Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Podsumowanie

Rekonstrukcja in vitro białek cytoszkieletu jest kluczowym narzędziem do zrozumienia podstawowych właściwości funkcjonalnych tych białek. W niniejszej pracy opisano protokół oczyszczania i oceny jakości rekombinowanych kompleksów septynowych, które odgrywają kluczową rolę w podziale i migracji komórek.

Streszczenie

Septyny to rodzina konserwatywnych eukariotycznych białek wiążących GTP, które mogą tworzyć włókna cytoszkieletu i struktury wyższego rzędu z hetero-oligomerycznych kompleksów. Oddziałują z innymi składnikami cytoszkieletu i błoną komórkową, aby uczestniczyć w ważnych funkcjach komórkowych, takich jak migracja i podział komórek. Ze względu na złożoność wielu interakcji septyn, dużą liczbę genów septyny (13 u ludzi) oraz zdolność septyn do tworzenia heterooligomerycznych kompleksów o różnym składzie podjednostek, rekonstytucja bezkomórkowa jest niezbędną strategią zrozumienia podstaw biologii septyny. W niniejszej pracy po raz pierwszy opisano metodę oczyszczania rekombinowanych septyn w ich postaci heterooligomerycznej przy użyciu podejścia opartego na dwuetapowej chromatografii powinowactwa. Następnie szczegółowo omówiono proces kontroli jakości stosowany w celu sprawdzenia czystości i integralności kompleksów septynowych. Proces ten łączy w sobie elektroforezę w żelu natywnym i denaturującym, mikroskopię elektronową z barwieniem ujemnym i interferometryczną mikroskopię rozpraszania. Na koniec podano opis procesu sprawdzania zdolności polimeryzacji kompleksów septynowych przy użyciu mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem i mikroskopii fluorescencyjnej. Pokazuje to, że możliwe jest wyprodukowanie wysokiej jakości ludzkich heksamerów septynowych i oktamerów zawierających różne izoformy septin_9, a także heksamerów septynowych Drosophila.

Wprowadzenie

Cytoszkielet został klasycznie opisany jako trójskładnikowy system składający się z filamentów aktynowych, mikrotubul i filamentów pośrednich¹, ale ostatnio septyny zostały uznane za czwarty składnik cytoszkieletu¹. Septyny to rodzina białek wiążących GTP, które są konserwatywne u eukariontów². Septyny biorą udział w wielu funkcjach komórkowych, takich jak podział komórek³, adhezja komórka-komórka⁴, ruchliwość komórek⁵, morfogeneza⁶, infekcja komórkowa⁷, oraz ustanowienie i utrzymanie polaryzacji komórek⁸. Pomimo ich ważnych funkcji, sposób, w jaki septyny biorą udział w takich procesach, jest słabo poznany.

Rodzina białek septyny jest podzielona na kilka podgrup (cztery lub siedem, w zależności od klasyfikacji) na podstawie podobieństwa sekwencji białek². Członkowie różnych podrodzin mogą tworzyć palindromiczne kompleksy heterooligomeryczne, które są budulcem włókien i które z kolei łączą się w struktury wyższego rzędu, takie jak wiązki, pierścienie i siatki^1,9^,10,11,12. Dalsza złożoność molekularna wynika z obecności różnych wariantów splicingu, przykładem jest ludzki SEPT9, gdzie istnieją dowody na specyficzne funkcje różnych wariantów splicingu^13,14,15. Dodatkowo długość heterooligomerów zależy od gatunku i typu komórki. Na przykład septyny Caenorhabditis elegans tworzą tetramery¹⁶, septyny Drosophila melanogaster tworzą heksamery¹⁷ (Rysunek 1A), septyny Saccharomyces cerevisiae tworzą oktamery¹⁸, a ludzkie septyny tworzą zarówno heksamery, jak i oktamery¹⁹ (Rysunek 1A). Zdolność izoform septyny, wariantów splicingu i potranslacyjnie zmodyfikowanych septyn z tej samej podrodziny do zastępowania się nawzajem w kompleksie oraz (współ)istnienie różnej wielkości heterooligomerów utrudniły określenie funkcji komórkowych różnych kompleksów heterooligomerycznych¹².

Inną interesującą zdolnością septyn jest ich zdolność do interakcji z wieloma partnerami wiążącymi w komórce. Septyny wiążą błonę plazmatyczną i organelle błoniaste podczas interfazy i podziału komórki^20,21,22. W dzieleniu komórek septyny współpracują z aniliną^23,24,25 oraz aktyną i miozyną podczas cytokinezy^26,27. W późnych stadiach cytokinezy septyny wydają się regulować endosomalne kompleksy sortujące wymagane przez system transportu (ESCRT) do odcięcia środkowej części ciała²⁸. Ponadto istnieją również dowody na obecność septyny zlokalizowanej na korze aktyny i włókien stresowych aktyny komórek w komórkach interfazowych^29,30,31. W określonych typach komórek septyny wiążą również i regulują cytoszkielet mikrotubul^32,33.

Wszystkie te cechy sprawiają, że septyny są bardzo interesującym systemem białkowym do zbadania, ale także wymagającym. Połączenie dużej liczby podjednostek septyny (13 genów u ludzi bez liczenia wariantów splicingu²) z potencjałem podjednostek septyny z tej samej podrodziny do zastępowania się nawzajem i tworzenia różnej wielkości heterooligomerów utrudnia wyciągnięcie wniosków na temat funkcji komórkowej konkretnej septyny za pomocą manipulacji genetycznej. Co więcej, wielorakie interakcje septyn sprawiają, że interpretacja efektów typowych narzędzi badawczych, takich jak leki³⁴ skierowanych na składniki cytoszkieletu lub błony, jest trudnym zadaniem.

Sposobem na przezwyciężenie tej sytuacji jest uzupełnienie badań na komórkach o odtworzenie septyn in vitro (bez komórek). Rekonstytucja in vitro pozwala na wyizolowanie pojedynczego typu heterooligomerów septyny o określonym składzie i długości podjednostek^18,35,36,37. Kompleks ten może być następnie badany w kontrolowanym środowisku, albo samodzielnie, aby odkryć podstawowe właściwości strukturalne i fizykochemiczne septyn^38,39,40, albo w połączeniu z pożądanymi partnerami, takimi jak model biomembran^11,41,42, filamenty aktynowe^10,27, lub mikrotubule^32,36, aby rozszyfrować naturę ich interakcji.

Dlatego niezawodna metoda skutecznego oczyszczania różnych kompleksów septynowych jest niezbędna do badań nad septyną. Jednak nawet przy użyciu tego samego protokołu, różne oczyszczania mogą dać białka o różnej aktywności/funkcjonalności, a nawet integralności. W przypadku komercyjnie dostępnych białek, takich jak enzymy, funkcjonalność i aktywność enzymatyczna są dokładnie weryfikowane⁴³. Wdrożenie starannej kontroli jakości białek cytoszkieletu lub strukturalnych, takich jak septyny, może być trudne, ale ważne jest, aby eksperymenty w różnych laboratoriach były porównywalne.

Ten artykuł opisuje solidną metodę oczyszczania wysokiej jakości rekombinowanych septyn w ich heterooligomerycznej formie opartej na jednoczesnej ekspresji dwóch wektorów zawierających konstrukty mono- lub bi-cistroniczne (Tabela 1) w komórkach Escherichia coli. Metoda składa się z dwuetapowego podejścia do chromatografii powinowactwa w celu wychwycenia heterooligomerów septyny zawierających zarówno jego 6-znakowaną septynę, jak i septynę znakowaną Strep-II (Rysunek 1B, C). Ten protokół, po raz pierwszy opisany w Iv et al.¹⁰, został użyty do oczyszczania heksamerów septyny Drosophila^11,27,35, human septin hexamers¹⁰, oraz kilka ludzkich oktamerów septin zawierających różne natywne (izoforma 1, 3 i 5)^10,32 lub zmutowane izoformy SEPT9³². Ponadto podano opis zestawu technik oceny jakości oczyszczonych septyn. Po pierwsze, integralność i poprawność stechiometrii podjednostek septyny jest sprawdzana za pomocą elektroforezy denaturującej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Następnie obecność heterooligomerów o prawidłowej masie cząsteczkowej oraz obecność monomerów lub mniejszych oligomerów wskazujących na niestabilność zespoloną bada się za pomocą elektroforezy natywnej i fotometrii masowej za pomocą interferometrycznej mikroskopii rozpraszania (iSCAT). Wreszcie ostatni etap polega na ocenie aktywności polimeryzacyjnej septyn za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i TEM.

Rysunek 1: Strategia oczyszczania. (A) Schematy heterooligomerów septyny, które istnieją w komórkach ludzkich (po lewej) i Drosophila (po prawej). Liczby oznaczają podjednostki septyny ze wskazanych grup, a P oznacza orzeszki ziemne. Ludzki SEPT9 może być dowolną z jego izoform. Podjednostki septyny mają asymetryczny kształt i są podłużnie związane z dwoma odrębnymi interfejsami, interfejsem NC: NC i interfejsem G: G, oznaczonymi odpowiednio przez NC i G na szczycie ludzkiego heksameru. (B,C) Schematyczna ilustracja dwuetapowej strategii chromatografii, pokazana dla (B) ludzkich heksamerów septynowych i (C) oktamerów. H oznacza his-tagi, podczas gdy S oznacza tagi Strep-II. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Oczyszczanie heterooligomerów septyny

1. Kotransformacja komórek bakteryjnych z wektorami ekspresyjnymi
   1. Wybierz kombinację jednego pnEA i jednego plazmidu pnCS class<="xref">44, która będzie używana do wyrażenia. Wybierz kombinację w zależności od pożądanego składu podjednostek heterooligomeru septyny^10,35 oraz od tego, czy wymagane jest znakowanie fluorescencyjne.
      UWAGA: Stosuje się tutaj monomeryczny superfolder GFP (msfGFP) znakowany C-terminalnie SEPT2 (dla ludzkich septyn) lub msfGFP- lub monomerycznie wzmocniony GFP (mEGFP)-DSep2 (dla septin Drosophila) (Tabela 1).
   2. Odpipetować 1 μl każdego plazmidu (~1 ng/μL) do 100 μl kompetentnych komórek BL21 Escherichia coli i inkubować na lodzie przez 20 minut.
   3. Umieścić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 40 s, a następnie natychmiast inkubować je przez 3 minuty na lodzie.
   4. Dodać 0,9 ml pożywki bulionu lizogennego (LB) do zawiesiny komórek i pozostawić komórkom rosnąć przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umieścić 100 μl komórek na ciepłych płytkach LB-agar zawierających 100 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml spektynomycyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Uprawa wstępnej kultury bakteryjnej
   1. Napełnij kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml 100 ml bulionu Terrific (TB) lub pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml spektynomycyny.
   2. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki LB-agar za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej i przenieść ją na świeżą pożywkę z kroku 1.2.1.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką obrotową, przez noc lub przez co najmniej 6 h.
      UWAGA: Z tej hodowli można przygotować bulion glicerolowy, mieszając zawiesinę bakteryjną w stosunku 1:1 z glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C. Ten zapas może być użyty w kroku 1.2.2. zamiast świeżo przekształconej kolonii.
3. Hodowla bakteryjna i indukcja ekspresji białek
   1. Przenieś 100 ml wyhodowanych bakterii do 5 l TB lub LB zawierającego 50 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml spektynomycyny.
   2. Hodować tę kulturę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) mierzoną przy długości fali 600 nm w zakresie 2-3 dla nieznakowanych septyn lub 0,6-0,8 dla septyn znakowanych msfGFP/mEGFP i indukować ekspresję białka przez dodanie końcowego stężenia 0,5 mM IPTG. Niższy OD dla znakowanych septyn ma na celu uniknięcie osiągnięcia fazy śmierci w ich dłuższym czasie ekspresji, jak opisano w następnym kroku.
   3. Inkubować komórki wykazujące ekspresję nieznakowanych heterooligomerów septyny przez 3 godziny w temperaturze 37 °C lub komórki wykazujące ekspresję heterooligomerów znakowanych msfGFP przez noc w temperaturze 17 °C.
      UWAGA: Krótki czas ekspresji białek dla nieznakowanych kompleksów, ułatwiony dzięki zastosowaniu bogatszej pożywki przeciwgruźliczej, jest wybrany w celu zapobieżenia degradacji białek. Dłuższy czas odciągania w połączeniu z niższą temperaturą dla znakowanych kompleksów jest tak dobrany, aby umożliwić prawidłowe składanie znacznika msfGFP.
4. Liza bakteryjna i klarowanie lizatu
   UWAGA: Począwszy od tego momentu procedury oczyszczania, roztwór zawierający białko należy utrzymywać przez cały czas na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapobiec degradacji białek proteolitycznych lub utracie aktywności.
   1. Zebrać wyhodowane komórki przez odwirowanie w stężeniu 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      1. Opcjonalnie na tym etapie należy zamrozić granulat i przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Jeśli ta opcja zostanie wybrana, pamiętaj, aby rozmrozić granulki na lodzie przed kontynuowaniem.
   2. Rozpuścić osad w 100 ml buforu do lizy (Tabela 2) i poddać komórki lizie. Wybierz jedną z dwóch poniższych opcji
      1. Sonikuj w 7 cyklach po 30 s ON i 59 s OFF za pomocą sonatora z końcówką wykorzystującą amplitudę 30% (należy pamiętać, że ustawienia są zależne od sonikatora).
      2. Rozbij komórki we francuskiej prasie, przekazując je co najmniej 3 razy.
   3. Klarować lizat komórkowy przez odwirowywanie przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant. Zaleca się rozpoczęcie od kroku 1.5.1. podczas tego etapu odśrodkowego.
   4. Opcjonalnie należy pobrać próbkę do elektroforezy denaturującej, jak opisano w sekcji 2.
5. Chromatografia powinowactwa do białek znakowanych His
   UWAGA: W tym kroku uzyskuje się kompleksy zawierające ludzki SEPT2 lub Drosophila Sep1 przy użyciu kolumny niklowej (Rysunek 1B).
   1. Zrównoważyć wstępnie wypełnioną kolumnę do wysokosprawnej chromatografii sefarozy niklu buforem septynowym (tabela 2).
   2. Załadować oczyszczony supernatant do kolumny z prędkością 1 ml/min i przemyć związane białko buforem septynowym w co najmniej trzech objętościach.
   3. Eluować kompleksy septynowe za pomocą 50% buforu elucyjnego HisTrap (Tabela 2) z prędkością 1 ml/min, zbierając frakcje 0,5 ml, aby uzyskać stężenie imidazolu 250 mM.
   4. Pobrać frakcje zawierające kompleksy septynowe, zgodnie z dedykancją optyczną eluatu przy 280 nm monitorowaną online za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) lub po oczyszczeniu za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      UWAGA: Imidazol pochłania światło o długości fali 280 nm. To prawdopodobnie wyjaśnia, dlaczego pik białka nie wraca do zerowej absorbancji po elucji septyny (Rysunek 2A).
6. Chromatografia powinowactwa do białek znakowanych Strep-II
   UWAGA: W tym kroku otrzymujemy kompleksy zawierające ludzki SEPT7 (heksamery), ludzki SEPT9 (oktamery) lub orzeszki ziemne Drosophila przy użyciu kolumny Strep-Tactin (Rysunek 1B). Kolumna chromatograficzna oparta jest na zmodyfikowanym układzie biotyna-streptawidyna. Białko jest znakowane zmodyfikowaną biotyną (Strep-II-tag), a kolumna zawiera zmodyfikowaną streptawidynę (Strep-Tactin). Pomimo modyfikacji z układu biotyna-streptawidyna, nie ma interferencji między układem Strep-Tactin-Strep-II-tag a układem biotyna-streptawidyna. Opisany system jest stosowany w celu uniknięcia zakłóceń w testach rekonstytucji z użyciem biotyny i streptawidyny.
   1. Zrównoważyć wstępnie upakowaną kolumnę do wysokosprawnej chromatografii sefarozy StrepTactin z buforem septynowym (Tabela 2). Załadować frakcje zawierające septynę odzyskane z kolumny niklowej z prędkością 1 ml/min i przepłukać związane białko buforem septynowym w co najmniej trzech objętościach.
   2. Eluować kompleksy septyny za pomocą 100% buforu elucyjnego StrepTrap (Tabela 2) w tempie 1 ml/min, zbierając frakcje 0,5 ml, aby uzyskać stężenie 2,5 mM destiobiotyny.
      UWAGA: Destiobiotyna w buforze elucyjnym StrepTrap musi być rozpuszczona na świeżo.
   3. Pobrać frakcje zawierające kompleksy septynowe, zgodnie z absorpcją optyczną eluatu przy 280 nm monitorowaną online za pomocą systemu FPLC lub po oczyszczeniu za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      UWAGA: Elektroforeza denaturująca jest zwykle wykonywana w tym momencie z próbkami popłuczyn kolumnowych i frakcji septynowych. Kolejność kolumn można odwrócić z nierozróżnialnymi wynikami, tj. oczyszczonym lizatem po kroku 1.4. można poddać chromatografii powinowactwa Strep-Taktyny, a następnie chromatografii powinowactwa niklu.
7. Dializa i przechowywanie
   1. Aby usunąć destiobiotynę z końcowego roztworu do przechowywania, należy dializować kompleksy septyny w stosunku objętościowym ~1:300 próbki do buforu w stosunku do buforu septyny (Tabela 2) uzupełnionym 1 mM DTT przez noc lub przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C przy użyciu membrany do dializy MWCO o sile 30 kDa.
   2. Opcjonalnie należy zagęścić septyny za pomocą odśrodkowej kolumny zatężającej MWCO o stężeniu 30 kDa do żądanego stężenia. Dążyć do stężenia 5-7 μM, mierzonego za pomocą absorbancji optycznej roztworu przy 280 nm i przy użyciu teoretycznego współczynnika ekstynkcji obliczonego za pomocą ProtParam (tabela 3).
   3. Podwielokrotność kompleksów białkowych do pożądanej podwielokrotności, szybkie zamrożenie podwielokrotności i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Zaleca się, aby nie przechowywać białka dłużej niż 6 miesięcy. Ponadto zaleca się przeprowadzanie regularnych eksperymentów kontroli jakości, zwłaszcza jeśli białko jest przechowywane dłużej niż zalecany czas.

2. Kontrola jakości czystości i integralności heterooligomeru septyny

UWAGA: Kontrola jakości heterooligomerów składa się z zestawu technik biochemicznych i obrazowania, które pozwalają na wykrycie masy i integralności kompleksów septynowych obecnych w roztworze.

1. Elektroforeza denaturacji w celu sprawdzenia, czy nie tworzy się heterooligomeru septyny z odpowiednimi składnikami
   1. Wymieszaj 10 μl wybranych frakcji z 10 μl buforu do próbek 2x SDS, załaduj je na prefabrykowany żel TGX 4%-15% i napełnij system buforem biegowym Tris/glicyna/SDS.
   2. Uruchom elektroforezę na 35 minut przy napięciu 200 V i zabarwij żel (tabela materiałów), aby zobrazować wyniki. Masy cząsteczkowe poszczególnych białek septyny i heterooligomerycznych kompleksów septynowych przedstawiono w tabeli 3.
   3. Zmierz względną intensywność każdego pasma wewnątrz każdego pasa zawierającego oczyszczone septyny na obrazie odwróconym kontrastem. W tym celu należy obliczyć średnią intensywność prostokątów o jednakowej wielkości wokół każdego pasma i prostokąta o jednakowej wielkości w obszarze bez żadnego pasma na tym samym pasie. Następnie znormalizuj wartości, dzieląc intensywność każdego pasma przez intensywność obszaru bez pasm.
      UWAGA: Jeśli intensywność jest nasycona (na przykład wartości 255 dla obrazu 8-bitowego na obrazie odwróconym kontrastem), pomiń pas ruchu.
2. Uśredniony zespołowo natywny rozkład wielkości za pomocą natywnej elektroforezy
   1. Przygotuj 800 ml buforu anodowego i 200 ml jasnoniebieskiego buforu katodowego dzień wcześniej i przechowuj je w lodówce. Aby przygotować bufor anodowy, rozcieńczyć 40 ml 20-krotnie działającego buforu z 760 ml wody dejonizowanej typu I (I-woda). Aby przygotować jasnoniebieski bufor katodowy, rozcieńczyć 10 ml 20-krotnego buforu bieżącego i 1 ml 20-krotnego dodatku katodowego w 189 ml I-wody. Bieżący bufor i dodatek katodowy są dostarczane z zestawem (tabela materiałów).
   2. Przygotować 10 μl próbki, mieszając ~500 ng septyny z potrzebną ilością buforu próbki (w tym przypadku 2,5 μl, ze względu na użycie 4-krotnego buforu do próbki; patrz tabela materiałów) i wystarczającą ilością I-wody, aby osiągnąć objętość 10 μl.
   3. Załaduj próbki do żelu i napełnij system lodowato zimnymi anodowymi i katodowymi.
   4. Uruchom elektroforezę na około 115 minut przy napięciu 150 V z zasilaczem, który nie zatrzymuje się na niskich prądach i zabarwia żel (tabela materiałów), aby zobrazować wyniki. Masy cząsteczkowe pojedynczych białek i kompleksów obliczone na podstawie sekwencji można znaleźć w tabeli 3.
3. Rozkład masy pojedynczej cząsteczki za pomocą fotometrii masowej za pomocą interferometrycznej mikroskopii rozpraszania
   1. Umyj szkiełka #1.5 poprzez sonikowanie ich w myjce ultradźwiękowej przez 5 minut w I-wodzie, 5 minut w izopropanolu i na koniec 5 minut w I-wodzie.
   2. Osusz dwie szklane szkiełka delikatnym strumieniem azotu i umieść kroplę o pojemności 7 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny (PLL) na środku jednego z szkiełek. Następnie umieść środek drugiej prowadnicy na górze kropli PLL, ustawiając obie szkiełka prostopadle, aby ułatwić rozdzielenie. Inkubować przez 30 s.
      1. Umyć zanurzając w zlewce z I-water 1x i bezpośrednio nakładając strumień I-water 2x. Następnie wysusz dwie szkiełka strumieniem azotu. Szkiełka te można przechowywać przez około 6 tygodni w temperaturze pokojowej w suchych warunkach.
         UWAGA: Oznacz stronę szkiełka, która jest traktowana PLL, aby poprawnie przeprowadzić eksperyment.
   3. Tuż przed eksperymentem wytnij kawałek uszczelek 2 x 2, 3 x 2 lub 3 x 3 (które dają odpowiednio 4, 6 lub 9 komór obrazowania / szkiełka) i przyklej go do części szkła nasączonej PLL, unikając kontaktu szkiełka i uszczelek z jakąkolwiek brudną powierzchnią. Umieść suwak na lekkiej chusteczce do wycierania i naciśnij uszczelki końcówką pipety, aby przykleić je do ochronnego tworzywa sztucznego nadal na uszczelkach.
   4. Podgrzej bufor septynowy (Tabela 2) do temperatury pokojowej i rozmroź białka w dłoni (później trzymaj je na lodzie).
      UWAGA: iSCAT pokazuje sygnał niektórych detergentów i małych cząsteczek, które przypominają sygnały białkowe ⁴⁵. DTT jest jedną z tych małych cząsteczek i dlatego nie jest używana w tym eksperymencie. Z przechowywanej septyny pochodzi tylko ślad naziemnej telewizji cyfrowej.
   5. Umieścić szkiełko z uszczelkami na komercyjnym systemie fotometrii masowej zawierającym 19 μL buforu septynowego i ustawić ostrość mikroskopu za pomocą opcji autofokusa. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby sprawdzić, czy znaleziona ostrość jest prawidłowa. Używany jest tutaj standardowy obiektyw 100x, który jest częścią konfiguracji.
   6. Utwórz lub załaduj folder projektu do przechowywania danych przy użyciu polecenia Plik > Nowy projekt lub Plik > załaduj projekt.
   7. Odpipetować 1 μl próbki na 19 μl kropli buforu septyny (etap 2.3.5) używanej do ustawiania ostrości i mieszania, minimalizując jednocześnie ruchy szkiełka poprzez niedotykanie niczego podczas wykonywania tej czynności. Następnie nagraj wideo z 6,000 klatek, klikając Nagraj.
      1. W celu prawidłowej analizy należy zapisać następujące próbki: bufor septynowy, wzorzec masy białka do kalibracji stosunku sygnału do masy (jeśli dostępna jest ostatnia kalibracja, a warunki środowiskowe nie uległy zmianie, próbkę tę można pominąć) oraz 250 nM kompleksów septynowych rozcieńczonych w buforze septynowym bez DTT (daje to końcowe stężenie ~12,5 nM).
   8. Przeanalizuj filmy za pomocą oprogramowania producenta, aby uzyskać rozkład masy białka. Sprawdź, czy dane są dobrej jakości w następujący sposób.
      1. Jeśli piki heterooligomerów septyny o różnych rozmiarach nakładają się na siebie zbyt mocno lub wykryto zbyt wiele zdarzeń (>3500 zdarzeń dla filmu o długości 6000 klatek przy regularnym polu widzenia 128 x 34 piksele obejmującym 10,8 μm x 2,9 μm), zmniejsz końcowe stężenie septyny i zmierz ponownie.
      2. Jeśli nie ma wystarczającej liczby mierzonych pojedynczych cząsteczek (co najmniej 2,500-3,500 dla filmu o długości 6,000 klatek ze zwykłym polem widzenia), zwiększ stężenie septyny i zmierz ponownie.
4. Bezpośrednie obrazowanie kompleksów septynowych za pomocą mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego
   1. Rozcieńczyć próbki do stężenia około 50 nM w buforze septynowym i przygotować roztwór barwiący (2% mrówczan uranylu lub octan uranylu w wodzie).
      UWAGA: Mrówczan uranylu musi być przygotowany na świeżo.
   2. Pobrać pipetę 4 μl rozcieńczonych septyn na siatkę mikroskopu elektronowego z rozżarzonymi rozładowaniami i inkubować przez 30 s.
   3. Usuń większość roztworu białkowego za pomocą bibuły filtracyjnej i umyj siatkę 2x buforem septynowym i 1x wodą I, aby usunąć luźno zaadsorbowane septyny.
   4. Zabarwić 2% octanem uranylu lub roztworem mrówczanu uranylu w wodzie przez 1 minutę, wchłonąć roztwór barwiący bibułą filtracyjną i wysuszyć siatkę na powietrzu przez kilka minut.
   5. Prześwietl siatkę za pomocą odpowiednio ustawionego transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby wyszukać obszary wzmocnionego zabarwienia i zbierz około 100 obrazów w tych wybranych obszarach.
   6. Zbieraj obrazy w powiększeniu co najmniej 50 000x, aby uzyskać rozmiar piksela około 2 A/piksel i z rozmyciem w zakresie od −1 μm do −2 μm. Użyj napięcia przyspieszenia 200 kV. Najlepiej użyć zautomatyzowanej procedury do zbierania danych, która będzie zależeć od dostępnego oprogramowania do akwizycji.
   7. Przetwarzanie obrazu 2D za pomocą dedykowanego oprogramowania
      1. Zapakuj co najmniej 2,000 cząsteczek za pomocą dedykowanego oprogramowania⁴⁶.
      2. Wykonuj dwuwymiarowe wyrównanie i klasyfikację iteracyjnie, aż klasy zostaną uzyskane bez dalszej poprawy. Pierwszy etap dostosowania i klasyfikacji powinien być wolny od odniesień, aby uniknąć jakichkolwiek uprzedzeń w klasyfikacji.
      3. Średnie uzyskane z pierwszej klasyfikacji bez odniesień należy wykorzystać jako nowe referencje w celu przeprowadzenia dodatkowej rundy klasyfikacji. Powtarzaj ten proces iteracyjnie, aż nie zostanie osiągnięta dalsza poprawa. Upewnij się, że każda klasa opiera się na 50 do 100 wybranych cząstkach, a poszczególne podjednostki są wyraźnie widoczne. Można używać różnych narzędzi programowych (Spider, Eman lub Relion)^46,47,48.

3. Funkcjonalna kontrola jakości Septin poprzez analizę polimeryzacji

UWAGA: Kontrola jakości funkcjonalności składa się z zestawu technik obrazowania, które pozwalają na wykrycie spolimeryzowanych kompleksów septynowych. Poniżej nieznakowane septyny są określane jako "ciemne" septyny, a bufor używany do polimeryzacji nieznakowanych septyn jest określany jako "ciemny" bufor polimeryzacyjny septyny (SPB).

1. Obrazowanie pęczka Septyny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
   1. Przygotować 5x fluoSPB (Tabela 2) i mieszaninę septyny składającą się z 90% ciemnej septyny i 10% msfGFP-septyny w sześciokrotnie wyższym stężeniu niż pożądane stężenie końcowe w buforze septynowym + 1 mM DTT. Typowe stężenie dla tego testu wynosi 300 nM, a zatem stężenie wynosi 1,800 nM dla tej mieszaniny.
   2. Polimeryzuj septynę, mieszając, w określonej kolejności, I-wodę (wystarczającą do uzupełnienia do końcowej pożądanej objętości), 20% 5xfluoSPB (końcowe rozcieńczenie 1:5), 0,05 μM PCD i 16,67% septyny (końcowe rozcieńczenie 1:6). Na 10 μl wymieszaj 6,23 μl I-wody, 2 μl 5xfluoSPB, 0,1 μl PCD (z zapasem 5 μM) i 1,67 μl mieszanki septyny. Inkubuj tę mieszankę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Dodać próbki do komory obrazowania przemytej fluoSPB (Tabela 2) i zobrazować wiązki septyny. Kanały przepływu pasywowane PLL-PEG, jak opisano w poprzednich badaniach^10,32, dobrze sprawdzają się w tym eksperymencie.
2. Obrazowanie wiązki septyny za pomocą mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego
   1. Przygotuj 5x darkSPB (Tabela 2) i mieszankę septyny składającą się ze 100% ciemnej septyny o sześciokrotnie wyższym stężeniu niż pożądane stężenie końcowe w buforze septynowym + 1 mM DTT. Typowe stężenie dla tego testu wynosi 300 nM, a zatem stężenie wynosi 1,800 nM dla tej mieszaniny.
   2. Polimeryzuj kompleksy septyny, mieszając, w określonej kolejności, I-wodę (wystarczająco, aby uzupełnić do końcowej pożądanej objętości), 20% 5xdarkSPB i 16,67% septin mix. Aby uzyskać 5 μl, wymieszaj 3,16 μl I-water, 1 μL 5x darkSPB i 0,83 μl septin mix. Inkubuj tę mieszankę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Dodać 3-5 μl próbki do siatki do mikroskopii elektronowej z rozrzezeniem jarzeniowym i inkubować przez 1 minutę. Następnie przemyj siatkę 2x darkSPB (Tabela 2), wchłaniając ciecz bibułą filtracyjną i dodając kroplę buforu darkSPB, przemyj 1x I-wodą, inkubuj przez ~30 s z 2% octanem uranylu, osusz plamę i susz próbkę na powietrzu przez kilka minut.
   4. Zobrazuj wiązki septyny przy napięciu 120 kV i powiększeniach od 5 000x do 60 000x z rozogniskowaniem w zakresie 1-2 μm.

Wyniki

Jak wspomniano w protokole, wyhodowano 5 L komórek E. coli współtransformowanych z dwoma plazmidami wyrażającymi septynę, a ekspresja septyn została wywołana przez dodanie IPTG. Po 3 godzinach komórki zebrano przez odwirowanie, ponownie zawieszono w buforze do lizy i poddano lizie za pomocą sonikacji. Lizat został następnie sklarowany przez odwirowanie, a oczyszczony roztwór nałożono na kolumnę HisTrap (Rysunek 2A). Po pierwszym oczyszczeniu frakcje zawierające septynę zostały zebrane i naniesione na kolumnę StrepTrap (Rysunek 2B). Zwykle daje to około 3-5 ml ~ 1 μM kompleksu septyny. Przed połączeniem frakcji zawierających septynę można zastosować elektroforezę żelową denaturującą w celu sprawdzenia integralności podjednostek septyny i równomolowego stosunku stechiometrycznego między różnymi podjednostkami septyny tworzącymi kompleks. (Rysunek 3A). Jeśli żel wykazuje podobnie intensywne prążki odpowiadające masie cząsteczkowej (tabela 3) podjednostek septyny, protokół może być kontynuowany. Jeśli nie, zaleca się ponowne uruchomienie protokołu. W przykładzie pokazanym dla ludzkiego oktamera septyny z SEPT9_i1, Rysunek 3A wyraźnie pokazuje pasma odpowiadające SEPT9_i1, 6 września, 7 września i 2 września (w kolejności od góry do dołu) o podobnej intensywności; 99% przedział ufności znormalizowanej intensywności wynosił 1,128 ± 0,048 dla 2 września, 1,092 ± 0,034 dla 6 września, 1,108 ± 0,040 dla 7 września i 1,067 ± 0,029 dla 9 września. Jeśli SEPT2 zostanie oznaczony tagiem msfGFP, przesunie się bardzo blisko poniżej SEPT9_i1. W zależności od zastosowanego systemu elektroforezy i obecności C-końcowego znacznika TEV-Strep dla SEPT7 (co sprawia, że migruje on wolniej niż nieoznakowany SEPT7), pasma SEPT7 i SEPT6 czasami łączą się ze względu na ich porównywalne masy cząsteczkowe. Następnym krokiem jest zebranie frakcji i dializa ich względem buforu septynowego za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej. Po dializie, jeśli stężenie jest zbyt niskie (<2 μM) lub do eksperymentów potrzebne jest wyższe stężenie, można uwzględnić etap koncentracji, zgodnie z opisem w protokole. Stężenia poniżej 1 μM zwykle wskazują na złą jakość funkcjonalną septyn. Końcowe stężenie kompleksu septyny między 3,5 μM a 7 μM sprawdza się w większości testów in vitro. Stężenia te uzyskuje się zwykle, gdy objętość po stężeniu osiągnie 0,5-1 ml.

Rysunek 2: Przykładowe chromatogramy odpowiadające oczyszczaniu ciemnej ludzkiej septyny octamers_9i1. (A) chromatogram kolumnowy HisTrap. Po piku elucji septyny absorbancja nie wraca do zera, prawdopodobnie z powodu obecności imidazolu w buforze. Frakcja zbiorcza przeszła od początku piku elucji do momentu, gdy absorbancja ustabilizowała się na poziomie około 250 ml. (B) Chromatogram kolumnowy StrepTrap. Frakcja zbiorcza przeszła od początku piku elucji do momentu, gdy absorbancja powróciła do około 0 przy 50 ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby kontynuować kontrolę jakości, przeprowadzono natywną elektroforezę, zgodnie z opisem w protokole (Rysunek 3B). W żelach można zaobserwować główne prążki odpowiadające nienaruszonym heterooligomerom i zwykle mniejsze pasmo odpowiadające dimerom. Ludzkie heksamery znajdują się nieco powyżej pasma markerów 242 kDa, podczas gdy oktamery znajdują się powyżej pasma 480 kDa, powyżej ich obliczonej masy cząsteczkowej. Lokalizacja tych prążków została sprawdzona za pomocą analizy western blot ekstraktów z komórek eukariotycznych ³². Znakowanie za pomocą msfGFP łączy każdy SEPT2 z białkiem msfGFP. Powoduje to wzrost masy cząsteczkowej kompleksów septynowych o 53,4 kDa (cząsteczka 26,7 kDa/msGFP). Niemniej jednak na natywnym żelu do elektroforezy pozorna masa cząsteczkowa kompleksów znakowanych msfGFP jest nie do odróżnienia od masy nieznakowanych kompleksów.

Uzupełniającą techniką do sprawdzania, czy kompleksy septynowe są nienaruszone, jest masowa fotometria za pomocą mikroskopii iSCAT. iSCAT monitoruje rozpraszanie światła przez cząsteczki lądujące na szkiełku podstawowym wzmacniane przez interferencję światła referencyjnego, zazwyczaj odbicie lasera od dna szkiełka. Następnie stosuje się podejście odejmowania tła, aby nadać kontrast cząstkom. Dzięki tej korekcie sygnał pokazuje wartości dodatnie i ujemne w zależności od tego, czy cząstki wylądują na szkle, czy się od niego oddalają⁴⁹. Wykryty sygnał jest wprost proporcjonalny do masy cząsteczkowej białek⁵⁰. W związku z tym kalibracja sygnału do masy za pomocą wzorca masy może określić masę białek próbki. Rysunek 3C pokazuje przykład ludzkich oktamerów septynowych zawierających SEPT9_i1. Większość wykrytych pojedynczych cząstek (~50%) ma masę cząsteczkową oczekiwaną dla kompletnych oktamerów zawierających SEPT9_i1 (423 kDa) (Rysunek 3C). Istnieją również cząstki o masach między 150-300 kDa, ale nie obserwuje się wyraźnego szczytu, co wskazuje na możliwą obecność innych gatunków septyny w niskiej liczebności. Podobnie, większość wykrytych pojedynczych cząstek dla heksamerów Drosophila znakowanych mEGFP ma masę cząsteczkową oczekiwaną dla nienaruszonych heksamerów (361 kDa) (Rysunek 3D). Dodatkowy wyraźny pik przy 241 kDa wskazuje na obecność stabilnych tetramerów zawierających dwa białka orzeszków ziemnych, jedno DSep1 i jedno mEGFP-DSep2. Wreszcie, zarówno kompleksy septyny ludzkiej, jak i muchowej wykazują pik około 80 kDa, który może być mieszanką monomerów i dimerów, prawdopodobnie wzmocnioną przez ślad DTT lub inną małą cząsteczkę, która agreguje, wykazując pik po dodatniej stronie wykresu⁴⁵.

Rysunek 3: Przykłady wyników kontroli jakości oligomerów. (A) Przykład żelu denaturującego pokazującego różne frakcje piku elucji z oczyszczania ciemnej ludzkiej septyny octamers_9i1. (B) Przykład natywnej elektroforezy różnych kompleksów septynowych. (C,D) Różne przykłady wyników histogramu fotometrii masowej przy 12,5 nM kompleksów septynowych: (C) ciemne ludzkie octamers_9i1 septynowe i (D) heksamery septynowe DSep1-msfGFP Drosophila. Linie są pasowaniami Gaussa. (E) Obraz TEM 25 nM ciemnej ludzkiej septyny octamers_9i1 w buforze septyny. Podziałka = 200 nm. (F) Średni dla klasy obraz ludzkiej septyny SEPT2-msfGFP octamers_9i1. Znaczniki msfGFP są widoczne jako gęstości rozmyte na dwóch końcach. Podziałka = 10 nm. Panele (E) i (F) są chronione prawami autorskimi The Company of Biologists i zostały zaadaptowane z Iv et al.¹⁰ za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Biorąc pod uwagę, że zarówno natywne żele, jak i iSCAT dostarczają tylko uśrednionych informacji zespołowych, zastosowano uśrednianie klas obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej pojedynczych oligomerów septyny do sprawdzenia integralności i czystości kompleksów poprzez bezpośrednią wizualizację. Na obrazach TEM kompleksów septynowych w buforze septynowym można zaobserwować pręciki o długości 24 nm (heksamery) lub 32 nm (oktamery). Przykład ludzkiej oktamery septynowej zawierającej SEPT9_i1 można zobaczyć w Rysunek 3E. Podczas uśredniania ich klas, każda z podjednostek może być obserwowana i liczona, jak widać w przypadku ludzkiego ośmiotamera z SEPT9_i1 oznaczonym tagiem msfGFP w Rysunek 3F. W przypadku, gdy oligomer jest znakowany fluorescencyjnie, na końcu pręcików można zaobserwować dodatkowe gęstości odpowiadające SEPT2-msfGFP (Rysunek 3F).

Kombinacja powyższych technik dowodzi, że oktamery (lub heksamery) o prawidłowym stosunku stechiometrycznym i wysokiej czystości mogą być oczyszczane za pomocą opisanego protokołu. Wreszcie ostatnia kontrola jakości dotyczy funkcjonalności kompleksów septynowych pod względem ich zdolności do polimeryzacji. W obecności niskiego stężenia soli (<150 mM KCl z opisanym buffer⁹), jeśli septyny nie znajdują się w obecności innych białek lub ujemnie naładowanych błon lipidowych, samoorganizują się w wiązki⁹. Septyny są zapobiegane polimeryzacji poprzez utrzymywanie ich w buforze magazynowym, który ma wysokie (300 mM) stężenie KCl. Heterooligomery septyny są następnie rozcieńczane w stosunku objętościowym 1:6 w buforze o tym samym składzie, ale bez KCl, aby osiągnąć końcowe stężenie KCl 50 mM. Aby wykonać obrazowanie fluorescencyjne, bufor ten jest uzupełniony o system oczyszczania tlenu w celu ochrony przed fotowybielaniem oraz o tłumik mrugania. W mikroskopii TIRF można zaobserwować małe skupiska białek w płytkim polu TIRF (~100 nm; Rysunek 4A,B). Pod mikroskopem konfokalnym można dostrzec duże skupiska nitkowatych struktur unoszących się wyżej w roztworze (Rysunek 4C). Wreszcie, za pomocą TEM można zaobserwować małe wiązki septyny (Rysunek 4D), odpowiadające skupiskom obserwowanym przez TIRF, oraz duże wiązki (Figura 4E), odpowiadające strukturom obserwowanym za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wstawki Rysunek 4D,E pokazują, że oba typy struktur składają się z długich, cienkich włókien, które biegną równolegle, tworząc wiązki o zwężających się końcach. Obrazy fluorescencji i TEM dowodzą, że oczyszczone kompleksy septyny mogą polimeryzować w włókna, które z kolei samoorganizują się w wiązki.

Rysunek 4: Przykłady wyników kontroli jakości zdolności polimeryzacji. (A) Obraz TIRF 300 nM ludzkich heksamerów septynowych (10% heksamerów znakowanych msfGFP) w fluoSPB. (B) Obraz TIRF 300 nM ludzkich oktamerów septynowych zawierających SEPT9_i1 (10% octamers9_i1 znakowanych msfGFP) w fluoSPB. (C) Konfokalne projekcje o maksymalnej intensywności stosów Z w poprzek ~30 μm z odstępem 0,5 μm 300 nM ludzkiej septyny octamers_9i3 w fluoSPB. (A-C) Podziałka = 10 μm i odwrócona skala szarości. (D,E) Przykładowe obrazy TEM (D) małych i (E) dużych wiązek ludzkiej septyny octamers_9i1 w darkSPB. Wstawki pokazują obszary, w których można zaobserwować przezroczyste włókna biegnące równolegle w wiązce. Podziałka liniowa = 500 nm. Panele (C-E) są chronione prawami autorskimi The Company of Biologists i zostały zaadaptowane z Iv et al.¹⁰ za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista plazmidów. Plazmidy do oczyszczania oligomerów septyny zgodnie z tym protokołem. Wszystkie plazmidy zostały zdeponowane w Addgene (pierwsza kolumna). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista. Kompozycje buforowe stosowane do oczyszczania i kontroli jakości oligomerów septyny. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Masy cząsteczkowe i współczynniki ekstynkcji. Wykaz mas cząsteczkowych (MW) i współczynników ekstynkcji optycznej (ε) przy długości fali 280 nm obliczonych za pomocą ProtParam na podstawie sekwencji kompleksu, przy założeniu liniowej fuzji podjednostek septyny, różnych kompleksów septyny i unikalnych podjednostek septyny (tylko MW), które można oczyścić plazmidami wymienionymi w tabeli 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda pozwala na solidne oczyszczanie i kontrolę jakości wstępnie uformowanych heterooligomerów septyny. Oto niektóre z kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę w celu prawidłowego zastosowania tej metody. Podczas etapów elucji w rozdziałach chromatograficznych ważne jest, aby stosować zalecane (lub niższe) natężenie przepływu, aby zminimalizować rozcieńczenie kompleksów septynowych. Dodatkowo, aby zmaksymalizować odzysk białka podczas końcowego etapu zagęszczania, kolumna koncentratora jest zorientowana w taki sposób, że roztwór nie jest dociskany do filtra (gdy filtr znajduje się tylko po jednej stronie). Jeśli roztwór trafi bezpośrednio do filtra, białko przykleja się do niego znacznie bardziej, znacznie zmniejszając końcową wydajność. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że etap koncentracji nie zawsze jest konieczny. Pobieranie frakcji tylko z wąskiego zakresu wokół piku na chromatogramie zwykle daje wystarczająco wysokie stężenie wyjściowe (>3000 nM) dla wielu zastosowań rekonstytucji (które zwykle działają w zakresie 10-300 nM). Wreszcie, w celu kontroli jakości funkcjonalności kompleksów septynowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, ważne jest prawidłowe pasywowanie powierzchni szkiełek mikroskopowych, ponieważ kompleksy septynowe chciwie przylegają do szkła. Pasywacja szkiełek może odbywać się albo poprzez funkcjonalizację PLL-PEG, albo przez tworzenie neutralnych (100% DOPC) dwuwarstw lipidowych^11,32.

W porównaniu z pierwotnym protokołem oczyszczania opisanym po raz pierwszy w Iv i ^wsp.10 nastąpiła zmiana w składzie (Tabela 2). Stężenie MgCl₂ zostało zmniejszone z 5 mM do 2 mM, a stężenie i pH Tris-HCl zostały zmniejszone odpowiednio z 50 mM do 20 mM i z 8,0 do 7,4. Zmiany te zostały wprowadzone, aby warunki buforowe były zgodne z badaniami interakcji ludzkich septyn z dwuwarstwami lipidowymi, włóknami aktynowymi i mikrotubulami 10,11,32. Dzieje się tak, ponieważ autorzy utworzyli wspierane dwuwarstwy lipidowe i spolimeryzowaną aktynę w buforze F, którego skład jest identyczny jak w darkSPB, z wyjątkiem obecności ATP w buforze F. Zmiana buforu nie spowodowała żadnych zmian w jakości ani żywotności oczyszczonych septyn w porównaniu z oryginalnymi.

Ta metoda oczyszczania ma jeszcze kilka ograniczeń. Po pierwsze, różne próby oczyszczania mogą różnić się wydajnością (0,5-1 ml 2-5 μM kompleksów septynowych) i jakością funkcjonalną, co sprawdza zdolność tworzenia wiązek oczyszczonych kompleksów septynowych. Dlatego bardzo ważne jest konsekwentne przeprowadzanie kontroli jakości opisanych w tym dokumencie. Bardzo dobra kontrola czasu ekspresji i gęstości optycznej kultury bakteryjnej może pomóc złagodzić różnicę w wydajności. Po drugie, ten rurociąg oczyszczania nie jest w stanie rozróżnić trimerów i heksamerów ani tetramerów i oktamerów (ryc. 1B). Jednak eksperymenty kontroli jakości można wykorzystać do udowodnienia, że większość kompleksów septynowych występuje w postaci długich oligomerów. W przypadku, gdy wymagany jest jeszcze węższy rozkład wielkości oligomerów, chromatografię wykluczania wielkości można wprowadzić pomiędzy krok 1.6. i krok 1.7. protokołu oczyszczania. Ten opcjonalny krok jednak drastycznie zmniejsza wydajność i nie jest zalecany, chyba że jest to absolutnie konieczne. Ostatnie, bardziej fundamentalne ograniczenie wynika z zastosowania E. coli jako systemu ekspresji dla rekombinowanych kompleksów septynowych. Oczywiście system ten nie pozwala na modyfikacje potranslacyjne (PTM), które zostały zgłoszone w komórkach zwierzęcych, takie jak fosforylacja, acetylacja i sumoilacja 6,51,52,53. Te modyfikacje potranslacyjne można dodać poprzez wdrożenie podobnej strategii oczyszczania w komórkach owadów lub ludzi. Co więcej, w artykule tym omówiono tylko rekonstytucję septyn jako takich, ale badania na komórkach wskazują, że białka regulatorowe, takie jak białka z rodziny Borg^54,55 i anilina 24,25,56, mogą mieć znaczący, ale słabo poznany wpływ na tworzenie i funkcje septyn, a zatem są ważne do ostatecznego włączenia do in vitro studia. Protokoły oczyszczania białek Borg i aniliny zostały zgłoszone^54,57.

Opisany tutaj protokół oczyszczania septyny oferuje ustandaryzowany sposób oczyszczania septyn w postaci oligomerów za pomocą prawidłowej stechiometrii podjednostek, oferując ważny postęp w stosunku do wielu wcześniejszych badań in vitro opierających się na pojedynczych podjednostkach septyny. Mimo że niektóre septyny w określonych kontekstach mogą działać jako pojedyncza podjednostka², obecna literatura zdecydowanie sugeruje, że w komórkach zwierzęcych septyny funkcjonują głównie w kompleksach ^9,58. W związku z tym zastosowanie wstępnie uformowanych heterooligomerów, takich jak te opisane w tym artykule i innych 10,11,18,32,35,36,37, ma ogromne znaczenie dla badania strukturalnych i biofizycznych właściwości septyn za pomocą in vitro rekonstytucji w celu przeanalizowania ich funkcji w komórce. Co więcej, septyny są samoorganizującymi się białkami z wieloma partnerami interakcji, w tym błoną i cytoszkieletem, co czyni je bardzo interesującymi dla oddolnej biologii syntetycznej 59,60,61 i badań wywołanych przez białka zmian we właściwościach biofizycznych błony, takich jak krzywizna 42,62,63.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sumator laserowy 488nm Mikroskop iLAS2	Gataca	TIRF
linie laserowe	Koherentny		mikroskop konfokalny
4k X 4k F416 Kamera CMOS	TVIPS		Dla JEM-1400plus
4x bufor próbki nativePAGE	Thermo Fisher scientific	BN2003
Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813	Aby zapobiec mruganiu
AKTA pure 25 M1	GE healthcare	1680311
Ampicylina	Sigma-Aldrich	A9518-25G
Węgiel Type-B, siatka EM 300	Ted pella	01813-F
Węgiel Type-B, siatka 300 EM	Nauka o mikokopii elektronowej	CF300-Cu
Szkło nakrywkowe #1.5H	Thorslabs	CG15KH
CSU-X1-M1 jednostka konfokalna	konfokalny	Yokogawa
Desthiobiotin	Sigma-Aldrich	D1411-1G
Ditiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779
DNAse	Sigma-Aldrich	10104159001
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
	Eclipse Ti2-E	Nikon	Mikroskop konfokalny
Koktajl hamujący proteazę bez EDTA	Roche	481761
HisTrap HP, 5 mL	GE healthcare	29-0588-3
iLAS2 azymutalny system oświetlenia TIRF	Mikroskop Gataca		TIRF
Imidazol	Sigma-Aldrich	1202-1KG
InstantBlue Protein Gel Stain	Westburg Life Sciences	EP ab119211
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Thermo Fisher	naukowy 10849040
iXon Ultra 888 Kamera EMCCD	Mikroskop
iXon Ultra 897 EM-CCD	Mikroskop Andor		TIRF
JEM-1400plus	Mikroskop JOEL		TEM TUDelft
kappa-cassein	Rosół Sigma-Aldrich	C0406
LB	Sigma-Aldrich	L3022-6X1KG
Lizozym	Sigma-Aldrich	62971-10G-F
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	746452-1KG
Metylokleloza	Sigma-Aldrich	8074844
System MilliQ (Integral 10)	Dozownik wody	Merck-Millipore
Mini protean TGX	żele BIORAD	4561086
NativeMark niebarwiony wzorzec białka	Invitrogen	LC0725	Do iSCAT i Native żele
NativePAGE 4-16% ŻELE	Thermo Fisher BN1002BOX
NativePAGE Zestaw buforowy do biegania	Thermo Fisher naukowy	BN2007
Nikon Ti2-E		firmy Nikon	Mikroskop TIRF
Nr 1 Szkiełka nakrywkowe Menzel	Thermo Fisher 11961988
naukowy parafilm	Sigma-Aldrich	P7668
Plan Apo i czasy; Obiektyw zanurzeniowy 100/1.45 NA	Instrumenty		Mikroskop konfokalny
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Poli(L-lizyna)-biotynylowany PEG (PLL-PEG	)sSuSoS	CHF560.00
Roztwór poli-L-lizyny 0,01%	Sigma-Aldrich	P4832	Do szkiełek iSCAT
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
Zasilacz do natywnych żeli	CONSORT	S/N 71638
POWERPAC UNIVERSAL	BIORAD	042BR31206
Protokatechuat 3,4-dioksygenazy (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	pochłaniacz tlenu - enzym
Kwas protokatechowy (PCA)	Sigma-Aldrich	03930590-50MG	pochłaniacz tlenu - odczynnik
Q500 Sonicator		Qsonica Q500-110
Kamera Quemesa	Olympus		For Tecnai Spirit
Refeyn OneMP	Refeyn
Bufor do próbek, laemmli 2x koncentrat	Sigma-Aldrich	S3401-10vl
Uszczelki silikonowe	Sigma-Aldrich	GBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer Kasety do dializy 30k MWCO 3mL	Thermo Fisher scientific	66381
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	PHR1441-1G
StrepTrap HP, 1 ml	GE healthcare	28-9075-46
Mikroskop Tecnai Spirit	Thermo Scientific, mikroskop FEI		TEM Instytut Curie
Wspaniały bulion	Sigma-Aldrich	T0918-1KG
Bufor Tris/Glyine/SDS	BIORAD	1610772
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941-1KG
Myjka ultradźwiękowa	Branson	CPX2800H-E
Vivaspin 6, 30 000 MWCO PES	Sartorius	VS0622