemat rozcieńczenia i liczbę powtórzeń na rozcieńczenie. Stężenie podaje się jako objętość w ml wymaganą do zakażenia 50% hodowli tkankowej (TCID50) i jednostek tworzących blaszki na ml zawiesiny wirusa. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający S1: Oznaczanie stężeń jodiksanolu. (A) Krzywa wzorcowa uzyskana z absorbancji roztworów o znanym stężeniu jodiksanolu przy 340 nm. (B) Krzywą wzorcową i równanie z (A) wykorzystano do określenia stężenia jodiksanolu w roztworze po ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, dializie i stężeniu glikolu polietylenowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Amplifikacja i krzywa standardowa wygenerowana z testu qRT-PCR syntetycznego dwuniciowego fragmentu DNA 500 pz genu NDV L. Amplifikację (A) i krzywą wzorcową (B) utworzono z próbek zawierających dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie (1,0 × 109 kopii do 1,0 × 100 kopii) fragmentu DNA. Dla amplifikacji i krzywej standardowej próbki zawierające 1,0 ×10 1 kopii i 1,0 × 100 kopii znajdowały się poniżej progu i nie dawały wartości punktu przecięcia poniżej 35 Cp. Ostateczna krzywa wzorcowa została wygenerowana na podstawie próbek zawierających 1,0 ×10 9 kopii do 1,0 × 102 kopii fragmentu DNA. (C) Sekwencja DNA 500-nukleotydowego fragmentu genu NDV L użytego do wygenerowania krzywej wzorcowej w protokole qRT-PCR. Skróty: PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; RT-qPCR = ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją; NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu; Cp = punkt przecięcia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Ładowanie i ekstrakcja NDV z kasety dializy. (A) Typowy rozmiar kasety dializacyjnej po załadowaniu około 10 ml roztworu zawierającego wirusa, wyizolowanego z gradientu gęstości sacharozy i zobrazowanego na końcu etapu dializy. (B) Przykład wyników uzyskanych przy zastosowaniu ultrawirowania w gradionym poziomie gęstości jodiksanolu bez suplementacji buforem ML. W pobliżu znajduje się docelowe pasmo wirusa do usunięcia. Strzałki wskazują dodatkowe pasmo, które może zawierać uszkodzone wiriony. Należy pamiętać, że po włączeniu buforu ML w procesie oczyszczania, pasmo to nie jest już widoczne. Skróty: NDV = wirus rzekomego pomoru drobiu; ML = mannitol-lizyna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Zawiera kroki wymagane do wytworzenia roztworów western blot i bufora ML używanych podczas procesu oczyszczania. Skróty: SDS-PAGE = elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu; TEMED = tetrametyloetylenodiamina; ML = mannitol-lizyna. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.