Artykuł metodologiczny

Fragmentacja hydrożeli luzem i przetwarzanie na granulowane hydrożele do zastosowań biomedycznych

DOI:

10.3791/63867

⸱

17 maja 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute, University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Colorado Boulder

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje proste, elastyczne i tanie metody wytwarzania mikrożeli z fragmentacją ekstruzji, przetwarzania mikrożeli na granulowane hydrożele do wstrzykiwania i stosowania granulowanych hydrożeli jako farb drukarskich do zastosowań biomedycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granulowane hydrożele to zakleszczone zespoły mikrocząsteczek hydrożelu (tj. "mikrożele"). W dziedzinie biomateriałów granulowane hydrożele mają wiele korzystnych właściwości, w tym wstrzykiwalność, porowatość w mikroskali i możliwość przestrajania poprzez mieszanie wielu populacji mikrożeli. Metody wytwarzania mikrożeli często opierają się na emulsjach typu woda w oleju (np. mikrofluidyka, emulsje wsadowe, elektronatryskiwanie) lub fotolitografii, które mogą wiązać się z wysokimi wymaganiami pod względem zasobów i kosztów oraz mogą nie być kompatybilne z wieloma hydrożelami. Praca ta szczegółowo opisuje proste, ale bardzo skuteczne metody wytwarzania mikrożeli za pomocą fragmentacji przez wytłaczanie i przetwarzania ich w granulowane hydrożele przydatne do zastosowań biomedycznych (np. Tusze do druku 3D). Po pierwsze, hydrożele luzem (na przykład przy użyciu fotosieciowalnego kwasu hialuronowego (HA)) są wytłaczane przez szereg igieł o sekwencyjnie mniejszych średnicach w celu utworzenia rozdrobnionych mikrożeli. Ta technika wytwarzania mikrożelu jest szybka, tania i wysoce skalowalna. Opisano metody wtłaczania mikrożeli w granulowane hydrożele za pomocą wirowania i filtracji sterowanej próżnią, z opcjonalnym sieciowaniem po usieciowaniu w celu stabilizacji hydrożelu. Wreszcie, granulowane hydrożele wytwarzane z rozdrobnionych mikrożeli są demonstrowane jako atramenty drukarskie do wytłaczania. Podczas gdy opisane tutaj przykłady wykorzystują fotosieciowalny HA do druku 3D, metody te można łatwo dostosować do szerokiej gamy rodzajów hydrożeli i zastosowań biomedycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granulowane hydrożele są wytwarzane poprzez pakowanie cząsteczek hydrożelu (tj. mikrożeli) i są ekscytującą klasą biomateriałów o wielu korzystnych właściwościach do zastosowań biomedycznych1,2,3. Ze względu na swoją strukturę cząstek, granulowane hydrożele są rozrzedzone ścinaniem i samoregenerują się, co pozwala na ich stosowanie jako atramentów do druku ekstruzyjnego (bio), granulowanych nośników do wbudowanego drukowania oraz wstrzykiwanych środków terapeutycznych4,5,6,7,8,9. Dodatkowo, pusta przestrzeń między mikrożelami zapewnia porowatość w mikroskali dla ruchu komórek i dyfuzji molekularnej8,10,11. Co więcej, wiele populacji mikrożeli można połączyć w jeden preparat, aby umożliwić zwiększenie możliwości przestrajania i funkcjonalności materiału8,10,12,13. Te ważne właściwości zmotywowały w ostatnich latach do szybkiego rozwoju hydrożelu granulowanego.

Istnieje szereg metod formowania mikrożeli w kierunku produkcji granulowanego hydrożelu, każda z własnymi zaletami i wadami. Na przykład mikrożele są często tworzone z emulsji typu woda w oleju za pomocą mikrofluidyki kropelkowej4,11,13,14,15,16,17, emulsje wsadowe7,18,19,20,21,22, lub elektronatryskiwanie6,23,24,25. Metody te pozwalają uzyskać sferyczne mikrożele o średnicy jednorodnej (mikrofluidyka) lub polidyspersyjnej (emulsje wsadowe, elektronatryskiwanie). Istnieją pewne ograniczenia dotyczące tych metod wytwarzania emulsji typu woda w oleju, w tym potencjalnie niska przepustowość produkcji, potrzeba roztworów prekursorów hydrożelowych o niskiej lepkości oraz wysokie koszty i zasoby związane z instalacją. Ponadto protokoły te mogą wymagać ostrych olejów i środków powierzchniowo czynnych, które muszą zostać wypłukane z mikrożeli przy użyciu procedur, które dodają etapy przetwarzania, i mogą być trudne do przełożenia na sterylne warunki do zastosowań biomedycznych w wielu laboratoriach. Eliminując potrzebę stosowania emulsji typu woda w oleju, można również zastosować (foto)litografię, w której formy lub fotomaski są używane do kontrolowania utwardzania mikrożeli z roztworów prekursorów hydrożelowych1,26,27. Podobnie jak w przypadku mikrofluidyki, metody te mogą mieć ograniczoną wydajność produkcyjną, co stanowi poważne wyzwanie, gdy potrzebne są duże ilości.

Jako alternatywę dla tych metod, do produkcji mikrożeli o nieregularnych rozmiarach zastosowano mechaniczne rozdrobnienie hydrożeli luzem19,28,29,30,31,32. Na przykład, hydrożele luzem mogą być wstępnie formowane, a następnie przepuszczane przez siatki lub sita w celu utworzenia rozdrobnionych mikrożeli, proces, który został przeprowadzony nawet w obecności komórek w pasmach mikrożelu33,34. Hydrożele luzem zostały również przetworzone na mikrożele z mechanicznym rozbiciem przy użyciu technik takich jak mielenie moździerza i tłuczka lub za pomocą komercyjnych blenderów35,36,37. Inni stosowali również mechaniczne mieszanie podczas tworzenia hydrożelu do wytwarzania rozdrobnionych mikrożeli (tj. płynnych żeli)31.

Opisane tutaj metody rozszerzają te techniki mechanicznej fragmentacji i prezentują proste podejście do wytwarzania mikrożeli z fragmentacją przez ekstruzję, używając jako przykładu fotosieciowalnych hydrożeli kwasu hialuronowego (HA). Fragmentacja przez wytłaczanie wykorzystuje wyłącznie strzykawki i igły do wytwarzania rozdrobnionych mikrożeli w taniej, wysokowydajnej i łatwo skalowalnej metodzie, która jest odpowiednia dla szerokiej gamy hydrożeli19,32. Ponadto opisano metody łączenia tych rozdrobnionych mikrożeli w granulowane hydrożele przy użyciu wirowania (niskie upakowanie) lub filtracji sterowanej próżnią (wysokie upakowanie). Na koniec omówiono zastosowanie tych rozdrobnionych granulowanych hydrożeli do stosowania jako atrament do wytłaczania. Celem tego protokołu jest wprowadzenie prostych metod, które można dostosować do szerokiej gamy hydrożeli i można je wdrożyć w praktycznie każdym laboratorium zainteresowanym hydrożelami granulowanymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie hydrożeli w strzykawce za pomocą fotosieciowania

UWAGA: Przegląd masowej produkcji hydrożelu wewnątrz strzykawki za pomocą fotosieciowania jest pokazany w Rysunek 1. Protokół ten wykorzystuje kwas hialuronowy modyfikowany norbornenem (NorHA) do wytwarzania hydrożeli luzem przy użyciu reakcji tiol-en, w której pośredniczy światło. Szczegółowe procedury syntezy NorHA są opisane w innym miejscu38. Jednak protokół ten można w dużym stopniu dostosować do każdego hydrożelu sieciowanego fotokrokropiśmiennie. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji.

  1. Z góry określ pożądane stężenia polimeru, środka sieciującego i inicjatorów dla masowej formuły hydrożelu. W tym protokole roztwór prekursora hydrożelu składa się z NorHA (2 wag., ~25% stopień modyfikacji norbornenu), ditiotreitolu (DTT, 6 mM) i Irgacure D-2959 (I2959, 0,05% wag.). Upewnij się, że składniki (1 ml) są całkowicie rozpuszczone w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: Podczas przygotowywania roztworu prekursora hydrożelu, do roztworu można dodać dekstran FITC-dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej (2 MDa, 0,1% wag.) w celu wizualizacji mikrożeli wytworzonych w dalszej części protokołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Załadować strzykawkę o pojemności 3 ml roztworem prekursora hydrożelu.
    1. Wyjąć tłok z tyłu pustej strzykawki o pojemności 3 ml i umieścić nasadkę końcówki na górze cylindra strzykawki.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś roztwór prekursora hydrożelu do cylindra strzykawki z nasadką końcówki.
    3. Trzymać cylinder strzykawki z roztworem prekursora hydrożelu w jednej ręce, z nasadką końcówki skierowaną w dół i otwartym końcem cylindra skierowanym do góry. Drugą ręką umieścić tłok strzykawki z powrotem w otworze z tyłu cylindra strzykawki. Delikatnie wepchnąć tłok strzykawki do cylindra, na tyle mocno, aby uszczelnić otwór z tyłu cylindra strzykawki.
    4. Ostrożnie trzymając tłok i cylinder strzykawki razem, aby upewnić się, że tylna część cylindra strzykawki jest uszczelniona tłokiem, odwróć strzykawkę tak, aby tłok był skierowany w dół, a nasadka końcówki była teraz skierowana do góry. Zdjąć nasadkę końcówki i delikatnie wepchnąć tłok do cylindra strzykawki, aż całe powietrze zostanie usunięte ze strzykawki (pozostaje tylko roztwór prekursora hydrożelowego).
    5. Ponownie założyć nasadkę końcówki na strzykawkę. Upewnij się, że roztwór prekursora hydrożelu jest zabezpieczony w strzykawce o pojemności 3 ml z nasadką z końcówką.
  3. Uformuj hydrożel luzem w strzykawce o pojemności 3 ml.
    1. Upewnij się, że podjęto odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i środki bezpieczeństwa przed włączeniem UV lamp. Obejmuje to noszenie okularów chroniących przed promieniowaniem UV i ogrodzenie obszaru lampy w celu ochrony innych przed światłem UV.
    2. Skalibruj lampę UV do utwardzania punktowego do natężenia światła 10 mW/cm2 za pomocą radiometru.
      UWAGA: Przez cylinder strzykawki będzie przechodził lekki tłumik. Przed wytwarzaniem należy określić procent obecnego tłumienia światła za pomocą radiometru. Natężenie światła emitowane przez system utwardzania punktowego powinno być odpowiednio dostosowane, aby uwzględnić takie tłumienie.
    3. Umieść strzykawkę o pojemności 3 ml wypełnioną roztworem prekursora hydrożelu pod lampą utwardzania punktowego UV na żądany czas, aby w pełni usieciować fotokropelk. W przypadku opisanego tutaj systemu, roztwór prekursora hydrożelu NorHA jest wystawiony na działanie światła UV przez 5 minut o intensywności 10 mW/cm2, co, w oparciu o wcześniejsze badania39, było wystarczająco dużo czasu i natężenia światła, aby zapewnić pełne usieciowanie, jak określono za pomocą fotosieciowania oscylacyjnego reologii ścinania w czasie.
      UWAGA: Aby zapewnić pełne fotosieciowanie w strzykawce, strzykawkę można obrócić w połowie okresu fotosieciowania.
    4. Wyłączyć lampę UV i wyjąć strzykawkę. Upewnij się, że hydrożel jest teraz usieciowany fotoseksualnie w strzykawce. Można to zrobić, odciągając tłok i obserwując, jak hydrożel porusza się jako stały blok, a nie lepka ciecz.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd wytwarzania hydrożeli w strzykawce za pomocą fotosieciowania. Rysunek przedstawia (A) usunięcie tłoka ze strzykawki, (B) przymocowanie nasadki końcówki do cylindra strzykawki, (C) dodanie prekursora hydrożelu do cylindra strzykawki, (D) powrót tłoka do strzykawki, (E) usunięcie nadmiaru powietrza i zabezpieczenie nasadki końcówki oraz (F) fotosieciowanie hydrożelu luzem wewnątrz strzykawki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wytwarzanie mikrożeli za pomocą fragmentacji ekstruzji

UWAGA: Przegląd wytwarzania mikrożeli za pomocą fragmentacji przez wytłaczanie jest pokazany w Rysunek 2.

  1. Wyjąć tłok z tyłu pustej strzykawki o pojemności 3 ml. Przymocuj nasadkę końcówki do Luer-Lock.
  2. Zdjąć nasadkę końcówki ze strzykawki zawierającej usieciowany fotożel luzem. Wyrównać górną część strzykawki z hydrożelem z otworem cylindra na pustej strzykawce.
  3. Wytłoczyć hydrożel luzem przez otwór strzykawki (bez dołączonej igły) do cylindra pustej strzykawki. Strzykawkę, która jest teraz pusta (poprzednio zawierała hydrożel) należy wyrzucić do właściwego strumienia odpadów.
  4. Trzymaj strzykawkę zawierającą wytłaczany hydrożel tak, aby nasadka końcówki była skierowana w dół, a otwór lufy był skierowany do góry. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl dodać 1,5 ml PBS do cylindra strzykawki.
  5. Wyrównać tłok strzykawki z otworem cylindra, ledwo wciskając tłok na tyle, aby uzyskać uszczelnienie. Odwrócić strzykawkę tak, aby tłok był skierowany w dół, a nasadka końcówki skierowana do góry, upewniając się, że tłok i cylinder strzykawki są trzymane razem na miejscu, tak aby nie wyciekał hydrożel lub PBS. Odwróć wiele razy, aby wymieszać rozdrobniony hydrożel z dodanym PBS.
  6. Trzymać strzykawkę w taki sposób, aby nasadka końcówki była skierowana do góry, a tłok do dołu. Zdejmij nasadkę końcówki. Bardzo delikatnie popchnąć tłok do góry, aby usunąć powietrze z wnętrza strzykawki.
    UWAGA: Prawdopodobnie z tyłu strzykawki o pojemności 3 ml będzie znajdował się rowek, który będzie wymagał dodatkowej siły, aby wepchnąć tłok. Bardzo ostrożnie popchnąć tłok przez rowek. Każda nagła lub gwałtowna siła spowoduje, że tłok będzie poruszał się zbyt szybko i prawdopodobnie wyrzuci rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową.
  7. Wytłacz rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową przez szereg igieł, aby utworzyć rozdrobnione mikrożele.
    1. Przymocować igłę o końcówce 18 G do górnej części strzykawki zawierającej rozdrobniony hydrożel i PBS. Wyjąć tłok ze świeżej strzykawki o pojemności 3 ml i przymocować nasadkę końcówki do pustego cylindra strzykawki.
    2. Wytłaczać rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową przez igłę 18 G do tylnej części pustego cylindra strzykawki. Wyrzuć pustą strzykawkę i igłę do odpowiedniego strumienia odpadów ostrych narzędzi.
    3. Trzymać strzykawkę zawierającą rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową tak, aby nasadka końcówki była skierowana w dół, a otwór lufy był skierowany do góry. Wyrównać tłok strzykawki z otworem cylindra, ledwo wciskając tłok na tyle, aby uzyskać uszczelnienie.
    4. Odwrócić strzykawkę tak, aby tłok był skierowany w dół, a nasadka końcówki skierowana do góry, upewniając się, że tłok i cylinder strzykawki są trzymane razem, aby nie wyciekał hydrożel lub PBS.
    5. Trzymać strzykawkę w taki sposób, aby nasadka końcówki była skierowana do góry, a tłok do dołu. Zdejmij nasadkę końcówki. Bardzo delikatnie popchnąć tłok do góry, aby usunąć powietrze z wnętrza strzykawki. Patrz UWAGA powyżej dotycząca delikatnego wciskania tłoka strzykawki do środka, aby zapobiec niepożądanemu wydaleniu materiału hydrożelowego.
    6. Powtórz kroki 2.7.1-2.7.5 za pomocą igły 23 G, 27 G i 30 G. Na ostatnim etapie wytłaczania (igła 30 G) wytłacz rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową do probówek do mikrowirówek. Dla objętości opisanych w niniejszym dokumencie, końcowa objętość rozdrobnionej zawiesiny hydrożelu wyniesie ~ 2,5 ml, co wymaga dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (objętość podzielona równomiernie).
      UWAGA: Nie należy używać nadmiernej siły do wytłaczania rozdrobnionej zawiesiny hydrożelowej przez igły. Aby zapewnić najlepsze praktyki bezpieczeństwa, zaleca się wykonanie wszystkich etapów fragmentacji wytłaczania wewnątrz okapu chemicznego, aby zapewnić ochronę w przypadku nadmiernego ciśnienia w strzykawce podczas wytłaczania. Ponadto proces ten można łatwo przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego/okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność podczas produkcji. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać dodatkowe sugestie dotyczące rozwiązywania problemów.
  8. Przemyć i odizolować rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową.
    UWAGA: Mycie rozdrobnionych mikrożeli pomoże usunąć wszelkie nieprzereagowane polimery i środki sieciujące. Ponadto wirowanie pomoże wyizolować mikrożele z zawiesiny poprzez utworzenie granulki.
    1. Za pomocą mikrowirówki odwirowywać rozdrobnioną zawiesinę mikrożelu o sile 5 000 x g przez 5 minut.
    2. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Dodaj 1 ml PBS do każdej probówki mikrowirówki zawierającej rozdrobnione mikrożele i wiruj przez 5-10 s.
    3. Powtórz wirowanie i mycie PBS 3x.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przegląd produkcji mikrożelu z wykorzystaniem fragmentacji ekstruzji. Rysunek przedstawia (A) wytłaczanie hydrożelu luzem do pustego cylindra strzykawki i dodawanie PBS, (B) zabezpieczanie tłoka w strzykawce rozdrobnionym hydrożelem, (C) mocowanie igły 18 G i wytłaczanie rozdrobnionej zawiesiny hydrożelu do pustego cylindra strzykawki oraz (D) powtarzanie etapów fragmentacji ekstruzji za pomocą igieł 23 G, 27 G i 30 G, Zbieranie rozdrobnionej zawiesiny hydrożelowej w probówkach mikrowirówek podczas końcowego wytłaczania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Charakterystyka rozdrobnionych mikrożeli za pomocą ImageJ

UWAGA: Przegląd charakterystyki rozdrobnionych mikrożeli za pomocą ImageJ jest pokazany w Rysunek 3, jak również reprezentatywne wyniki do opisywania rozkładów wielkości i kształtów w partii rozdrobnionych mikrożeli. Mikrożele powinny być znakowane fluorescencyjnie przed wizualizacją. Na przykład dekstran FITC-dekstran (2 MDa) o dużej masie cząsteczkowej może być zamknięty w hydrożelu luzem przed fragmentacją w celu wytworzenia mikrożeli znakowanych fluoresceiną.

  1. Połączyć 20 μl rozdrobnionej zawiesiny mikrożelu ze 180 μl PBS, aby uzyskać rozcieńczoną zawiesinę rozdrobnionego mikrożelu. Wirować, aby dokładnie wymieszać.
  2. Przenieść 50 μl rozcieńczonej zawiesiny mikrożelu na szklane szkiełko mikroskopowe.
  3. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby uzyskać obrazy znakowanych fluorescencyjnie mikrożeli przy 4- lub 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Zawiesina mikrożelu powinna być na tyle rozcieńczona, aby sąsiednie mikrożele nie stykały się ze sobą, a jednocześnie na tyle skoncentrowana, aby w rzutni widoczne były dziesiątki mikrożeli. Aby to osiągnąć, rozcieńczenie zawiesiny mikrożelu można odpowiednio dostosować.
  4. Wykorzystanie ImageJ do analizy rozdrobnionych cząstek mikrożelu. Dodatkowe informacje na temat korzystania z funkcji Analyze Particles w ImageJ można znaleźć pod linkiem znajdującym się w Tabeli Materiałów.
    1. Otwórz obrazy mikrożeli w zawiesinie w ImageJ.
    2. Wybierz opcję Analizuj > ustaw pomiary, Sprawdź obszar, Deskryptory kształtu i Średnicę Fereta. Kliknij przycisk OK.
    3. Wybierz opcję Image > Type (Typ obrazu) > 8-bitowy.
    4. Wybierz opcję Obraz > Dostosuj > próg. Dostosuj próg tak, aby mikrożele były pokryte czerwoną maską, a tło pozostało czarne. Kliknij Apply.
      UWAGA: Jeśli jakiekolwiek mikrożele nieznacznie zachodzą na siebie, użyj narzędzia Ołówek, aby narysować cienką (<5 pikseli) czarną linię między mikrożelami, aby oddzielić je na czarno-białym obrazie.
    5. Wybierz opcję Analizuj > Analizuj cząstki. Ustaw Rozmiar (piksel2) od 50-Nieskończoność, aby zredukować szumy tła. Ustaw okrągłość na 0,00-1,00. Wybierz opcję Pokaż kontury z menu rozwijanego. Sprawdź wyświetlanie wyników, wykluczanie na krawędziach i uwzględnij otwory. Pozostałe pola pozostaw niezaznaczone. Kliknij OK.
    6. Otworzy się ekran wyników, w tym obszar, deskryptory kształtu i informacje o średnicy Fereta dla każdego zidentyfikowanego mikrożelu. Skopiuj wyniki i wklej je do arkusza kalkulacyjnego.
    7. Określ równoważną średnicę kołową dla każdej cząstki.
      1. Uzyskaj skalę obrazu w μm/piksel z paska skali lub informacji o instrumencie. Utwórz kolumnę w arkuszu kalkulacyjnym, która konwertuje powierzchnię każdego mikrożelu z piksela2 na μm2.
      2. Użyj pola w μm2, aby określić równoważną średnicę kołową mikrożelu w μm (tj. weź pierwiastek kwadratowy z obszaru podzielonego przez liczbę pi, a następnie podwój go).
    8. Użyj skali μm/pikseli, aby przeliczyć średnice Fereta (tj. najdłuższą odległość między dowolnymi dwoma punktami na granicy cząstek) dla każdego mikrożelu na jednostkę μm.
    9. Wartości cyrkularności ("Circ."), proporcji ("AR"), okrągłości ("Round") i solidity dla każdego mikrożelu mogą być używane bezpośrednio z ImageJ.
    10. Przeanalizuj populację mikrożelu zgodnie z potrzebami, biorąc pod uwagę rozkład średnic (równoważny kołowy i Fereta), okrągłość, współczynnik kształtu, okrągłość i solidność.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przegląd charakterystyki rozdrobnionych cząstek mikrożelu za pomocą ImageJ. Rysunek przedstawia (A) tworzenie rozcieńczonej zawiesiny rozdrobnionych cząstek mikrożelu i używanie mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego do obrazowania mikrożeli w zawiesinie (podziałka = 500 μm), (B) konwersję do obrazu binarnego w ImageJ i analizę cząstek (liczba, deskryptory kształtu itp.) oraz (C) reprezentatywne wyniki. Słupki błędów przedstawiają miny i maksimum z wyznaczonymi zakresami kwartyla wewnętrznego. Pokazano wielkość populacji n = 100 mikrożeli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Składanie rozdrobnionych mikrożeli w granulowane hydrożele

UWAGA: Przedstawiono dwie metody formułowania granulowanych hydrożeli z rozdrobnionych mikrożeli, wykorzystujące wirowanie i filtrację. Zastosowana metoda będzie zależeć od pożądanego upakowania mikrożelu (tj. filtracja pakuje cząstki gęściej) oraz od tego, czy zawarte są składniki biologiczne (tj. wirowanie zachowa składniki między cząstkami, podczas gdy podczas filtracji mogą one zostać utracone). Wcześniejszy work40 dokładnie opisuje wyniki porównawcze (np. mechanikę, porowatość) dla granulowanych hydrożeli powstałych w wyniku filtracji wirówkowej lub próżniowej.

  1. Opcja 1: Zadżem rozdrobnione mikrożele za pomocą wirowania.
    1. Po usunięciu supernatantu PBS z ostatniego etapu mycia, dodać 1 ml PBS do każdej probówki mikrowirówki i ponownie zawiesić mikrożele.
    2. Odkręcać rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową o sile 18 000 x g przez 5 minut
      UWAGA: W razie potrzeby można użyć wolniejszych prędkości wirówki do zakleszczania mikrożeli w granulowane hydrożele o mniej gęstym upakowaniu.
    3. Usunąć supernatant PBS.
    4. Zaopatrzyć się w świeżą strzykawkę o pojemności 3 ml i usunąć tłok. Za pomocą metalowej szpatułki nabierz rozdrobniony granulowany hydrożel z probówki mikrowirówki i przenieś go do tylnej części pustego cylindra strzykawki. Końcówka do pipety może być użyta do pomocy w przenoszeniu granulowanego hydrożelu do strzykawki. Umieścić tłok z powrotem w strzykawce. Teraz załaduj rozdrobniony granulowany hydrożel do strzykawki i jest gotowy do użycia.
  2. Opcja 2: Zadżem rozdrobnione mikrożele za pomocą filtracji próżniowej. Przegląd zagłuszania przez filtrację sterowaną podciśnieniem jest przedstawiony w Rysunek 4.
    1. Zmontuj i przetestuj próżniowe urządzenie filtrujące.
      1. Zabezpiecz lejek Buchnera wewnątrz kolby filtracyjnej, umieszczając adapter filtra między lejkiem a otworem kolby.
      2. Użyj rurki, aby podłączyć kolbę filtra do przewodu próżniowego.
      3. Umieść filtr membranowy (0.22 μm) w kubku lejkowym Buchnera.
      4. Włącz przewód podciśnieniowy, otwierając zawór zegarowy. Sprawdzić połączenie, pipetując ~0,5 ml PBS na filtr membranowy i obserwować, czy cały PBS przechodzi przez filtr i zbiera się na dnie kolby filtracyjnej.
    2. Włącz przewód podciśnieniowy i upewnij się, że jest całkowicie uszczelniony. Zwirować rozdrobnioną zawiesinę hydrożelową tak, aby mikrożele były zawieszone w PBS.
    3. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieść rozdrobnioną zawiesinę hydrożelu na filtr membranowy (0,22 μm). Po przeniesieniu całej zawiesiny mikrożelu odczekaj ~30 s, aż próżnia wyciągnie PBS z rozdrobnionej zawiesiny hydrożelowej. Wyłącz przewód podciśnieniowy.
      UWAGA: Czas, w którym rozdrobniona zawiesina hydrożelowa pozostaje na filtrze membranowym podczas wysysania podciśnienia, może być różny. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji i sugestie dotyczące rozwiązywania problemów.
    4. Zaopatrzyć się w świeżą strzykawkę o pojemności 3 ml i usunąć tłok. Za pomocą metalowej szpatułki nabrać rozdrobniony granulowany hydrożel z filtra i przenieść go do tylnej części pustego cylindra strzykawki. Końcówka do pipety może być użyta do pomocy w przenoszeniu granulowanego hydrożelu do strzykawki. Umieścić tłok z powrotem w strzykawce. Załaduj rozdrobniony granulowany hydrożel do strzykawki i jest on gotowy do użycia.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Przegląd zagłuszania mikrożeli za pomocą filtracji sterowanej próżnią w celu wytworzenia ciasno upakowanych rozdrobnionych granulowanych hydrożeli. Rysunek przedstawia (A) umieszczenie filtra membranowego na aparacie filtracji próżniowej, (B) użycie pipety do przeniesienia rozdrobnionej zawiesiny mikrożelu na filtr, (C) pociągnięcie próżni i oczekiwanie, aż mikrożele zatną się i utworzą granulowany hydrożel, (D) wyłączenie próżni i usunięcie rozdrobnionego granulowanego hydrożelu za pomocą metalowej szpatułki, oraz (E) za pomocą metalowej szpatułki przenieść granulowany hydrożel do strzykawki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Druk ekstruzyjny z użyciem granulowanych atramentów hydrożelowych

UWAGA: Przegląd procesu drukowania ekstruzyjnego jest pokazany w Rysunek 5, w tym reprezentatywny wydruk konstrukcji w kształcie gwiazdy przy użyciu rozdrobnionych granulowanych hydrożeli zablokowanych przez filtrację sterowaną próżnią. Przepływ pracy drukowania składa się z formułowania atramentu, planowania projektu druku, a następnie drukowania atramentu na podstawie żądanego projektu41. W razie potrzeby, drukowane granulowane konstrukcje hydrożelowe można ustabilizować za pomocą fotosieciowania po wytłaczeniu, dodając nadmiar DTT (5 mM) i I2959 (0,05 wag.) do rozdrobnionej zawiesiny mikrożelu przed zakleszczeniem. Spowoduje to powstanie fotousieciowanych wiązań kowalencyjnych utworzonych między mikrożelami, co doprowadzi do trwałej stabilizacji granulowanego konstruktu hydrożelowego.

  1. Receptura atramentu
    1. Podczas procesu planowania należy pamiętać o właściwościach tuszu, który ma być użyty. Aby scharakteryzować farbę, należy przeprowadzić analizę reologiczną rozdrobnionych hydrożeli, aby pomóc w procesie projektowania druku. Metody opisujące charakterystykę reologiczną granulowanych hydrożeli są opisane w innym miejscu i mogą być dostosowane do tego badania40.
    2. Z analizy reologicznej wybierz platformę drukującą i serię początkowych parametrów druku.
      UWAGA: Ze względu na ogólną wysoką lepkość i właściwości rozrzedzania przy ścinaniu granulowanych atramentów hydrożelowych, zwykle stosuje się drukarki do wytłaczania śrubowego.
  2. Projekt druku
    UWAGA: Oprogramowanie Repetier Host (zwane dalej oprogramowaniem do drukowania 3D) jest używane do zastosowań związanych z drukowaniem 3D (kroki 5.2-5.3).
    1. Twórz projekty do druku za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Użytkownicy mogą tworzyć nowatorskie projekty od podstaw lub modyfikować istniejące projekty, na przykład na podstawie skanów tkanek pacjenta lub innych użytkowników. Aby uzyskać więcej informacji na temat tworzenia projektów CAD, zapoznaj się z następującymi odnośnikami41,42,43.
    2. Aby przetworzyć modele CAD do G-Code, upewnij się, że plik CAD jest zapisany w formacie ".stl" (plik uzupełniający 1) i przesłany do oprogramowania do drukowania 3D, wybierając przycisk ładowania w górnym panelu lub wybierając Plik > Załaduj na pasku menu. Ten kod G określa ścieżkę drukowania dla osadzania atramentu. Przykładowy plik .stl pustego cylindra został dołączony do plików uzupełniających.
    3. Po przesłaniu pliku STL do oprogramowania do drukowania 3D przejdź do panelu Slicer i wybierz Slic3r jako opcję slicera. W tym miejscu ustawienia, takie jak średnica dyszy, wysokość warstwy, prędkość drukowania i szybkość wytłaczania, można dostosować w oparciu o charakterystykę atramentu i pożądane wyniki drukowania. W tym protokole stosuje się igłę 18 G (średnica wewnętrzna 838 μm). Wysokość warstwy jest ustawiona na 1 mm, prędkość drukowania jest ustawiona na 8 mm/s, a natężenie przepływu jest ustawione na 9 μl/s, w oparciu o poprzednią optymalizację39. Wartości liczbowe parametrów można dostosować o ± 20% w celu uwzględnienia różnic we właściwościach granulowanych farb hydrożelowych.
      UWAGA: Należy pamiętać, że te ustawienia i projekt wydruku mogą wymagać dostosowania za pomocą iteracyjnych testów eksperymentalnych, w zależności od zmian w recepturze atramentu, żądanej rozdzielczości druku lub używanej platformie drukowania. Więcej informacji na temat tych parametrów, a także na temat charakterystyki ustawień druku za pomocą nowatorskiej formuły atramentu, można znaleźć w innych źródłach40,44,45,46.
  3. Druk ekstruzyjny z rozdrobnionymi granulowanymi hydrożelami
    1. Aby zapoznać się z ładowaniem strzykawek z rozdrobnionymi granulowanymi hydrożelami, patrz 4.2.4, a także Rysunek 4 i Rysunek 5.
    2. Zdejmij nasadkę końcówki i zastąp ją wybraną igłą.
    3. Załadować strzykawkę do wybranej platformy drukującej. W tym przypadku używana jest niestandardowa drukarka do wytłaczania na bazie.
      UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat tworzenia niestandardowych bioprinterów, zobacz inne referencje44,47.
    4. Załaduj przygotowany plik G-Code z fazy planowania do oprogramowania do druku 3D. Przejdź do panelu Podgląd wydruku i naciśnij przycisk Drukuj.
    5. Jak tylko osadzanie drukowania zostanie zakończone, wystaw rozdrobnione granulowane konstrukcje hydrożelowe na działanie światła UV w celu fotosieciowania i stabilizacji.
    6. Po zakończeniu sieciowania przetworzyć próbkę, myjąc ją trzykrotnie w PBS.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Przegląd druku ekstruzyjnego z rozdrobnionymi granulowanymi hydrożelami. Rysunek przedstawia (A) użycie szpatułki do przeniesienia rozdrobnionego granulowanego hydrożelu do cylindra strzykawki, (B) przymocowanie igły z końcówką (pokazano 18 G) i wypchnięcie próbki na górę, (C) grafikę przedstawiającą połączenie z oprogramowaniem komputerowym do drukowania oraz (D) zakończenie drukowania konstrukcji w kształcie gwiazdy za pomocą rozdrobnionego granulowanego hydrożelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki z tych protokołów są pokazane w Rysunek 3 i Rysunek 6. W wyniku fragmentacji przez wytłaczanie powstają mikrożele o postrzępionych, wielokątnych kształtach o średnicach od 10 do 300 μm (Rysunek 3). Co więcej, okrągłość waha się od 0,2 (nie kołowa) do prawie 1 (idealne koło), a współczynnik proporcji waha się od 1 do 3 (Rysunek 3). Parametry te opisują nieregularne i postrzępione kształty mikrożelu po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisano metody wytwarzania granulowanych hydrożeli przy użyciu wytłaczania rozdrobnionych mikrożeli i pakowania przez wirowanie lub filtrację próżniową. W porównaniu z innymi metodami wytwarzania mikrożeli (tj. mikrofluidyką, emulsjami wsadowymi, elektronatryskiwaniem, fotolitografią), wytwarzanie mikrożeli przez fragmentację przez wytłaczanie jest bardzo szybkie, tanie, łatwo skalowalne i podatne na szeroką gamę systemów hydrożelowych. Co więcej, protokół ten jest wysoce powtarzalny przy minimalnej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation poprzez program UPenn MRSEC (DMR-1720530) oraz stypendia naukowe dla absolwentów (dla V.G.M i M.E.P.) oraz National Institutes of Health (R01AR077362 dla J.A.B.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml plastikowa stożkowa probówka wirówkowaCorning430766
30 G NT Premium Series Końcówka dozującaJensen GlobalJG30-0.5HPXPodany tutaj numer katalogowy dotyczy igły 30 G, 0,5 ". Dostępne są różne rozmiary.
Jednorazowe strzykawki BD z końcówkami Luer-Lok (3 ml)Fisher Scientific14-823-435Podany tutaj numer katalogowy dotyczy strzykawki 3 ml. Dostępne są różne rozmiary (14-823-XXX).
Czarne folderyRóżni dostawcy Jednorazowa
igła sondy do użytku ze strzykawkami i maszynami dozującymi (18 G, 0,5 ")Grainger5FVH5Podany tutaj numer katalogowy dotyczy igły 18 G, 0,5". Dostępne są różne rozmiary.
Jednorazowa igła do sondy do użytku ze strzykawkami i automatami dozującymi (23 G, 0,5 ")Jednorazowa igłaGrainger5FVJ3
do użytku ze strzykawkami i maszynami dozującymi (27 G, 1,5 ")Grainger5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineFisher Scientific14190-250Podany tutaj numer katalogowy dotyczy pudełka 10 butelek o pojemności 500 ml.
Filtr membranowy Durapore, 0,22 i mikro; mMilliporeGVWP04700
Mikroskop epifluorescencyjny lub konfokalnyRóżni dostawcyDo wizualizacji mikrożeli i granulowanych hydrożeli
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock ProbówkiFisher Scientific05-402-25
Drukarka do wytłaczaniaBudowanaMożna używać innych drukarek do wytłaczania, takich jak dostępne na rynku BIOX.
Adaptery filtrówFisher Scientific05-888-107Podany tutaj numer katalogowy dotyczy zestawu wielu rozmiarów. Dostępne są różne rozmiary (05-888-XXX).
Kolba filtrującaRóżni dostawcy
Izotiocyjanian fluoresceiny (2 MDa)Sigma-Aldrich52471
Szklane szkiełko mikroskopoweRóżni dostawcy
ImageJNational Institutes of HealthLink do informacji o "Analizuj cząstki": https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
LaptopRóżni dostawcy
Nasadki końcówek Luer-LockZintegrowane rozwiązania dozujące 9991329
Metalowa szpatułka do nabieraniaRóżni dostawcy
MikrowirówkiRóżni dostawcyMożliwość prędkości do 18 000 x g
Microscoft ExeclMicrosoftMożna korzystać z innych programów, takich jak Google Slides.
OmniCure S2000 Punktowy system utwardzania UVExcelitas TechnologiesS2000W razie potrzeby do wytwarzania hydrożeli luzem można użyć różnych systemów oświetleniowych.
Porcelanowy lejek Buchner ze stałą perforowaną płytkąFisher ScientificFB966CNumer katalogowy podany tutaj dotyczy płyty o średnicy 56 mm. Dostępne są różne rozmiary.
RadiometerRóżni dostawcy
Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGOprogramowanie do druku 3D
Drukarka do wytłaczania na bazieRóżni dostawcyW tym badaniu wykorzystano niestandardowo zmodyfikowaną drukarkę 3D FDM (Velleman K8200). Dostępnych jest wiele alternatyw.
Oprogramowanie Solidworks/CADDassault Systè mes SolidWorks CorporationMożna korzystać z innych programów, takich jak Blender lub TinkerCAD.
Rurki do podłączenia kolby filtra do linii próżniowejRóżni dostawcy
Ochrona oczu przed promieniowaniem UV (tj. okulary ochronne)Różni dostawcy
do sondy na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008(2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929(2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644(2021).
  9. Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).
  11. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520(2019).
  14. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725(2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004(2013).
  28. Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191(2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).
  30. Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162(2021).
  32. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087(2018).
  34. Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419(2020).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115(2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069(2019).
  45. Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606(2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372(2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
  48. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Granular HydrogelsHydrogel FragmentationMicrogel FabricationExtrusion FragmentationBulk HydrogelsVacuum FiltrationCentrifugation MethodInjectable Hydrogels3D Printing InksBiomedical Applications

Powiązane artykuły