Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Summary

Celem tego manuskryptu jest opisanie modelu myszy Kit^V558Δ/+ oraz technik udanej sekcji i przetwarzania próbek myszy.

Abstract

Guz podścieliskowy przewodu pokarmowego (GIST) jest najczęstszym ludzkim mięsakiem i zazwyczaj jest spowodowany pojedynczą mutacją w receptorze KIT. We wszystkich typach nowotworów opracowano liczne modele mysie w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych nowej generacji. Jednak w GIST większość badań in vivo wykorzystuje mysie modele ksenoprzeszczepów, które mają nieodłączne ograniczenia. Tutaj opisujemy immunokompetentny, genetycznie zmodyfikowany mysi model guza podścieliska przewodu pokarmowego z mutacją Kit^V558Δ/+. W tym modelu zmutowany KIT, onkogen odpowiedzialny za większość GIST, jest napędzany przez swój endogenny promotor, co prowadzi do GIST, który naśladuje wygląd histologiczny i naciek immunologiczny obserwowany w ludzkich GIST. Co więcej, model ten został z powodzeniem wykorzystany do zbadania zarówno celowanych terapii molekularnych, jak i immunologicznych. Tutaj opisujemy hodowlę i utrzymanie kolonii myszy Kit^V558Δ/+. Ponadto w artykule szczegółowo opisano leczenie i pobieranie GIST, drenaż krezkowego węzła chłonnego i przylegającego jelita ślepego u myszy Kit^{V558Δ / +}, a także przygotowanie próbek do analiz molekularnych i immunologicznych.

Introduction

GIST to najczęstszy mięsak u ludzi, z częstością występowania około 6 000 przypadków w Stanach Zjednoczonych Ameryki¹. Wydaje się, że GIST pochodzi z komórek rozrusznika przewodu pokarmowego zwanych komórkami śródmiąższowymi Cajala i jest zwykle napędzany przez pojedynczą mutację w kinazie tyrozynowej KIT lub PDGFRA². Chirurgia jest podstawą leczenia GIST i może być lecznicza, ale pacjenci z zaawansowaną chorobą mogą być leczeni inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI), imatynibem. Od czasu wprowadzenia na rynek ponad 20 lat temu, imatynib zmienił paradygmat leczenia GIST, poprawiając przeżywalność w za....

Protocol

Wszystkie myszy były trzymane w warunkach wolnych od patogenów na Uniwersytecie Pensylwanii zgodnie z wytycznymi NIH i za zgodą IACUC Uniwersytetu Pensylwanii. Eutanazja została przeprowadzona zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.

1. Zestaw^V558Δ/+ hodowla myszy

1. Krzyżuj wstecznie myszy ^{Kit V558Δ/+} ponad 10 razy na tle C57BL/6J za pomocą myszy C57BL/6J. Aby to zrobić, wyhoduj samce myszy ^{Kit V558Δ/+} z samicami myszy C57BL/6J w stosunku 1:2.
   UWAGA: Genot....

Results

Mysi model Kit^V558Δ/+ pozwala na badanie terapii w immunokompetentnym modelu myszy. Zestaw^V558Δ/+ myszy mają średnią długość życia 8 miesięcy z powodu postępującej niedrożności jelit (Rysunek 4). Guzy myszy ^{Kit V558Δ / +} wyrażają kanoniczne markery GIST, w tym kinazę tyrozynową KIT i kanał transbłonowy DOG1 (Figura 5), a także czynnik transkrypcyjny ETV1 (.......

Discussion

Mysi model Kit^V558Δ/+ jest potężnym narzędziem badawczym w molekularnej i immunologicznej analizie GIST. Chociaż strategia hodowlana wymaga pojedynczego krzyżowania, użycie kohort myszy Kit^V558Δ/+ w eksperymentach analizujących odpowiedź guza wymaga ekstensywnej hodowli. Myszy powinny być dopasowane pod względem wieku i płci, aby zapewnić podobną masę guza, a 10% myszy umiera przed 8 tygodniem życia, kiedy guzy się utrwalą. Mniej rozległe strategie hodowlane są możliwe w przypadku .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtr 100 mikronów	EMSCO	1194-2360
1x bufor do lizy RBC	Life Technologies	00-4333-57
Strzykawka 3 ml	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 30 i mikro; l	Bio-Rad	4561083
4% roztwór paraformaldehydu	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
Filtr 40 mikronów	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
Filtr 70 mikronów	EMSCO	1194-2350
Przeciwciało AKT (C67E7)	Sygnalizacja komórkowa	4691
Myszy C57BL/6J	Kolagenaza Laboratorium
IV	Sigma Aldrich	C5138
Kompletny mini inhibitor proteazy wolnej od edta	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher Scientific
Jednorazowe skalpele	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnaza I	Przeciwciało	Scientific C756V81
Dog1	ABCAM	ABC64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
Przeciwciało ERK (p44/42)	Sygnalizacja komórkowa	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
oprogramowanie	FIJI FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Homogenizator Fisherbrand 850	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS			komórkowe Uniwersytetu Pensylwanii
Metylan imatynibu	Selleck Chemicals	S1026
KIT Przeciwciało (D13A2)	Zestaw sygnalizacji komórkowej	3074V558
Δ/+ Genotypowanie	Transnetyx
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Zestaw do immunodetekcji myszy na myszy, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Membrana nitrocelulozowa, wstępnie nacięta, 0,45 i mikro; m	Rio-Rad	1620145
Beztłuszczowe mleko w proszku	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substytut	Sigma Aldrich	74385
Przeciwciało p-AKT (S473)	Sygnalizacja komórkowa	4060
Przeciwciało p-ERK (p44/42)	Sygnalizacja komórkowa	9101
Przeciwciało p-KIT (Y719)	Sygnalizacja komórkowa	3391
Inhibitor proteazy PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinaza K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
probówki do okrągłodennego polistyrenu (FACS)	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Fluorek sodu (NaF)	Sigma Aldrich
Ortowanadan sodu (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo	Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Naczynie do hodowli tkankowych (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
Platforma vivaCT 80	Scanco medical