Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63895

⸱

19 maja 2022

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Streszczenie

Rola pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w kontekście infekcji bakteryjnej pojawiła się jako nowa droga do zrozumienia fizjologii mikrobiologicznej. W szczególności Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV odgrywają rolę w interakcji gospodarz-patogen i odpowiedzi na stres środowiskowy. Mtb EV są również wysoce antygenowe i wykazują potencjał jako składniki szczepionek. Najpopularniejszą metodą oczyszczania Mtb EV jest ultrawirowanie w gradieniu gęstości. Proces ten ma kilka ograniczeń, w tym niską przepustowość, niską wydajność, zależność od drogiego sprzętu, wyzwania techniczne i może negatywnie wpłynąć na powstałe przygotowanie. Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) jest łagodniejszą metodą alternatywną, która zwalcza wiele ograniczeń ultrawirowania. Protokół ten pokazuje, że SEC jest skuteczny w wzbogacaniu Mtb EV i wytwarza wysokiej jakości preparaty Mtb EV o zwiększonej wydajności w szybki i skalowalny sposób. Ponadto porównanie z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości za pomocą procedur kwantyfikacji i kwalifikacji pokazuje korzyści płynące z SEC. Podczas gdy ocena ilości EV (analiza śledzenia nanocząstek), fenotypu (transmisyjna mikroskopia elektronowa) i zawartości (Western blotting) jest dostosowana do Mtb EV, zapewniony przepływ pracy można zastosować do innych prątków.

Wprowadzenie

Uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) przez patogeny może być kluczem do odblokowania nowych technologii do kontroli chorób zakaźnych1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jest patogenem o poważnych konsekwencjach, zaraża około jednej trzeciej światowej populacji i odbiera życie milionom ludzi każdego roku2. Produkcja EV przez Mtb jest dobrze udokumentowana, ale nieuchwytna w biogenezie i różnych rolach (tj. immunostymulacyjnych, immunosupresyjnych, pozyskiwania żelaza i składników odżywczych) tych EV w kontekście infekcji3,4,5. Wysiłki mające na celu zrozumienie składu Mtb EV ujawniły kule zamknięte błoną lipidową o długości 50-150 nm, pochodzące z błony plazmatycznej zawierającej lipidy i białka o znaczeniu immunologicznym3,6. Badania nad rolą Mtb EV w fizjologii bakterii ujawniły znaczenie modulacji bakteryjnej EV w odpowiedzi na stres środowiskowy dla przeżycia5. Badania interakcji gospodarz-patogen były bardziej skomplikowane do interpretacji, ale dowody wskazują, że Mtb EV mogą wpływać na odpowiedź immunologiczną gospodarza i mogą potencjalnie służyć jako skuteczny składnik szczepienia3,4,7.

Większość dotychczasowych badań nad pojazdami elektrycznymi Mtb opierała się na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wzbogacenia pęcherzyków8. Okazało się to skuteczne w przypadku badań na małą skalę; Technika ta wiąże się jednak z kilkoma wyzwaniami technicznymi i logistycznymi. Alternatywne przepływy pracy łączą wieloetapowe wirowanie w celu usunięcia całych komórek i dużych zanieczyszczeń, z końcowym etapem ultrawirowania w celu granulowania pojazdów elektrycznych. Metodologia ta może różnić się wydajnością i często skutkuje niską wydajnością i współoczyszczaniem rozpuszczalnych biomolekuł niezwiązanych z pęcherzykami, wpływając jednocześnie na integralność pęcherzyków9. Ponadto proces ten jest czasochłonny, wymaga ręcznej pracy i jest bardzo ograniczony pod względem przepustowości ze względu na ograniczenia sprzętowe.

Obecny protokół opisuje technikę alternatywną dla ultrawirowania gradientu gęstości: chromatografię wykluczającą rozmiar (SEC). Metoda ta została zademonstrowana dla prątków środowiskowych, a w obecnej pracy została ekstrapolowana do Mtb10. Dostępna na rynku kolumna i automatyczny kolektor frakcji mogą poprawić spójność przygotowania pęcherzowego i zmniejszyć konieczność stosowania specjalistycznego, drogiego sprzętu. Możliwe jest również wykonanie tego protokołu w ułamku czasu w porównaniu z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości, co zwiększa przepustowość. Technika ta jest mniej wymagająca technicznie, dzięki czemu jest łatwiejsza do opanowania i może zwiększyć odtwarzalność między i wewnątrz laboratorium. Wreszcie, SEC ma wysoką skuteczność separacji i jest delikatny, zachowując integralność pęcherzyków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Stanowego Kolorado zatwierdził niniejsze badanie (19-046B). Hodowla prątków gruźlicy i zbiór supernatantów z kultur bogatych w EV przeprowadzono przez przeszkolony personel w laboratorium o wysokim stopniu hermetyzacji. Materiały zostały wyprowadzone z obszaru o wysokim stopniu hermetyczności po przeprowadzeniu, potwierdzeniu i zatwierdzeniu prawidłowej metody inaktywacji przez instytucjonalne polityki bezpieczeństwa biologicznego. Podczas powielania protokołu, jeśli zwalidowana metoda inaktywacji lub sterylnej filtracji nie jest wykonalna, należy wykonać następujące procedury w laboratorium o wysokim stopniu hermetyzacji.

1. Przygotowanie surowego koncentratu Mtb EV

UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące uprawy Mtb i przygotowania białka filtratu kulturowego (CFP) można znaleźć w Bibliografii11,12. Zaleca się, aby pożywki do hodowli bakteryjnych były wolne od suplementów wzrostu zawierających EV lub składników białkowych, takich jak albumina oleinowa i katalaza dekstrozy (OADC) oraz detergentów, takich jak Tween. Zaleca się również, aby jakość kultury bakteryjnej i zebrany CFP były badane przesiewowo, aby zapewnić ograniczoną śmierć komórek i lizę13,14.

  1. Przygotować filtr odśrodkowy o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) (patrz tabela materiałów), dodając pełną objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS). Wirować przez 5 minut w temperaturze 2.800 x g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W przypadku korzystania z filtra bez martwej objętości należy zadbać o to, aby objętość próbki nie zmniejszyła się poniżej poziomu filtra, co spowodowałoby całkowite wysuszenie filtra podczas wirowania.
  2. Odrzucić przepływowy i pozostały PBS przed napełnieniem komory na próbkę Mtb CFP do maksymalnej pojemności. Odwirować przy 2 800 x g w temperaturze 4 °C do momentu, gdy objętość zmniejszy się do minimalnej objętości urządzenia do ultrafiltracji. Powtórz w razie potrzeby, dodając więcej CFP do urządzenia, aż cała próbka zostanie wystarczająco zredukowana.
    UWAGA: W razie potrzeby zachowaj część materiału przepływowego 100 kDa (100F) do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 1x PBS do jednostki filtrującej zawierającej koncentrat do całkowitej pojemności urządzenia. Zmniejsz głośność zgodnie z opisem w 1.2. Powtórz ten krok pięć razy, aby zapewnić całkowite umycie i wymianę bufora.
  4. Odzyskać skoncentrowany retentat CFP o stężeniu 100 kDa (100R) zgodnie ze specyfikacją urządzenia do ultrafiltracji (patrz tabela materiałów). Po odzyskaniu 100R umyj filtr minimalną objętością 1x PBS co najmniej trzy razy i połącz płukanie z 100R, aby zmaksymalizować odzysk.
  5. Określić ilościowo materiał 100R za pomocą testu bicynkonicznego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Aby wykonać test, użyj kilku rozcieńczeń próbek 1:2, 1:5 i 1:10 w PBS. Zbadać próbkę w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: W razie potrzeby zachowaj część materiału 100R do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Chromatografia wykluczania wielkości do wzbogacania Mtb EV z CFP

UWAGA: Poniższa procedura jest specyficzna dla użycia 3 mg 100R Mtb CFP z kolumną SEC i automatycznym kolektorem frakcji (AFC, patrz Tabela Materiałów). Można go dostosować do innych stężeń początkowych i typów kolumn, postępując zgodnie ze specyfikacjami producenta. Dodatkowo użytkownikom zaleca się przeczytanie i zrozumienie instrukcji obsługi automatycznego kolektora frakcji.

  1. Pozwól, aby kolumna SEC zrównoważyła się do temperatury pokojowej.
  2. Włącz AFC za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu jednostki wieżowej i w razie potrzeby dostosuj ustawienia ogniwa obciążnikowego, naciskając przycisk SETUP na ekranie dotykowym menu głównego. Czujnik wagowy należy kalibrować tylko przy pierwszym użyciu, po każdej aktualizacji oprogramowania i w przypadku zauważenia niespójności w objętościach zbierania frakcji.
  3. Na ekranie SETUP (Konfiguracja) wyrównaj karuzelę, wybierając opcję KARUZELA > KALIBRUJ. Włóż karuzelę z 13 małymi otworami skierowanymi do góry do wieży AFC i wyreguluj karuzelę tak, aby dysza płynu znajdowała się bezpośrednio nad pozycją spłukiwania, naciskając przyciski - i/lub +.
  4. Usuń zaślepki z zrównoważonej kolumny SEC. Wsuń kolumnę SEC do odpowiedniego uchwytu kolumny i ostrożnie zainstaluj ją na wieży AFC. Upewnij się, że znacznik identyfikacji radiowej (RFID) na kolumnie jest skierowany w stronę AFC i sprawdź, czy połączenie między kolumną a zaworem jest bezpieczne. Umieść rurkę odprowadzającą odpady w pojemniku zbiorczym.
  5. Na ekranie SETUP wybierz Harmonogram odbioru i ustaw liczbę na 13, a rozmiar na 0.5 ml, naciskając przyciski - i/lub +. Pozostaw ustawienie "Objętość bufora" jako domyślne 2,7 ml, a następnie zamknij okno "Harmonogram odbioru", naciskając X.
  6. Wybierz ROZPOCZNIJ KOLEKCJĘ na ekranie głównym i potwierdź parametry zbierania, wybierając TAK. Załaduj 13 oznaczonych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml z otwartymi pokrywkami i skierowanymi w stronę środka karuzeli.
  7. Przesuń AFC, wybierając OK, a następnie zamontuj zbiornik kolumny i ponownie przejdź, naciskając OK. Wybierz opcję opróżnienia kolumny, naciskając przycisk TAK, a następnie dodaj jeden wolumin kolumny PBS filtrowanego przez 0,2 μm, aby usunąć bufor magazynu. Po zakończeniu spłukiwania przesuń AFC, naciskając OK.
  8. Umieść pokrywę karuzeli na AFC i naciśnij OK. Przygotować jedną objętość jednej kolumny z filtrowanym PBS 0,2 μm. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar buforu z kolumny.
  9. Przynieś 3 mg próbki 100R, jak określono ilościowo w kroku 1.5, do 500 μL z 1x PBS. Dodać próbkę 3 mg na górze kolumny. Przesunąć AFC i pozwolić, aby próbka spłynęła do fryty. Gdy próbka całkowicie wprowadzi się do kolumny, dodać PBS przygotowany w kroku 2.6 do zbiornika.
  10. Monitoruj przebieg AFC, gdy zbiera on najpierw wolumin pustek, a następnie określone frakcje. Po zakończeniu przebiegu i powrocie karuzeli do pozycji odpadu zdejmij pokrywę i wyjmij rurki z frakcjami z karuzeli. Frakcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed oznaczaniem ilościowym (etap 3) i kwalifikacją (etap 4).
  11. Jeśli kolumna ma być ponownie użyta, wybierz opcję czyszczenia kolumny, naciskając przycisk TAK; w przeciwnym razie naciśnij przycisk NIE. Postępuj zgodnie z instrukcjami na AFC.
    UWAGA: Po umyciu kolumny i przepuszczeniu bufora magazynowego można ją wyjąć, zakryć i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Kwantyfikacja pojazdów elektrycznych Mtb

  1. Zmierz stężenie białka dla każdej frakcji za pomocą BCA i mikro BCA12.
    1. W przypadku frakcji o wielkości 0,5 ml pobranych z 3 mg 100R Mtb CFP należy użyć mikro BCA z rozcieńczeniem 1:3 dla frakcji o numerach 1-7 każdej próbki w trzech egzemplarzach.
    2. W przypadku frakcji o objętości 0,5 ml o numerach 5-13 należy użyć BCA bez rozcieńczania dla każdej próbki w trzech egzemplarzach.
      UWAGA: Nakładanie się testów dla frakcji 5-7 pomoże zapewnić, że wszystkie frakcje będą miały czytelne dane wyjściowe.
  2. Określ ilościowo stężenie cząstek dla każdej frakcji za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA).
    1. Rozcieńczyć próbki w 1 ml 1x PBS, stosując następujące sugerowane proporcje początkowe; dla frakcji 1-3 należy użyć 1:100, a następnie dla pozostałych frakcji użyć rozcieńczenia 1:10.
    2. Rozcieńczone roztwory należy przemieszać wirowo, a następnie pobrać próbkę do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Umieścić strzykawkę w automatycznej pompie strzykawkowej, jeśli jest dostępna.
    3. Ustaw pompę strzykawkową na 30 μl/min i użyj ustawień przechwytywania wideo z wzmocnieniem ekranu 10-12 i poziomem kamery 10-12. Dostosuj ostrość dla każdej próbki.
    4. Zbierz co najmniej trzy filmy w ciągu 30 sekund każdy, używając stałego przepływu.
    5. Wykonaj analizę z progiem wykrywania oprogramowania ustawionym na pięć.
      UWAGA: Uzyskanie danych NTA dla najnowszych frakcji (>7) bez poświęcenia znacznej objętości próbki może nie być możliwe.

4. Kwalifikacja Mtb EV

  1. Wizualizacja ogólnego profilu białkowego każdej frakcji za pomocą żelu białkowego barwionego srebrem.
    UWAGA: Szczegółowe procedury dla SDS-PAGE i srebrnej plamy można znaleźć w Reference15.
    1. Dodać bufor próbki SDS do 10 μl każdej frakcji i 5 μg CFP, 100R i 100F. Gotować przez 5 minut w temperaturze 100 °C, a następnie załadować 4%-12% żel Bis-Tris z drabinką masy cząsteczkowej do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (STRONA) (patrz Tabela materiałów).
    2. Uruchomić żel za pomocą 1x buforu do pracy kwasu 2-[N-morfolino]etanosulfonowego (MES) (patrz tabela materiałów) i prądu 200 V przez 35 minut.
    3. Wyjmij żel z kasety i kontynuuj barwienie srebrem15.
  2. Oceń obecność lub brak markerów EV w każdej frakcji za pomocą Western blot.
    UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące Western blotting można znaleźć w Reference15.
    1. Uruchom żel SDS-PAGE zgodnie z opisem w krokach 4.1.1-4.1.2.
    2. Wyjąć żel z kasety i przenieść rozwiązane białka na membranę nitrocelulozową o wielkości 0,2 μm (patrz tabela materiałów), przykładając prąd o napięciu 50 V przez co najmniej 1 godzinę.
    3. Wykonaj analizę Western blot, aby ocenić interesujące Cię białka. Zaleca się pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko LpqH, lipoarabinomannanowi (LAM) i GroES (patrz tabela materiałów).
    4. Frakcje pulowe na podstawie obecności lub braku markerów, w zależności od zastosowania w dalszej części łańcucha dostaw.
  3. Potwierdź obecność nienaruszonych pęcherzyków za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
    1. Utrwalić 15 μl próbki pęcherzyka, dodając 15 μl 4% paraformaldehydu klasy EM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Przygotuj siatkę TEM o siatce 200 mesh z miedzi powlekanej węglem, oczyszczając powierzchnię i tworząc hydrofilowe podłoże.
      UWAGA: Zaleca się czyszczenie plazmowe 95% argonem, 5% tlenem i 30% mocą plazmy przez 1 minutę.
    3. Upuść 10 μl utrwalonej próbki na siatkę i pozwól próbce przylegać przez 10 minut, a następnie zetrzyj nadmiar cieczy bibułą filtracyjną.
    4. Unosić siatkę na kropli ultraczystej wody przez 30 s, a następnie zetrzyj nadmiar płynu.
    5. Unosić siatkę na kropli octanu uranylu klasy d% EM przez 2 minuty, a następnie zetrzeć nadmiar płynu.
    6. Pozostaw ruszt do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
    7. Obraz za pomocą TEM (patrz tabela materiałów) przy napięciu 100 kV lub podobnym.
      UWAGA: Inne metody oznaczania ilościowego i charakterystyki EV powinny być stosowane w oparciu o dalsze zastosowania. Należy zapoznać się z Minimalnymi informacjami do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych18 w celu uzyskania wytycznych zapewniających rygor i odtwarzalność wszystkich badań EV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Białko z filtratu hodowli (CFP) z Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zostało skoncentrowane, poddane ilościowemu oznaczeniu, a następnie 3 mg materiału naniesiono na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC). Stężenia białek oraz cząstek wyznaczono odpowiednio metodą BCA i NTA. Przewidywane zakresy odzysku białek i cząstek oraz dokładne wartości uzyskane w tych wynikach przedstawiono w Tabeli 1. Wartości znacznie przekraczające te zakresy mogą wskazywać na zanieczyszczenie lub pro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe Mycobacterium tuberculosis są wysoce antygenowymi rezerwuarami, co czyni je atrakcyjną drogą do opracowywania narzędzi diagnostycznych i przyszłych szczepionek 4,19,20. Historycznie rzecz biorąc, ultrawirowanie w gradiencie gęstości było stosowane do oddzielania Mtb EV od innych rozpuszczalnych, wydzielanych materiałów8. Chociaż proces ten jest skuteczny, jest również...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie ze strony College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award i College Research Council Shared Research Program dla NKG oraz finansowanie przez ATCC (nagroda # 2016-0550-0002) dla KMD. Chcielibyśmy również podziękować Anne Simpson za wsparcie techniczne i BEI Resources, NIAID, NIH za następujące odczynniki: Monoklonalny Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produkowany in vitro), NR-13792, Monoklonalny Anti-My-Mybacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Klon IT-3 (SA-12) (produkowany in vitro), NR-49223 i Monoklonalny Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Klon CS-35 (produkowany in vitro), NR-13811.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20x bufor do biegania MES SDSThermoFisher ScientificNP0002
96-dołkowa płytkaCorning15705-066
Automatyczny kolektor frakcjiIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark Wstępnie barwiona drabinka białkowaInvitrogen10748010
Wirówka stołowaBeckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 Filtr odśrodkowy, odcięcie 100 kDaMillipore SigmaUFC710008Urządzenie do ultrafiltracji używane w kroku 1.1
System elektroblottinguThermoFisher Scientific09-528-135
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowaSciences 15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu GridsMikroskopia elektronowa NaukiFCF200H-Cu-TA
Kozia Anty-Mysia IgG H& L (fosfataza alkaliczna), cała cząsteczka, 1 mlAbCamab6790Przeciwciało wtórne
JEM-1400 Transmisyjny mikroskop elektronowyZestaw
Micro BCA Czytnik mikropłytekThermoFisher Scientific23235
BIOTEKEpoch
Monoklonalny anty-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3814c)Zasoby BEINR-49223Przeciwciało pierwszorzędowe
Monoklonalne przeciwciało anty-Mycobacterium tuberculosis LpqH (gen Rv3763)Zasoby BEINR-13792Przeciwciało pierwszorzędowe
Mono-Mycobacterium tuberculosis LAM, klon CS-35Zasoby BEINR-13811Przeciwciało pierwotne
NanoClean 1070Fischione InstrumentsDo plazmowego czyszczenia siatki TEM
Nanosight wyposażony w pompę strzykawkową i komputer z oprogramowaniem NanoSight NTAMalvern PanalyticalNS300
Membrana nitrocelulozowa, rolka, 0,2 μ mBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkoweThermoFisher ScientificNP0323BOX
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X bez wapnia i magnezuCorning21-040-CV
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
qEV Oryginalny 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDSEC kolumna SDS
bufor próbkiBosterAR1112Autorska receptura używana w tej procedurze, jednak ten produkt jest odpowiednikiem
komory żelowej SDS-PAGEThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449Wewnętrzny protokół używany w tej procedurze, jednak ten zestaw jest równoważny
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Sciences22400
klasy EM do oznaczania białek JOEL

Bibliografia

  1. Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
  2. World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
  3. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  4. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921(2014).
  5. Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
  6. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  7. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).
  10. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  11. Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
  12. Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
  13. Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
  14. Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).
  15. Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
  16. Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
  17. Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
  20. Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
  21. Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

p cherzyki zewn trzkom rkowe Mycobacterium tuberculosisp cherzyki zewn trzkom rkoweultrawirowanie w gradiencie g sto cianaliza ledzenia nanocz stektransmisyjna mikroskopia elektronowaWestern blotoznaczanie ilo ci bia kaSDS PAGEinterakcja gospodarz patogen
Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.