Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fragmentacja hydrożeli luzem i przetwarzanie na granulowane hydrożele do zastosowań biomedycznych

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63867

⸱

17 maja 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute, University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Colorado Boulder

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje proste, elastyczne i tanie metody wytwarzania mikrożeli z fragmentacją ekstruzji, przetwarzania mikrożeli na granulowane hydrożele do wstrzykiwania i stosowania granulowanych hydrożeli jako farb drukarskich do zastosowań biomedycznych.

Streszczenie

Granulowane hydrożele to zakleszczone zespoły mikrocząsteczek hydrożelu (tj. "mikrożele"). W dziedzinie biomateriałów granulowane hydrożele mają wiele korzystnych właściwości, w tym wstrzykiwalność, porowatość w mikroskali i możliwość przestrajania poprzez mieszanie wielu populacji mikrożeli. Metody wytwarzania mikrożeli często opierają się na emulsjach typu woda w oleju (np. mikrofluidyka, emulsje wsadowe, elektronatryskiwanie) lub fotolitografii, które mogą wiązać się z wysokimi wymaganiami pod względem zasobów i kosztów oraz mogą nie być kompatybilne z wieloma hydrożelami. Praca ta szczegółowo opisuje proste, ale bardzo skuteczne metody wytwarzania mikrożeli za pomocą fragmentacji przez wytłaczanie i przetwarzania ich w granulowane hydrożele przydatne do zastosowań biomedycznych (np. Tusze do druku 3D). Po pierwsze, hydrożele luzem (na przykład przy użyciu fotosieciowalnego kwasu hialuronowego (HA)) są wytłaczane przez szereg igieł o sekwencyjnie mniejszych średnicach w celu utworzenia rozdrobnionych mikrożeli. Ta technika wytwarzania mikrożelu jest szybka, tania i wysoce skalowalna. Opisano metody wtłaczania mikrożeli w granulowane hydrożele za pomocą wirowania i filtracji sterowanej próżnią, z opcjonalnym sieciowaniem po usieciowaniu w celu stabilizacji hydrożelu. Wreszcie, granulowane hydrożele wytwarzane z rozdrobnionych mikrożeli są demonstrowane jako atramenty drukarskie do wytłaczania. Podczas gdy opisane tutaj przykłady wykorzystują fotosieciowalny HA do druku 3D, metody te można łatwo dostosować do szerokiej gamy rodzajów hydrożeli i zastosowań biomedycznych.

Wprowadzenie

Granulowane hydrożele są wytwarzane poprzez pakowanie cząsteczek hydrożelu (tj. mikrożeli) i są ekscytującą klasą biomateriałów o wielu korzystnych właściwościach do zastosowań biomedycznych1,2,3. Ze względu na swoją strukturę cząstek, granulowane hydrożele są rozrzedzone ścinaniem i samoregenerują się, co pozwala na ich stosowanie jako atramentów do druku ekstruzyjnego (bio), granulowanych nośników do wbudowanego drukowania oraz wstrzykiwanych środków terapeutycznych4,5,6,7,8,9. Dodatkowo, pusta przestrzeń między mikrożelami zapewnia porowatość w mikroskali dla ruchu komórek i dyfuzji molekularnej8,10,11. Co więcej, wiele populacji mikrożeli można połączyć w jeden preparat, aby umożliwić zwiększenie możliwości przestrajania i funkcjonalności materiału8,10,12,13. Te ważne właściwości zmotywowały w ostatnich latach do szybkiego rozwoju hydrożelu granulowanego.

Istnieje szereg metod formowania mikrożeli w kierunku produkcji granulowanego hydrożelu, każda z własnymi zaletami i wadami. Na przykład mikrożele są często tworzone z emulsji typu woda w oleju za pomocą mikrofluidyki kropelkowej4,11,13,14,15,16,17, emulsje wsadowe7,18,19,20,21,22, lub elektronatryskiwanie6,23,24,25. Metody te pozwalają uzyskać sferyczne mikrożele o średnicy jednorodnej (mikrofluidyka) lub polidyspersyjnej (emulsje wsadowe, elektronatryskiwanie). Istnieją pewne ograniczenia dotyczące tych metod wytwarzania emulsji typu woda w oleju, w tym potencjalnie niska przepustowość produkcji, potrzeba roztworów prekursorów hydrożelowych o niskiej lepkości oraz wysokie koszty i zasoby związane z instalacją. Ponadto protokoły te mogą wymagać ostrych olejów i środków powierzchniowo czynnych, które muszą zostać wypłukane z mikrożeli przy użyciu procedur, które dodają etapy przetwarzania, i mogą być trudne do przełożenia na sterylne warunki do zastosowań biomedycznych w wielu laboratoriach. Eliminując potrzebę stosowania emulsji typu woda w oleju, można również zastosować (foto)litografię, w której formy lub fotomaski są używane do kontrolowania utwardzania mikrożeli z roztworów prekursorów hydrożelowych1,26,27. Podobnie jak w przypadku mikrofluidyki, metody te mogą mieć ograniczoną wydajność produkcyjną, co stanowi poważne wyzwanie, gdy potrzebne są duże ilości.

Jako alternatywę dla tych metod, do produkcji mikrożeli o nieregularnych rozmiarach zastosowano mechaniczne rozdrobnienie hydrożeli luzem19,28,29,30,31,32. Na przykład, hydrożele luzem mogą być wstępnie formowane, a następnie przepuszczane przez siatki lub sita w celu utworzenia rozdrobnionych mikrożeli, proces, który został przeprowadzony nawet w obecności komórek w pasmach mikrożelu33,34. Hydrożele luzem zostały również przetworzone na mikrożele z mechanicznym rozbiciem przy użyciu technik takich jak mielenie moździerza i tłuczka lub za pomocą komercyjnych blenderów35,36,37. Inni stosowali również mechaniczne mieszanie podczas tworzenia hydrożelu do wytwarzania rozdrobnionych mikrożeli (tj. płynnych żeli)31.

Opisane tutaj metody rozszerzają te techniki mechanicznej fragmentacji i prezentują proste podejście do wytwarzania mikrożeli z fragmentacją przez ekstruzję, używając jako przykładu fotosieciowalnych hydrożeli kwasu hialuronowego (HA). Fragmentacja przez wytłaczanie wykorzystuje wyłącznie strzykawki i igły do wytwarzania rozdrobnionych mikrożeli w taniej, wysokowydajnej i łatwo skalowalnej metodzie, która jest odpowiednia dla szerokiej gamy hydrożeli19,32. Ponadto opisano metody łączenia tych rozdrobnionych mikrożeli w granulowane hydrożele przy użyciu wirowania (niskie upakowanie) lub filtracji sterowanej próżnią (wysokie upakowanie). Na koniec omówiono zastosowanie tych rozdrobnionych granulowanych hydrożeli do stosowania jako atrament do wytłaczania. Celem tego protokołu jest wprowadzenie prostych metod, które można dostosować do szerokiej gamy hydrożeli i można je wdrożyć w praktycznie każdym laboratorium zainteresowanym hydrożelami granulowanymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wytwarzanie hydrożeli masowych wewnątrz strzykawki za pomocą fotousieciowania

UWAGA: Przegląd procesu wytwarzania hydrożelu masowego wewnątrz strzykawki przy użyciu fotousieciowania przedstawiono na Rysunku 1. Niniejszy protokół wykorzystuje kwas hialuronowy modyfikowany norbornenem (NorHA) do wytwarzania hydrożeli masowych przy użyciu reakcji tiol-en indukowanej światłem. Szczegółowe procedury syntezy NorHA opisano w innym opracowaniu38. Protokół ten jest jednak w wysokim stopniu adaptowalny do każdego hydrożelu podatnego na fotousieciowanie. Więcej informacji znajduje się w sekcji Dyskusja.

  1. Wyznacz pożądane stężenia polimeru, sieciowania i inicjatorów dla formulacji hydrożelu objętościowego. W niniejszym protokole roztwór prekursora hydrożelu składa się z NorHA (2 wt.%, ~25% stopień modyfikacji norbornenowej), ditiotreitolu (DTT, 6 mM) oraz Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 wt.%). Upewnij się, że składniki (1 mL) są całkowicie rozpuszczone w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w probówce do mikrocentryfugi.
    UWAGA: Podczas przygotowywania roztworu prekursora hydrożelu do roztworu można dodać wysokocząsteczkowy FITC-dekstran (2 MDa, 0,1 wt.%), aby umożliwić późniejszą wizualizację wytworzonych mikrogeli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Napełnij strzykawkę 3 mL roztworem prekursora hydrożelu.
    1. Wyjmij tłok z tyłu pustej strzykawki 3 mL i nałóż zatyczkę na końcówkę korpusu strzykawki.
    2. Za pomocą pipety 1 000 µL przenieś roztwór prekursora hydrożelu do korpusu strzykawki z nałożoną zatyczką.
    3. Trzymając korpus strzykawki z roztworem prekursora hydrożelu w jednej ręce, z zatyczką skierowaną w dół, a otwartym końcem korpusu do góry, drugą ręką wprowadź tłok strzykawki do otworu z tyłu korpusu. Delikatnie dociśnij tłok do korpusu, na tyle, aby uszczelnić otwór z tyłu strzykawki.
    4. Trzymając ostrożnie tłok i korpus strzykawki razem, aby upewnić się, że tył korpusu jest uszczelniony tłokiem, odwróć strzykawkę tak, aby tłok był skierowany w dół, a zatyczka w górę. Zdejmij zatyczkę i delikatnie pchaj tłok do wnętrza korpusu, aż z strzykawki zostanie usunięte całe powietrze (powinien pozostać tylko roztwór prekursora hydrożelu).
    5. Ponownie nałóż zatyczkę na strzykawkę. Upewnij się, że roztwór prekursora hydrożelu jest zabezpieczony w strzykawce 3 mL z zatyczką.
  3. Utwórz hydrożel objętościowy wewnątrz strzykawki 3 mL.
    1. Przed włączeniem lampy UV upewnij się, że zastosowano odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i zabezpieczenia. Obejmuje to noszenie okularów chroniących przed promieniowaniem UV oraz osłonięcie obszaru lampy, aby chronić inne osoby przed światłem UV.
    2. Zkalibruj lampę UV do utwardzania punktowego do natężenia światła 10 mW/cm2 za pomocą radiometru.
      UWAGA: Przez korpus strzykawki nastąpi tłumienie światła. Przed rozpoczęciem procesu określ za pomocą radiometru procentowe tłumienie światła. Wyjściowe natężenie światła z systemu utwardzania punktowego powinno zostać odpowiednio dostosowane, aby uwzględnić to tłumienie.
    3. Umieść strzykawkę 3 mL wypełnioną roztworem prekursora hydrożelu pod lampą UV do utwardzania punktowego na pożądany czas w celu pełnego sieciowania fotochemicznego. Dla opisanego tutaj systemu roztwór prekursora hydrożelu NorHA jest naświetlany światłem UV przez 5 min przy natężeniu 10 mW/cm2, co w oparciu o wcześniejsze badania39 okazało się wystarczającym czasem i natężeniem światła, aby zapewnić całkowite sieciowanie, co potwierdzono w badaniach reologicznych czasu przemieszczania się ścinania oscylacyjnego podczas fotosiieciowania.
      UWAGA: Aby zapewnić całkowite fotosiieciowanie wewnątrz strzykawki, można ją obrócić w połowie czasu naświetlania.
    4. Wyłącz lampę UV i wyjmij strzykawkę. Upewnij się, że hydrożel w strzykawce został poddany fotosiieciowaniu. Można to sprawdzić, cofając tłok i obserwując, czy hydrożel przemieszcza się jako ciało stałe, a nie jako lepka ciecz.

Schemat procesu chromatografii; filtracja strzykawkowa; oczyszczanie białek; analiza fluorescencyjna.
Rysunek 1: Przegląd procesu wytwarzania objętościowych hydrożeli w strzykawce przy użyciu fotousieciowania. Rysunek przedstawia (A) wyjmowanie tłoka ze strzykawki, (B) mocowanie nasadki końcówki do korpusu strzykawki, (C) dodawanie prekursora hydrożelu do korpusu strzykawki, (D) ponowne włożenie tłoka do strzykawki, (E) usuwanie nadmiaru powietrza i zabezpieczenie nasadki końcówki oraz (F) fotousieciowanie objętościowego hydrożelu wewnątrz strzykawki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Wytwarzanie mikrogeli metodą fragmentacji ekstruzyjnej

UWAGA: Przegląd procesu wytwarzania mikrożeli z wykorzystaniem fragmentacji ekstruzyjnej przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Wyjąć tłok z tyłu pustej strzykawki 3 mL. Zamocować nasadkę do złącza Luer-Lock.
  2. Zdjąć nasadkę ze strzykawki zawierającej fotousieciowany hydrożel masowy. Ustawić górną część strzykawki z hydrożelem w linii z otworem cylindra pustej strzykawki.
  3. Wytłoczyć hydrożel masowy przez otwór strzykawki (bez załączonej igły) do cylindra pustej strzykawki. Prawidłowo zutylizować pustą strzykawkę (tę, która wcześniej zawierała hydrożel) w odpowiednim strumieniu odpadów.
  4. Trzymać strzykawkę z wytłoczonym hydrożelem tak, aby nasadka była skierowana w dół, a otwór cylindra w górę. Za pomocą pipety 1 000 µL dodać 1,5 mL PBS do cylindra strzykawki.
  5. Dopasować tłok strzykawki do otworu cylindra, wsuwając go tylko na tyle, aby stworzyć uszczelnienie. Odwrócić strzykawkę tak, aby tłok był skierowany w dół, a nasadka w górę, dbając o to, by trzymać tłok i cylinder strzykawki razem, aby nie wyciekł hydrożel ani PBS. Odwracać wielokrotnie, aby wymieszać pofragmentowany hydrożel z dodanym PBS.
  6. Trzymać strzykawkę tak, aby nasadka była skierowana w górę, a tłok w dół. Zdjąć nasadkę. Bardzo delikatnie pchnąć tłok w górę, aby usunąć powietrze z wnętrza strzykawki.
    UWAGA: Z tyłu strzykawki 3 mL prawdopodobnie znajduje się rowek, który wymaga użycia większej siły przy wsuwaniu tłoka. Bardzo ostrożnie pchnąć tłok przez rowek. Każde nagłe lub zbyt silne użycie siły spowoduje zbyt szybki ruch tłoka i może doprowadzić do wyrzucenia zawiesiny pofragmentowanego hydrożelu.
  7. Wytłoczyć zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu przez serię igieł, aby utworzyć pofragmentowane mikrożele.
    1. Zamocować igłę tępą 18 G do góry strzykawki zawierającej pofragmentowany hydrożel i PBS. Wyjąć tłok z nowej strzykawki 3 mL i zamocować nasadkę do pustego cylindra strzykawki.
    2. Wytłoczyć zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu przez igłę 18 G do tyłu pustego cylindra strzykawki. Zutylizować pustą strzykawkę i igłę w odpowiednim strumieniu odpadów ostrych.
    3. Trzymać strzykawkę z zawiesiną pofragmentowanego hydrożelu tak, aby nasadka była skierowana w dół, a otwór cylindra w górę. Dopasować tłok strzykawki do otworu cylindra, wsuwając go tylko na tyle, aby stworzyć uszczelnienie.
    4. Odwrócić strzykawkę tak, aby tłok był skierowany w dół, a nasadka w górę, dbając o to, by trzymać tłok i cylinder strzykawki razem, aby nie wyciekł hydrożel ani PBS.
    5. Trzymać strzykawkę tak, aby nasadka była skierowana w górę, a tłok w dół. Zdjąć nasadkę. Bardzo delikatnie pchnąć tłok w górę, aby usunąć powietrze z wnętrza strzykawki. Patrz powyższa UWAGA dotycząca delikatnego pchania tłoka strzykawki do wewnątrz, aby zapobiec niepożądanemu wyrzuceniu materiału hydrożelowego.
    6. Powtórzyć kroki 2.7.1-2.7.5 z igłami 23 G, 27 G i 30 G. Podczas ostatniego etapu wytłaczania (igła 30 G) wytłoczyć zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu do probówek do mikrowirówki. Dla objętości opisanych w niniejszym protokole, końcowa objętość zawiesiny pofragmentowanego hydrożelu wyniesie ~2,5 mL, co wymaga użycia dwóch probówek do mikrowirówki 1,5 mL (objętość podzielona po równo).
      UWAGA: Wytłaczanie zawiesiny pofragmentowanego hydrożelu przez igły nie powinno wymagać nadmiernej siły. Dla zachowania najlepszych zasad bezpieczeństwa zaleca się wykonywanie wszystkich etapów fragmentacji przez wytłaczanie w dygestorium chemicznym, aby zapewnić ochronę w przypadku nadmiernego wzrostu ciśnienia w strzykawce podczas wytłaczania. Ponadto proces ten można łatwo przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego/dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność podczas wytwarzania. Dodatkowe sugestie dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w sekcji Dyskusja.
  8. Przemyć i wyizolować zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu.
    UWAGA: Przemywanie pofragmentowanych mikrożeli pomoże usunąć nieprzereagowany polimer i czynnik sieciujący. Ponadto wirowanie pomoże wyizolować mikrożele z zawiesiny poprzez utworzenie osadu.
    1. Używając mikrowirówki, odwirować zawiesinę pofragmentowanych mikrożeli z prędkością 5 000 × g przez 5 min.
    2. Za pomocą pipety usunąć nadsącz. Dodać 1 mL PBS do każdej probówki do mikrowirówki zawierającej pofragmentowane mikrożele i wstrząsnąć w wirówce (vortex) przez 5-10 s.
    3. Powtórzyć wirowanie i przemywanie PBS 3x.

Krokowe procesy ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą strzykawek; schemat metody rozdziału faz.
Rycina 2: Przegląd procesu wytwarzania mikrożeli metodą fragmentacji przez ekstruzję. Na rycinie przedstawiono (A) ekstruzję hydrożelu masowego do pustej tuby strzykawki i dodanie PBS, (B) zabezpieczenie tłoka w strzykawce z fragmentarycznym hydrożelem, (C) przymocowanie igły 18 G i ekstruzję zawiesiny fragmentarycznego hydrożelu do pustej tuby strzykawki oraz (D) powtarzanie etapów fragmentacji przez ekstruzję przy użyciu igieł 23 G, 27 G i 30 G, z końcowym zbieraniem zawiesiny fragmentarycznego hydrożelu do probówek do mikrowirówki podczas ostatniej ekstruzji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Charakterystyka pofragmentowanych mikrogeli przy użyciu programu ImageJ

UWAGA: Przegląd charakterystyki pofragmentowanych mikrogeli z wykorzystaniem programu ImageJ przedstawiono na Rysunku 3, wraz z reprezentatywnymi wynikami opisującymi rozkłady wielkości i kształty w partii pofragmentowanych mikrogeli. Mikrogele powinny zostać znakowane fluorescencyjnie przed wizualizacją. Na przykład w objętościowym hydrożelu przed fragmentacją można zamknąć FITC-dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej (2 MDa), aby stworzyć mikrogele znakowane fluoresceiną.

  1. Połącz 20 µL zawiesiny pofragmentowanych mikrożeli z 180 µL PBS, aby przygotować rozcieńczoną zawiesinę pofragmentowanych mikrożeli. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa.
  2. Przenieś 50 µL rozcieńczonej zawiesiny pofragmentowanych mikrożeli na szklane okładkę mikroskopową.
  3. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego do wykonania obrazów mikrożeli znakowanych fluorescencyjnie przy powiększeniu 4x lub 10x.
    UWAGA: Zawiesina mikrożeli powinna być na tyle rozcieńczona, aby sąsiednie mikrożele nie stykały się ze sobą, ale jednocześnie na tyle skoncentrowana, aby w polu widzenia widoczne były dziesiątki mikrożeli. Rozcieńczenie zawiesiny mikrożeli można odpowiednio dostosować, aby osiągnąć taki efekt.
  4. Użyj programu ImageJ do analizy cząstek pofragmentowanych mikrożeli. Dodatkowe informacje na temat korzystania z funkcji Analyze Particles w programie ImageJ można znaleźć pod linkiem podanym w Tabe li materiałów.
    1. Otwórz w programie ImageJ obrazy mikrożeli w zawiesinie.
    2. Wybierz Analyze > Set Measurements, zaznacz Area, Shape Descriptors oraz Feret's Diameter. Kliknij OK.
    3. Wybierz Image > Type > 8-bit.
    4. Wybierz Image > Adjust > Threshold. Dostosuj próg tak, aby mikrożele zostały pokryte czerwoną maską, a tło pozostało czarne. Kliknij Apply.
      UWAGA: Jeśli niektóre mikrożele lekko na siebie nachodzą, użyj narzędzia Pencil Tool, aby narysować cienką (<5 pikseli) czarną linię między mikrożelami w celu ich rozdzielenia na czarno-białym obrazie.
    5. Wybierz Analyze > Analyze Particles. Ustaw parametr Size (pixel2) w zakresie od 50 do nieskończoności, aby zredukować szum tła. Ustaw Circularity w zakresie 0,00–1,00. Z menu rozwijanego wybierz Show Outlines. Zaznacz Display Results, Exclude on Edges oraz Include Holes. Pozostałe pola pozostaw niezaznaczone. Kliknij OK.
    6. Otworzy się okno wyników zawierające informacje o powierzchni, deskryptorach kształtu i średnicy Fereta dla każdego zidentyfikowanego mikrożelu. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
    7. Wyznacz równoważną średnicę kołową dla każdej cząstki.
      1. Wyznacz skalę obrazu w µm/pixel na podstawie paska skali lub informacji o urządzeniu. Utwórz w arkuszu kalkulacyjnym kolumnę, która przeliczy powierzchnię każdego mikrożelu z pixel2 na µm2.
      2. Wykorzystaj powierzchnię w µm2 do wyznaczenia równoważnej średnicy kołowej mikrożelu w µm (tj. wyciągnij pierwiastek kwadratowy z powierzchni podzielonej przez pi, a następnie pomnóż wynik przez dwa).
    8. Użyj skali µm/pixel, aby przeliczyć średnice Fereta (tj. najdłuższą odległość między dowolnymi dwoma punktami na obrysie cząstki) dla każdego mikrożelu na jednostkę µm.
    9. Wartości kolistości („Circ.”), współczynnika kształtu („AR”), zaokrąglenia („Round”) oraz zwartości („solidity”) dla każdego mikrożelu można wykorzystać bezpośrednio z programu ImageJ.
    10. Przeanalizuj populację mikrożeli według uznania, biorąc pod uwagę rozkład średnic (równoważnej kołowej i Fereta), kolistość, współczynnik kształtu, zaokrąglenie oraz zwartość.

Analiza obrazów mikroskopowych; detekcja fluorescencji; charakterystyka cząstek; analiza danych za pomocą wykresów pudełkowych.
Rysunek 3: Przegląd charakterystyki pofragmentowanych cząstek mikrożeli przy użyciu programu ImageJ. Na rysunku przedstawiono (A) przygotowanie rozcieńczonej zawiesiny pofragmentowanych cząstek mikrożeli i wykorzystanie mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego do obrazowania mikrożeli w zawiesinie (pasek skali = 500 µm), (B) konwersję do obrazu binarnego w programie ImageJ i analizę cząstek (liczba, deskryptory kształtu itp.) oraz (C) reprezentatywne wyniki. Słupki błędów przedstawiają wartości minimalne i maksymalne z zaznaczonymi rozstępami międzykwartylnymi. Przedstawiono wielkość populacji n = 100 mikrożeli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Montowanie pofragmentowanych mikrogeli w granularne hydrogele

UWAGA: Przedstawiono dwie metody formowania hydrożeli granularnych z pofragmentowanych mikrogeli: z wykorzystaniem wirowania oraz filtracji. Wybór metody zależy od pożądanego upakowania mikrogeli (np. filtracja upakowuje cząsteczki gęściej) oraz od tego, czy zastosowano komponenty biologiczne (np. wirowanie pozwoli zachować komponenty pomiędzy cząsteczkami, podczas gdy w procesie filtracji mogą one zostać utracone). Wcześniejsze prace40 szczegółowo opisują wyniki porównawcze (np. mechanikę, porowatość) dla hydrożeli granularnych formowanych za pomocą wirowania lub filtracji próżniowej.

  1. Opcja 1: Zagęszczanie pofragmentowanych mikrożeli za pomocą wirowania.
    1. Po usunięciu supernatantu PBS z ostatniego etapu płukania, dodać 1 mL PBS do każdej probówki do mikrocentryfugi i resuspender mikrożele.
    2. Odwirować zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu przy 18 000 x g przez 5 min.
      UWAGA: Jeśli jest to pożądane, do zagęszczania mikrożeli w hydrożele ziarniste o mniejszej gęstości upakowania można zastosować niższe prędkości wirowania.
    3. Usunąć supernatant PBS.
    4. Przygotować nową strzykawkę o objętości 3 mL i wyjąć tłok. Za pomocą metalnej szpatułki nabrać pofragmentowany ziarnisty hydrożel z probówki do mikrocentryfugi i przenieść go do tylnej części pustej tulei strzykawki. Do pomocy przy przenoszeniu ziarnistego hydrożelu do strzykawki można użyć końcówki do pipety. Włożyć tłok z powrotem do strzykawki. Następnie załadować pofragmentowany ziarnisty hydrożel do strzykawki; jest on teraz gotowy do użycia.
  2. Opcja 2: Zagęszczanie pofragmentowanych mikrożeli za pomocą filtracji próżniowej. Przegląd procesu zagęszczania poprzez filtrację próżniową przedstawiono na Rysunku 4.
    1. Złożyć i przetestować aparat do filtracji próżniowej.
      1. Zamocować lejek Buchnera w kolbie filtracyjnej, umieszczając adapter filtra pomiędzy lejkiem a otworem kolby.
      2. Użyć przewodu, aby połączyć kolbę filtracyjną z linią próżniową.
      3. Umieścić filtr membranowy (0,22 µm) w części stożkowej lejka Buchnera.
      4. Włączyć linię próżniową, otwierając zawór pokrętny. Przetestować połączenie, pipetując ~0,5 mL PBS na filtr membranowy i obserwując, czy cały PBS przenika przez filtr i zbiera się na dnie kolby filtracyjnej.
    2. Włączyć linię próżniową i upewnić się, że uszczelnienie jest całkowite. Wymieszać zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu w wstrząsarze vortex, aby mikrożele zostały zawieszone w PBS.
    3. Za pomocą pipety 1 000 µL przenieść zawiesinę pofragmentowanego hydrożelu na filtr membranowy (0,22 µm). Po przeniesieniu całej zawiesiny mikrożeli odczekać ~30 s, aż próżnia odciągnie PBS z zawiesiny pofragmentowanego hydrożelu. Wyłączyć linię próżniową.
      UWAGA: Czas, przez który zawiesina pofragmentowanego hydrożelu pozostaje na filtrze membranowym podczas odsysania próżniowego, może być zmienny. Więcej informacji oraz sugestii dotyczących rozwiązywania problemów znajduje się w sekcji Dyskusja.
    4. Przygotować nową strzykawkę o objętości 3 mL i wyjąć tłok. Za pomocą metalnej szpatułki nabrać pofragmentowany ziarnisty hydrożel z filtra i przenieść go do tylnej części pustej tulei strzykawki. Do pomocy przy przenoszeniu ziarnistego hydrożelu do strzykawki można użyć końcówki do pipety. Włożyć tłok z powrotem do strzykawki. Załadować pofragmentowany ziarnisty hydrożel do strzykawki; jest on teraz gotowy do użycia.

Schemat procesu filtracji próżniowej; aplikacja próbki i filtracja w układzie laboratoryjnym; metoda krok po kroku.
Rycina 4: Przegląd procesu zagęszczania mikrogeli poprzez filtrację próżniową w celu wytworzenia ściśle upakowanych, pofragmentowanych hydrożeli granularnych. Na rysunku przedstawiono (A>) umieszczanie filtra membranowego w aparaturze do filtracji próżniowej, (B>) przenoszenie zawiesiny pofragmentowanych mikrogeli na filtr za pomocą pipety, (C>) wytworzenie próżni i oczekiwanie na zagęszczenie mikrogeli i utworzenie hydrożelu granularnego, (D>) wyłączenie próżni i usunięcie pofragmentowanego hydrożelu granularnego za pomocą metalnej szpatułki oraz (E>) przenoszenie hydrożelu granularnego do strzykawki za pomocą metalnej szpatułki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Drukowanie ekstruzyjne z użyciem tuszów hydrożelowych z granulatem

UWAGA: Przegląd procesu druku ekstruzyjnego przedstawiono na Rysunku 5, w tym reprezentatywny wydruk konstrukcji w kształcie gwiazdy z wykorzystaniem pofragmentowanych hydrożeli granularnych upakowanych za pomocą filtracji próżniowej. Proces druku składa się z przygotowania tuszu, zaplanowania projektu wydruku, a następnie wydrukowania tuszu zgodnie z pożądanym projektem41. W razie potrzeby wydrukowane konstrukcje z hydrożelu granularnego można stabilizować za pomocą fotousieciowania po ekstruzji, dodając nadmiar DTT (5 mM) i I2959 (0,05% masowych) do zawiesiny pofragmentowanych mikrożeli przed upakowaniem. Spowoduje to powstanie kowalencyjnych wiązań fotousieciowanych między mikrożelami, co doprowadzi do trwałej stabilizacji konstrukcji z hydrożelu granularnego.

  1. Formulacja tuszu
    1. Podczas procesu planowania należy wziąć pod uwagę właściwości stosowanego tuszu. Aby scharakteryzować tusz, należy przeprowadzić analizę reologiczną pofragmentowanych hydrożeli, co pomoże w opracowaniu projektu druku. Metody opisujące charakterystykę reologiczną hydrożeli granularnych są opisane w innej literaturze i mogą zostać dostosowane do niniejszego badania40.
    2. Na podstawie analizy reologicznej należy wybrać platformę drukującą oraz zestaw początkowych parametrów druku.
      UWAGA: Ze względu na ogólnie wysoką lepkość i właściwości rozrzedzania ścinaniem tuszy z hydrożeli granularnych, zazwyczaj stosuje się drukarki ekstruzyjne z napędem śrubowym.
  2. Projekt druku
    UWAGA: Do zastosowań w druku 3D (kroki 5.2-5.3) wykorzystywane jest oprogramowanie Repetier Host (dalej nazywane oprogramowaniem do druku 3D).
    1. Projekty druku należy stworzyć za pomocą oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD). Użytkownicy mogą tworzyć nowe projekty od podstaw lub modyfikować istniejące, np. na podstawie skanów tkanek pacjentów lub projektów innych użytkowników. Więcej informacji na temat tworzenia projektów CAD znajduje się w następujących referencjach41,42,43.
    2. Aby przetworzyć modele CAD na G-Code, należy upewnić się, że plik CAD został zapisany w formacie „.stl” (Supplemental File 1) i przesłany do oprogramowania do druku 3D poprzez wybranie przycisku ładowania w górnym panelu lub wybranie File > Load w pasku menu. Ten G-code definiuje ścieżkę drukowania dla nakładania tuszu. Przykład pliku .stl przedstawiającego pusty w środku cylinder został dołączony do plików uzupełniających.
    3. Po przesłaniu pliku STL do oprogramowania do druku 3D, należy przejść do panelu Slicer i wybrać Slic3r jako opcję slicera. Tutaj można dostosować takie ustawienia jak średnica dyszy, wysokość warstwy, prędkość druku i szybkość ekstruzji w oparciu o charakterystykę tuszu i pożądane efekty drukowania. W niniejszym protokole stosowana jest igła 18 G (średnica wewnętrzna 838 µm). Wysokość warstwy została ustawiona na 1 mm, prędkość druku na 8 mm/s, a szybkość przepływu na 9 µL/s, na podstawie wcześniejszej optymalizacji39. Wartości liczbowe parametrów mogą być korygowane o ± 20%, aby uwzględnić zmienność właściwości tuszy z hydrożeli granularnych.
      UWAGA: Należy pamiętać, że ustawienia te oraz projekt druku mogą wymagać dostosowania poprzez iteracyjne testy eksperymentalne, w zależności od zmian w formulacji tuszu, pożądanej rozdzielczości druku lub stosowanej platformy drukującej. Więcej informacji na temat tych parametrów, a także o charakterystyce ustawień druku dla nowej formulacji tuszu, znajduje się w innych referencjach40,44,45,46.
  3. Druk ekstruzyjny z pofragmentowanych hydrożeli granularnych
    1. Sposób napełniania strzykawek pofragmentowanymi hydrożelami granularnymi opisano w punkcie 4.2.4, a także na Rysunku 4 i Rysunku 5.
    2. Należy zdjąć nasadkę końcówki i zastąpić ją wybraną igłą.
    3. Strzykawkę należy umieścić w wybranej platformie drukującej. W niniejszym przypadku zastosowano własnej konstrukcji drukarkę ekstruzyjną z napędem śrubowym.
      UWAGA: Informacje na temat budowy własnych biodrukarek znajdują się w innych referencjach44,47.
    4. Należy wczytać przygotowany plik G-Code z fazy planowania do oprogramowania do druku 3D. Następnie przejść do panelu Print Preview i nacisnąć Print.
    5. Niezwłocznie po zakończeniu nakładania warstw druku, konstrukty z pofragmentowanych hydrożeli granularnych należy naświetlić światłem UV w celu fotousieciowania i stabilizacji.
    6. Po zakończeniu sieciowania próbkę należy przetworzyć, trzykrotnie płucząc ją w PBS.

Proces biodruku 3D: przygotowanie strzykawki, projekt komputerowy, konfiguracja ekstruzji, wynik biomateriału.
Rysunek 5: Przegląd druku ekstruzyjnego z wykorzystaniem fragmentarycznych hydrożeli ziarnistych. Na rysunku przedstawiono (A) użycie szpatułki do przeniesienia fragmentarycznego hydrożelu ziarnistego do korpusu strzykawki, (B) mocowanie igły z tępym końcem (pokazano 18 G) i wypychanie próbki ku górze, (C) grafikę przedstawiającą połączenie z oprogramowaniem komputerowym do druku oraz (D) zakończenie druku konstrukcji w kształcie gwiazdy z fragmentarycznego hydrożelu ziarnistego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki z tych protokołów przedstawiono na Rysunku 3 oraz Rysunku 6. Fragmentacja przez ekstruzję pozwala na otrzymanie mikrogeli o poszarpanych, wielobocznych kształtach o średnicach w zakresie 10-300 µm (Rysunek 3). Ponadto kołowość mieści się w zakresie od 0,2 (brak kolistości) do prawie 1 (idealne koło), a współczynnik kształtu wynosi od 1 do 3 (Rysunek 3). Parametry te opisują niereg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule opisano metody wytwarzania granulowanych hydrożeli przy użyciu wytłaczania rozdrobnionych mikrożeli i pakowania przez wirowanie lub filtrację próżniową. W porównaniu z innymi metodami wytwarzania mikrożeli (tj. mikrofluidyką, emulsjami wsadowymi, elektronatryskiwaniem, fotolitografią), wytwarzanie mikrożeli przez fragmentację przez wytłaczanie jest bardzo szybkie, tanie, łatwo skalowalne i podatne na szeroką gamę systemów hydrożelowych. Co więcej, protokół ten jest wysoce powtarzalny przy minimalnej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation poprzez program UPenn MRSEC (DMR-1720530) oraz stypendia naukowe dla absolwentów (dla V.G.M i M.E.P.) oraz National Institutes of Health (R01AR077362 dla J.A.B.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml plastikowa stożkowa probówka wirówkowaCorning430766
30 G NT Premium Series Końcówka dozującaJensen GlobalJG30-0.5HPXPodany tutaj numer katalogowy dotyczy igły 30 G, 0,5 ". Dostępne są różne rozmiary.
Jednorazowe strzykawki BD z końcówkami Luer-Lok (3 ml)Fisher Scientific14-823-435Podany tutaj numer katalogowy dotyczy strzykawki 3 ml. Dostępne są różne rozmiary (14-823-XXX).
Czarne folderyRóżni dostawcy Jednorazowa
igła sondy do użytku ze strzykawkami i maszynami dozującymi (18 G, 0,5 ")Grainger5FVH5Podany tutaj numer katalogowy dotyczy igły 18 G, 0,5". Dostępne są różne rozmiary.
Jednorazowa igła do sondy do użytku ze strzykawkami i automatami dozującymi (23 G, 0,5 ")Jednorazowa igłaGrainger5FVJ3
do użytku ze strzykawkami i maszynami dozującymi (27 G, 1,5 ")Grainger5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineFisher Scientific14190-250Podany tutaj numer katalogowy dotyczy pudełka 10 butelek o pojemności 500 ml.
Filtr membranowy Durapore, 0,22 i mikro; mMilliporeGVWP04700
Mikroskop epifluorescencyjny lub konfokalnyRóżni dostawcyDo wizualizacji mikrożeli i granulowanych hydrożeli
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock ProbówkiFisher Scientific05-402-25
Drukarka do wytłaczaniaBudowanaMożna używać innych drukarek do wytłaczania, takich jak dostępne na rynku BIOX.
Adaptery filtrówFisher Scientific05-888-107Podany tutaj numer katalogowy dotyczy zestawu wielu rozmiarów. Dostępne są różne rozmiary (05-888-XXX).
Kolba filtrującaRóżni dostawcy
Izotiocyjanian fluoresceiny (2 MDa)Sigma-Aldrich52471
Szklane szkiełko mikroskopoweRóżni dostawcy
ImageJNational Institutes of HealthLink do informacji o "Analizuj cząstki": https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
LaptopRóżni dostawcy
Nasadki końcówek Luer-LockZintegrowane rozwiązania dozujące 9991329
Metalowa szpatułka do nabieraniaRóżni dostawcy
MikrowirówkiRóżni dostawcyMożliwość prędkości do 18 000 x g
Microscoft ExeclMicrosoftMożna korzystać z innych programów, takich jak Google Slides.
OmniCure S2000 Punktowy system utwardzania UVExcelitas TechnologiesS2000W razie potrzeby do wytwarzania hydrożeli luzem można użyć różnych systemów oświetleniowych.
Porcelanowy lejek Buchner ze stałą perforowaną płytkąFisher ScientificFB966CNumer katalogowy podany tutaj dotyczy płyty o średnicy 56 mm. Dostępne są różne rozmiary.
RadiometerRóżni dostawcy
Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGOprogramowanie do druku 3D
Drukarka do wytłaczania na bazieRóżni dostawcyW tym badaniu wykorzystano niestandardowo zmodyfikowaną drukarkę 3D FDM (Velleman K8200). Dostępnych jest wiele alternatyw.
Oprogramowanie Solidworks/CADDassault Systè mes SolidWorks CorporationMożna korzystać z innych programów, takich jak Blender lub TinkerCAD.
Rurki do podłączenia kolby filtra do linii próżniowejRóżni dostawcy
Ochrona oczu przed promieniowaniem UV (tj. okulary ochronne)Różni dostawcy
do sondy na zamówienie

Bibliografia

  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008(2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929(2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644(2021).
  9. Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).
  11. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520(2019).
  14. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725(2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004(2013).
  28. Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191(2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).
  30. Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162(2021).
  32. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087(2018).
  34. Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419(2020).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115(2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069(2019).
  45. Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606(2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372(2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
  48. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fragmentacja hydrożeluwytwarzanie mikrożelifragmentacja przez ekstruzjęfiltracja próżniowametoda wirowaniahydrożele wstrzykiwalnetusze do druku 3D
Fragmentacja hydrożeli luzem i przetwarzanie na granulowane hydrożele do zastosowań biomedycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.