Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63871

⸱

23 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Institut Curie, Université PSL, Sorbonne Université

W tym artykule

Podsumowanie

Rekonstrukcja in vitro białek cytoszkieletu jest kluczowym narzędziem do zrozumienia podstawowych właściwości funkcjonalnych tych białek. W niniejszej pracy opisano protokół oczyszczania i oceny jakości rekombinowanych kompleksów septynowych, które odgrywają kluczową rolę w podziale i migracji komórek.

Streszczenie

Septyny to rodzina konserwatywnych eukariotycznych białek wiążących GTP, które mogą tworzyć włókna cytoszkieletu i struktury wyższego rzędu z hetero-oligomerycznych kompleksów. Oddziałują z innymi składnikami cytoszkieletu i błoną komórkową, aby uczestniczyć w ważnych funkcjach komórkowych, takich jak migracja i podział komórek. Ze względu na złożoność wielu interakcji septyn, dużą liczbę genów septyny (13 u ludzi) oraz zdolność septyn do tworzenia heterooligomerycznych kompleksów o różnym składzie podjednostek, rekonstytucja bezkomórkowa jest niezbędną strategią zrozumienia podstaw biologii septyny. W niniejszej pracy po raz pierwszy opisano metodę oczyszczania rekombinowanych septyn w ich postaci heterooligomerycznej przy użyciu podejścia opartego na dwuetapowej chromatografii powinowactwa. Następnie szczegółowo omówiono proces kontroli jakości stosowany w celu sprawdzenia czystości i integralności kompleksów septynowych. Proces ten łączy w sobie elektroforezę w żelu natywnym i denaturującym, mikroskopię elektronową z barwieniem ujemnym i interferometryczną mikroskopię rozpraszania. Na koniec podano opis procesu sprawdzania zdolności polimeryzacji kompleksów septynowych przy użyciu mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem i mikroskopii fluorescencyjnej. Pokazuje to, że możliwe jest wyprodukowanie wysokiej jakości ludzkich heksamerów septynowych i oktamerów zawierających różne izoformy septin_9, a także heksamerów septynowych Drosophila.

Wprowadzenie

Cytoszkielet tradycyjnie opisywano jako system trójskładnikowy, składający się z filamentów aktynowych, mikrotubul i filamentów pośrednich1, jednak niedawno uznano septyny za czwarty składnik cytoszkieletu1. Septyny stanowią rodzinę białek wiążących GTP, które są konserwatywne u eukariontów2. Septyny uczestniczą w wielu funkcjach komórkowych, takich jak podział komórki3, adhezja międzykomórkowa4, ruchliwość komórek5, morfogeneza6, infekcja komórkowa7 oraz ustanawianie i utrzymywanie polarności komórki8. Pomimo ich istotnych funkcji, mechanizmy uczestnictwa septyn w tych procesach nie są jeszcze dobrze poznane.

Rodzina białek septyn jest podzielona na kilka podgrup (cztery lub siedem, w zależności od klasyfikacji) w oparciu o podobieństwo sekwencji białkowej2. Członkowie różnych podrodzin mogą tworzyć palindromiczne kompleksy hetero-oligomeryczne, które stanowią jednostki budulcowe filamentów, a te z kolei organizują się w struktury wyższego rzędu, takie jak wiązki, pierścienie i sieci1,9,10,11,12. Dalsza złożoność molekularna wynika z obecności różnych wariantów splicingowych; przykładem jest ludzka SEPT9, w przypadku której istnieją dowody na specyficzne funkcje poszczególnych wariantów splicingowych13,14,15. Ponadto długość hetero-oligomerów zależy od gatunku i typu komórki. Na przykład septyny Caenorhabditis elegans tworzą tetramery16, septyny Drosophila melanogaster tworzą heksamery17 (Rycyna 1A), septyny Saccharomyces cerevisiae tworzą oktamery18, a septyny ludzkie tworzą zarówno heksamery, jak i oktamery19 (Rycyna 1A). Zdolność izoform septyn, wariantów splicingowych i septyn zmodyfikowanych posttranslacyjnie z tej samej podrodziny do wzajemnego zastępowania się w kompleksie oraz (współ)istnienie hetero-oligomerów o różnej wielkości utrudniają precyzyjne określenie funkcji komórkowych poszczególnych kompleksów hetero-oligomerycznych12.

Kolejną interesującą właściwością septyn jest ich zdolność do oddziaływania z wieloma partnerami wiążącymi w komórce. Septyny wiążą błonę plazmatyczną i organella błonowe podczas interfazy oraz podziału komórki20,21,22. W dzielących się komórkach septyny współpracują z anilliną23,24,25 oraz z aktyną i miozyną podczas cytokinezy26,27. W późnych etapach cytokinezy septyny wydają się regulować kompleksy sortowania endosomalnego wymagane do transportu (system ESCRT) w procesie odsznurowania ciała środkowego28. Ponadto istnieją dowody na obecność septyn w kory aktynowej oraz w aktynowych włóknach stresowych komórek w interfazie29,30,31. W określonych typach komórek septyny wiążą i regulują również cytoszkielet mikrotubularny32,33.

Wszystkie te cechy sprawiają, że septyny stanowią bardzo interesujący, ale jednocześnie wymagający system białkowy do badania. Połączenie dużej liczby podjednostek septyn (13 genów u ludzi, nie licząc wariantów splicingowych2) z możliwością wzajemnego zastępowania się podjednostek z tej samej podrodziny i tworzenia hetero-oligomerów o różnych rozmiarach utrudnia wyciąganie wniosków na temat funkcji komórkowej konkretnej septyny za pomocą manipulacji genetycznych. Ponadto liczne oddziaływania septyn sprawiają, że interpretacja efektów powszechnie stosowanych w badaniach narzędzi, takich jak leki34 skierowane na komponenty cytoszkieletu lub błony, jest trudnym zadaniem.

Sposobem na rozwiązanie tego problemu jest uzupełnienie badań na komórkach rekonstrukcją septyn in vitro (bezkomórkową). Rekonstrukcja in vitro umożliwia wyizolowanie pojedynczego typu heterooligomerów septyn o określonym składzie podjednostek i długości18,35,36,37. Kompleks ten może być następnie badany w kontrolowanym środowisku — albo samodzielnie, aby odkryć podstawowe właściwości strukturalne i fizykochemiczne septyn38,39,40, albo w połączeniu z odpowiednimi partnerami, takimi jak modelowe biomembrany11,41,42, filamenty aktynowe10,27 lub mikrotubule32,36, w celu rozszyfrowania natury ich oddziaływań.

W związku z tym, dla badań nad septynami kluczowe jest opracowanie niezawodnej metody efektywnej puryfikacji różnych kompleksów septyn. Jednakże, nawet przy zastosowaniu tego samego protokołu, poszczególne puryfikacje mogą prowadzić do uzyskania białek o różnej aktywności, funkcjonalności, a nawet różnym stopniu integralności. W przypadku białek dostępnych komercyjnie, takich jak enzymy, funkcjonalność i aktywność enzymatyczna są starannie walidowane43. Wdrożenie rygorystycznej kontroli jakości dla białek cytoszkieletowych lub strukturalnych, takich jak septyny, może być trudne, lecz jest niezbędne, aby eksperymenty prowadzone w różnych laboratoriach były porównywalne.

Niniejszy artykuł opisuje niezawodną metodę oczyszczania wysokiej jakości rekombinowanych septyn w ich formie hetero-oligomerycznej, opartą na jednoczesnej ekspresji dwóch wektorów zawierających konstrukty mono- lub bi-cistroniczne (Tabela 1) w Escherichia coli komórki. Metoda polega na dwuetapowym podejściu z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa w celu wychwycenia hetero-oligomerów septyn zawierających zarówno znacznik his6septynę z etykietą i septynę z etykietą Strep-II (Rysunek 1B,C). Protokół ten został po raz pierwszy opisany przez Iv et al.10zostało zastosowane do oczyszczenia Muszka owocówka heksamery septyn11,27,35, ludzkie heksamery septyn10oraz kilka ludzkich oktamerów septyn zawierających różne natywne izoformy (1, 3 i 5)10,32 lub zmutowane izoformy SEPT932Ponadto przedstawiono opis zestawu technik służących do oceny jakości oczyszczonych septyn. W pierwszej kolejności, za pomocą elektroforezy denaturującej oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), sprawdzana jest integralność i prawidłowa stechiometria podjednostek septyn. Następnie, za pomocą elektroforezy natywnej oraz fotometrii masowej z wykorzystaniem interferometryjnej mikroskopii rozproszonej (iSCAT), badana jest obecność heterooligomerów o prawidłowej masie cząsteczkowej, a także obecność monomerów lub mniejszych oligomerów świadczących o niestabilności kompleksu. Ostatnim krokiem jest ocena aktywności polimeryzacyjnej septyn z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej oraz TEM.

Proces oczyszczania białek z użyciem HisTrap i StrepTrap; schematy wiązania i elucji białek.
Rysunek 1: Strategia oczyszczania. (A) Schematy hetero-oligomerów septyn występujących w komórkach ludzkich (lewo) i Drosophila (prawo). Numery oznaczają podjednostki septyn z wskazanych grup, a P oznacza Peanut. Ludzka SEPT9 może być dowolną z jej izoform. Podjednostki septyn mają asymetryczny kształt i są powiązane podłużnie poprzez dwa odrębne interfejsy: interfejs NC:NC oraz interfejs G:G, co zaznaczono odpowiednio jako NC i G na górze ludzkiego heksameru. (B,C) Schematyczny rysunek dwuetapowej strategii chromatograficznej, przedstawiony dla (B) ludzkich heksamerów septyn i (C) oktamerów. H oznacza znaczniki his, natomiast S oznacza znaczniki Strep-II. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Oczyszczanie heterooligomerów septyny

  1. Kotransformacja komórek bakteryjnych z wektorami ekspresyjnymi
    1. Wybierz kombinację jednego pnEA i jednego plazmidu pnCS class<="xref">44, która będzie używana do wyrażenia. Wybierz kombinację w zależności od pożądanego składu podjednostek heterooligomeru septyny10,35 oraz od tego, czy wymagane jest znakowanie fluorescencyjne.
      UWAGA: Stosuje się tutaj monomeryczny superfolder GFP (msfGFP) znakowany C-terminalnie SEPT2 (dla ludzkich septyn) lub msfGFP- lub monomerycznie wzmocniony GFP (mEGFP)-DSep2 (dla septin Drosophila) (Tabela 1).
    2. Odpipetować 1 μl każdego plazmidu (~1 ng/μL) do 100 μl kompetentnych komórek BL21 Escherichia coli i inkubować na lodzie przez 20 minut.
    3. Umieścić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 40 s, a następnie natychmiast inkubować je przez 3 minuty na lodzie.
    4. Dodać 0,9 ml pożywki bulionu lizogennego (LB) do zawiesiny komórek i pozostawić komórkom rosnąć przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umieścić 100 μl komórek na ciepłych płytkach LB-agar zawierających 100 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml spektynomycyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Uprawa wstępnej kultury bakteryjnej
    1. Napełnij kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml 100 ml bulionu Terrific (TB) lub pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml spektynomycyny.
    2. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki LB-agar za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej i przenieść ją na świeżą pożywkę z kroku 1.2.1.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką obrotową, przez noc lub przez co najmniej 6 h.
      UWAGA: Z tej hodowli można przygotować bulion glicerolowy, mieszając zawiesinę bakteryjną w stosunku 1:1 z glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C. Ten zapas może być użyty w kroku 1.2.2. zamiast świeżo przekształconej kolonii.
  3. Hodowla bakteryjna i indukcja ekspresji białek
    1. Przenieś 100 ml wyhodowanych bakterii do 5 l TB lub LB zawierającego 50 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml spektynomycyny.
    2. Hodować tę kulturę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) mierzoną przy długości fali 600 nm w zakresie 2-3 dla nieznakowanych septyn lub 0,6-0,8 dla septyn znakowanych msfGFP/mEGFP i indukować ekspresję białka przez dodanie końcowego stężenia 0,5 mM IPTG. Niższy OD dla znakowanych septyn ma na celu uniknięcie osiągnięcia fazy śmierci w ich dłuższym czasie ekspresji, jak opisano w następnym kroku.
    3. Inkubować komórki wykazujące ekspresję nieznakowanych heterooligomerów septyny przez 3 godziny w temperaturze 37 °C lub komórki wykazujące ekspresję heterooligomerów znakowanych msfGFP przez noc w temperaturze 17 °C.
      UWAGA: Krótki czas ekspresji białek dla nieznakowanych kompleksów, ułatwiony dzięki zastosowaniu bogatszej pożywki przeciwgruźliczej, jest wybrany w celu zapobieżenia degradacji białek. Dłuższy czas odciągania w połączeniu z niższą temperaturą dla znakowanych kompleksów jest tak dobrany, aby umożliwić prawidłowe składanie znacznika msfGFP.
  4. Liza bakteryjna i klarowanie lizatu
    UWAGA: Począwszy od tego momentu procedury oczyszczania, roztwór zawierający białko należy utrzymywać przez cały czas na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapobiec degradacji białek proteolitycznych lub utracie aktywności.
    1. Zebrać wyhodowane komórki przez odwirowanie w stężeniu 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      1. Opcjonalnie na tym etapie należy zamrozić granulat i przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Jeśli ta opcja zostanie wybrana, pamiętaj, aby rozmrozić granulki na lodzie przed kontynuowaniem.
    2. Rozpuścić osad w 100 ml buforu do lizy (Tabela 2) i poddać komórki lizie. Wybierz jedną z dwóch poniższych opcji
      1. Sonikuj w 7 cyklach po 30 s ON i 59 s OFF za pomocą sonatora z końcówką wykorzystującą amplitudę 30% (należy pamiętać, że ustawienia są zależne od sonikatora).
      2. Rozbij komórki we francuskiej prasie, przekazując je co najmniej 3 razy.
    3. Klarować lizat komórkowy przez odwirowywanie przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant. Zaleca się rozpoczęcie od kroku 1.5.1. podczas tego etapu odśrodkowego.
    4. Opcjonalnie należy pobrać próbkę do elektroforezy denaturującej, jak opisano w sekcji 2.
  5. Chromatografia powinowactwa do białek znakowanych His
    UWAGA: W tym kroku uzyskuje się kompleksy zawierające ludzki SEPT2 lub Drosophila Sep1 przy użyciu kolumny niklowej (Rysunek 1B).
    1. Zrównoważyć wstępnie wypełnioną kolumnę do wysokosprawnej chromatografii sefarozy niklu buforem septynowym (tabela 2).
    2. Załadować oczyszczony supernatant do kolumny z prędkością 1 ml/min i przemyć związane białko buforem septynowym w co najmniej trzech objętościach.
    3. Eluować kompleksy septynowe za pomocą 50% buforu elucyjnego HisTrap (Tabela 2) z prędkością 1 ml/min, zbierając frakcje 0,5 ml, aby uzyskać stężenie imidazolu 250 mM.
    4. Pobrać frakcje zawierające kompleksy septynowe, zgodnie z dedykancją optyczną eluatu przy 280 nm monitorowaną online za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) lub po oczyszczeniu za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      UWAGA: Imidazol pochłania światło o długości fali 280 nm. To prawdopodobnie wyjaśnia, dlaczego pik białka nie wraca do zerowej absorbancji po elucji septyny (Rysunek 2A).
  6. Chromatografia powinowactwa do białek znakowanych Strep-II
    UWAGA: W tym kroku otrzymujemy kompleksy zawierające ludzki SEPT7 (heksamery), ludzki SEPT9 (oktamery) lub orzeszki ziemne Drosophila przy użyciu kolumny Strep-Tactin (Rysunek 1B). Kolumna chromatograficzna oparta jest na zmodyfikowanym układzie biotyna-streptawidyna. Białko jest znakowane zmodyfikowaną biotyną (Strep-II-tag), a kolumna zawiera zmodyfikowaną streptawidynę (Strep-Tactin). Pomimo modyfikacji z układu biotyna-streptawidyna, nie ma interferencji między układem Strep-Tactin-Strep-II-tag a układem biotyna-streptawidyna. Opisany system jest stosowany w celu uniknięcia zakłóceń w testach rekonstytucji z użyciem biotyny i streptawidyny.
    1. Zrównoważyć wstępnie upakowaną kolumnę do wysokosprawnej chromatografii sefarozy StrepTactin z buforem septynowym (Tabela 2). Załadować frakcje zawierające septynę odzyskane z kolumny niklowej z prędkością 1 ml/min i przepłukać związane białko buforem septynowym w co najmniej trzech objętościach.
    2. Eluować kompleksy septyny za pomocą 100% buforu elucyjnego StrepTrap (Tabela 2) w tempie 1 ml/min, zbierając frakcje 0,5 ml, aby uzyskać stężenie 2,5 mM destiobiotyny.
      UWAGA: Destiobiotyna w buforze elucyjnym StrepTrap musi być rozpuszczona na świeżo.
    3. Pobrać frakcje zawierające kompleksy septynowe, zgodnie z absorpcją optyczną eluatu przy 280 nm monitorowaną online za pomocą systemu FPLC lub po oczyszczeniu za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      UWAGA: Elektroforeza denaturująca jest zwykle wykonywana w tym momencie z próbkami popłuczyn kolumnowych i frakcji septynowych. Kolejność kolumn można odwrócić z nierozróżnialnymi wynikami, tj. oczyszczonym lizatem po kroku 1.4. można poddać chromatografii powinowactwa Strep-Taktyny, a następnie chromatografii powinowactwa niklu.
  7. Dializa i przechowywanie
    1. Aby usunąć destiobiotynę z końcowego roztworu do przechowywania, należy dializować kompleksy septyny w stosunku objętościowym ~1:300 próbki do buforu w stosunku do buforu septyny (Tabela 2) uzupełnionym 1 mM DTT przez noc lub przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C przy użyciu membrany do dializy MWCO o sile 30 kDa.
    2. Opcjonalnie należy zagęścić septyny za pomocą odśrodkowej kolumny zatężającej MWCO o stężeniu 30 kDa do żądanego stężenia. Dążyć do stężenia 5-7 μM, mierzonego za pomocą absorbancji optycznej roztworu przy 280 nm i przy użyciu teoretycznego współczynnika ekstynkcji obliczonego za pomocą ProtParam (tabela 3).
    3. Podwielokrotność kompleksów białkowych do pożądanej podwielokrotności, szybkie zamrożenie podwielokrotności i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Zaleca się, aby nie przechowywać białka dłużej niż 6 miesięcy. Ponadto zaleca się przeprowadzanie regularnych eksperymentów kontroli jakości, zwłaszcza jeśli białko jest przechowywane dłużej niż zalecany czas.

2. Kontrola jakości czystości i integralności heterooligomeru septyny

UWAGA: Kontrola jakości heterooligomerów składa się z zestawu technik biochemicznych i obrazowania, które pozwalają na wykrycie masy i integralności kompleksów septynowych obecnych w roztworze.

  1. Elektroforeza denaturacji w celu sprawdzenia, czy nie tworzy się heterooligomeru septyny z odpowiednimi składnikami
    1. Wymieszaj 10 μl wybranych frakcji z 10 μl buforu do próbek 2x SDS, załaduj je na prefabrykowany żel TGX 4%-15% i napełnij system buforem biegowym Tris/glicyna/SDS.
    2. Uruchom elektroforezę na 35 minut przy napięciu 200 V i zabarwij żel (tabela materiałów), aby zobrazować wyniki. Masy cząsteczkowe poszczególnych białek septyny i heterooligomerycznych kompleksów septynowych przedstawiono w tabeli 3.
    3. Zmierz względną intensywność każdego pasma wewnątrz każdego pasa zawierającego oczyszczone septyny na obrazie odwróconym kontrastem. W tym celu należy obliczyć średnią intensywność prostokątów o jednakowej wielkości wokół każdego pasma i prostokąta o jednakowej wielkości w obszarze bez żadnego pasma na tym samym pasie. Następnie znormalizuj wartości, dzieląc intensywność każdego pasma przez intensywność obszaru bez pasm.
      UWAGA: Jeśli intensywność jest nasycona (na przykład wartości 255 dla obrazu 8-bitowego na obrazie odwróconym kontrastem), pomiń pas ruchu.
  2. Uśredniony zespołowo natywny rozkład wielkości za pomocą natywnej elektroforezy
    1. Przygotuj 800 ml buforu anodowego i 200 ml jasnoniebieskiego buforu katodowego dzień wcześniej i przechowuj je w lodówce. Aby przygotować bufor anodowy, rozcieńczyć 40 ml 20-krotnie działającego buforu z 760 ml wody dejonizowanej typu I (I-woda). Aby przygotować jasnoniebieski bufor katodowy, rozcieńczyć 10 ml 20-krotnego buforu bieżącego i 1 ml 20-krotnego dodatku katodowego w 189 ml I-wody. Bieżący bufor i dodatek katodowy są dostarczane z zestawem (tabela materiałów).
    2. Przygotować 10 μl próbki, mieszając ~500 ng septyny z potrzebną ilością buforu próbki (w tym przypadku 2,5 μl, ze względu na użycie 4-krotnego buforu do próbki; patrz tabela materiałów) i wystarczającą ilością I-wody, aby osiągnąć objętość 10 μl.
    3. Załaduj próbki do żelu i napełnij system lodowato zimnymi anodowymi i katodowymi.
    4. Uruchom elektroforezę na około 115 minut przy napięciu 150 V z zasilaczem, który nie zatrzymuje się na niskich prądach i zabarwia żel (tabela materiałów), aby zobrazować wyniki. Masy cząsteczkowe pojedynczych białek i kompleksów obliczone na podstawie sekwencji można znaleźć w tabeli 3.
  3. Rozkład masy pojedynczej cząsteczki za pomocą fotometrii masowej za pomocą interferometrycznej mikroskopii rozpraszania
    1. Umyj szkiełka #1.5 poprzez sonikowanie ich w myjce ultradźwiękowej przez 5 minut w I-wodzie, 5 minut w izopropanolu i na koniec 5 minut w I-wodzie.
    2. Osusz dwie szklane szkiełka delikatnym strumieniem azotu i umieść kroplę o pojemności 7 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny (PLL) na środku jednego z szkiełek. Następnie umieść środek drugiej prowadnicy na górze kropli PLL, ustawiając obie szkiełka prostopadle, aby ułatwić rozdzielenie. Inkubować przez 30 s.
      1. Umyć zanurzając w zlewce z I-water 1x i bezpośrednio nakładając strumień I-water 2x. Następnie wysusz dwie szkiełka strumieniem azotu. Szkiełka te można przechowywać przez około 6 tygodni w temperaturze pokojowej w suchych warunkach.
        UWAGA: Oznacz stronę szkiełka, która jest traktowana PLL, aby poprawnie przeprowadzić eksperyment.
    3. Tuż przed eksperymentem wytnij kawałek uszczelek 2 x 2, 3 x 2 lub 3 x 3 (które dają odpowiednio 4, 6 lub 9 komór obrazowania / szkiełka) i przyklej go do części szkła nasączonej PLL, unikając kontaktu szkiełka i uszczelek z jakąkolwiek brudną powierzchnią. Umieść suwak na lekkiej chusteczce do wycierania i naciśnij uszczelki końcówką pipety, aby przykleić je do ochronnego tworzywa sztucznego nadal na uszczelkach.
    4. Podgrzej bufor septynowy (Tabela 2) do temperatury pokojowej i rozmroź białka w dłoni (później trzymaj je na lodzie).
      UWAGA: iSCAT pokazuje sygnał niektórych detergentów i małych cząsteczek, które przypominają sygnały białkowe 45. DTT jest jedną z tych małych cząsteczek i dlatego nie jest używana w tym eksperymencie. Z przechowywanej septyny pochodzi tylko ślad naziemnej telewizji cyfrowej.
    5. Umieścić szkiełko z uszczelkami na komercyjnym systemie fotometrii masowej zawierającym 19 μL buforu septynowego i ustawić ostrość mikroskopu za pomocą opcji autofokusa. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby sprawdzić, czy znaleziona ostrość jest prawidłowa. Używany jest tutaj standardowy obiektyw 100x, który jest częścią konfiguracji.
    6. Utwórz lub załaduj folder projektu do przechowywania danych przy użyciu polecenia Plik > Nowy projekt lub Plik > załaduj projekt.
    7. Odpipetować 1 μl próbki na 19 μl kropli buforu septyny (etap 2.3.5) używanej do ustawiania ostrości i mieszania, minimalizując jednocześnie ruchy szkiełka poprzez niedotykanie niczego podczas wykonywania tej czynności. Następnie nagraj wideo z 6,000 klatek, klikając Nagraj.
      1. W celu prawidłowej analizy należy zapisać następujące próbki: bufor septynowy, wzorzec masy białka do kalibracji stosunku sygnału do masy (jeśli dostępna jest ostatnia kalibracja, a warunki środowiskowe nie uległy zmianie, próbkę tę można pominąć) oraz 250 nM kompleksów septynowych rozcieńczonych w buforze septynowym bez DTT (daje to końcowe stężenie ~12,5 nM).
    8. Przeanalizuj filmy za pomocą oprogramowania producenta, aby uzyskać rozkład masy białka. Sprawdź, czy dane są dobrej jakości w następujący sposób.
      1. Jeśli piki heterooligomerów septyny o różnych rozmiarach nakładają się na siebie zbyt mocno lub wykryto zbyt wiele zdarzeń (>3500 zdarzeń dla filmu o długości 6000 klatek przy regularnym polu widzenia 128 x 34 piksele obejmującym 10,8 μm x 2,9 μm), zmniejsz końcowe stężenie septyny i zmierz ponownie.
      2. Jeśli nie ma wystarczającej liczby mierzonych pojedynczych cząsteczek (co najmniej 2,500-3,500 dla filmu o długości 6,000 klatek ze zwykłym polem widzenia), zwiększ stężenie septyny i zmierz ponownie.
  4. Bezpośrednie obrazowanie kompleksów septynowych za pomocą mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego
    1. Rozcieńczyć próbki do stężenia około 50 nM w buforze septynowym i przygotować roztwór barwiący (2% mrówczan uranylu lub octan uranylu w wodzie).
      UWAGA: Mrówczan uranylu musi być przygotowany na świeżo.
    2. Pobrać pipetę 4 μl rozcieńczonych septyn na siatkę mikroskopu elektronowego z rozżarzonymi rozładowaniami i inkubować przez 30 s.
    3. Usuń większość roztworu białkowego za pomocą bibuły filtracyjnej i umyj siatkę 2x buforem septynowym i 1x wodą I, aby usunąć luźno zaadsorbowane septyny.
    4. Zabarwić 2% octanem uranylu lub roztworem mrówczanu uranylu w wodzie przez 1 minutę, wchłonąć roztwór barwiący bibułą filtracyjną i wysuszyć siatkę na powietrzu przez kilka minut.
    5. Prześwietl siatkę za pomocą odpowiednio ustawionego transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby wyszukać obszary wzmocnionego zabarwienia i zbierz około 100 obrazów w tych wybranych obszarach.
    6. Zbieraj obrazy w powiększeniu co najmniej 50 000x, aby uzyskać rozmiar piksela około 2 A/piksel i z rozmyciem w zakresie od −1 μm do −2 μm. Użyj napięcia przyspieszenia 200 kV. Najlepiej użyć zautomatyzowanej procedury do zbierania danych, która będzie zależeć od dostępnego oprogramowania do akwizycji.
    7. Przetwarzanie obrazu 2D za pomocą dedykowanego oprogramowania
      1. Zapakuj co najmniej 2,000 cząsteczek za pomocą dedykowanego oprogramowania46.
      2. Wykonuj dwuwymiarowe wyrównanie i klasyfikację iteracyjnie, aż klasy zostaną uzyskane bez dalszej poprawy. Pierwszy etap dostosowania i klasyfikacji powinien być wolny od odniesień, aby uniknąć jakichkolwiek uprzedzeń w klasyfikacji.
      3. Średnie uzyskane z pierwszej klasyfikacji bez odniesień należy wykorzystać jako nowe referencje w celu przeprowadzenia dodatkowej rundy klasyfikacji. Powtarzaj ten proces iteracyjnie, aż nie zostanie osiągnięta dalsza poprawa. Upewnij się, że każda klasa opiera się na 50 do 100 wybranych cząstkach, a poszczególne podjednostki są wyraźnie widoczne. Można używać różnych narzędzi programowych (Spider, Eman lub Relion)46,47,48.

3. Funkcjonalna kontrola jakości Septin poprzez analizę polimeryzacji

UWAGA: Kontrola jakości funkcjonalności składa się z zestawu technik obrazowania, które pozwalają na wykrycie spolimeryzowanych kompleksów septynowych. Poniżej nieznakowane septyny są określane jako "ciemne" septyny, a bufor używany do polimeryzacji nieznakowanych septyn jest określany jako "ciemny" bufor polimeryzacyjny septyny (SPB).

  1. Obrazowanie pęczka Septyny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Przygotować 5x fluoSPB (Tabela 2) i mieszaninę septyny składającą się z 90% ciemnej septyny i 10% msfGFP-septyny w sześciokrotnie wyższym stężeniu niż pożądane stężenie końcowe w buforze septynowym + 1 mM DTT. Typowe stężenie dla tego testu wynosi 300 nM, a zatem stężenie wynosi 1,800 nM dla tej mieszaniny.
    2. Polimeryzuj septynę, mieszając, w określonej kolejności, I-wodę (wystarczającą do uzupełnienia do końcowej pożądanej objętości), 20% 5xfluoSPB (końcowe rozcieńczenie 1:5), 0,05 μM PCD i 16,67% septyny (końcowe rozcieńczenie 1:6). Na 10 μl wymieszaj 6,23 μl I-wody, 2 μl 5xfluoSPB, 0,1 μl PCD (z zapasem 5 μM) i 1,67 μl mieszanki septyny. Inkubuj tę mieszankę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać próbki do komory obrazowania przemytej fluoSPB (Tabela 2) i zobrazować wiązki septyny. Kanały przepływu pasywowane PLL-PEG, jak opisano w poprzednich badaniach10,32, dobrze sprawdzają się w tym eksperymencie.
  2. Obrazowanie wiązki septyny za pomocą mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego
    1. Przygotuj 5x darkSPB (Tabela 2) i mieszankę septyny składającą się ze 100% ciemnej septyny o sześciokrotnie wyższym stężeniu niż pożądane stężenie końcowe w buforze septynowym + 1 mM DTT. Typowe stężenie dla tego testu wynosi 300 nM, a zatem stężenie wynosi 1,800 nM dla tej mieszaniny.
    2. Polimeryzuj kompleksy septyny, mieszając, w określonej kolejności, I-wodę (wystarczająco, aby uzupełnić do końcowej pożądanej objętości), 20% 5xdarkSPB i 16,67% septin mix. Aby uzyskać 5 μl, wymieszaj 3,16 μl I-water, 1 μL 5x darkSPB i 0,83 μl septin mix. Inkubuj tę mieszankę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać 3-5 μl próbki do siatki do mikroskopii elektronowej z rozrzezeniem jarzeniowym i inkubować przez 1 minutę. Następnie przemyj siatkę 2x darkSPB (Tabela 2), wchłaniając ciecz bibułą filtracyjną i dodając kroplę buforu darkSPB, przemyj 1x I-wodą, inkubuj przez ~30 s z 2% octanem uranylu, osusz plamę i susz próbkę na powietrzu przez kilka minut.
    4. Zobrazuj wiązki septyny przy napięciu 120 kV i powiększeniach od 5 000x do 60 000x z rozogniskowaniem w zakresie 1-2 μm.

Wyniki

Zgodnie z opisem w protokole, wyhodowano 5 L komórek E. coli kotransformowanych dwoma plazmidami kodującymi septyny, a ekspresję septyn indukowano poprzez dodanie IPTG. Po 3 h komórki zebrano poprzez wirowanie, zawieszono ponownie w buforze do lizy i poddano lizie za pomocą sonikacji. Lizat następnie klarowano przez wirowanie, a otrzymany roztwór nałożono na kolumnę HisTrap (Rycina 2A). Po pierwszej puryfikacji frakcje zawierające septyny połączono i nałożono na kolumnę StrepTrap (Rycina 2B). Zazwyczaj pozwala to na uzyskanie około 3-5 mL kompleksu septyn o stężeniu ~1 μM. Przed połączeniem frakcji zawierających septyny można zastosować denaturującą elektroforezę żelową, aby sprawdzić integralność podjednostek septyn oraz ekvimolarny stosunek stechiometryczny między różnymi podjednostkami septyn tworzącymi kompleks (Rycina 3A). Jeśli na żelu widoczne są prążki o podobnej intensywności odpowiadające masom cząsteczkowym (Tabela 3) podjednostek septyn, można kontynuować protokół. W przeciwnym razie zaleca się ponowne rozpoczęcie procedury. W przykładzie przedstawionym dla ludzkiego oktameru septyn z SEPT9_i1, na Rycynie 3A wyraźnie widoczne są prążki odpowiadające SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 i SEPT2 (w kolejności od góry do dołu) o podobnych intensywnościach; 99% przedział ufności znormalizowanej intensywności wynosił 1,128 ± 0,048 dla SEPT2, 1,092 ± 0,034 dla SEPT6, 1,108 ± 0,040 dla SEPT7 oraz 1,067 ± 0,029 dla SEPT9. Jeśli SEPT2 jest znakowany msfGFP, jego prążek przesunie się w górę, bardzo blisko poniżej SEPT9_i1. W zależności od zastosowanego systemu elektroforezy oraz obecności C-końcowego znacznika TEV-Strep dla SEPT7 (co powoduje jego wolniejszą migrację w porównaniu do nieznakowanego SEPT7), prążki SEPT7 i SEPT6 czasami zlewają się ze względu na zbliżone masy cząsteczkowe. Kolejnym krokiem jest połączenie frakcji i ich dializa przeciwko buforowi do septyn z DTT. Po dializie, jeśli stężenie jest zbyt niskie (<2 μM) lub do eksperymentów wymagane jest wyższe stężenie, można przeprowadzić etap zagęszczania, zgodnie z opisem w protokole. Stężenia poniżej 1 μM zazwyczaj wskazują na niską jakość funkcjonalną septyn. Końcowe stężenie kompleksu septyn między 3,5 μM a 7 μM sprawdza się w większości testów in vitro. Takie stężenia są zazwyczaj osiągane, gdy objętość po zagęszczeniu wynosi 0,5-1 mL.

Diagramy chromatogramów HisTrap i StrepTrap; oczyszczanie białek, eluowane kompleksy septyn.
Rycina 2: Przykładowe chromatogramy odpowiadające oczyszczaniu ciemnych ludzkich oktamerów septyn_9i1. (A) Chromatogram kolumny HisTrap. Po piku elucji septyn absorbancja nie powróciła do zera, prawdopodobnie ze względu na obecność imidazolu w buforze. Połączona frakcja obejmowała zakres od początku piku elucji do momentu stabilizacji absorbancji przy około 250 mL. (B) Chromatogram kolumny StrepTrap. Połączona frakcja obejmowała zakres od początku piku elucji do momentu powrotu absorbancji do wartości około 0 przy 50 mL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby kontynuować kontrolę jakości, przeprowadzono elektroforezę w warunkach natywnych, zgodnie z opisem w protokole (Rysunek 3B). W żelach można zaobserwować główny prążek odpowiadający nienaruszonym hetero-oligomerom oraz, zazwyczaj, prążek mniejszy odpowiadający dimerom. Heksamery ludzkie znajdują się nieco powyżej prążka markera 242 kDa, natomiast oktamery znajdują się powyżej prążka 480 kDa, powyżej ich obliczonej masy cząsteczkowej. Położenie tych prążków sprawdzono za pomocą analizy western blot ekstraktów z komórek eukariotycznych32. Oznakowanie białkiem msfGFP łączy każde białko SEPT2 z białkiem msfGFP. Powoduje to wzrost masy cząsteczkowej kompleksów septyn o 53,4 kDa (26,7 kDa/cząsteczka msGFP). Niemniej jednak, w żelu do elektroforezy natywnej pozorna masa cząsteczkowa kompleksów oznakowanych msfGFP jest nieodróżnialna od masy kompleksów nieoznakowanych.

Komplementarną techniką służącą do sprawdzenia, czy kompleksy septyn są nienaruszone, jest fotometria masowa z wykorzystaniem mikroskopii iSCAT. iSCAT monitoruje rozpraszanie światła cząsteczek osiadających na szklanym podstawce, wzmocnione interferencją ze światłem referencyjnym, zazwyczaj będącym odbiciem lasera od spodu szklanej podstawki. Następnie stosuje się metodę odejmowania tła, aby uzyskać kontrast cząstek. Dzięki tej korekcie sygnał przyjmuje wartości dodatnie i ujemne w zależności od tego, czy cząstki osiadają na szkle, czy od niego odchodzą49. Wykryty sygnał jest wprost proporcjonalny do masy cząsteczkowej białek50. Zatem kalibracja sygnału względem masy z użyciem standardu masy pozwala wyznaczyć masę białek w próbce. Rycina 3C przedstawia przykład ludzkich oktamerów septyn zawierających SEPT9_i1. Większość wykrytych pojedynczych cząstek (~50%) posiada masę cząsteczkową oczekiwaną dla kompletnych oktamerów zawierających SEPT9_i1 (423 kDa) (Rycina 3C). Występują również cząstki o masach od 150 do 300 kDa, jednak nie zaobserwowano wyraźnego piku, co wskazuje na możliwą obecność innych gatunków septyn w niskim stężeniu. Podobnie, większość wykrytych pojedynczych cząstek dla heksamerów Drosophila znakowanych mEGFP posiada masę cząsteczkową oczekiwaną dla nienaruszonych heksamerów (361 kDa) (Rycina 3D). Dodatkowy wyraźny pik przy 241 kDa wskazuje na obecność stabilnych tetramerów zawierających dwa białka peanut, jedno DSep1 i jedno mEGFP-DSep2. Wreszcie, zarówno ludzkie, jak i muchowe kompleksy septyn wykazują pik w okolicy 80 kDa, który może być mieszaniną monomerów i dimerów, prawdopodobnie wzmocnioną przez śladowe ilości DTT lub inną małą cząsteczkę ulegającą agregacji, co objawia się pikiem po dodatniej stronie wykresu45.

Elektroforeza w żelu, rozkład masy białek, mikroskopia; oczyszczanie septyn, spektrometria mas.
Rycina 3: Przykłady wyników kontroli jakości oligomerów. (A) Przykład żelu denaturującego pokazujący różne frakcje piku elucji z oczyszczania ciemnych ludzkich oktamerów septyny_9i1. (B) Przykład elektroforezy natywnej różnych kompleksów septyn. (C,D) Różne przykłady wyników histogramów fotometrii masowej przy stężeniu 12.5 nM kompleksów septyn: (C) ciemne ludzkie oktamery septyny_9i1 oraz (D) heksamery septyn Drosophila DSep1-msfGFP. Linie przedstawiają dopasowania Gaussa. (E) Obraz TEM ciemnych ludzkich oktamerów septyny_9i1 o stężeniu 25 nM w buforze do septyn. Pasek skali = 200 nm. (F) Obraz średniej klasy ludzkich oktamerów septyny_9i1 SEPT2-msfGFP. Znaczniki msfGFP są widoczne jako rozmyte gęstości na dwóch końcach. Pasek skali = 10 nm. Panele (E) i (F) są prawem autorskim The Company of Biologists i zostały zaadaptowane z Iv et al.10 za zgodą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Biorąc pod uwagę, że zarówno żele rodzime, jak i iSCAT dostarczają jedynie informacji uśrednionych dla całego zespołu, w celu sprawdzenia integralności i czystości kompleksów poprzez bezpośrednią wizualizację zastosowano uśrednianie klas obrazów pojedynczych oligomerów septyn uzyskanych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Na obrazach TEM kompleksów septyn w buforze do septyn można zaobserwować pręty o długości 24 nm (heksamery) lub 32 nm (oktamerzy). Przykład ludzkiego oktameru septyn zawierającego SEPT9_i1 przedstawiono na Rysunku 3E. Podczas ich uśredniania klas można zaobserwować i policzyć każdą z podjednostek, co widać w przypadku ludzkiego oktameru z SEPT9_i1 znakowanego msfGFP na Rysunku 3F. W przypadku, gdy oligomer jest znakowany fluorescencyjnie, na końcach prętów można zaobserwować dodatkowe zagęszczenia odpowiadające SEPT2-msfGFP (Rysunek 3F).

Połączenie powyższych technik dowodzi, że oktamery (lub heksamery) o prawidłowym stosunku stechiometrycznym i wysokiej czystości mogą zostać oczyszczone przy użyciu opisanego protokołu. Ostatnim etapem kontroli jakości jest sprawdzenie funkcjonalności kompleksów septyn pod kątem ich zdolności do polimeryzacji. W obecności niskiego stężenia soli (<150 mM KCl w opisanym buforze9), jeśli septyny nie znajdują się w obecności innych białek lub ujemnie naładowanych błon lipidowych, ulegają one samoorganizacji w pęczki9. Polimeryzacji septyn zapobiega utrzymywanie ich w buforze do przechowywania, który charakteryzuje się wysokim (300 mM) stężeniem KCl. Heterooligomery septyn są następnie rozcieńczane w stosunku objętościowym 1:6 w buforze o tym samym składzie, ale bez KCl, aby uzyskać końcowe stężenie KCl wynoszące 50 mM. W celu przeprowadzenia obrazowania fluorescencyjnego bufor ten jest uzupełniany o układ usuwający tlen w celu ochrony przed fotobieleniem oraz o supresor mrugania. W mikroskopii TIRF w płytkim polu TIRF (~100 nm) można zaobserwować małe klastry białek (Ryc. 4A,B). W mikroskopie konfokalnym w górnych warstwach roztworu widoczne są duże klastry struktur nitkowatych (Ryc. 4C). W końcu, za pomocą TEM, można zaobserwować małe pęczki septyn (Ryc. 4D), odpowiadające klastrom zaobserwowanym w TIRF, oraz duże pęczki (Ryc. 4E), odpowiadające strukturom zaobserwowanym w mikroskopii konfokalnej. Wstawki na Ryc. 4D,E ujawniają, że oba typy struktur składają się z długich, cienkich filamentów biegnących równolegle, tworzących pęczki o zwężających się końcach. Wspólnie obrazy fluorescencyjne i TEM dowodzą, że oczyszczone kompleksy septyn mogą polimeryzować w filamenty, które z kolei samoorganizują się w pęczki.

Mikroskopia elektronowa struktur biomolekularnych; morfologia włókien białkowych; wstawka o wysokiej rozdzielczości.
Rysunek 4: Przykłady wyników kontroli jakości zdolności do polimeryzacji. (A) Obraz TIRF ludzkich heksamerów septyny o stężeniu 300 nM (10% heksamerów znakowanych msfGFP) w buforze fluoSPB. (B) Obraz TIRF ludzkich oktamerów septyny o stężeniu 300 nM zawierających SEPT9_i1 (10% oktamerów9_i1 znakowanych msfGFP) w buforze fluoSPB. (C) Konfokalne projekcje maksymalnej intensywności stosów Z w zakresie ~30 μm z odstępem 0,5 μm dla ludzkich oktamerów septyny_9i3 o stężeniu 300 nM w buforze fluoSPB. (A-C) Pasek skali = 10 μm i odwrócona skala szarości. (D,E) Przykładowe obrazy TEM (D) małych i (E) dużych pęczków ludzkich oktamerów septyny_9i1 w buforze darkSPB. Wstawki pokazują obszary, w których widoczne są wyraźne filamenty biegnące równolegle wewnątrz pęczka. Paski skali = 500 nm. Panele (C-E) są chronione prawem autorskim The Company of Biologists i zostały opracowane na podstawie pracy Iv et al.10 za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista plazmidów. Plazmidy do oczyszczania oligomerów septyn zgodnie z tym protokołem. Wszystkie plazmidy zostały zdeponowane w Addgene (pierwsza kolumna). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista buforów. Składy buforów wykorzystywanych do oczyszczania i kontroli jakości oligomerów septyn. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Masy cząsteczkowe i współczynniki wymierania. Lista mas cząsteczkowych (MW) i optycznych współczynników wymierania (ε) przy długości fali 280 nm, obliczonych za pomocą ProtParam na podstawie sekwencji kompleksu, przy założeniu liniowej fuzji podjednostek septyn, różnych kompleksów septyn oraz unikalnych podjednostek septyn (tylko MW), które można oczyścić przy użyciu plazmidów wymienionych w Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda pozwala na solidne oczyszczanie i kontrolę jakości wstępnie uformowanych heterooligomerów septyny. Oto niektóre z kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę w celu prawidłowego zastosowania tej metody. Podczas etapów elucji w rozdziałach chromatograficznych ważne jest, aby stosować zalecane (lub niższe) natężenie przepływu, aby zminimalizować rozcieńczenie kompleksów septynowych. Dodatkowo, aby zmaksymalizować odzysk białka podczas końcowego etapu zagęszczania, kolumna koncentratora jest zorientowana w taki sposób, że roztwór nie jest dociskany do filtra (gdy filtr znajduje się tylko po jednej stronie). Jeśli roztwór trafi bezpośrednio do filtra, białko przykleja się do niego znacznie bardziej, znacznie zmniejszając końcową wydajność. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że etap koncentracji nie zawsze jest konieczny. Pobieranie frakcji tylko z wąskiego zakresu wokół piku na chromatogramie zwykle daje wystarczająco wysokie stężenie wyjściowe (>3000 nM) dla wielu zastosowań rekonstytucji (które zwykle działają w zakresie 10-300 nM). Wreszcie, w celu kontroli jakości funkcjonalności kompleksów septynowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, ważne jest prawidłowe pasywowanie powierzchni szkiełek mikroskopowych, ponieważ kompleksy septynowe chciwie przylegają do szkła. Pasywacja szkiełek może odbywać się albo poprzez funkcjonalizację PLL-PEG, albo przez tworzenie neutralnych (100% DOPC) dwuwarstw lipidowych11,32.

W porównaniu z pierwotnym protokołem oczyszczania opisanym po raz pierwszy w Iv i wsp.10 nastąpiła zmiana w składzie (Tabela 2). Stężenie MgCl2 zostało zmniejszone z 5 mM do 2 mM, a stężenie i pH Tris-HCl zostały zmniejszone odpowiednio z 50 mM do 20 mM i z 8,0 do 7,4. Zmiany te zostały wprowadzone, aby warunki buforowe były zgodne z badaniami interakcji ludzkich septyn z dwuwarstwami lipidowymi, włóknami aktynowymi i mikrotubulami 10,11,32. Dzieje się tak, ponieważ autorzy utworzyli wspierane dwuwarstwy lipidowe i spolimeryzowaną aktynę w buforze F, którego skład jest identyczny jak w darkSPB, z wyjątkiem obecności ATP w buforze F. Zmiana buforu nie spowodowała żadnych zmian w jakości ani żywotności oczyszczonych septyn w porównaniu z oryginalnymi.

Ta metoda oczyszczania ma jeszcze kilka ograniczeń. Po pierwsze, różne próby oczyszczania mogą różnić się wydajnością (0,5-1 ml 2-5 μM kompleksów septynowych) i jakością funkcjonalną, co sprawdza zdolność tworzenia wiązek oczyszczonych kompleksów septynowych. Dlatego bardzo ważne jest konsekwentne przeprowadzanie kontroli jakości opisanych w tym dokumencie. Bardzo dobra kontrola czasu ekspresji i gęstości optycznej kultury bakteryjnej może pomóc złagodzić różnicę w wydajności. Po drugie, ten rurociąg oczyszczania nie jest w stanie rozróżnić trimerów i heksamerów ani tetramerów i oktamerów (ryc. 1B). Jednak eksperymenty kontroli jakości można wykorzystać do udowodnienia, że większość kompleksów septynowych występuje w postaci długich oligomerów. W przypadku, gdy wymagany jest jeszcze węższy rozkład wielkości oligomerów, chromatografię wykluczania wielkości można wprowadzić pomiędzy krok 1.6. i krok 1.7. protokołu oczyszczania. Ten opcjonalny krok jednak drastycznie zmniejsza wydajność i nie jest zalecany, chyba że jest to absolutnie konieczne. Ostatnie, bardziej fundamentalne ograniczenie wynika z zastosowania E. coli jako systemu ekspresji dla rekombinowanych kompleksów septynowych. Oczywiście system ten nie pozwala na modyfikacje potranslacyjne (PTM), które zostały zgłoszone w komórkach zwierzęcych, takie jak fosforylacja, acetylacja i sumoilacja 6,51,52,53. Te modyfikacje potranslacyjne można dodać poprzez wdrożenie podobnej strategii oczyszczania w komórkach owadów lub ludzi. Co więcej, w artykule tym omówiono tylko rekonstytucję septyn jako takich, ale badania na komórkach wskazują, że białka regulatorowe, takie jak białka z rodziny Borg54,55 i anilina 24,25,56, mogą mieć znaczący, ale słabo poznany wpływ na tworzenie i funkcje septyn, a zatem są ważne do ostatecznego włączenia do in vitro studia. Protokoły oczyszczania białek Borg i aniliny zostały zgłoszone54,57.

Opisany tutaj protokół oczyszczania septyny oferuje ustandaryzowany sposób oczyszczania septyn w postaci oligomerów za pomocą prawidłowej stechiometrii podjednostek, oferując ważny postęp w stosunku do wielu wcześniejszych badań in vitro opierających się na pojedynczych podjednostkach septyny. Mimo że niektóre septyny w określonych kontekstach mogą działać jako pojedyncza podjednostka2, obecna literatura zdecydowanie sugeruje, że w komórkach zwierzęcych septyny funkcjonują głównie w kompleksach 9,58. W związku z tym zastosowanie wstępnie uformowanych heterooligomerów, takich jak te opisane w tym artykule i innych 10,11,18,32,35,36,37, ma ogromne znaczenie dla badania strukturalnych i biofizycznych właściwości septyn za pomocą in vitro rekonstytucji w celu przeanalizowania ich funkcji w komórce. Co więcej, septyny są samoorganizującymi się białkami z wieloma partnerami interakcji, w tym błoną i cytoszkieletem, co czyni je bardzo interesującymi dla oddolnej biologii syntetycznej 59,60,61 i badań wywołanych przez białka zmian we właściwościach biofizycznych błony, takich jak krzywizna 42,62,63.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Cecilii de Agrela Pinto, Tomásowi de Garaya i Katharinie Häußermann za pomoc w eksperymentach z masową fotometrią (iSCAT); Arjen Jakobi i Wiel Evers za ich pomoc w TEM; Lucii Baldauf za pomoc w realizacji TIRF; Pascal Verdier-Pinard za rady dotyczące elektroforezy natywnej; Agata Szuba i Marjolein Vinkenoog za pomoc w organizacji działań na rzecz oczyszczania septyny Drosophila oraz obrazowania komórek i tkanek (PICT-IBiSA), Instytutu Curie, członka francuskiej Narodowej Infrastruktury Badawczej Francja-BioImaging (ANR10-INBS-04). Badania te otrzymały finansowanie z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO/OCW) w ramach grantu Grawitacyjnego "BaSyC-Building a Synthetic Cell" (024.003.019) oraz z Agence Nationale pour la Recherche (ANR przyznaje ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "CZAS WRZEŚNIA"; oraz ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sumator laserowy 488nm Mikroskop iLAS2GatacaTIRF
linie laseroweKoherentnymikroskop konfokalny
4k X 4k F416 Kamera CMOSTVIPSDla JEM-1400plus
4x bufor próbki nativePAGEThermo Fisher scientificBN2003
Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (TROLOX)Sigma-Aldrich238813Aby zapobiec mruganiu
AKTA pure 25 M1GE healthcare1680311
AmpicylinaSigma-AldrichA9518-25G
Węgiel Type-B, siatka EM 300Ted pella01813-F
Węgiel Type-B, siatka 300 EMNauka o mikokopii elektronowejCF300-Cu
Szkło nakrywkowe #1.5HThorslabsCG15KH
CSU-X1-M1 jednostka konfokalnakonfokalnyYokogawa
DesthiobiotinSigma-AldrichD1411-1G
Ditiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779
DNAseSigma-Aldrich10104159001
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
Eclipse Ti2-ENikonMikroskop konfokalny
Koktajl hamujący proteazę bez EDTARoche481761
HisTrap HP, 5 mLGE healthcare29-0588-3
iLAS2 azymutalny system oświetlenia TIRF Mikroskop GatacaTIRF
ImidazolSigma-Aldrich1202-1KG
InstantBlue Protein Gel StainWestburg Life SciencesEP ab119211
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Thermo Fishernaukowy 10849040
iXon Ultra 888 Kamera EMCCDMikroskop
iXon Ultra 897 EM-CCD Mikroskop AndorTIRF
JEM-1400plusMikroskop JOELTEM TUDelft
kappa-cassein Rosół Sigma-AldrichC0406
LBSigma-AldrichL3022-6X1KG
LizozymSigma-Aldrich62971-10G-F
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266-100G
Siarczan magnezuSigma-Aldrich746452-1KG
MetyloklelozaSigma-Aldrich8074844
System MilliQ (Integral 10)Dozownik wodyMerck-Millipore
Mini protean TGXżele BIORAD4561086
NativeMark niebarwiony wzorzec białkaInvitrogenLC0725Do iSCAT i Native żele
NativePAGE 4-16% ŻELEThermo Fisher BN1002BOX
NativePAGE Zestaw buforowy do bieganiaThermo Fisher naukowyBN2007
Nikon Ti2-E firmy NikonMikroskop TIRF
Nr 1 Szkiełka nakrywkowe MenzelThermo Fisher 11961988
naukowy parafilm Sigma-AldrichP7668
Plan Apo i czasy; Obiektyw zanurzeniowy 100/1.45 NAInstrumentyMikroskop konfokalny
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Poli(L-lizyna)-biotynylowany PEG (PLL-PEG)sSuSoSCHF560.00
Roztwór poli-L-lizyny 0,01%Sigma-AldrichP4832Do szkiełek iSCAT
Chlorek potasuSigma-AldrichP9541-1KG
Zasilacz do natywnych żeliCONSORTS/N 71638
POWERPAC UNIVERSALBIORAD042BR31206
Protokatechuat 3,4-dioksygenazy (PCD)Sigma-AldrichP8279-25UNpochłaniacz tlenu - enzym
Kwas protokatechowy (PCA)Sigma-Aldrich03930590-50MGpochłaniacz tlenu - odczynnik
Q500 SonicatorQsonica Q500-110
Kamera QuemesaOlympusFor Tecnai Spirit
Refeyn OneMPRefeyn
Bufor do próbek, laemmli 2x koncentratSigma-AldrichS3401-10vl
Uszczelki silikonoweSigma-AldrichGBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer Kasety do dializy 30k MWCO 3mLThermo Fisher scientific66381
SpectinomycinSigma-AldrichPHR1441-1G
StrepTrap HP, 1 mlGE healthcare28-9075-46
Mikroskop Tecnai SpiritThermo Scientific, mikroskop FEITEM Instytut Curie
Wspaniały bulionSigma-AldrichT0918-1KG
Bufor Tris/Glyine/SDSBIORAD1610772
Tris-HClSigma-AldrichT5941-1KG
Myjka ultradźwiękowaBransonCPX2800H-E
Vivaspin 6, 30 000 MWCO PESSartoriusVS0622
488nm Szafirowe Mikroskop Instrumenty konfokalnyInstrumenty Nikon

Bibliografia

  1. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: The fourth component of the cytoskeleton. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 183-194 (2012).
  2. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3802(2022).
  3. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. Septin form and function at the cell cortex. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17173-17180 (2015).
  4. Smith, C., et al. Septin 9 exhibits polymorphic binding to F-actin and inhibits myosin and cofilin activity. Journal of Molecular Biology. 427 (20), 3273-3284 (2015).
  5. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  6. Marquardt, J., Chen, X., Bi, E. Architecture, remodeling, and functions of the septin cytoskeleton. Cytoskeleton. 76 (1), 7-14 (2018).
  7. Van Ngo, H., Mostowy, S. Role of septins in microbial infection. Journal of Cell Science. 132 (9), (2019).
  8. Fung, K. Y. Y., Dai, L., Trimble, W. S. Cell and molecular biology of septins. International Review of Cell and Molecular Biology. 310, 289-339 (2014).
  9. Kinoshita, M., Field, C. M., Coughlin, M. L., Straight, A. F., Mitchison, T. J. Self- and actin-templated assembly of mammalian septins. Developmental Cell. 3 (6), 791-802 (2002).
  10. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers 2 with distinct SEPT9 isoforms. Journal of Cell Science. 134 (15), (2021).
  11. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349(2021).
  12. Kinoshita, M. Assembly of mammalian septins. Journal of Biochemistry. 134 (4), 491-496 (2003).
  13. Connolly, D., et al. Septin 9 isoform expression, localization and epigenetic changes during human and mouse breast cancer progression. Breast Cancer Research. 13 (4), 76(2011).
  14. Connolly, D., et al. Septin 9 amplification and isoform-specific expression in peritumoral and tumor breast tissue. Biological Chemistry. 395 (2), 157-167 (2014).
  15. Estey, M. P., Di Ciano-Oliveira, C., Froese, C. D., Bejide, M. T., Trimble, W. S. Distinct roles of septins in cytokinesis: SEPT9 mediates midbody abscission. Journal of Cell Biology. 191 (4), 741-749 (2010).
  16. John, C. M., et al. The Caenorhabditis elegans septin complex is nonpolar. EMBO Journal. 26 (14), 3296-3307 (2007).
  17. Field, C. M., et al. A purified Drosophila septin complex forms filaments and exhibits GTPase activity. Journal of Cell Biology. 133 (3), 605-616 (1996).
  18. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: Supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  19. Sellin, M. E., Sandblad, L., Stenmark, S., Gullberg, M. Deciphering the rules governing assembly order of mammalian septin complexes. Molecular Biology of the Cell. 22 (17), 3152-3164 (2011).
  20. Akil, A., et al. Septin 9 induces lipid droplets growth by a phosphatidylinositol-5-phosphate and microtubule-dependent mechanism hijacked by HCV. Nature Communications. 7, 12203(2016).
  21. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology. 19 (2), 140-145 (2009).
  22. Omrane, M., et al. Septin 9 has two polybasic domains critical to septin filament assembly and Golgi integrity. iScience. 13, 138-153 (2019).
  23. Carim, S. C., Kechad, A., Hickson, G. R. X. Animal cell cytokinesis: The rho-dependent actomyosin-anilloseptin contractile ring as a membrane microdomain gathering, compressing, and sorting machine. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575226(2020).
  24. El Amine, N., Kechad, A., Jananji, S., Hickson, G. R. X. Opposing actions of septins and Sticky on Anillin promote the transition from contractile to midbody ring. Journal of Cell Biology. 203 (3), 487-504 (2013).
  25. Renshaw, M. J., Liu, J., Lavoie, B. D., Wilde, A. Anillin-dependent organization of septin filaments promotes intercellular bridge elongation and Chmp4B targeting to the abscission site. Open Biology. 4 (1), 130190(2014).
  26. Vogt, E. T., et al. The ultrastructural organization of actin and myosin II filaments in the contractile ring: new support for an old model of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 28 (5), 613-623 (2017).
  27. Mavrakis, M., et al. Septins promote F-actin ring formation by crosslinking actin filaments into curved bundles. Nature Cell Biology. 16 (4), 322-334 (2014).
  28. Karasmanis, E. P., et al. A septin double ring controls the spatiotemporal organization of the ESCRT machinery in cytokinetic abscission. Current Biology. 29 (13), 2174-2182 (2019).
  29. Hagiwara, A., et al. Submembranous septins as relatively stable components of actin-based membrane skeleton. Cytoskeleton. 68 (9), 512-525 (2011).
  30. Calvo, F., et al. Cdc42EP3/BORG2 and septin network enables mechano-transduction and the emergence of cancer-associated fibroblasts. Cell Reports. 13 (12), 2699-2714 (2015).
  31. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  32. Kuzmić, M., et al. Septin-microtubule association via a motif unique to isoform 1 of septin 9 tunes stress fibers. Journal of Cell Science. 135 (1), (2022).
  33. Shindo, A., et al. Septin-dependent remodeling of cortical microtubule drives cell reshaping during epithelial wound healing. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  34. Hu, Q., Nelson, W. J., Spiliotis, E. T. Forchlorfenuron alters mammalian septin assembly, organization, and dynamics. Journal of Biological Chemistry. 283 (43), 29563-29571 (2008).
  35. Mavrakis, M., Tsai, F. C., Koenderink, G. H. Purification of recombinant human and Drosophila septin hexamers for TIRF assays of actin-septin filament assembly. Methods in Cell Biology. 136, 199-220 (2016).
  36. Nakos, K., Radler, M. R., Spiliotis, E. T. Septin 2/6/7 complexes tune microtubule plus-end growth and EB1 binding in a concentration- and filament-dependent manner. Molecular Biology of the Cell. 30 (23), 2913-2928 (2019).
  37. Kaplan, C., et al. Absolute arrangement of subunits in cytoskeletal septin filaments in cells measured by fluorescence microscopy. Nano Letters. 15 (6), 3859-3864 (2015).
  38. Castro, D. K. S. V., et al. A complete compendium of crystal structures for the human SEPT3 subgroup reveals functional plasticity at a specific septin interface. IUCrJ. 7, Pt 3 462-479 (2020).
  39. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 1-13 (2020).
  40. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  41. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  42. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10, 420(2019).
  43. Zhou, R., Shi, Y., Yang, G. Expression, purification, and enzymatic characterization of intramembrane proteases. Methods in Enzymology. 584, 127-155 (2017).
  44. Diebold, M. L., Fribourg, S., Koch, M., Metzger, T., Romier, C. Deciphering correct strategies for multiprotein complex assembly by co-expression: Application to complexes as large as the histone octamer. Journal of Structural Biology. 175 (2), 178-188 (2011).
  45. Lebedeva, M. A., Palmieri, E., Kukura, P., Fletcher, S. P. Emergence and rearrangement of dynamic supramolecular aggregates visualized by interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 14 (9), 11160-11168 (2020).
  46. Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. Journal of Structural Biology. 128 (1), 82-97 (1999).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166(2018).
  48. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. Journal of Structural Biology. 116 (1), 190-199 (1996).
  49. Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 70, 301-322 (2019).
  50. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  51. Hernández-Rodríguez, Y., Momany, M. Posttranslational modifications and assembly of septin heteropolymers and higher-order structures. Current Opinion in Microbiology. 15 (6), 660-668 (2012).
  52. Ribet, D., et al. SUMOylation of human septins is critical for septin filament bundling and cytokinesis. Journal of Cell Biology. 216 (12), 4041-4052 (2017).
  53. Sinha, I., et al. Cyclin-dependent kinases control septin phosphorylation in Candida albicans hyphal development. Developmental Cell. 13 (3), 421-432 (2007).
  54. Sheffield, P. J., et al. Borg/Septin interactions and the assembly of mammalian septin heterodimers, trimers, and filaments. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3483-3488 (2003).
  55. Joberty, G., et al. Borg proteins control septin organization and are negatively regulated by Cdc42. Nature Cell Biology. 3 (10), 861-866 (2001).
  56. Chen, X., Wang, K., Svitkina, T., Bi, E. Critical roles of a RhoGEF-anillin module in septin architectural remodeling during cytokinesis. Current Biology. 30 (8), 1477-1490 (2020).
  57. Kučera, O., et al. Anillin propels myosin-independent constriction of actin rings. Nature Communications. 12 (1), 1-12 (2021).
  58. Hsu, S. C., et al. Subunit composition, protein interactions, and structures of the mammalian brain sec6/8 complex and septin filaments. Neuron. 20 (6), 1111-1122 (1998).
  59. Olivi, L., et al. Towards a synthetic cell cycle. Nature Communications. 12 (1), 1-11 (2021).
  60. Hürtgen, D., Härtel, T., Murray, S. M., Sourjik, V., Schwille, P. Functional modules of minimal cell division for synthetic biology. Advanced Biosystems. 3 (6), 1800315(2019).
  61. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: Reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  62. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. The Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  63. Lobato-Márquez, D., Mostowy, S. Septins recognize micron-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie septynchromatografia powinowactwafotometria masowamikroskopia elektronowaelektroforeza elowapolimeryzacja septynfilamenty cytoszkieletu
Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.