Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Podsumowanie

Celem tego manuskryptu jest opisanie modelu myszy Kit^V558Δ/+ oraz technik udanej sekcji i przetwarzania próbek myszy.

Streszczenie

Guz podścieliskowy przewodu pokarmowego (GIST) jest najczęstszym ludzkim mięsakiem i zazwyczaj jest spowodowany pojedynczą mutacją w receptorze KIT. We wszystkich typach nowotworów opracowano liczne modele mysie w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych nowej generacji. Jednak w GIST większość badań in vivo wykorzystuje mysie modele ksenoprzeszczepów, które mają nieodłączne ograniczenia. Tutaj opisujemy immunokompetentny, genetycznie zmodyfikowany mysi model guza podścieliska przewodu pokarmowego z mutacją Kit^V558Δ/+. W tym modelu zmutowany KIT, onkogen odpowiedzialny za większość GIST, jest napędzany przez swój endogenny promotor, co prowadzi do GIST, który naśladuje wygląd histologiczny i naciek immunologiczny obserwowany w ludzkich GIST. Co więcej, model ten został z powodzeniem wykorzystany do zbadania zarówno celowanych terapii molekularnych, jak i immunologicznych. Tutaj opisujemy hodowlę i utrzymanie kolonii myszy Kit^V558Δ/+. Ponadto w artykule szczegółowo opisano leczenie i pobieranie GIST, drenaż krezkowego węzła chłonnego i przylegającego jelita ślepego u myszy Kit^{V558Δ / +}, a także przygotowanie próbek do analiz molekularnych i immunologicznych.

Wprowadzenie

GIST to najczęstszy mięsak u ludzi, z częstością występowania około 6 000 przypadków w Stanach Zjednoczonych Ameryki¹. Wydaje się, że GIST pochodzi z komórek rozrusznika przewodu pokarmowego zwanych komórkami śródmiąższowymi Cajala i jest zwykle napędzany przez pojedynczą mutację w kinazie tyrozynowej KIT lub PDGFRA². Chirurgia jest podstawą leczenia GIST i może być lecznicza, ale pacjenci z zaawansowaną chorobą mogą być leczeni inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI), imatynibem. Od czasu wprowadzenia na rynek ponad 20 lat temu, imatynib zmienił paradygmat leczenia GIST, poprawiając przeżywalność w zaawansowanej chorobie z 1 do ponad 5 lat^3,4,5. Niestety, imatynib rzadko jest leczniczy ze względu na nabyte mutacje KIT, dlatego potrzebne są nowe metody leczenia tego nowotworu.

Modele mysie są ważnym narzędziem badawczym w badaniach nad nowymi terapiami raka. Wiele modeli ksenoprzeszczepów podskórnych i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów zostało opracowanych i zbadanych w GIST^6,7. Jednak myszy z niedoborem odporności nie reprezentują w pełni ludzkiego GIST, ponieważ GIST mają zróżnicowane profile immunologiczne w zależności od ich mutacji onkogennej, a zmiana mikrośrodowiska guza przewodu pokarmowego poprawia efekty terapii TKI ^8,9. Mysz Kit^V558Δ/+ ma heterozygotyczną delecję linii zarodkowej w eksonie 11 Kit, która koduje domenę przybłonową, najczęściej zmutowane miejsce w ludzkiej klasie GIST¹⁰. Myszy z zestawu^V558Δ/+ rozwijają pojedynczy GIST jelita ślepego ze 100% penetracją, a guzy mają podobną histologię, sygnalizację molekularną, infiltrację immunologiczną i odpowiedź na terapię jak ludzki GIST^8,11,12,13. W tym miejscu opisujemy hodowlę, leczenie oraz izolację i przetwarzanie próbek u myszy Kit^V558Δ/+ do stosowania w badaniach molekularnych i immunologicznych w GIST.

Protokół

Wszystkie myszy były trzymane w warunkach wolnych od patogenów na Uniwersytecie Pensylwanii zgodnie z wytycznymi NIH i za zgodą IACUC Uniwersytetu Pensylwanii. Eutanazja została przeprowadzona zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.

1. Zestaw^V558Δ/+ hodowla myszy

1. Krzyżuj wstecznie myszy ^{Kit V558Δ/+} ponad 10 razy na tle C57BL/6J za pomocą myszy C57BL/6J. Aby to zrobić, wyhoduj samce myszy ^{Kit V558Δ/+} z samicami myszy C57BL/6J w stosunku 1:2.
   UWAGA: Genotyp homozygotyczny^{Kit V558Δ/V558Δ} jest śmiertelny w macicy. Możliwe jest rozmnażanie samic myszy Kit^V558Δ/+ z samcami myszy C57BL/6J, ale wielkość miotu jest o połowę mniejsza niż w przypadku samic myszy C57BL/6J typu dzikiego. Co więcej, samice myszy ^{Kit V558Δ/+} produkują ograniczoną liczbę miotów po 4 miesiącu życia.
2. Genotyp szczeniąt w wieku 7-14 dni poprzez obcinanie palców u nóg w celu potwierdzenia obecności genotypu Kit^V558Δ/+. Użyj startera do przodu: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; sprawozdawca 1: CCTCGACAACCTTCCA; podkład odwrotny: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; oraz reporter 2: TCTCCTCGACCTTCCA do genotypowania.

2. Zestaw^V558Δ/+ leczenie myszy

1. Wiek i płeć pasują do myszy Kit^V558Δ/+ przed leczeniem. Użyj myszy dopasowanych pod względem wieku i płci w kohortach, ponieważ guzy u samic myszy^{Kit V558Δ / +} są większe niż u samców. Leczenie myszy w wieku 8-12 tygodni, w którym to czasie ustalają się guzy (Rysunek 1).
2. Inhibitory kinazy tyrozynowej należy podawać doustnie lub we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.); Guzy Kit^V558Δ/+ są wrażliwe na inhibitory kinazy tyrozynowej. Imatynib należy podawać w dawce 600 mg/l w wodzie do picia lub w iniekcjach 45 mg/kg mc. dwa razy na dobę. Zmierz zmniejszenie masy guza za pomocą wag cyfrowych po rozcięciu guza, jak pokazano w kroku 3, co wynosi około 50% po 1 tygodniu i 80% po 4 tygodniach po leczeniu imatynibem (Rycina 2).

3. Zestaw^V558Δ/+ pobieranie organów myszy

1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą narkozy CO₂ przy natężeniu przepływu 60% objętości komory na minutę. Pozostaw myszy w komorze na co najmniej 2 minuty po ustaniu oddychania, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć.
2. Sterylizuj wszystkie narzędzia, noś rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu i utrzymuj sterylne pole. Przygotuj skórę za pomocą 70% etanolu. Wykonaj 2 cm pionowe nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek i wejdź do jamy brzusznej. Ostro zlikwiduj wszelkie zrosty wewnątrz brzucha.
3. Aby usunąć drenujący węzeł chłonny krezkowy, wykonaj czynności opisane poniżej.
   1. Zidentyfikuj jelito ślepe i podnieś jego krezkę wyżej. Mniej więcej w połowie drogi do podstawy krezki zidentyfikuj węzeł chłonny krezki i ostro go wypreparuj. Węzeł chłonny jest białawy i ma wymiary około 0,5 cm x 0,5 cm.
   2. Podziel tkankę węzła chłonnego na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki, w razie potrzeby. W przypadku zawiesin jednokomórkowych należy umieścić tkankę węzłów chłonnych w 20 ml pożywki wolnej od surowicy (RPMI) i trzymać na lodzie.
4. W celu odizolowania GIST i jelita ślepego należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
   1. Jelito ślepe w myszach Kit^V558Δ/+ jest w większości zastępowane przez GIST. Ostrożnie podziel połączenie krętniczo-kolkowe od podstawy guza. Aby zebrać jelito ślepe, ponownie podziel okrężnicę, 2 cm proksymalnie do podstawy guza.
   2. U 50%-60% myszy Kit^V558Δ/+ głowa guza zawiera czapeczkę z tkanki jelita ślepego, która zwykle zawiera płyn surowiczy, ale rzadko może zawierać ropę (Ryc. 3). Ostro wypreparuj tkankę czapeczki z dala od tkanki nowotworowej.
   3. Podziel tkankę nowotworową i/lub jelito ślepe na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki, w razie potrzeby. W przypadku zawiesin pojedynczych komórek umieść tkankę nowotworową lub jelito ślepe w HBSS z 2% FCS, wystarczającym do przykrycia próbki i utrzymania na lodzie.

4. Analiza Western blot tkanki GIST

1. Przygotować bufor do lizy tkanek zawierający 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% detergentu niedenaturującego, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 10 mM NaF i mieszaninę inhibitorów proteinaz 20 μl/ml.
2. Przygotuj 1x Tris-buforowany roztwór soli fizjologicznej z 1% Tween 20 (TBST), łącząc 1800 ml wody dejonizowanej, 2 ml Tween 20 i 200 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS).
3. Zawiesić tkankę z kroku 3.4.3 w probówce FACS w 5 ml/g buforu do lizy tkanek i dwukrotnie homogenizować za pomocą homogenizatora mechanicznego z prędkością 15 000 obr./min przez 15 s na lodzie. Inkubować lizat przez 30 minut na lodzie.
4. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
5. Uruchom lizaty na żelu o gradiencie od 4% do 15%, a następnie przenieś do membrany nitrocelulozowej, zgodnie z opisem w¹⁴.
6. Membranę myć raz w 1x TBS przez 5 min, a następnie zablokować membranę w 5% mleku na 1 godzinę. Ponownie umyj membranę raz na 1x TBS przez 10 minut.
7. Inkubować błonę w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w 5% BSA w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj membranę 3x w 1x TBST przez 10 min każdy. Inkubować blot z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:2500 w 2,5% mleku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Umyj membranę raz na 1x TBS przez 5 minut. Dodaj wystarczającą ilość substratu HRP, aby pokryć membranę, zwykle 200-500 μl, i użyj cyfrowego imagera do wykrycia i ilościowego określenia chemiluminescencji.

5. Immunohistochemia tkanki GIST

1. Utrwalić tkankę z kroku 3.3.2 lub 3.4.3 w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez noc. Przechowuj tkankę w 70% EtOH do momentu, gdy będzie gotowa do przetwarzania. Osadzaj i dziel bloki o grubości 5 μm na szkiełkach podstawowych, zgodnie z opisem^15,16.
2. Pełna detekcja immunohistochemiczna przy użyciu podstawowego zestawu do immunodetekcji, jak opisano wcześniej¹⁷.

6. Jednokomórkowe zawiesina krezki węzła chłonnego

1. Wlać pożywkę RPMI z próbką węzłów chłonnych z kroku 3.3.2 przez filtr 100 μm. Przenieś filtr do nowego stożkowego węzła chłonnego o pojemności 50 ml i zacier miękkim końcem plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml. Umyj filtr 20 ml pożywki RPMI.
2. Odwirować filtrat przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
3. Zawiesić osad w 20 ml 1% FBS w PBS (bufor perełkowy) i zalać filtrem 40 μm. Zebrać filtrat komórkowy. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
4. Odwirować filtrat przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Zawiesić w buforze kulkowym o stężeniu 6 x 10⁷ komórek/ml do cytometrii przepływowej.

7. Jednokomórkowe zawiesiny GIST

1. Przygotować bufor kolagenazy, dodając 250 mg kolagenazy dożylnej, jedną tabletkę inhibitora proteazy wolnej od EDTA i 100 μl DNazy I do 50 ml HBSS. Obracaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aż się rozpuści.
2. Umieść GIST w sterylnym naczyniu i dodaj 2,5 ml buforu kolagenazy. Miel guz za pomocą sterylnego skalpela i nożyczek, aż guz będzie w drobnych fragmentach. Użyj pipety o dużym otworze, aby zassać guz i kolagenazę do probówki o pojemności 50 ml.
3. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 100 obr./min w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Reakcję gaszenia z użyciem 2 ml FBS.
4. Wlać kolagenazę z próbką GIST przez filtr 100 μm i rozgnieść guz miękką końcówką plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml i zebrać w probówce o pojemności 50 ml. Umyj filtr 20 ml HBSS. Odwirować filtrat w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 5 min. Odessać supernatant.
5. Zawiesić osad w 20 ml buforu perełkowego i zalać filtrem 40 μm. Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować filtrat w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 5 min. Odessać supernatant. Zawiesić w buforze kulkowym o stężeniu 6 x 10⁷ komórek/ml do cytometrii przepływowej.

8. Jednokomórkowe zawieszenie jelita ślepego

1. Przygotuj bufor kolagenazy jak w kroku 7.1. Za pomocą nożyczek rozłup jelito ślepe wzdłużnie, aby odsłonić wewnętrzną błonę śluzową. Pokrój na odcinki o długości 0,5 cm i umieść w probówce o pojemności 50 ml z 5 ml HBSS z 2% FBS. Wstrząsać energicznie przez 30 s, odwirowywać przy 450 x g przez 20 s, a następnie zassać supernatant.
2. Dodać 5 ml HBSS z 2 mM EDTA. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min przez 15 min. Wirować przy 450 x g przez 20 s. Odessać supernatant.
3. Dodaj 5 ml HBSS. Wstrząsać energicznie przez 30 s, odwirowywać przy 450 x g przez 20 s, a następnie zassać supernatant. Powtórz jeszcze raz.
4. Dodaj 5 ml buforu kolagenazy. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 100 obr./min. Wstrząsać energicznie co 10 minut. Reakcję gaszenia za pomocą 2 ml FBS.
5. Wlać kolagenazę z próbką jelita ślepego przez filtr 100 μm i rozgnieść miękką końcówką plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml. Umyj filtr 20 ml HBSS. Zebrać filtrat.
6. Odwirować filtrat o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant. Zawiesić granulat w 20 ml buforu perełkowego i zalać filtrem 40 μm. Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
7. Odwirować filtrat o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant. Zawiesić w buforze kulkowym o stężeniu 6 x 10⁷ komórek/ml do cytometrii przepływowej.

Wyniki

Model myszy Kit^V558Δ/+ umożliwia badanie terapii w modelu mysim z zachowaną kompetencją immunologiczną. Myszy Kit^V558Δ/+ mają średnią długość życia wynoszącą 8 miesięcy z powodu postępującego niedrożności jelit (Rysunek 4). Guzy u myszy Kit^V558Δ/+ wykazują ekspresję kanonicznych markerów GIST, w tym tyrozynokinazy KIT i kanału transbłonowego DOG1 (Rysunek 5

Dyskusja

Mysi model Kit^V558Δ/+ jest potężnym narzędziem badawczym w molekularnej i immunologicznej analizie GIST. Chociaż strategia hodowlana wymaga pojedynczego krzyżowania, użycie kohort myszy Kit^V558Δ/+ w eksperymentach analizujących odpowiedź guza wymaga ekstensywnej hodowli. Myszy powinny być dopasowane pod względem wieku i płci, aby zapewnić podobną masę guza, a 10% myszy umiera przed 8 tygodniem życia, kiedy guzy się utrwalą. Mniej rozległe strategie hodowlane są możliwe w przypadku ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 100 mikronów	EMSCO	1194-2360
1x bufor do lizy RBC	Life Technologies	00-4333-57
Strzykawka 3 ml	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 30 i mikro; l	Bio-Rad	4561083
4% roztwór paraformaldehydu	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
Filtr 40 mikronów	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
Filtr 70 mikronów	EMSCO	1194-2350
Przeciwciało AKT (C67E7)	Sygnalizacja komórkowa	4691
Myszy C57BL/6J	Kolagenaza Laboratorium
IV	Sigma Aldrich	C5138
Kompletny mini inhibitor proteazy wolnej od edta	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher Scientific
Jednorazowe skalpele	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnaza I	Przeciwciało	Scientific C756V81
Dog1	ABCAM	ABC64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
Przeciwciało ERK (p44/42)	Sygnalizacja komórkowa	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
oprogramowanie	FIJI FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Homogenizator Fisherbrand 850	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS			komórkowe Uniwersytetu Pensylwanii
Metylan imatynibu	Selleck Chemicals	S1026
KIT Przeciwciało (D13A2)	Zestaw sygnalizacji komórkowej	3074V558
Δ/+ Genotypowanie	Transnetyx
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Zestaw do immunodetekcji myszy na myszy, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Membrana nitrocelulozowa, wstępnie nacięta, 0,45 i mikro; m	Rio-Rad	1620145
Beztłuszczowe mleko w proszku	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substytut	Sigma Aldrich	74385
Przeciwciało p-AKT (S473)	Sygnalizacja komórkowa	4060
Przeciwciało p-ERK (p44/42)	Sygnalizacja komórkowa	9101
Przeciwciało p-KIT (Y719)	Sygnalizacja komórkowa	3391
Inhibitor proteazy PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinaza K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
probówki do okrągłodennego polistyrenu (FACS)	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Fluorek sodu (NaF)	Sigma Aldrich
Ortowanadan sodu (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo	Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Naczynie do hodowli tkankowych (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
Platforma vivaCT 80	Scanco medical

Jacksona Thomas Centrum 201154