Artykuł metodologiczny

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

DOI:

10.3791/63837

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożone środowisko komórkowe stanowi wyzwanie dla analizy ruchliwości pojedynczych molekuł. Jednak postęp w technikach obrazowania usprawnił badania pojedynczych cząsteczek i zyskał ogromną popularność w wykrywaniu i zrozumieniu dynamicznego zachowania cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodę badań in vitro pojedynczych cząsteczek silników z rodziny kinezyny-3 przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Kinesin-3 to duża rodzina, która odgrywa kluczową rolę w funkcjach komórkowych i fizjologicznych, od wewnątrzkomórkowego transportu ładunku, przez podział komórek, po rozwój. Wykazaliśmy wcześniej, że konstytutywnie aktywne dimeryczne silniki kinezyny-3 wykazują szybką i superprocesywną ruchliwość z wysokim powinowactwem do mikrotubul na poziomie pojedynczej cząsteczki przy użyciu lizatów komórkowych przygotowanych przez ekspresję silnika w komórkach ssaków. Nasze laboratorium bada silniki kinezyny-3 i ich mechanizmy regulacyjne przy użyciu podejść komórkowych, biochemicznych i biofizycznych, a takie badania wymagają oczyszczonych białek na dużą skalę. Ekspresja i oczyszczanie tych silników przy użyciu komórek ssaków byłoby kosztowne i czasochłonne, podczas gdy ekspresja w prokariotycznym systemie ekspresji skutkowała znacznie zagregowanym i nieaktywnym białkiem. Aby przezwyciężyć ograniczenia stwarzane przez systemy oczyszczania bakteryjnego i lizat komórek ssaków, opracowaliśmy solidny system ekspresji bakulowirusa Sf9 do ekspresji i oczyszczania tych silników. Silniki kinezyny-3 są C-końcowe znakowane 3-tandemowymi białkami fluorescencyjnymi (3xmCitirine lub 3xmCit), które zapewniają wzmocnione sygnały i zmniejszone fotowybielanie. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielosilnikowych białek oczyszczonych z Sf9 pokazuje, że silniki kinezyny-3 są szybkie i superprocesywne, podobnie jak nasze poprzednie badania z użyciem lizatów komórek ssaków. Inne zastosowania wykorzystujące te testy obejmują szczegółową wiedzę na temat warunków oligomerowych silników, specyficznych czynników wiążących równoległych do badań biochemicznych oraz ich stanu kinetycznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogromnie zatłoczone środowisko komórkowe stwarza wiele wyzwań w sortowaniu przeznaczonych do tego białek i molekuł. To intensywne obciążenie związane z organizacją i czasoprzestrzenną dystrybucją cząsteczek w cytoplazmie jest ułatwione przez silniki molekularne i ścieżki cytoszkieletowe. Silniki molekularne to enzymy, które hydrolizują waluty energii, takie jak ATP, i wykorzystują tę energię podczas ruchu i generowania siły1. W oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasów, kinezyny są pogrupowane w 14 rodzin i pomimo tego podobieństwa, każdy silnik w unikalny sposób przyczynia się do funkcjonowania komórki. Silniki z rodziny Kinesin-3 stanowią jedną z największych, obejmującą pięć podrodzin (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 i KIF28)2, związanych z różnymi funkcjami komórkowymi i fizjologicznymi, w tym transportem pęcherzyków, sygnalizacją, mitozą, migracją jądrową i rozwojem 3,4,5. Upośledzenie funkcji transportu kinezyny-3 wiąże się z wieloma zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, wadami rozwojowymi i chorobami nowotworowymi6,7,8,9.

Ostatnie prace wykazały, że silniki kinesin-3 są monomerami, ale ulegają dimeryzacji wywołanej przez ładunek i powodują szybką i superprocesową ruchliwość w porównaniu do konwencjonalnych kinesin10,11,12,13. Ich charakterystyka biochemiczna i biofizyczna wymaga dużej ilości oczyszczonych, aktywnych białek. Jednak ich produkcja w prokariotycznym systemie ekspresji skutkowała nieaktywnymi lub zagregowanymi silnikami, prawdopodobnie z powodu niezgodnej syntezy, fałdowania i modyfikacji białek14,15,16,17,18. Aby obejść takie ograniczenia i zwiększyć wydajność, opracowaliśmy solidny system ekspresji bakulowirusa Sf9 do ekspresji i oczyszczania tych silników.

System ekspresji bakulowirusa wykorzystuje linie komórkowe owadów Sf9 jako system gospodarza do wysokoprzepustowej ekspresji białek rekombinowanych eukariotycznych19,20. Bakulowirus posiada silny promotor polihedryny, który pomaga w heterologicznej ekspresji genów i produkcji rozpuszczalnych białek rekombinowanych17. Ze względu na swoją opłacalność, bezpieczeństwo obsługi i wysoką ekspresję aktywnego białka, stał się potężnym narzędziem21. Aby wyrazić interesujące nas białko, kluczowym krokiem jest wygenerowanie rekombinowanego bakmidu. Ponieważ dostępne na rynku zestawy generujące bakcydy są drogie i będziemy pracować z większą liczbą próbek, opracowaliśmy wewnętrzny protokół zarówno dla dużych, jak i małych wkładek silników kinezyny-3 do bakmidów. Oczyszczone z Sf9 silniki kinezyny-3 wykorzystano do scharakteryzowania in vitro właściwości ślizgowych pojedynczych cząsteczek i wielosilnikowych mikrotubul przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Silniki są oznaczone C-końcowymi cząsteczkami fluorescencyjnymi (3xmCit), aby zapewnić lepszy sygnał i zmniejszone fotowybielanie. Ze względu na zwiększony stosunek sygnału do szumu, mniejszą fototoksyczność i selektywne obrazowanie bardzo małego obszaru w pobliżu szkiełka nakrywkowego, obrazowanie TIRF jest szeroko stosowane do wizualizacji dynamiki białek na poziomie pojedynczej cząsteczki in vivo i in vitro.

To badanie omawia oczyszczanie silników kinezyny-3 za pomocą systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa oraz obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro i wielosilnikowej analizy ślizgowej silników za pomocą mikroskopii TIRF. Podsumowując, badanie to pokazuje, że właściwości ruchowe silników oczyszczonych z Sf9 są identyczne z właściwościami silników przygotowanych z lizatów komórek ssaków. Dlatego uważamy, że system Sf9-bakulowirusa może być przystosowany do ekspresji i oczyszczania dowolnego białka motorycznego, które jest przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla Sf9, transfekcja i generowanie wirusów

UWAGA: Utrzymuj komórki Sf9 w 30 ml pożywki Sf-900/SFM w 100 ml sterylnej, jednorazowej kolbie stożkowej bez żadnego antybiotyku/antybiotyku w temperaturze 28 °C. Utrzymuj hodowlę zawiesiny w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 90 obr./min. Zasilanie CO2 i utrzymanie wilgotności nie jest wymagane. Komórki są zwykle hodowane co czwarty dzień poprzez inokulację 0,5 x 106 komórek/ml, aby osiągnąć gęstość 2,0 x 106 komórek/ml w czwartym dniu.

  1. Generowanie zapasów wirusów P0
    1. Do transfekcji umieścić komórki nasienne w naczyniu o średnicy 35 mm ze zbiegiem 4,5 x 105 komórek/ml i utrzymywać w temperaturze 28 °C bez wstrząsania.
    2. Po 24 godzinach, gdy komórki są przyczepione i wyglądają zdrowo, przystąp do transfekcji zgodnie z poniższym opisem.
      1. Probówka A: Wymieszaj 1 μg bakimidowego DNA kodującego konstytutywnie aktywny silnik kinezynowy KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG specyficzny dla KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG ze 100 μl nieuzupełnionej pożywki Grace.
      2. Probówka B: Wymieszaj 6 μl odczynnika do transfekcji ze 100 μl nieuzupełnionej pożywki Grace's.
      3. Ostrożnie przenieść zawartość probówki A do probówki B i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół (około 20 razy).
      4. Inkubować mieszaninę przez ~45 min w temperaturze pokojowej.
    3. Po zakończeniu inkubacji dodać 0,8 ml nieuzupełnionej pożywki Grace do powyższej mieszaniny i powoli mieszać pipetując.
    4. Delikatnie odessać pożywkę Sf-900/SFM z komórek (aby usunąć wszelkie ślady surowicy, które mogą wpływać na wydajność transfekcji).
    5. Dodać mieszaninę do transfekcji z etapu 1.1.3 kroplami na wierzch komórek i inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 28 °C.
    6. Po inkubacji ostrożnie usunąć mieszaninę transfekcji, dodać 2 ml pożywki Sf-900/SFM i kontynuować inkubację przez 48 godzin w temperaturze 28 °C.
    7. Sprawdź ekspresję białka motorycznego pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Białko motoryczne jest oznaczone białkiem fluorescencyjnym, mCytryną, wariantem żółtego białka fluorescencyjnego.
      UWAGA: Transfekowane komórki wizualizowano pod mikroskopem odwróconym wyposażonym w różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) i oświetlenie epifluorescencyjne z obiektywem 20x (200-krotne powiększenie), lampą rtęciową i kamerą EM-CCD. Sprawdź skuteczność generowania wirusa i infekcji, monitorując ekspresję silników znakowanych mCitrine w komórkach za pomocą kostki filtra wzbudzenia i emisji mCitrine. Ponadto sprawdź, czy nie ma zmian morfologicznych w zakażonych komórkach, takich jak powiększone komórki/jądra (Rysunek 1A-C).
    8. Ponownie sprawdź komórki 72 godziny po zakażeniu. Zazwyczaj komórki zaczynają odczepiać się od powierzchni (Rysunek 2).
    9. Jeśli >5% komórek oderwało się od powierzchni, należy zebrać pożywkę z zainfekowanymi komórkami do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 500 x g.
    10. Zebrać supernatant i zatrzaskowo zamrozić porcje 1 ml w ciekłym azocie i przechowywać jako zapas P0 w temperaturze -80 °C lub użyć go do wytworzenia zapasu wirusa P1.
  2. Generowanie zapasów wirusów P1
    1. Aby jeszcze bardziej wzmocnić zapas bakulowirusa P0 i potwierdzić ekspresję białka, hoduj komórki Sf9 w hodowli płynnej zawiesiny.
    2. Do sterylnej kolby stożkowej o pojemności 100 ml dodać 10 ml pożywki Sf-900/SFM o gęstości komórek 2 x 106 komórek/ml i 1 ml zapasu wirusa P0. Inkubować w temperaturze 28 °C ze stałym wytrząsaniem przy 90 obr./min.
    3. Po 72 godzinach od zakażenia należy sprawdzić ekspresję białka zgodnie z opisem wcześniej (krok 1.1.7). Jeśli ekspresja białka jest dobra (>90% komórek wykazuje jasny sygnał fluorescencyjny mCitrine) i wykazuje znaczną śmierć komórki (około 10%-15%), należy odwirować komórki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml przy 500 x g przez 5 minut.
    4. Zebrać supernatant, błyskawicznie zamrozić porcje 1 ml (zapas P1) w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C lub przystąpić do infekcji na dużą skalę i oczyszczania białka.
  3. Infekcja na dużą skalę
    1. W celu uzyskania ekspresji białek na dużą skalę należy zainfekować 30 ml kultury zawiesinowej o gęstości 2 x 106 komórek/ml 1 ml zapasu wirusa P1 i inkubować w temperaturze 28 °C ze stałym wytrząsaniem przy 90 obr./min.
    2. Po ~72 godzinach od infekcji sprawdź ekspresję białka (ogólnie rzecz biorąc, maksymalna ekspresja białka osiągana jest między 65-75 godzinami po zakażeniu).
    3. Jeśli >90% komórek wykazuje jasny sygnał fluorescencyjny przy minimalnej śmierci komórki (<5%), zbierz komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wiruj w dół przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut
      UWAGA: Śmierć komórki powinna być minimalna (<5%), ponieważ martwe komórki uwalniają zawartość komórkową do pożywki, co prowadzi do utraty ekspresji białka.
    4. Odrzucić supernatant, zebrać osad komórkowy i przystąpić do oczyszczania białka.

2. Oczyszczanie Sf9 silników kinesin-3

  1. Do powyższej osadki komórkowej dodać 3 ml lodowatego buforu do lizy (tabela uzupełniająca 1) świeżo uzupełnionego 5 mM DTT, 5 μg/ml aprotyniny, 5 μg/ml leupeptyny i 5 μg/ml PMSF i poddać komórki lizie przez pipetowanie 20-25 razy bez wytwarzania pęcherzyków powietrza. Wszystkie składy buforowe i odczynniki znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1.
  2. Wirować lizat komórkowy w temperaturze 150 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać supernatant do świeżej, sterylnej probówki i wymieszać z ~40 μL 50% żywicy powinowactwa anty-FLAG M2. Inkubować mieszaninę przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z masowaniem od końca do końca.
  4. Po inkubacji zawiesić żywicę FLAG przez wirowanie w temperaturze 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu za pomocą igły 26 G i wyrzucić.
  5. Umyj trzykrotnie osad żywicy FLAG lodowatym buforem do płukania (tabela uzupełniająca 1) świeżo uzupełnionym 2 mM DTT, 5 μg/ml aprotyniny, 5 μg/ml leupeptyny i 5 μg/ml PMSF. Granulować kulki, wirując w temperaturze 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C przy każdym praniu.
  6. Po trzecim praniu ostrożnie opróżnij bufor do płukania tak bardzo, jak to możliwe, nie naruszając osadu. W celu elucji białek dodać ~70 μl buforu płuczącego zawierającego 100 μg/ml peptydu FLAG do osadu żywicy i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z wirowaniem od końca do końca.
  7. Następnego dnia odwirować żywicę w temperaturze 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać sklarowany osad zawierający oczyszczone białko do świeżej probówki i uzupełnić 10% glicerolu. Porcje 5 μl należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  8. Uruchom żel SDS-PAGE, aby określić stężenie białka i wydajność. Wraz z oczyszczonym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, standardową kontrolą białka, BSA o znanych stężeniach w zakresie 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg i 1 μg są ładowane w celu wygenerowania krzywej standardowej. Zabarwić żel kolorem Coomassie Brilliant blue (Rysunek 3).
  9. Przeanalizuj żel za pomocą wbudowanego narzędzia do kwantyfikacji żelu w oprogramowaniu ImageJ. Najpierw zmierz intensywność pasma znanych stężeń BSA i wygeneruj krzywą wzorcową. Następnie zmierz intensywność oczyszczonego pasma białkowego i określ stężenie białka. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie Image J, kliknij opcję Analizuj na pasku menu i wybierz Żele z menu rozwijanego.

3. Test ruchliwości pojedynczej cząsteczki in vitro przy użyciu silników kinezynowych-3 oczyszczonych z Sf9

UWAGA: Silniki kinezyny-3 oczyszczone z Sf9 mogą być używane do badania właściwości biochemicznych i biofizycznych, takich jak szybkość obrotu ATP, powinowactwo do mikrotubul, prędkość, długość przebiegu, rozmiar kroku i generowanie siły. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół analizy ruchliwości pojedynczej cząsteczki KIF1A(1-393LZ) in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Wszystkie skład i odczynniki znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1.

  1. Polimeryzacja mikrotubul
    1. We wstępnie schłodzonej probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml przygotować mieszaninę polimeryzacyjną, pipetując w następującej kolejności: 12,0 μl buforu BRB80 o pH 6,9; 0,45 μl 100 mM MgCl2, 1 μl 25 mM GTP.
    2. Wyjmij 10 μl podwielokrotności 10 mg/ml tubuliny przechowywanej w ciekłym azocie, natychmiast rozmrozić i dodać do powyższej mieszaniny polimeryzacyjnej. Delikatnie wymieszać, pipetując 2-3 razy, nie tworząc pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Powyższe kroki wykonuj szybko i ściśle na lodzie.
    3. Pozostaw powyższą mieszaninę na lodzie na 5 min.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok, aby zapobiec denaturacji tubuliny lub uniknąć tworzenia się krótkich nasion mikrotubul.
    4. Przenieść probówkę do wstępnie ogrzanego bloku grzewczego/łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 minut w celu polimeryzacji mikrotubul.
    5. Podczas polimeryzacji mikrotubul rozmrozić podwielokrotność buforu P12 i doprowadzić ją do temperatury pokojowej.
    6. Przed zakończeniem 30 minut inkubacji należy rozpocząć przygotowanie buforu stabilizacyjnego MT od odpipetowania 100 μl buforu P12 do świeżej probówki do mikrowirówki. Do tego dodać 1 μl 1 mM taksolu i natychmiast zmieszać mieszaninę.
      UWAGA: Przygotowanie buforu stabilizacyjnego MT należy rozpocząć około 5 minut przed zakończeniem inkubacji w kroku 3.1.4. Taksol stabilizuje spolimeryzowane mikrotubule poprzez wiązanie się z β-tubuliną.
    7. Ogrzewać bufor stabilizacyjny mikrotubul przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C i delikatnie dodać go do spolimeryzowanych mikrotubul, nie naruszając mieszaniny polimeryzacyjnej na dnie.
      UWAGA: Podgrzanie buforu stabilizacyjnego doprowadzi go do tej samej temperatury, co mieszanina polimeryzacyjna.
    8. Nie stukać ani nie pipetować mieszaniny i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    9. Delikatnie postukaj w mieszaninę i powoli wymieszaj ją ze ściętą końcówką (pojemność 200 μl) za pomocą pipety.
      UWAGA: Od tego momentu należy zawsze obchodzić się z mikrotubulami ze ściętą końcówką, aby uniknąć ścinania mikrotubul.
    10. Weź 10-15 μl spolimeryzowanych mikrotubul w komorze przepływowej, aby sprawdzić prawidłową polimeryzację mikrotubul.
      UWAGA: Nieznakowane mikrotubule można wizualizować za pomocą zestawu mikroskopowego DIC.
    11. Jeśli mikrotubule są zagęszczone, rozcieńczyć je w buforze P12 uzupełnionym 10 μM taksolem.
  2. Przygotowanie komory przepływowej o ruchliwości
    1. Przygotować komorę ruchliwości za pomocą szkiełka podstawowego, taśmy dwustronnej i szkiełka nakrywkowego (22 mm x 30 mm).
    2. Weź szklane szkiełko, umieść na środku kroplę (~70 μL) dejonizowanej wody destylowanej i przetrzyj ją niestrzępiącą się bibułą.
    3. Wytnij dwa paski taśmy dwustronnej (~35 x 3 mm) i mocno przyklej je równolegle do szkiełka, pozostawiając ~4-5 mm odstęp między dwoma paskami, aby utworzyć wąskie przejście.
    4. Następnie weź szkiełko nakrywkowe i dodaj kroplę (~20 μl) dejonizowanej wody destylowanej na środek. Umieść pasek niestrzępiącej się bibułki do czyszczenia soczewek na kropli wody, aż wchłonie wodę. Następnie powoli przesuń go w kierunku jednego końca szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Szkiełko nakrywkowe powinno być całkowicie suche. Na szkiełku nakrywkowym nie powinna być widoczna woda.
    5. Umieść szkiełko nakrywkowe na dwustronnych paskach przyklejonych do szkiełka i równomiernie dociśnij szkiełko nakrywkowe wzdłuż pasków, aby mocno przylegało.
      UWAGA: Upewnij się, że oczyszczona strona szkiełka nakrywkowego jest skierowana w stronę szkiełka
      6. podstawowego.
    6. Upewnij się, że razem tworzy to wąską komorę o pojemności 10-15 μl do przeprowadzenia testu ruchliwości (Rysunek 4A).
  3. Test ruchliwości pojedynczej cząsteczki in vitro
    UWAGA: Aby zbadać właściwości motoryczne silników w zakresie ruchliwości pojedynczych cząsteczek opartych na mikrotubulach, mikrotubule muszą zostać zaadsorbowane na powierzchni szkiełka nakrywkowego w komorze ruchliwości.
    1. Rozcieńczyć spolimeryzowane mikrotubule stabilizowane taksolem w buforze P12 uzupełnionym 10 μM taksolem w proporcjach 1:5 i wymieszać przez powolne pipetowanie ze ściętą końcówką.
    2. Utrzymuj komorę przepływową w pozycji skośnej (~15-20°). Przelej 30 μl rozcieńczonego roztworu mikrotubul przez komorę przepływową od górnego końca, trzymając niestrzępiącą się bibułkę na dolnym końcu, aby wchłonąć płyn. Wytwarza to siłę ścinającą, która ustawia mikrotubulę w kierunku przepływu i pomaga adsorbować mikrotubule prosto i równolegle.
    3. Pozostaw niewielką kroplę płynu na obu końcach komory i utrzymuj komorę przepływową w pozycji odwróconej (szkiełko nakrywkowe skierowane do dołu) w zamkniętej, wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu komory ruchliwości.
    4. Pozostaw na ~ 30 minut, aby mikrotubule zaadsorbowały się na powierzchni szkiełka nakrywkowego wewnątrz komory ruchliwości.
    5. W międzyczasie przygotować bufor blokujący, mieszając 500 μl buforu P12-BSA z 5 μl 1 mM taksolu.
    6. Przelej 40-50 μl buforu blokującego i inkubuj szkiełko w pozycji odwróconej przez 10 minut w wilgotnej komorze.
    7. Przygotować mieszaninę ruchliwości, pipetując następujące składniki do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 500 μl w następującej kolejności: 25 μl buforu P12 z taksolem, 0,5 μl ze 100 mM MgCl2, 0,5 μl ze 100 mM DTT, 0,5 μl z 20 mg/ml oksydazy glukozowej, 0,5 μl z 8 mg/ml katalazy, 0,5 μl z 2,25 M glukozy i 1,0 μl ze 100 mM ATP.
      UWAGA: Obrazowanie fluorescencyjne jest szeroko stosowane w zastosowaniach biologicznych22,23,24,25,26. Fotowzbudzenie białek fluorescencyjnych generuje reaktywne formy tlenu (ROS), które mogą powodować fotowybielanie białek fluorescencyjnych i uszkodzenie próbek biologicznych27,28. Pochłaniacze tlenu, takie jak glukoza, oksydaza glukozowa i katalaza, są rutynowo stosowane w testach ruchliwości w celu ograniczenia fotouszkodzeń i przedłużenia czasu bielenia białek fluorescencyjnych.
    8. Na koniec dodać 1 μl oczyszczonego silnika do powyższej mieszanki ruchliwości i dobrze wymieszać przed wlaniem do komory ruchliwości.
    9. Uszczelnij oba końce komory ruchliwości płynnym woskiem parafinowym i natychmiast wykonaj obraz w oświetleniu TIRF za pomocą obiektywu TIRF 100X 1,49 NA z 1,5-krotnym powiększeniem.
    10. Aby ustawić ostrość powierzchni szkiełka nakrywkowego, najpierw należy skupić się na jednej z wewnętrznych krawędzi taśmy dwustronnej w komorze ruchliwości przy oświetleniu kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC).
      UWAGA: Widoczna będzie jasna i nierówna powierzchnia.
    11. Następnie przenieś ostrość do komory ruchliwości. Za pomocą precyzyjnej regulacji skoncentruj powierzchnię szkiełka nakrywkowego i poszukaj mikrotubul zaadsorbowanych na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    12. Po zogniskowaniu mikrotubul przełącz się na oświetlenie TIRF za pomocą lasera wzbudzającego 488 nm i dostosuj głębokość oświetlenia, zmieniając kąt wiązki wzbudzenia, aby uzyskać najlepsze i równomierne oświetlenie TIRF (Rysunek 4B).
    13. Skoncentruj poszczególne silniki oznaczone mCitrine, poruszające się procesowo po powierzchni mikrotubul z ekspozycją 100 ms i zarejestruj ruch za pomocą kamery EM-CCD.
      UWAGA: Chociaż testy ruchliwości przeprowadzono na nieznakowanych mikrotubulach, funkcja projekcji z o maksymalnej intensywności może być użyta do ujawnienia konturu toru mikrotubul. Preferencyjnie do analizy śledzenia brano pod uwagę zdarzenia na długich torach mikrotubul.
    14. Ręcznie śledź pozycję oznaczonych fluorescencyjnie pojedynczych silników chodzących po długich ścieżkach mikrotubul klatka po klatce za pomocą specjalnie napisanej wtyczki w oprogramowaniu ImageJ (nih.gov), jak opisano wcześniej29.
    15. Wygeneruj histogramy prędkości i długości biegu dla populacji motorycznej, wykreślając liczbę zdarzeń w każdym pojemniku. Dopasuj te histogramy do pojedynczej funkcji piku Gaussa, aby uzyskać średnią prędkość i długość przebiegu12 (Rysunek 4C-E).

4. Test ślizgowy in vitro mikrotubul

UWAGA: Aby zrozumieć zbiorowe zachowanie silników kinezyny-3, przeprowadzono test ślizgowy in vitro mikrotubul18,30,31. Tam, gdzie silniki są unieruchomione na szkiełku nakrywkowym w pozycji odwróconej, a po dodaniu mikrotubul do komory, mikrotubule lądują na silnikach i ślizgają się, gdy silniki próbują po nich chodzić (Rysunek 5A,B).

  1. Fluorescencyjna polimeryzacja mikrotubul: Polimeryzować mikrotubule zgodnie z opisanym wcześniej protokołem, z wyjątkiem mieszania tubuliny znakowanej rodaminą (3 mg / ml) z nieznakowaną tubuliną (10 mg / ml) w stosunku 1:10.
  2. Po 30 minutach polimeryzacji delikatnie dodać 30 μl wstępnie podgrzanego buforu stabilizacyjnego do mikrotubul i inkubować dalej przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Następnie ścinaj mikrotubule, pipetując końcówką kapilarną (~25-30 razy).
  4. Przygotować komorę przepływu ruchliwości zgodnie z wcześniejszym opisem, przepuścić 50 μl nanociał GFP oczyszczonych z Sf9 (2,5 μl ze 100 nM rozcieńczonych w 50 μl buforu P12) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół w wilgotnej komorze.
    UWAGA: Silniki są oznaczone na końcach C za pomocą mCitrine. Nanociała GFP są używane do unieruchamiania silników ze względu na ich niską stałą dysocjacji32.
  5. Zablokować powierzchnię szkiełka nakrywkowego, wlewając 50 μl buforu blokowego do komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji białek i kontynuować inkubację przez 5 minut.
  6. Przygotować mieszankę silnikową, pipetując 50 μl buforu blokowego, 1 μl 100 mM ATP i 5 μl silników kinezyny-3 oczyszczonych 100 nM Sf9. Delikatnie wymieszać przed wlaniem do komory i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  7. Przemyć komorę dwukrotnie 50 μl kazeiny P12.
  8. W sterylnej probówce do mikrowirówek przygotować mieszaninę do oznaczania ślizgu w następującej kolejności: 45 μl kazeiny P12 z 10 μM taksolem, 1 μl 100 mM ATP, 0,5 μl katalazy 8 mg/ml, 0,5 μl 20 mg/ml oksydazy glukozowej, 0,5 μl 2,25 M glukozy i 1 μl ściętych mikrotubul fluorescencyjnych. Delikatnie wymieszaj zawartość przed wlaniem do komory ruchliwości i uszczelnij końce komory płynnym woskiem parafinowym.
  9. Obraz mikrotubuli ślizgającej się w oświetleniu TIRF przy ekspozycji 100 ms i uchwyć obrazy za pomocą dołączonej kamery EM-CCD.
    UWAGA: Średnia prędkość ślizgania się mikrotubul została określona poprzez ręczne śledzenie około 100 pojedynczych mikrotubul klatka po klatce za pomocą specjalnie napisanej wtyczki w ImageJ29. Określ średnią prędkość ślizgania się mikrotubul, generując histogram i dopasowując go do funkcji Gaussa (Rysunek 5C,D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyrazić i oczyścić aktywne i funkcjonalne rekombinowane białka motoryczne na dużą skalę za pomocą ekspresji Sf9-bakulowirusa, system potrzebuje generacji cząsteczek wirusa stabilnie przenoszących sekwencję kodującą do infekowania komórek Sf9. Aby to osiągnąć, komórki Sf9 transfekowano rekombinowanym kodowaniem bakcydu KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Po 72 godzinach znaczna populacja komórek wykazała ekspresję białka zielonej fluorescencji (mCitrine) z powiększonymi komórkami i jądrami (Rysunek 1 i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System ekspresji bakulowirusa Sf9 jest jedną z najbardziej wszechstronnych i skutecznych metod wysokoprzepustowej produkcji białek 19,36,37. Zdolność komórek Sf9 do modyfikacji potranslacyjnej jest wysoce porównywalna z systemem ssaków15. Istotną wadą korzystania z tego systemu jest to, że jest on powolny i wrażliwy na zanieczyszczenia. Jednym z najbardziej krytycznych etapów jest skuteczna infekcja i uda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.S. i P.S. dziękują prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) i prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) za ich bezwarunkowe wsparcie podczas całego badania. P.S. dziękuje dr Sivapriya Kirubakaran za wsparcie przez cały czas trwania projektu. V.S. dziękuje za finansowanie poprzez DBT (nr grantu: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 i BT/RLF/Re-entry/45/2015) oraz DST-SERB (nr grantu: Zb.Orz. (2016/000913). P.K.N dziękuje ICMR za dofinansowanie (Grant nr 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. potwierdza dofinansowanie z DST (nr grantu: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S dziękuje za stypendium z IIT Gandhinagar.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sf9 kultury i materiały transfekcyjne
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502Do oczyszczania białek
AprotininSigmaA6279Do oczyszczania białek
CellfectinInvitrogen10362100Do transfekcji Sf9
DTTSigmaD5545Do oznaczania ruchliwości i oczyszczania białek
Peptyd FLAGSigmaF3290Do oczyszczania białek
GlycerolSigmaG5516Do zamrażania białka
HEPESSigmaH3375Do buforu do lizy Sf9
IGEPAL CA 630SigmaI8896Do buforu do lizy Sf9
KClSigmaP9541Do przygotowania
LeupeptinSigmaL2884Do oczyszczania białek
MgCl2SigmaM2670Do przygotowania
NaClSigmaS7653Do przygotowania buforu do lizy
PMSFSigmaP7626Do oczyszczania białek
Komórki Sf9Uprzejmy prezent od dr Thomasa Pucadyila (Indyjski Instytut Naukowy) Edukacja i Badania, Pune, Indie).Do ekspresji bakulowirów i oczyszczania białek
Butelki hodowlane Sf9Thermo Scientific4115-0125Do hodowli zawiesinowych
Sf-900/SFM pożywka (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlDo hodowli komórek Sf9
SacharozaSigmaS1888Przygotowanie buforu lizującego dla komórek Sf9
Niesuplementowany Grace' s mediaThermo Scientific11595030 -500 mlDo transfekcji Sf9
< strong> polimeryzacji mirotubuli i materiałów do oznaczania pojedynczych cząsteczek< / strong>
ATPSigmaA2647Do oznaczania ruchliwości i ślizgu
BSASigmaA2153Do blokowania komory ruchliwości
KatalazaSigmaC9322Dla Test ruchliwości i ślizgania
DMSOSigmaD5879Do rozpuszczania rodaminy
EGTASigma3777Do przygotowania
GlukozaSigmaG7021Do oznaczania ruchliwości i ślizgania
Oksydaza glukozowaSigmaG2133Do oznaczania ruchliwości i ślizgania
GTPSigmaG8877Do polimeryzacji mikrotubul
KOHSigmaP1767Przygotowanie RUR bufor pH 6,9
RURYSigmaP6757Do przygotowania do testów ruchliwości i ślizgu
Materiały do oznaczania ślizgu mikrotubul
26G  IgłaDispovanDo ścinania mikrotubul
KazeinaSigmaC3400Do Test ślizgowy mikrotubul
Nanociała GFPPrezent od dr Sivaraja Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)Do mocowania silników do szkiełka nakrywkowego
RhodamineThermo Scientific46406Do przygotowania tubuliny
mikroskopu i innych przyrządów
0,5 ml, 1,5 i 2 ml probówekmikrowirówekEppendorfDo hodowli i oczyszczania Sf9
10ml  jednorazowe sterylne pipetyEppendorfDo hodowli i oczyszczania Sf9
10ul, 200ul, 1ml końcówki do mikropipetEppendorfDo hodowli i oczyszczania Sf9
15ml probówki konkalneEppendorfDo hodowli i oczyszczania Sf9
35mm naczynie do hodowli komórkowychCole Palmer15179-39Do hodowli Sf9
BalanceSartorious0,01g-300g
Stołowy inkubator do wytrząsania jamy ustnejREMIDo hodowli suspenculture Sf9 w temperaturze 28oC
KameraEMCCD Andor iXon Ultra 897Do obrazowania i akwizycji TIRF
Taśma dwustronnaScotchDo wykonywania komory ruchliwości
Szkiełko nakrywkoweFisherfinestRozmiar 12-548-5A; 22X30
SzkiełkoBlue StarDo wykonywania komory ruchliwości
Blok grzewczyNeuationRozpuszczanie wosku parafinowego
Mikroskop odwróconyNikon Eclipse Ti- UDo sprawdzania ekspresji białek
Lasery488nm (100mW)Do obrazowania TIRF
Ciekły azotDo zamrażania i przechowywania próbek
Mikrokapilarna końcówka ładującaEppendorfEP022491920Do ścinania mikrotubul
MikroskopNikon Eclipse Ti2-E z konfiguracją DIC Doobrazowania TIRF
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdDo szybkiego obracania
Obiektyw100X TIRF z zanurzeniem w oleju 1,49NA Doobrazowania
TIRFOptima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterDo oczyszczania białek
ParafilmEppendorf
pH-metrCorningCoring 430Do regulacji pH
Pipeta ChłopiecVWRDo hodowli i oczyszczania Sf9
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificDo oczyszczania białek
Sorvall ST8R wirówka Thermo ScientificOczyszczanie białek
ThermoMixerEppendorfDo polimeryzacji mikrotubul
Rotor ultrawirówkiRedlica Beckman RotorSW60Ti
Probówki do ultrawirówekBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Mieszalnik wirowyNeuation Mieszaniepróbek
WoskSigmaV001228Do uszczelnienia komory ruchliwości

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973(2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Motory kinezyny 3oczyszczanie z kom rek Sf9ekspresja bakulowirusowamikroskopia TIRFruchomo bia ek motorycznychpo lizg mikrotubuloczyszczanie powinowactwemznakowanie bia kami fluorescencyjnymirekonstytucja in vitro

Powiązane artykuły