Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63861

⸱

4 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of Tennessee

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje prostą metodę izolowania preadipocytów z tkanki tłuszczowej w zarodkach brojlerów. Metoda ta umożliwia izolację z wysoką wydajnością, hodowlą pierwotną i różnicowaniem adipogennym preadipocytów. Barwienie czerwienią olejową O i barwienie lipidami/DNA mierzyło zdolność adipogenną izolowanych komórek indukowanych pożywką różnicującą.

Streszczenie

Pierwotne preadipocyty są cennym systemem eksperymentalnym do zrozumienia molekularnych szlaków kontrolujących różnicowanie i metabolizm adipocytów. Zarodki kurczaków dają możliwość wyizolowania preadipocytów już od najwcześniejszego etapu rozwoju tkanki tłuszczowej. Ta pierwotna komórka może być wykorzystana do identyfikacji czynników wpływających na proliferację preadipocytów i różnicowanie adipogenne, co czyni je cennym modelem do badań związanych z otyłością u dzieci i kontrolą nadmiernego odkładania się tłuszczu u drobiu. Szybki wzrost poporodowej tkanki tłuszczowej skutecznie marnuje paszę, alokując ją z dala od wzrostu mięśni u kurcząt brojlerów. Dlatego metody pozwalające zrozumieć najwcześniejsze etapy rozwoju tkanki tłuszczowej mogą dostarczyć wskazówek do regulacji tej tendencji i zidentyfikowania sposobów ograniczenia ekspansji tkanki tłuszczowej we wczesnym okresie życia. Niniejsze badanie miało na celu opracowanie skutecznej metody izolacji, hodowli pierwotnej i różnicowania adipogennego preadipocytów wyizolowanych z rozwijającej się tkanki tłuszczowej komercyjnych zarodków piskląt brojlerów (typu mięsnego). Procedura została zoptymalizowana w celu uzyskania komórek o wysokiej żywotności (~98%) i zwiększonej zdolności do różnicowania się w dojrzałe adipocyty. Ta prosta metoda izolacji, hodowli i różnicowania zarodków preadipocytów wspiera funkcjonalne analizy wzrostu i rozwoju tłuszczu we wczesnym okresie życia.

Wprowadzenie

Otyłość jest globalnym zagrożeniem dla zdrowia zarówno dorosłych, jak i dzieci. Dzieci z nadwagą lub otyłością są około pięć razy bardziej narażone na otyłość niż dorośli, co naraża je na znacznie zwiększone ryzyko chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy i wielu innych chorób współistniejących. Około 13,4% amerykańskich dzieci w wieku 2-5 lat cierpi na otyłość1, co ilustruje, że tendencja do gromadzenia nadmiaru tkanki tłuszczowej może być uruchomiona bardzo wcześnie w życiu. Z bardzo różnych powodów nagromadzenie nadmiaru tkanki tłuszczowej jest problemem dla kurcząt brojlerów (typu mięsnego). Nowoczesne brojlery są niezwykle wydajne, ale nadal gromadzą więcej lipidów, niż jest to fizjologicznie konieczne2,3. Tendencja ta zaczyna się wkrótce po wykluciu i skutecznie marnuje paszę, najdroższy składnik produkcji, przeznaczając ją z dala od wzrostu mięśni. Dlatego zarówno w przypadku dzieci, jak i kurcząt brojlerów, choć z bardzo różnych powodów, istnieje potrzeba zrozumienia czynników wpływających na rozwój tkanki tłuszczowej i określenia sposobów ograniczenia ekspansji tkanki tłuszczowej we wczesnym okresie życia.

Adipocyty powstają z preadipocytów, komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które ulegają różnicowaniu, aby rozwinąć dojrzałe, magazynujące lipidy komórki tłuszczowe. W związku z tym preadipocyty in vitro są cennym modelem eksperymentalnym do badań nad otyłością. Komórki te, wyizolowane z zrębowej frakcji naczyniowej magazynów tłuszczu, mogą zapewnić podstawowe zrozumienie szlaków molekularnych kontrolujących różnicowanie i metabolizm adipocytów4,5. Zarodki piskląt są korzystnym modelem eksperymentalnym w badaniach rozwojowych, ponieważ hodowla komórek jajowych zgodnie z pożądanym harmonogramem ułatwia manipulację eksperymentalną, ponieważ umożliwia uzyskanie zarodków bez poświęcania matki w celu obserwacji szeregu etapów rozwojowych zarodków. Co więcej, skomplikowane zabiegi chirurgiczne i długie okresy czasu nie są wymagane do uzyskania zarodków w porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi. W związku z tym zarodek pisklęcia stwarza możliwość pozyskania preadipocytów już od najwcześniejszych etapów rozwoju tkanki tłuszczowej. Podskórna tkanka tłuszczowa staje się widoczna u pisklęcia około 12 dnia embrionalnego (E12) jako wyraźnie zaznaczony magazyn zlokalizowany wokół uda. Ten magazyn jest wzbogacony w wysoce proliferacyjne preadipocyty, które aktywnie ulegają różnicowaniu pod wpływem sygnałów rozwojowych, tworząc dojrzałe adipocyty6,7. Proces różnicowania adipogennego jest porównywalny u kurcząt i ludzi. W związku z tym preadipocyty wyizolowane z zarodków piskląt mogą być wykorzystywane jako model o podwójnym przeznaczeniu do badań istotnych dla ludzi i drobiu. Jednak wydajność preadipocytów spada wraz z wiekiem, gdy komórki wyrastają na dojrzałe adipocyty5.

Obecny protokół optymalizuje izolację preadipocytów z tkanki tłuszczowej podczas etapu (E16-E18), w którym różnicowanie adipogenne i przerost adipocytów osiągają szczyt u zarodków piskląt brojlerów8. Procedura ta może ocenić wpływ czynników, na które rozwijający się zarodek jest narażony in ovo, takich jak dieta kur, na rozwój adipocytów i potencjał adipogenny ex vivo. Może również testować wpływ różnych manipulacji (np. niedotlenienia, dodatków składników odżywczych, farmakologicznych agonistów i antagonistów) na adipogenezę lub różne "omy" (np. transkryptom, metabolom, metylom) komórek progenitorowych adipocytów. Jako reprezentacja najwcześniejszego etapu powstawania tkanki tłuszczowej, komórki uzyskane przy użyciu tego protokołu są cennymi modelami do badań istotnych dla drobiu i ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tennessee. Świeżo zapłodnione komercyjne jaja brojlerów (Cobb 500) uzyskano z lokalnej wylęgarni. Jaja inkubowano w temperaturze 38 °C przy wilgotności względnej 60% aż do sekcji w 16-18 dniu embrionalnym (E16-E18). Tkankę tłuszczową pobrano z depotu podskórnego (udowego).

1. Przygotowanie do izolacji i kultury

  1. Przygotuj kaptur hodowlany i instrumenty.
    1. Przed rozpoczęciem preparacji należy ustawić obszar roboczy w okapie z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj obszar roboczy i wszystkie narzędzia, pobierając wacik z 70% etanolem. Wszystkie zabiegi wykonuj przy użyciu sterylnych materiałów.
      UWAGA: Zawsze przetrzyj pojemniki i narzędzia 70% etanolem przed umieszczeniem ich z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych. Zaleca się umieszczenie stacjonarnego sterylizatora narzędzi w kapturze, aby narzędzia można było łatwo sterylizować między zarodkami.
      UWAGA: Podczas korzystania ze sterylizatora narzędzi należy odpowiednio schłodzić gorący instrument, aby zapobiec poparzeniom i uszkodzeniu tkanek. Zalecany minimalny czas chłodzenia wynosi 3 minuty. Przed użyciem przetrzyj wacik z 70% etanolem.
    2. Zmontuj następujące narzędzia i naczynia w kapturze: kleszcze proste (120 mm), pęseta (110 mm), dwie pary kleszczyków zakrzywionych (100 mm), dwie pary prostych nożyczek (140 mm), zakrzywione nożyczki chirurgiczne (115 mm), sitko do tkanek (siatka nylonowa 250 μm), sitko do komórek (siatka nylonowa 40 μm), stożkowe probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml), szalki Petriego (60 mm i 100 mm), mała zlewka (100 ml), spray 70% etanolu i sterylna gaza, ręcznik papierowy i wycieraczka stołowa (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotuj roztwór enzymatyczny, pożywkę do zbierania i pożywkę hodowlaną, wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: Roztwory należy przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Pożywkę należy umieścić na lodzie przed pobraniem tkanki. Wszystkie odczynniki użyte w tym kroku są wymienione w Tabeli materiałów.
    1. Przygotować pożywkę używaną zarówno do pobierania tkanki tłuszczowej, jak i przygotowania roztworu enzymatycznego, uzupełniając DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium z 2,50 mM L-glutaminy i 15 mM buforu HEPES) z 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 1x penicyliny/streptomycyny (P/S), 100 U/mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Ten nośnik pozostaje stabilny przez 1 rok przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować roztwór sterylizacyjny, rozcieńczając betadynę do 20% (v/v) w 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem o pH 7,4, bez czerwieni wapniowej, magnezowej lub fenolowej) z 2,5 μg/ml amfoterycyny B. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 2 lata przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować roztwór enzymatyczny, rozpuszczając kolagenazę typu 1 (1 mg / ml) w DMEM/F12 z 2,5 μg / ml amfoterycyny B i 1x P/S (krok 1.2.1). Przygotuj świeży roztwór kolagenazy i utrzymuj go na lodzie podczas sekcji. Około 10 minut przed użyciem należy wstępnie ogrzać ten roztwór poprzez inkubację w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, aby zainicjować jego aktywność enzymatyczną.
      UWAGA: Na 100 mg tkanki tłuszczowej potrzeba około 1 ml roztworu kolagenazy (1 mg/ml).
    4. Przygotuj pożywkę wzrostową używaną do posiewu i rozmnażania, uzupełniając pożywkę DMEM/F12 1x P/S i 10% FBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 1 rok przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotuj roztwór myjący, uzupełniając 1x PBS 2,5 μg/ml amfoterycyny B. Dostosuj roztwór do pożądanego pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 2 lata przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.

2. Pobieranie i trawienie tkanki tłuszczowej

  1. Poddać zarodek eutanazji.
    1. W 16. dniu zarodka wyjąć jaja z inkubatora. Podstawowym potencjalnym źródłem zanieczyszczenia mikrobiologicznego jest powierzchnia jaja; Dlatego przed ich rozbiciem przetrzyj jajka sterylną gazą nasączoną 70% etanolem. Po pobraniu wacika umieść jajko pionowo spiczastym końcem w dół na małej zlewce (100 ml) wyłożonej ręcznikami papierowymi, aby zamortyzować jajko ze szkła.
    2. Za pomocą rączki kleszczy rozbij jajko, stukając w koniec jajka. Ostrożnie usunąć skorupkę jaja, aby utworzyć otwór wystarczająco duży do usunięcia zarodka (krok 2.1.3). Delikatnie rozerwij białą błonę skorupy, aby odsłonić zarodek (Ryc. 1A). Ostrożnie przekłuj owodnię za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 1B).
      UWAGA: Worek owodniowy to przezroczysta błona wypełniona płynem owodniowym, która otacza zarodek.
    3. Usuń zarodek z komórki jajowej, lekko chwytając szyję zarodka za pomocą prostych kleszczy. Odetnij woreczek żółtkowy, aby odłączyć go od zarodka, a następnie przenieś zarodek na szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
    4. Natychmiast odciąć głowę za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
  2. Wykonaj pobranie tkanki tłuszczowej.
    1. Wytrzyj ciało zarodka 70% etanolem i delikatnie wyszoruj powierzchnię skóry sterylną gazą, aby usunąć pióra, ponieważ mogą one zakłócać filtrację na późniejszych etapach po strawieniu. Używaj wycieraczek stacjonarnych, aby skóra i pióra nie dotykały zebranych tkanek.
    2. Odetnij skórę między nogami i okolicą brzucha, aby odsłonić parę magazynów tłuszczu udowego.
    3. Przytrzymaj skórę wokół nogi za pomocą zakrzywionych kleszczy jedną ręką. Drugą ręką delikatnie usuń podskórną tkankę tłuszczową z kości udowej, używając zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć magazyn od nogi.
      UWAGA: Jest stosunkowo mało tkanki łącznej, która przylega do poduszki tłuszczowej do nogi, a cała poduszka tłuszczowa powinna być usuwalna w jednym kawałku za pomocą samych kleszczy. Można to ułatwić, trzymając kleszcze do tyłu, tak aby zakrzywione części (a nie końce) zaciskały poduszeczkę tłuszczową do usunięcia.
      1. W razie potrzeby odetnij poduszeczkę tłuszczową zakrzywionymi nożyczkami. W razie potrzeby powtórz z drugą poduszeczką tłuszczową i dodatkowymi zarodkami.
        UWAGA: Łącznie 80 mg podskórnej tkanki tłuszczowej można uzyskać z większości zarodków w E16 (Rysunek 1C). Zwykle daje to ~1 x 106 komórek, wystarczających do pokrycia jednej kolby T-25. Na tym etapie przydatne może być zważenie poduszek tłuszczowych z kilku zarodków w celu oceny ilości materiału wyjściowego, ponieważ waga poduszek tłuszczowych może się różnić w zależności od linii brojlerów oraz z powodu niekontrolowanych czynników, takich jak wiek kur hodowlanych i dieta. Podskórny tłuszcz był rutynowo pobierany z pięciu jaj, aby zapewnić odpowiednią wydajność komórek do posiewu w wielu kolbach.
    4. Przenieś tkanki do ~5 ml pożywki zbiorczej w probówce o pojemności 15 ml i powtórz sekcję pozostałych jaj.
    5. Zebrane poduszeczki tłuszczowe należy krótko opłukać, przenosząc je na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą roztwór sterylizacyjny i kilkakrotnie obracając naczynie.
    6. Spłukać roztwór sterylizacyjny, przenosząc poduszeczki tłuszczowe na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 1x PBS. Delikatnie obracaj. Powtórz ten krok, przenosząc na drugą szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 1x PBS.
  3. Wykonaj trawienie enzymatyczne i izolację preadipocytów, wykonując poniższe czynności.
    1. Przenieś tkanki tłuszczowe do probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~1 ml wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego na 100 mg tkanki. Zanurz parę długich, prostych nożyczek w probówce i drobno zmiel tkanki tłuszczowe w roztworze na jak najmniejsze kawałki (~1 mm3) (Rysunek 2A).
      UWAGA: Wydajność komórek zostanie zmniejszona, jeśli tkanki nie zostaną dokładnie zmielone.
    2. Przenieść tkankę mieloną i roztwór enzymatyczny do autoklawizowanej kolby o pojemności 25 ml. Owinąć kolbę folią parafinową. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora i wstrząsnąć w temperaturze 37 °C na etapie mineralizacji.
      UWAGA: Alternatywnie użyj kąpieli wodnej z wytrząsaniem. Przy każdym z tych podejść prędkość powinna być wystarczająca, aby zapobiec osiadaniu kawałków tkanki na dnie kolby, ale nie może być tak duża, aby kawałki były wypychane na wierzch kolby i przyklejały się do szkła lub aby płyn gromadził się na pokrywie folii parafinowej.
    3. Po ~30 minutach odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml do średnicy około 3 mm. Odpipetuj mieszaninę tkanek kilka razy w górę i w dół, aby pomóc uwolnić komórki z tkanki tłuszczowej. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze/łaźni wodnej i wznowić wstrząsanie.
    4. Po upływie dodatkowych 15 minut sprawdzić, czy kolba jest całkowicie wytrawiona. Po wyjęciu kolby z wytrząsarki, na górze warstwy płynu utworzy się warstwa białawych komórek. Jeśli fragmenty tkanki nadal pozostają, odetnij koniec z innej końcówki pipety i delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół, a następnie kontynuuj potrząsanie przez dodatkowe 15 minut
      UWAGA: Całkowicie strawiona mieszanina tkanki i kolagenazy wygląda jak mleczna treść pokarmowa. Zazwyczaj tkanka jest wystarczająco strawiona po 1 godzinie delikatnego wstrząsania. Jeśli w tym momencie pozostanie wiele fragmentów, może to wskazywać na problem z zastosowanym enzymem kolagenazy. Ciągłe potrząsanie może zwiększyć wydajność; Jednak długotrwałe narażenie na enzym i stres fizyczny może również uszkodzić komórki.
    5. Po strawieniu delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Przefiltrować przez sitko tkankowe o średnicy 250 μm do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipetowania, aby usunąć wszelkie kawałki niestrawionej tkanki i zanieczyszczeń.
      1. Przepłukać kolbę 4 ml pożywki wzrostowej, pipetując w celu usunięcia komórek, które mogą przykleić się do szkła, i przefiltrować do tej samej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać sitko dodatkową pożywką wzrostową, pipetując, aby poluzować uwięzione komórki, do całkowitej objętości 14 ml.
    6. Osadzać frakcję komórkową przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (7 minut dla probówki 50 ml).
      UWAGA: Zawsze przetrzyj probówki 70% etanolem przed powrotem do okapu do hodowli komórkowych.
    7. Odessać supernatant. Uważaj, aby nie usunąć osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (patrz Tabela materiałów) pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór zmieni kolor na czerwonawy, gdy czerwone krwinki zostaną poddane lizie (Rysunek 2B).
      UWAGA: Przed użyciem umieść bufor do lizy RBC w temperaturze pokojowej. Kurczaki mają jądrzaste czerwone krwinki9 i przyczepiają się do szalek z kulturą tkankową wraz z preadipocytami. Bufor do lizy RBC służy do lizy tych komórek, aby zapobiec ich interferencji z dokładną liczbą komórek.
    8. Dodać 5 ml pożywki wzrostowej do probówki zawierającej komórki, aby rozcieńczyć bufor do lizy i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Za pomocą pipety przefiltruj przez sitko o pojemności 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml i przepłucz sitko dodatkowymi 5 ml pożywki wzrostowej.
    9. Osadzanie komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zassać supernatant i ponownie zawiesić pozostałą osadkę komórkową w 1 ml pożywki wzrostowej, pipetując w górę i w dół.
      1. Użyj hemocytometru, licznika komórek i barwienia błękitem trypanowym, aby policzyć komórki i określić ich żywotność. Pobrać 10 μl próbki i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego za pomocą pipetowania. Załadować 10 μl mieszaniny do hematocytometru i zmierzyć10.
        UWAGA: Prędkości wirowania można zwiększyć do 600 x g, jeśli wystarczająca ilość komórek nie jest łatwo widoczna po początkowym wirowaniu.

3. Wysiewanie i hodowla preadipocytów

  1. Nasiona ~ 1 x 106 komórek w 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej w kolbie T-25. Postępuj zgodnie z tą samą gęstością posiewu, jeśli używasz innych rodzajów naczyń hodowlanych. Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych i pozostawić na noc.
    UWAGA: Komórki hoduje się w inkubatorze o temperaturze 38 °C z nawilżoną atmosferą 5% CO2 . Optymalna temperatura dla wzrostu komórek ptaków11 wynosi 38 °C, a rosną one powoli w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki 1x PBS przez pipetowanie w celu usunięcia nieprzyłączonych lub martwych komórek. Zastąp 4 ml świeżej pożywki wzrostowej. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Komórki powinny mieć wrzecionowaty kształt, jak fibroblasty (Rysunek 2A).
    UWAGA: Zazwyczaj preadipocyty przyczepiają się dość szybko (w ciągu kilku godzin). Powodzenie lub niepowodzenie izolacji komórek można potwierdzić w tym czasie (po 24 godzinach).
  3. Zastąp 4 ml świeżej pożywki wzrostowej co 2 dni i subkulturą lub komórkami kriokonserwującymi, gdy osiągną 70%-80% konfluencji (ryc. 3C).

4. Subkulturyzacja i kriokonserwacja

  1. Odessać stare podłoża i delikatnie przemyć komórki 4 ml 1x PBS przez pipetowanie. Odessać PBS, dodać 2 ml 0,1% trypsyny, aby pokryć powierzchnię komórki w kolbie T-25 (dostosować objętość odpowiednio dla innych naczyń hodowlanych), a następnie inkubować przez 3-4 minuty w temperaturze 38 °C.
    UWAGA: Obserwuj, czy komórki są odłączone od płytki hodowlanej. Delikatnie postukaj w płytkę hodowlaną, aby ułatwić odłączenie komórek. Zbyt długa inkubacja komórek z trypsyną spowoduje uszkodzenie komórek.
  2. Dodaj równoważną objętość wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej, aby zahamować reakcję trypsyny. Kilkakrotnie odpipetować po powierzchni komórki, przechylając płytkę, aby poluzować pozostałe komórki.
  3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (7 minut w przypadku probówki o pojemności 50 ml). Odessać supernatant.
  4. W przypadku hodowli należy ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki wzrostowej, pipetując w górę iw dół. Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3.9.1, a następnie ponownie plateruj, używając tej samej gęstości posiewu, która została pierwotnie użyta w kroku 3.1.
  5. W przypadku krioprezerwacji, przygotuj 4 ml pożywki do zamrażania dla kolby T-25 o 90% zlewności.
    UWAGA: Zamrażanie pożywki składają się z 10% DMSO, 30% FBS i 60% DMEM/F12.
  6. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do zamrażania i przenieść 1 ml pożywki do zamrażania do kriowialu. Powoli zamrażać kriowiale do temperatury -1 °C/min za pomocą pojemnika do zamrażania. Umieść pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc, a następnie przenieś go do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Prawidłowo zamrożone preadipocyty zachowują swoją żywotność przez co najmniej 3 lata i zwykle zachowują się jak świeżo wyizolowane komórki po rozmrożeniu i platerowaniu.

5. Różnicowanie adipogenne

UWAGA: 2% płytki pokryte żelatyną mogą być używane do zwiększenia adhezji komórek.

  1. Przygotować 2% (w/v) roztwór żelatyny (patrz Tabela Materiałów) w wodzie destylowanej. Autoklaw w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 minut w celu sterylizacji. Pokryj powierzchnię hodowli 5-10 μl roztworu żelatyny/cm2 (tj. 100-200 μg/cm2). Delikatnie zamieszaj, aby równomiernie pokryć powierzchnię.
  2. Sprawdź płytki pod kątem równomiernego rozprowadzenia roztworu żelatyny, ponieważ niektóre obszary mogą początkowo pozostać niepokryte. Pozostawić płytkę pokrytą żelatyną w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Usuń całą objętość roztworu żelatyny z dołków.
    UWAGA: Pozostawi to cienką warstwę żelatyny na dnie studzienek/naczyń. Roztwór żelatyny może być wielokrotnie używany (co najmniej 10 razy) bez zmiany adhezji i wzrostu komórek. Pozostawić naczynia pokryte żelatyną do pozostawienia w kapturze do hodowli tkankowych przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.
  3. Skłonić preadipocyty kurczaka do ulegania różnicowaniu adipogennemu poprzez uzupełnienie pożywki wzrostowej kwasami tłuszczowymi. Aby przygotować adipogeniczne pożywki różnicujące (ADM), uzupełnij DMEM/F12 10% surowicą kurczaka, 1x Kwas linolowy-Kwas oleinowy-Albumina (9,4 μg/ml) i 1x P/S (patrz Tabela Materiałów). Spraw, aby ADM był świeży i ciepły przed użyciem.
    UWAGA: Preadipocyty kurczaka są zwykle indukowane do różnicowania adipogennego poprzez uzupełnianie pożywki kwasami tłuszczowymi, a nie koktajlami hormonalnymi zwykle stosowanymi w przypadku adipocytów innych gatunków12.
  4. Indukuj różnicowanie, zastępując pożywkę wzrostową pożywką różnicującą adipogenną, gdy komórki osiągną ~90% konfluencji. Utrzymuj komórki w tym pożywce, wymieniając je co 2 dni. Oceń różnicowanie wizualnie pod mikroskopem (20x) na podstawie tworzenia kropelek lipidów, które stają się łatwo widoczne w ciągu 48 godzin od wywołania różnicowania.

6. Ocena adipogenezy

  1. Wykonaj barwienie olejem czerwonym O, wykonując poniższe czynności.
    1. Umieść komórki w sześciodołkowej płytce i indukuj różnicowanie adipogenne przy ~90% zbieganiu.
    2. Przygotować roztwór roboczy czerwieni olejowej O, łącząc sześć części roztworu podstawowego czerwieni olejowej O, z czterema częściami wody destylowanej w probówce o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i odstawić na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltrować przez bibułę filtracyjną stopnia 1 (patrz tabela materiałów) wewnątrz lejka, powoli wlewając roztwór do probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Roztwór podstawowy czerwieni olejowej O sporządza się przez rozpuszczenie 0,7 g czerwonej oleju O (patrz tabela materiałów) w 200 ml 100% izopropanolu w autoklawowanej butelce. Dobrze wymieszaj i odstaw na 20 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C i trzymać z dala od światła do czasu użycia. Jest to stabilne przez 1 rok. Roztwór roboczy można stosować przez 3 godziny; Zaleca się jednak zużyć go w ciągu 2 godzin.
    3. Usuń pożywkę i delikatnie umyj studzienki dwukrotnie 2 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS za pomocą pipety. Całkowicie usunąć PBS przez pipetowanie. Utrwal komórki 2 ml 10% buforowanej formaliny i owiń płytkę folią parafinową. Pozostawić w temperaturze pokojowej co najmniej 1 godzinę i do 2 dni przed barwieniem.
      UWAGA: Aby przygotować 1 l 10% buforowanego roztworu formaliny, wymieszaj 100 ml 37% formaldehydu, 4,09 g NaH2PO4, 6,5 g Na2HPO4 (patrz tabela materiałów) i 900 ml wody destylowanej. Nie pipetować formaliny bezpośrednio na komórki. Delikatnie dozuj na ścianie bocznej w pobliżu dna studzienki.
    4. Usuń formalinę i delikatnie umyj studzienki 2 ml wody destylowanej. Zastąp 2 ml 60% izopropanolu. Po 5 minutach usuń izopropanol i pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia na około 10 minut. Wykonaj wszystkie etapy barwienia w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 1 ml roztworu roboczego Oil Red O do komórek i inkubować przez 10-20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć plamę, pipetując i umyć pięć razy, zanurzając ją w wodzie z kranu, aż nie będzie widać nadmiaru plamy. Po ostatnim płukaniu dodaj 1 ml wody do komórek przed wizualizacją barwienia i zebraniem obrazów pod mikroskopem.
    6. Aby określić ilościowo nagromadzenie lipidów na naczynie, usuń wodę i wyekstrahuj barwnik Oil Red O z komórek, dodając 1-2 ml 100% izopropanolu, który jest wystarczający do całkowitego pokrycia komórek w studzience z sześciodołkową płytką. Inkubować z delikatnym wstrząsaniem na wytrząsarce płytkowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Przenieść 200 μl ekstrakcji do studzienki z 96-dołkową płytką testową. Określić ilościowo względną ilość barwienia za pomocą czytnika płytek spektrofotometru w celu zmierzenia absorbancji przy 495 nm.
  2. Wykonaj test barwienia wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów i jądra.
    1. Komórki płytki w 96-dołkowych płytkach z czarnym dnem i indukują różnicowanie adipogenne, jak opisano w kroku 5.3.
    2. Aby wybarwić komórki, dodać 200 μl roztworu barwiącego zawierającego fluorescencyjne barwienie lipidowe i fluorescencyjne barwienie DNA (patrz Tabela materiałów) w 1x PBS na studzienkę. Po obliczeniu całkowitej wymaganej objętości barwienia, dodaj dwie krople barwienia DNA i 25 μl barwienia lipidowego na ml wstępnie podgrzanego 1x PBS za pomocą rurki owiniętej folią, aby chronić roztwór przed światłem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i chronić przed światłem.
    3. Odczytać fluorescencję za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów). Wykryj barwienie lipidowe (wzbudzenie: 485 nm / emisja: 572 nm) za pomocą czerwonego filtra i barwienie DNA (wzbudzenie: 359 nm / emisja: 450 nm) przez filtr niebiesko-niebieskozielony.
      UWAGA: Barwienie można również wizualizować, a obrazy rejestrować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    4. Znormalizuj intensywność barwienia lipidów do intensywności barwienia DNA, aby określić ilościowo akumulację lipidów w stosunku do liczby komórek13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne preadipocyty są morfologicznie podobne do fibroblastów, mają nieregularne, gwiaździste kształty i centralnie położone jądro (Rysunek 2A-C). Komórki te łatwo przylegają do plastiku do hodowli tkankowych i zaczynają proliferować wkrótce po adhezji. W obecności kwasów tłuszczowych w pożywce szybko różnicują się i gromadzą kropelki lipidowe (Rysunek 3D). Wykazana w prezentowanych tu izolacjach żywotność (98%, na podstawie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż kilka dobrze opisanych protokołów donosiło o izolacji preadipocytów 14,15,16,17, izolacja zarodkowych preadipocytów została zoptymalizowana, co można wykorzystać do funkcjonalnych analiz wzrostu i rozwoju tłuszczu we wczesnym okresie życia u piskląt brojlerów. Protokół ten zapewnia embrionalne komórki progenitorowe adipocytów o wysokiej żywotności i wysokim potencjale różnicowania. Co w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują UT AgResearch i Departamentowi Nauk o Zwierzętach za wsparcie i optymalizację tego protokołu. Praca ta została sfinansowana z grantu USDA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta 1 mlEppendorfZ683825Pipeta jednokanałowa, 100 - 1000 &mikro; L
1 ml Końcówka do pipetyFisher Scientific02-707-402
100% IsopropanolFisher ScientificA426P4
1x PBSGibco10010023
25 mL KolbaPyrex4980-25
37% FormaldehydFisher ScientificF75P-1GAL
6-dołkowa płytkaFalcon353046
96-dołkowa płytka testowaCostar3632
96-dołkowa płytka, czarne dno Costar3603Adipo poddana działaniu kultur tkankowych
AdipoRedLonzaPT-7009
Amfoterycyna BGibco15290026
Wycieraczka laboratoryjna (Kimtechwiper)Kimberly-Clark34155
BetadineW górę & UpNDC 116730033420% roztworem roboczym
Licznik komórekCorning6749
Sitko do komórek, 40 i mikro; mSPL93040
WirówkaEppendorf5702
Surowica z kurczakaGibco16110082
Stożkowe probówki wirówkowe, 15 mlStożkowe10025-690
, 50 mlZakrzywione352098
CryovialNunc343958
100 mmRoboz SurgicalRS-5137
Zakrzywione nożyczki chirurgiczne, 115 mmRoboz SurgicalRS-6839
MiliporedestylowanejSYNSV0000dozowane w razie potrzeby
DMEM / F12HyCloneSH30023.01
DMSOSigmaD2650
EtanolDecon Labs270170% roztwór roboczy
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco
EVOSM7000
Czytnik płytek fluorescencyjnychFolia BiotekSynergy H1
ReynoldsWrap Heavy Duty Folia aluminiowa, 125 stóp kwadratowych.
Pojemnik do zamrażaniaThermo Scientific5100-0001
Miliporażelatyny40552% roztwór roboczy
Hematocytometr (komora zliczająca)Corning480200Inkubator o głębokości 0,1 mm
Sterylizator narzędzi Fisher Scientific6845
VWRB1205
Kwas linolowy-oleinowy Acid-AlbuminaSigmaL96551x Mikroskop z roztworem roboczym
EvosAMEX1000
Pipeta wielokanałowaThermo Scientific4661070Pittery 12-kanałowe, 30 - 300 i mikro; L
Na2HPO4SigmaS-7907
NaH2PO4SigmaS-3139
NucBlueInvitrogenR37605
Oil Red OSigmaO-0625
Wytrząsarka orbitalnaIKAKS130BS1
Ręcznik papierowyTorkRK8002
ParafilmParafilm MPM996
Penicylina/Steptomycyna (P/S)Gibco151401221x Roztwór roboczy
Szalki Petriego, 100 mmSzalki Falcona351029
Petriego, 60 mmWytrząsarka351007
Bufor200
RBCRezerwator11814389001
VWR89094-680
Mała zlewka, 100 mlPyrex1000-100
Czytnik płytek spektrofotometruBiotekSynergy H1
Sterylna gazaMcKesson762703
Kleszcze proste, 120 mmRoboz SurgicalRS-4960
Nożyczki proste, 140 mmRoboz SurgicalRS-6762
T-25 KolbaCorning430639poddany kulturom tkankowym
Thermo Scientific50144906
Sitko do tkanek, 250 i mikro; mPierce87791
Trypan Blue StainGibco15250061
TrypsinGibco154000540,1% roztworu roboczego
Pęseta, 110 mmRoboz SurgicalRS-5035
Type 1 CollagenazaGibco17100017
Kąpiel wodnaFisher Scientific15-462-10
Bibuła filtracyjna Whatman klasy 1 Whatman1001-110
poddana działaniu kultur tkankowych probówki wirówkowe VWR kleszcze Falcon , wodyMikroskop fluorescencyjny 10437028 płytkowa Falcon do lizy VWR odczynników Roche Inkubator kultur tkankowych

Bibliografia

  1. Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
  2. Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
  3. Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
  4. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  5. Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
  6. Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
  7. Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
  8. Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
  9. Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
  10. Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
  11. Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
  12. Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
  13. Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
  15. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
  16. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).
  18. Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
  19. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
  20. Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906(2018).
  21. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja preadipocyt wzarodki kurcz tr nicowanie adipogennetkanka t uszczowahodowla kom rkowaakumulacja lipid wproliferacja kom rekbarwienie Oil Red Oekspresja gen wywotno kom rek
Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.