Wykonano iniekcje doszklistkowe w oku owcy w celu dostarczenia wirusowej terapii genowej do siatkówki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcje doszklistkowe do oka owcy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje kilka metod dostarczania środków terapeutycznych do siatkówki, w tym doszklistkowe (IVT), podsiatkówkowe, naczyniówkowe, okołogałkowe lub miejscowe. Podawanie leku IVT polega na wstrzyknięciu do ciała szklistego oka, galaretowatej substancji, która wypełnia tylną komorę oka i utrzymuje kształt gałki ocznej. Chociaż droga IVT jest mniej specyficznie ukierunkowana niż dostawa podsiatkówkowa, jest znacznie mniej inwazyjna i jest szeroko stosowana w warunkach klinicznych w przypadku wielu chorób oczu.
Wcześniej wykazaliśmy skuteczność doszklistkowego dostarczania produktu terapii genowej za pośrednictwem wirusa adenowirusowego (AAV) (AAV9). CLN5) u owiec z naturalnie występującą postacią ceroidowej lipofuscynozy neuronalnej CLN5 (NCL). Owce dotknięte chorobą otrzymały terapię genową IVT w jednym oku, a drugie, nieleczone oko służyło jako kontrola wewnętrzna. Struktura i funkcja siatkówki utrzymywały się w leczonym oku do 15 miesięcy po leczeniu, podczas gdy nieleczone oko wykazywało postępującą pogarszającą się funkcję i ciężką atrofię podczas badania pośmiertnego. Na podstawie badań na owcach, produkt terapii genowej CLN5 został zatwierdzony jako kandydat na nowy lek eksperymentalny (IND) przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków we wrześniu 2021 r. W artykule szczegółowo opisano protokół chirurgiczny dostarczania terapeutycznego wektora wirusowego do oka owcy za pomocą IVT.
Wprowadzenie
Kilka metod może być użytych do dostarczania środków terapeutycznych do siatkówki, w tym doszklistkowe (IVT), podsiatkówkowe, naczyniówkowe, okołogałkowe lub miejscowe. Każda droga podania obejmuje pokonywanie barier, takich jak bariera krew-siatkówka lub wewnętrzna i zewnętrzna błona ograniczająca, i ma różne wskaźniki skuteczności w zależności od podawanego leku i konkretnego celu siatkówki1,2.
Dostarczanie leków IVT polega na wstrzyknięciu do ciała szklistego oka, galaretowatej substancji, która zajmuje tylną komorę oka. Podstawową funkcją ciała szklistego jest utrzymanie kształt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. zwierząt Uniwersytetu w Lincoln i są zgodne z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) USA dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach oraz nowozelandzką ustawą o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act z 1999 r.). Owce rasy Borderdale zdiagnozowano przy urodzeniu14 i utrzymywano na farmach badawczych Uniwersytetu w Lincoln. Trzy 3-miesięczne homozygotyczne (CLN5-/-) owce otrzymały pojedynczy wtrysk dopasychowy (IVT) do lewego oka, podczas gdy nieleczone prawe oko służyło jako kontrola wewnętrzna. Dane z elektroretinografii i badania p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skuteczność dostarczania wektora terapii genowej CLN5 drogą IVT w łagodzeniu dysfunkcji i degeneracji siatkówki u owiec z CLN5 NCL została wcześniej wykazana przez naszą grupę badawczą15. Owce objęte badaniem otrzymały pojedynczy wstrzyknięcie 100 µL CLN5 zapakowanego w wektor AAV serotypu 9 (AAV9) (AAV9.CLN5) drogą IVT do jednego oka, podczas gdy oko przeciwległe służyło jako nieleczona kontrola wewnętrzna. Wzrok oceniano co miesiąc od momentu wstrzyknięcia (3 miesiące) do końcowego stadium choro.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastrzyki doszklistkowe są jednym z najczęstszych zabiegów chirurgicznych w okulistyce człowieka i okazały się skuteczne w dostarczaniu terapii genowych za pośrednictwem AAV do siatkówki owiec. Wcześniej wykazaliśmy skuteczność AAV9. Terapia genowa CLN5 podawana doszklistkowo w celu osłabienia dysfunkcji i zwyrodnienia siatkówki u owiec z CLN5 NCL15. Oczekuje się, że przełożenie tej drogi podawania na pacjentów z NCL u ludzi również okaże się korzystne.
Protokół wstrzyk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Dr. Steve'owi Heapowi (BVSc, CertVOphthal) za pomoc w ustanowieniu tego protokołu i wykonaniu zastrzyków opisanych przez Murraya i wsp.15. Autorzy potwierdzają również finansowanie ze strony CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc oraz Batten Disease Support and Research Association.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bezpieczna strzykawka o pojemności 1 ml z igłą 0,5 cala przymocowaną na stałe Fisher | Scientific, Auckland, Nowa Zelandia | 05-561-28 | Bezpieczna strzykawka Covidien Monoject Tuberculin lub podobna |
| probówka do mikrowirówki 1,5 ml | Sigma Aldrich | HS4323 | Probówki autoklawowe do sterylizacji przed użyciem |
| Maszyna do znieczulenia z ławką gazową i monitorem | Hyvet Anesthesia, Christchurch, Nowa Zelandia | ||
| Antybiotykowe krople do oczu | Teva Pharma Ltd, Auckland, Nowa Zelandia | Nazwa handlowa: Chlorafast (0,5% chloramfenikol) | |
| BrightMount plus anti-fade medium montażowe | Abcam, Cambridge, Wielka Brytania | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,dichlorowodorek 6-diamidino-2-fenyloindolu) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone | 10236276001 | |
| Diazepam środek uspokajający | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | 5 mg/ml | |
| Rurki dotchawicze | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Wielka Brytania | Standard, mankietowe. Rozmiary 7, 7,5 lub 8 w zależności od wielkości owiec | |
| Wziernik do oczu | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Serweta chirurgiczna z okienkiem | Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nowa Zelandia | DI583 | Lub podobne |
| Końcówki filtrujące | Interlab, Auckland, Nowa Zelandia | 10, 200 i 1,000 &mikro; L | |
| Roztwór formaldehydu (37%) | Fisher Scientific, Auckland, Nowa Zelandia | AJA809-2.5PL | Uzupełnij do 10% w wodzie destylowanej z 0,9% NaCl |
| Kozioł anty-królik Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA& | nbsp; A-11012 | Stosować w rozcieńczeniu 1:500 |
| Izofluran znieczulający | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, Nowa Zelandia | ||
| Ketamina HCl środek znieczulający/przeciwbólowy | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Nowa Zelandia | 100 mg/ml | |
| Laryngoskop (weterynaryjny) | KaWe Medical, Dania | Ostrze Miller C, rozmiar 2 | |
| Igły | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | 302025 | Igły podskórne BD lub podobne |
| Niesteroidowe przeciwzapalne | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Nowa Zelandia | 49402/008 | Nazwa handlowa: Metacam 20 (20 mg/ml meloksykamu) |
| Kleszcze niezębate | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | AB864/16 | Lub podobne |
| Hemostat bezzębny | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | AA150/12 | Lub podobny |
| Normalna surowica kozia | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nowa Zelandia | 16210072 | |
| Tlen (medyczny) | BOC Gas, Christchurch, Nowa Zelandia | Butla D2, kod gazu 180 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nowa Zelandia | 10010023 | Sterylny, przefiltrowany |
| roztwór powidonu i jodu | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | 005835 | Nazwa handlowa: Betadine (10% jodu powidonu) |
| Królik anty-krowie białko fibrylarne fibrylarne (GFAP) | Dako, Glostrup, Dania | Z0334 | Stosować w rozcieńczeniu 1:2,500 |
| Samouzupełniający się serotyp 9 wirusa związanego z adenowirusem, zawierający promotor działania beta kurczaka (CBh) i zoptymalizowany pod kątem kodonów CLN5 owiec | of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Chlorek sodu 0,9% roztwór dożylny | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | AHB1322 | Nazwa handlowa: Roztwór soli fizjologicznej |
| Antybiotyki podskórne | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Nowa Zelandia | Nazwa handlowa: Duplocillin LA (150 000 IU/ml penicyliny prokainowej i 115 000 IU/ml penicyliny benzatynowej 115 000 IU/mL penicyliny benzatynowej | |
| , zakrzywione nożyczki | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia | SSSHBLC130 | |
| Terumo Strzykawka Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nowa Zelandia | SH159/SH160 | Sterylne strzykawki; 10 ml do sporządzania leków indukcyjnych, 20 ml do sporządzania soli fizjologicznej |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, Nowa Zelandia 28461115 |
Bibliografia
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
