Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów

Otyłość jest globalnym zagrożeniem dla zdrowia zarówno dorosłych, jak i dzieci. Dzieci z nadwagą lub otyłością są około pięć razy bardziej narażone na otyłość niż dorośli, co naraża je na znacznie zwiększone ryzyko chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy i wielu innych chorób współistniejących. Około 13,4% amerykańskich dzieci w wieku 2-5 lat cierpi na otyłość¹, co ilustruje, że tendencja do gromadzenia nadmiaru tkanki tłuszczowej może być uruchomiona bardzo wcześnie w życiu. Z bardzo różnych powodów nagromadzenie nadmiaru tkanki tłuszczowej jest problemem dla kurcząt brojlerów (typu mięsnego). Nowoczesne brojlery są niezwykle wydajne, ale nadal gromadzą więcej lipidów, niż jest to fizjologicznie konieczne^2,3. Tendencja ta zaczyna się wkrótce po wykluciu i skutecznie marnuje paszę, najdroższy składnik produkcji, przeznaczając ją z dala od wzrostu mięśni. Dlatego zarówno w przypadku dzieci, jak i kurcząt brojlerów, choć z bardzo różnych powodów, istnieje potrzeba zrozumienia czynników wpływających na rozwój tkanki tłuszczowej i określenia sposobów ograniczenia ekspansji tkanki tłuszczowej we wczesnym okresie życia.

Adipocyty powstają z preadipocytów, komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które ulegają różnicowaniu, aby rozwinąć dojrzałe, magazynujące lipidy komórki tłuszczowe. W związku z tym preadipocyty in vitro są cennym modelem eksperymentalnym do badań nad otyłością. Komórki te, wyizolowane z zrębowej frakcji naczyniowej magazynów tłuszczu, mogą zapewnić podstawowe zrozumienie szlaków molekularnych kontrolujących różnicowanie i metabolizm adipocytów^4,5. Zarodki piskląt są korzystnym modelem eksperymentalnym w badaniach rozwojowych, ponieważ hodowla komórek jajowych zgodnie z pożądanym harmonogramem ułatwia manipulację eksperymentalną, ponieważ umożliwia uzyskanie zarodków bez poświęcania matki w celu obserwacji szeregu etapów rozwojowych zarodków. Co więcej, skomplikowane zabiegi chirurgiczne i długie okresy czasu nie są wymagane do uzyskania zarodków w porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi. W związku z tym zarodek pisklęcia stwarza możliwość pozyskania preadipocytów już od najwcześniejszych etapów rozwoju tkanki tłuszczowej. Podskórna tkanka tłuszczowa staje się widoczna u pisklęcia około 12 dnia embrionalnego (E12) jako wyraźnie zaznaczony magazyn zlokalizowany wokół uda. Ten magazyn jest wzbogacony w wysoce proliferacyjne preadipocyty, które aktywnie ulegają różnicowaniu pod wpływem sygnałów rozwojowych, tworząc dojrzałe adipocyty^6,7. Proces różnicowania adipogennego jest porównywalny u kurcząt i ludzi. W związku z tym preadipocyty wyizolowane z zarodków piskląt mogą być wykorzystywane jako model o podwójnym przeznaczeniu do badań istotnych dla ludzi i drobiu. Jednak wydajność preadipocytów spada wraz z wiekiem, gdy komórki wyrastają na dojrzałe adipocyty⁵.

Obecny protokół optymalizuje izolację preadipocytów z tkanki tłuszczowej podczas etapu (E16-E18), w którym różnicowanie adipogenne i przerost adipocytów osiągają szczyt u zarodków piskląt brojlerów⁸. Procedura ta może ocenić wpływ czynników, na które rozwijający się zarodek jest narażony in ovo, takich jak dieta kur, na rozwój adipocytów i potencjał adipogenny ex vivo. Może również testować wpływ różnych manipulacji (np. niedotlenienia, dodatków składników odżywczych, farmakologicznych agonistów i antagonistów) na adipogenezę lub różne "omy" (np. transkryptom, metabolom, metylom) komórek progenitorowych adipocytów. Jako reprezentacja najwcześniejszego etapu powstawania tkanki tłuszczowej, komórki uzyskane przy użyciu tego protokołu są cennymi modelami do badań istotnych dla drobiu i ludzi.

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tennessee. Świeżo zapłodnione komercyjne jaja brojlerów (Cobb 500) uzyskano z lokalnej wylęgarni. Jaja inkubowano w temperaturze 38 °C przy wilgotności względnej 60% aż do sekcji w 16-18 dniu embrionalnym (E16-E18). Tkankę tłuszczową pobrano z depotu podskórnego (udowego).

1. Przygotowanie do izolacji i kultury

1. Przygotuj kaptur hodowlany i instrumenty.
   1. Przed rozpoczęciem preparacji należy ustawić obszar roboczy w okapie z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj obszar roboczy i wszystkie narzędzia, pobierając wacik z 70% etanolem. Wszystkie zabiegi wykonuj przy użyciu sterylnych materiałów.
      UWAGA: Zawsze przetrzyj pojemniki i narzędzia 70% etanolem przed umieszczeniem ich z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych. Zaleca się umieszczenie stacjonarnego sterylizatora narzędzi w kapturze, aby narzędzia można było łatwo sterylizować między zarodkami.
      UWAGA: Podczas korzystania ze sterylizatora narzędzi należy odpowiednio schłodzić gorący instrument, aby zapobiec poparzeniom i uszkodzeniu tkanek. Zalecany minimalny czas chłodzenia wynosi 3 minuty. Przed użyciem przetrzyj wacik z 70% etanolem.
   2. Zmontuj następujące narzędzia i naczynia w kapturze: kleszcze proste (120 mm), pęseta (110 mm), dwie pary kleszczyków zakrzywionych (100 mm), dwie pary prostych nożyczek (140 mm), zakrzywione nożyczki chirurgiczne (115 mm), sitko do tkanek (siatka nylonowa 250 μm), sitko do komórek (siatka nylonowa 40 μm), stożkowe probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml), szalki Petriego (60 mm i 100 mm), mała zlewka (100 ml), spray 70% etanolu i sterylna gaza, ręcznik papierowy i wycieraczka stołowa (patrz tabela materiałów).
2. Przygotuj roztwór enzymatyczny, pożywkę do zbierania i pożywkę hodowlaną, wykonując poniższe czynności.
   UWAGA: Roztwory należy przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Pożywkę należy umieścić na lodzie przed pobraniem tkanki. Wszystkie odczynniki użyte w tym kroku są wymienione w Tabeli materiałów.
   1. Przygotować pożywkę używaną zarówno do pobierania tkanki tłuszczowej, jak i przygotowania roztworu enzymatycznego, uzupełniając DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium z 2,50 mM L-glutaminy i 15 mM buforu HEPES) z 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 1x penicyliny/streptomycyny (P/S), 100 U/mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Ten nośnik pozostaje stabilny przez 1 rok przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotować roztwór sterylizacyjny, rozcieńczając betadynę do 20% (v/v) w 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem o pH 7,4, bez czerwieni wapniowej, magnezowej lub fenolowej) z 2,5 μg/ml amfoterycyny B. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 2 lata przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotować roztwór enzymatyczny, rozpuszczając kolagenazę typu 1 (1 mg / ml) w DMEM/F12 z 2,5 μg / ml amfoterycyny B i 1x P/S (krok 1.2.1). Przygotuj świeży roztwór kolagenazy i utrzymuj go na lodzie podczas sekcji. Około 10 minut przed użyciem należy wstępnie ogrzać ten roztwór poprzez inkubację w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, aby zainicjować jego aktywność enzymatyczną.
      UWAGA: Na 100 mg tkanki tłuszczowej potrzeba około 1 ml roztworu kolagenazy (1 mg/ml).
   4. Przygotuj pożywkę wzrostową używaną do posiewu i rozmnażania, uzupełniając pożywkę DMEM/F12 1x P/S i 10% FBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 1 rok przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotuj roztwór myjący, uzupełniając 1x PBS 2,5 μg/ml amfoterycyny B. Dostosuj roztwór do pożądanego pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 2 lata przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.

2. Pobieranie i trawienie tkanki tłuszczowej

1. Poddać zarodek eutanazji.
   1. W 16. dniu zarodka wyjąć jaja z inkubatora. Podstawowym potencjalnym źródłem zanieczyszczenia mikrobiologicznego jest powierzchnia jaja; Dlatego przed ich rozbiciem przetrzyj jajka sterylną gazą nasączoną 70% etanolem. Po pobraniu wacika umieść jajko pionowo spiczastym końcem w dół na małej zlewce (100 ml) wyłożonej ręcznikami papierowymi, aby zamortyzować jajko ze szkła.
   2. Za pomocą rączki kleszczy rozbij jajko, stukając w koniec jajka. Ostrożnie usunąć skorupkę jaja, aby utworzyć otwór wystarczająco duży do usunięcia zarodka (krok 2.1.3). Delikatnie rozerwij białą błonę skorupy, aby odsłonić zarodek (Ryc. 1A). Ostrożnie przekłuj owodnię za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 1B).
      UWAGA: Worek owodniowy to przezroczysta błona wypełniona płynem owodniowym, która otacza zarodek.
   3. Usuń zarodek z komórki jajowej, lekko chwytając szyję zarodka za pomocą prostych kleszczy. Odetnij woreczek żółtkowy, aby odłączyć go od zarodka, a następnie przenieś zarodek na szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
   4. Natychmiast odciąć głowę za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
2. Wykonaj pobranie tkanki tłuszczowej.
   1. Wytrzyj ciało zarodka 70% etanolem i delikatnie wyszoruj powierzchnię skóry sterylną gazą, aby usunąć pióra, ponieważ mogą one zakłócać filtrację na późniejszych etapach po strawieniu. Używaj wycieraczek stacjonarnych, aby skóra i pióra nie dotykały zebranych tkanek.
   2. Odetnij skórę między nogami i okolicą brzucha, aby odsłonić parę magazynów tłuszczu udowego.
   3. Przytrzymaj skórę wokół nogi za pomocą zakrzywionych kleszczy jedną ręką. Drugą ręką delikatnie usuń podskórną tkankę tłuszczową z kości udowej, używając zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć magazyn od nogi.
      UWAGA: Jest stosunkowo mało tkanki łącznej, która przylega do poduszki tłuszczowej do nogi, a cała poduszka tłuszczowa powinna być usuwalna w jednym kawałku za pomocą samych kleszczy. Można to ułatwić, trzymając kleszcze do tyłu, tak aby zakrzywione części (a nie końce) zaciskały poduszeczkę tłuszczową do usunięcia.
      1. W razie potrzeby odetnij poduszeczkę tłuszczową zakrzywionymi nożyczkami. W razie potrzeby powtórz z drugą poduszeczką tłuszczową i dodatkowymi zarodkami.
         UWAGA: Łącznie 80 mg podskórnej tkanki tłuszczowej można uzyskać z większości zarodków w E16 (Rysunek 1C). Zwykle daje to ~1 x 10⁶ komórek, wystarczających do pokrycia jednej kolby T-25. Na tym etapie przydatne może być zważenie poduszek tłuszczowych z kilku zarodków w celu oceny ilości materiału wyjściowego, ponieważ waga poduszek tłuszczowych może się różnić w zależności od linii brojlerów oraz z powodu niekontrolowanych czynników, takich jak wiek kur hodowlanych i dieta. Podskórny tłuszcz był rutynowo pobierany z pięciu jaj, aby zapewnić odpowiednią wydajność komórek do posiewu w wielu kolbach.
   4. Przenieś tkanki do ~5 ml pożywki zbiorczej w probówce o pojemności 15 ml i powtórz sekcję pozostałych jaj.
   5. Zebrane poduszeczki tłuszczowe należy krótko opłukać, przenosząc je na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą roztwór sterylizacyjny i kilkakrotnie obracając naczynie.
   6. Spłukać roztwór sterylizacyjny, przenosząc poduszeczki tłuszczowe na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 1x PBS. Delikatnie obracaj. Powtórz ten krok, przenosząc na drugą szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 1x PBS.
3. Wykonaj trawienie enzymatyczne i izolację preadipocytów, wykonując poniższe czynności.
   1. Przenieś tkanki tłuszczowe do probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~1 ml wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego na 100 mg tkanki. Zanurz parę długich, prostych nożyczek w probówce i drobno zmiel tkanki tłuszczowe w roztworze na jak najmniejsze kawałki (~1 mm³) (Rysunek 2A).
      UWAGA: Wydajność komórek zostanie zmniejszona, jeśli tkanki nie zostaną dokładnie zmielone.
   2. Przenieść tkankę mieloną i roztwór enzymatyczny do autoklawizowanej kolby o pojemności 25 ml. Owinąć kolbę folią parafinową. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora i wstrząsnąć w temperaturze 37 °C na etapie mineralizacji.
      UWAGA: Alternatywnie użyj kąpieli wodnej z wytrząsaniem. Przy każdym z tych podejść prędkość powinna być wystarczająca, aby zapobiec osiadaniu kawałków tkanki na dnie kolby, ale nie może być tak duża, aby kawałki były wypychane na wierzch kolby i przyklejały się do szkła lub aby płyn gromadził się na pokrywie folii parafinowej.
   3. Po ~30 minutach odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml do średnicy około 3 mm. Odpipetuj mieszaninę tkanek kilka razy w górę i w dół, aby pomóc uwolnić komórki z tkanki tłuszczowej. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze/łaźni wodnej i wznowić wstrząsanie.
   4. Po upływie dodatkowych 15 minut sprawdzić, czy kolba jest całkowicie wytrawiona. Po wyjęciu kolby z wytrząsarki, na górze warstwy płynu utworzy się warstwa białawych komórek. Jeśli fragmenty tkanki nadal pozostają, odetnij koniec z innej końcówki pipety i delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół, a następnie kontynuuj potrząsanie przez dodatkowe 15 minut
      UWAGA: Całkowicie strawiona mieszanina tkanki i kolagenazy wygląda jak mleczna treść pokarmowa. Zazwyczaj tkanka jest wystarczająco strawiona po 1 godzinie delikatnego wstrząsania. Jeśli w tym momencie pozostanie wiele fragmentów, może to wskazywać na problem z zastosowanym enzymem kolagenazy. Ciągłe potrząsanie może zwiększyć wydajność; Jednak długotrwałe narażenie na enzym i stres fizyczny może również uszkodzić komórki.
   5. Po strawieniu delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Przefiltrować przez sitko tkankowe o średnicy 250 μm do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipetowania, aby usunąć wszelkie kawałki niestrawionej tkanki i zanieczyszczeń.
      1. Przepłukać kolbę 4 ml pożywki wzrostowej, pipetując w celu usunięcia komórek, które mogą przykleić się do szkła, i przefiltrować do tej samej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać sitko dodatkową pożywką wzrostową, pipetując, aby poluzować uwięzione komórki, do całkowitej objętości 14 ml.
   6. Osadzać frakcję komórkową przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (7 minut dla probówki 50 ml).
      UWAGA: Zawsze przetrzyj probówki 70% etanolem przed powrotem do okapu do hodowli komórkowych.
   7. Odessać supernatant. Uważaj, aby nie usunąć osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (patrz Tabela materiałów) pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór zmieni kolor na czerwonawy, gdy czerwone krwinki zostaną poddane lizie (Rysunek 2B).
      UWAGA: Przed użyciem umieść bufor do lizy RBC w temperaturze pokojowej. Kurczaki mają jądrzaste czerwone krwinki⁹ i przyczepiają się do szalek z kulturą tkankową wraz z preadipocytami. Bufor do lizy RBC służy do lizy tych komórek, aby zapobiec ich interferencji z dokładną liczbą komórek.
   8. Dodać 5 ml pożywki wzrostowej do probówki zawierającej komórki, aby rozcieńczyć bufor do lizy i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Za pomocą pipety przefiltruj przez sitko o pojemności 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml i przepłucz sitko dodatkowymi 5 ml pożywki wzrostowej.
   9. Osadzanie komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zassać supernatant i ponownie zawiesić pozostałą osadkę komórkową w 1 ml pożywki wzrostowej, pipetując w górę i w dół.
      1. Użyj hemocytometru, licznika komórek i barwienia błękitem trypanowym, aby policzyć komórki i określić ich żywotność. Pobrać 10 μl próbki i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego za pomocą pipetowania. Załadować 10 μl mieszaniny do hematocytometru i zmierzyć¹⁰.
         UWAGA: Prędkości wirowania można zwiększyć do 600 x g, jeśli wystarczająca ilość komórek nie jest łatwo widoczna po początkowym wirowaniu.

3. Wysiewanie i hodowla preadipocytów

1. Nasiona ~ 1 x 10⁶ komórek w 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej w kolbie T-25. Postępuj zgodnie z tą samą gęstością posiewu, jeśli używasz innych rodzajów naczyń hodowlanych. Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych i pozostawić na noc.
   UWAGA: Komórki hoduje się w inkubatorze o temperaturze 38 °C z nawilżoną atmosferą 5% CO_{2 .} Optymalna temperatura dla wzrostu komórek ptaków¹¹ wynosi 38 °C, a rosną one powoli w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki 1x PBS przez pipetowanie w celu usunięcia nieprzyłączonych lub martwych komórek. Zastąp 4 ml świeżej pożywki wzrostowej. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Komórki powinny mieć wrzecionowaty kształt, jak fibroblasty (Rysunek 2A).
   UWAGA: Zazwyczaj preadipocyty przyczepiają się dość szybko (w ciągu kilku godzin). Powodzenie lub niepowodzenie izolacji komórek można potwierdzić w tym czasie (po 24 godzinach).
3. Zastąp 4 ml świeżej pożywki wzrostowej co 2 dni i subkulturą lub komórkami kriokonserwującymi, gdy osiągną 70%-80% konfluencji (ryc. 3C).

4. Subkulturyzacja i kriokonserwacja

1. Odessać stare podłoża i delikatnie przemyć komórki 4 ml 1x PBS przez pipetowanie. Odessać PBS, dodać 2 ml 0,1% trypsyny, aby pokryć powierzchnię komórki w kolbie T-25 (dostosować objętość odpowiednio dla innych naczyń hodowlanych), a następnie inkubować przez 3-4 minuty w temperaturze 38 °C.
   UWAGA: Obserwuj, czy komórki są odłączone od płytki hodowlanej. Delikatnie postukaj w płytkę hodowlaną, aby ułatwić odłączenie komórek. Zbyt długa inkubacja komórek z trypsyną spowoduje uszkodzenie komórek.
2. Dodaj równoważną objętość wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej, aby zahamować reakcję trypsyny. Kilkakrotnie odpipetować po powierzchni komórki, przechylając płytkę, aby poluzować pozostałe komórki.
3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (7 minut w przypadku probówki o pojemności 50 ml). Odessać supernatant.
4. W przypadku hodowli należy ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki wzrostowej, pipetując w górę iw dół. Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3.9.1, a następnie ponownie plateruj, używając tej samej gęstości posiewu, która została pierwotnie użyta w kroku 3.1.
5. W przypadku krioprezerwacji, przygotuj 4 ml pożywki do zamrażania dla kolby T-25 o 90% zlewności.
   UWAGA: Zamrażanie pożywki składają się z 10% DMSO, 30% FBS i 60% DMEM/F12.
6. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do zamrażania i przenieść 1 ml pożywki do zamrażania do kriowialu. Powoli zamrażać kriowiale do temperatury -1 °C/min za pomocą pojemnika do zamrażania. Umieść pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc, a następnie przenieś go do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
   UWAGA: Prawidłowo zamrożone preadipocyty zachowują swoją żywotność przez co najmniej 3 lata i zwykle zachowują się jak świeżo wyizolowane komórki po rozmrożeniu i platerowaniu.

5. Różnicowanie adipogenne

UWAGA: 2% płytki pokryte żelatyną mogą być używane do zwiększenia adhezji komórek.

1. Przygotować 2% (w/v) roztwór żelatyny (patrz Tabela Materiałów) w wodzie destylowanej. Autoklaw w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 minut w celu sterylizacji. Pokryj powierzchnię hodowli 5-10 μl roztworu żelatyny/^cm2 (tj. 100-200 μg/^cm2). Delikatnie zamieszaj, aby równomiernie pokryć powierzchnię.
2. Sprawdź płytki pod kątem równomiernego rozprowadzenia roztworu żelatyny, ponieważ niektóre obszary mogą początkowo pozostać niepokryte. Pozostawić płytkę pokrytą żelatyną w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Usuń całą objętość roztworu żelatyny z dołków.
   UWAGA: Pozostawi to cienką warstwę żelatyny na dnie studzienek/naczyń. Roztwór żelatyny może być wielokrotnie używany (co najmniej 10 razy) bez zmiany adhezji i wzrostu komórek. Pozostawić naczynia pokryte żelatyną do pozostawienia w kapturze do hodowli tkankowych przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.
3. Skłonić preadipocyty kurczaka do ulegania różnicowaniu adipogennemu poprzez uzupełnienie pożywki wzrostowej kwasami tłuszczowymi. Aby przygotować adipogeniczne pożywki różnicujące (ADM), uzupełnij DMEM/F12 10% surowicą kurczaka, 1x Kwas linolowy-Kwas oleinowy-Albumina (9,4 μg/ml) i 1x P/S (patrz Tabela Materiałów). Spraw, aby ADM był świeży i ciepły przed użyciem.
   UWAGA: Preadipocyty kurczaka są zwykle indukowane do różnicowania adipogennego poprzez uzupełnianie pożywki kwasami tłuszczowymi, a nie koktajlami hormonalnymi zwykle stosowanymi w przypadku adipocytów innych gatunków¹².
4. Indukuj różnicowanie, zastępując pożywkę wzrostową pożywką różnicującą adipogenną, gdy komórki osiągną ~90% konfluencji. Utrzymuj komórki w tym pożywce, wymieniając je co 2 dni. Oceń różnicowanie wizualnie pod mikroskopem (20x) na podstawie tworzenia kropelek lipidów, które stają się łatwo widoczne w ciągu 48 godzin od wywołania różnicowania.

6. Ocena adipogenezy

1. Wykonaj barwienie olejem czerwonym O, wykonując poniższe czynności.
   1. Umieść komórki w sześciodołkowej płytce i indukuj różnicowanie adipogenne przy ~90% zbieganiu.
   2. Przygotować roztwór roboczy czerwieni olejowej O, łącząc sześć części roztworu podstawowego czerwieni olejowej O, z czterema częściami wody destylowanej w probówce o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i odstawić na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltrować przez bibułę filtracyjną stopnia 1 (patrz tabela materiałów) wewnątrz lejka, powoli wlewając roztwór do probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Roztwór podstawowy czerwieni olejowej O sporządza się przez rozpuszczenie 0,7 g czerwonej oleju O (patrz tabela materiałów) w 200 ml 100% izopropanolu w autoklawowanej butelce. Dobrze wymieszaj i odstaw na 20 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C i trzymać z dala od światła do czasu użycia. Jest to stabilne przez 1 rok. Roztwór roboczy można stosować przez 3 godziny; Zaleca się jednak zużyć go w ciągu 2 godzin.
   3. Usuń pożywkę i delikatnie umyj studzienki dwukrotnie 2 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS za pomocą pipety. Całkowicie usunąć PBS przez pipetowanie. Utrwal komórki 2 ml 10% buforowanej formaliny i owiń płytkę folią parafinową. Pozostawić w temperaturze pokojowej co najmniej 1 godzinę i do 2 dni przed barwieniem.
      UWAGA: Aby przygotować 1 l 10% buforowanego roztworu formaliny, wymieszaj 100 ml 37% formaldehydu, 4,09 g NaH₂PO₄, 6,5 g Na₂HPO₄ (patrz tabela materiałów) i 900 ml wody destylowanej. Nie pipetować formaliny bezpośrednio na komórki. Delikatnie dozuj na ścianie bocznej w pobliżu dna studzienki.
   4. Usuń formalinę i delikatnie umyj studzienki 2 ml wody destylowanej. Zastąp 2 ml 60% izopropanolu. Po 5 minutach usuń izopropanol i pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia na około 10 minut. Wykonaj wszystkie etapy barwienia w temperaturze pokojowej.
   5. Dodać 1 ml roztworu roboczego Oil Red O do komórek i inkubować przez 10-20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć plamę, pipetując i umyć pięć razy, zanurzając ją w wodzie z kranu, aż nie będzie widać nadmiaru plamy. Po ostatnim płukaniu dodaj 1 ml wody do komórek przed wizualizacją barwienia i zebraniem obrazów pod mikroskopem.
   6. Aby określić ilościowo nagromadzenie lipidów na naczynie, usuń wodę i wyekstrahuj barwnik Oil Red O z komórek, dodając 1-2 ml 100% izopropanolu, który jest wystarczający do całkowitego pokrycia komórek w studzience z sześciodołkową płytką. Inkubować z delikatnym wstrząsaniem na wytrząsarce płytkowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Przenieść 200 μl ekstrakcji do studzienki z 96-dołkową płytką testową. Określić ilościowo względną ilość barwienia za pomocą czytnika płytek spektrofotometru w celu zmierzenia absorbancji przy 495 nm.
2. Wykonaj test barwienia wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów i jądra.
   1. Komórki płytki w 96-dołkowych płytkach z czarnym dnem i indukują różnicowanie adipogenne, jak opisano w kroku 5.3.
   2. Aby wybarwić komórki, dodać 200 μl roztworu barwiącego zawierającego fluorescencyjne barwienie lipidowe i fluorescencyjne barwienie DNA (patrz Tabela materiałów) w 1x PBS na studzienkę. Po obliczeniu całkowitej wymaganej objętości barwienia, dodaj dwie krople barwienia DNA i 25 μl barwienia lipidowego na ml wstępnie podgrzanego 1x PBS za pomocą rurki owiniętej folią, aby chronić roztwór przed światłem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i chronić przed światłem.
   3. Odczytać fluorescencję za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów). Wykryj barwienie lipidowe (wzbudzenie: 485 nm / emisja: 572 nm) za pomocą czerwonego filtra i barwienie DNA (wzbudzenie: 359 nm / emisja: 450 nm) przez filtr niebiesko-niebieskozielony.
      UWAGA: Barwienie można również wizualizować, a obrazy rejestrować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
   4. Znormalizuj intensywność barwienia lipidów do intensywności barwienia DNA, aby określić ilościowo akumulację lipidów w stosunku do liczby komórek¹³.

Pierwotne preadipocyty są morfologicznie podobne do fibroblastów, z nieregularnymi, gwiaździstymi kształtami i centralnym jądrem (Rysunek 2A-C). Komórki łatwo przylegają do plastiku hodowli tkankowej i zaczynają się namnażać wkrótce po przyczepieniu. Szybko różnicują się i gromadzą kropelki lipidów (Rysunek 3D), gdy są dostarczane z kwasami tłuszczowymi w pożywce. Żywotność (98%, w oparciu o wykluczenie barwnika) zgłoszona w przedstawionych tutaj izolacjach jest typowa. Chociaż komórki są dość wytrzymałe, agresywne obchodzenie się z nimi podczas izolacji prowadzi do uszkodzenia komórek (Rysunek 3E), dając komórki, które słabo się przyczepiają i nie rozmnażają się. Pomimo procedur zastosowanych w celu zapobiegania skażeniu mikrobiologicznemu, może dojść do przeniesienia materiału niesterylnego (Rysunek 3F). Ze względu na szybkie tempo wzrostu, preadipocyty zarodków piskląt zużywają glukozę w pożywce w dużych ilościach. Media powinny być wymieniane co 48 godzin, aby utrzymać ich zapas energii.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki ilustrują potencjał adipogenny preadipocytów zarodków piskląt. Komórki te szybko gromadzą się, tworząc kropelki lipidów w warunkach adipogennych, a akumulacja postępuje w czasie (Rysunek 4 i Rysunek 5). Przedstawiono dwie metody, które można wykorzystać do lepszej wizualizacji i ilościowego określenia stopnia akumulacji lipidów w tych komórkach, co jest bezpośrednim odzwierciedleniem adipogenezy. Barwienie lipidów za pomocą czerwieni olejowej O jest tanią metodą wizualizacji i ilościowego określania nagromadzenia kropelek lipidów (Rysunek 4). Do zbierania obrazów używa się mikroskopu świetlnego, a wybarwione komórki można trzymać na blacie do czasu zebrania obrazów. Nagromadzenie lipidów w każdym naczyniu komórek można określić ilościowo zgodnie z opisem, ekstrahując barwnik i odczytując absorbancję przy 495 nm za pomocą spektrofotometru. Korzystając z kombinacji wybranych barwników lipidowych i DNA, możliwe było ilościowe określenie akumulacji lipidów w stosunku do liczby komórek, co kompensuje komórki nieadipogenne, które mogą przetrwać w hodowli (Ryc. 5). Jeśli pomiary są mierzone w kilku punktach czasowych (Rysunek 5B-C), ta kombinacja umożliwia ocenę zarówno adipogenezy, jak i proliferacji, na przykład w odpowiedzi na dodane hormony lub peptydy.

Rysunek 1: Zbieranie tkanki tłuszczowej. (A) Po rozbiciu skorupki jajka ukazała się błona białej skorupy. (B) Przekłuwanie owodni za pomocą sterylnej pęsety. (C) Łącznie ~80 mg podskórnego tłuszczu kości udowej można uzyskać z E16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Fragmenty tkanek do trawienia enzymatycznego i osad komórkowy po trawieniu. (A) Mielona tkanka tłuszczowa w roztworze enzymatycznym (~1 mm3). (B) Strzałki wskazują osady komórek po lizie RBC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Porównanie morfologii komórek izolowanych pierwotnych preadipocytów. (A) Preadipocyty po 24 godzinach od izolacji. (B) Preadipocyty po 48 godzinach od izolacji. (C) Preadipocyty z 80% konfluencją po 72 godzinach od izolacji. (D) Preadipocyty po 48 h indukcji adipogennej przy pasażu 4 widoczne są kropelki lipidów. Wstawka wskazuje powiększony obraz kropelek lipidów. (E) Reprezentatywny obraz uszkodzonych komórek. (F) Strzałka wskazuje czarne pływające kropki w skażonej kulturze. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ocena akumulacji lipidów za pomocą barwienia czerwienią olejową O. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia czerwienią olejową O preadipocytów E16 po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach różnicowania adipogennego ex vivo. Podziałka = 100 μm. (B) Kwantyfikacja kropelek lipidów mierzona przez elucję barwienia czerwienią olejową O. Wartości są wyrażone jako średnia ± SD. a,b,c P < 0,05 za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z post-hocowym testem HSD Tukeya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ocena różnicowania adipocytów na podstawie barwienia lipidów/DNA. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia lipidów (czerwony) i DNA (niebieski) preadipocytów E16 po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach różnicowania adipogennego ex vivo. Podziałka = 150 μm. (B) Barwienie lipidów (wzbudzenie: 485 nm/emisja: 572 nm) przeprowadzono w celu oceny akumulacji lipidów w zróżnicowanych preadipocytach. (C) Barwienie DNA (wzbudzenie: 359 nm/emisja: 450 nm) przeprowadzono w celu oceny zmian w liczbie komórek. (D) Stosunek barwienia lipidami i DNA. Akumulacja lipidów jest znormalizowana do zawartości DNA. Wartości są wyrażone jako średnia ± SD. a,b,c P < 0,05 za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z post-hocowym testem HSD Tukeya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Średnia liczba komórek i żywotność izolowanych komórek z zarodków i piskląt po wykluciu.
Wartości są wyrażone jako średnia ± SD. a,b P < 0,05 za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z post-hoc'owym testem HSD Tukeya.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.