Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model uszkodzenia otrzewnej wywołanego glukonianem chlorheksydyny

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63903

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, College of Medicine, I-Shou University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Hospital, 3Department of Pediatrics, National Cheng Kung University Hospital, 4Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Dachang Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół ustanawia mysi model dializ otrzewnowych (PD) wywołanego glukonianem chlorheksydyny (CG) zwłóknienia otrzewnej. Obecny model jest prosty i łatwy w użyciu w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi PD.

Streszczenie

Zwłóknienie otrzewnej jest ważnym powikłaniem dializy otrzewnowej (PD). Aby zbadać i rozwiązać ten problem, wymagany jest odpowiedni zwierzęcy model PD. Niniejszy protokół ustanawia model zwłóknienia otrzewnej indukowany glukonianem chlorheksydyny (CG), który naśladuje stan pacjenta z chorobą Parkinsona. Zwłóknienie otrzewnej wywołano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1% CG w 15% etanolu przez 3 tygodnie (podawane co drugi dzień), w sumie dziewięć razy u samców myszy C57BL / 6. Następnie w 22 dobie przeprowadzono testy czynnościowe otrzewnej. Po uśmierceniu myszy pobrano otrzewną ciemieniową ściany brzucha i otrzewną trzewną wątroby. Były grubsze i bardziej zwłókniałe, gdy analizowano je pod mikroskopem po barwieniu trichromem Massona. Szybkość ultrafiltracji zmniejszyła się, a transport masy glukozy wskazywał na wywołany przez CG wzrost przepuszczalności otrzewnej. Opracowany w ten sposób model choroby Parkinsona może znaleźć zastosowanie w ulepszaniu technologii choroby Parkinsona, skuteczności dializy i przedłużaniu przeżycia pacjentów.

Wprowadzenie

Dializa otrzewnowa (PD) jest rodzajem terapii nerkozastępczej. Jednak PD ma problemy, których nie można rozwiązać. Na przykład, długotrwałe leczenie PD może spowodować uszkodzenie otrzewnej, ostatecznie prowadząc do niepowodzenia ultrafiltracji i wycofania leczenia1,2,3,4,5,6. Zwłóknienie otrzewnej jest jednym z najpoważniejszych powikłań7,8. Zwłóknienie otrzewnej charakteryzuje się odkładaniem się i gromadzeniem macierzy zewnątrzkomórkowej w śródmiąższu oraz neoangiogenezą i waskulopatią otrzewnej9,10.

Głównymi przyczynami tych zmian otrzewnowej są nawracające zapalenie otrzewnej i brak biokompatybilności dializatu, którymi są hiperosmotyczność, wysoki poziom glukozy, niskie pH i akumulacja produktów degradacji glukozy11,12. Dlatego odpowiednie modele eksperymentalne na zwierzętach mogą pomóc naukowcom lepiej badać fizjologiczne i patologiczne zmiany otrzewnej podczas terapii PD. W związku z tym opracowanie zwierzęcego modelu choroby Parkinsona jest ważne dla poprawy technologii choroby Parkinsona i skuteczności dializy oraz wydłużenia przeżycia pacjentów. Badanie to miało na celu wygenerowanie mysiego modelu PD poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie glukonianu chlorheksydyny (CG), jak opisano wcześniej13,14. Ten model myszy PD jest prosty, łatwy w użyciu i wykonalny w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi PD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez Laboratory Animal Center of the E-DA Hospital/ I-Shou University i były prowadzone zgodnie z wytycznymi „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (NRC, USA 2011). W niniejszym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku 7-8 tygodni.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować drażniący środek chemiczny poprzez rozcieńczenie 0,1% glukonianu chlorheksydyny (CG, patrz Tabela materiałów) w 15% etanolu.

2. Postępowanie z zwierzętami

  1. Wyznaczyć trzy myszy do grupy kontrolnej. Wykonywać iniekcje dosytronikowe (i.p.) 1 mL/kg 0,9% soli fizjologicznej (NS) co drugi dzień przez 3 tygodnie, łącznie dziewięć razy.
  2. Wyznaczyć trzy myszy do grupy z włóknieniem otrzewnej. Wywołać włóknienie otrzewnej za pomocą glukonianu chlorheksydyny (CG), podając dożylnie (i.p.) 0,1% CG w 15% etanolu (krok 1.1) w dawce 12,5 µL/g masy ciała. Zabieg powtarzać co drugi dzień przez 3 tygodnie, łącznie dziewięć razy.

3. Testy funkcji otrzewnej (zmodyfikowany test równowagi otrzewnej)

  1. Przygotować roztwór do dializy zawierający 4,25% glukozy. Pobrać 0,5 mL próbki dializatu za pomocą strzykawki, a następnie sprawdzić stężenie glukozy w próbce dializatu.
    UWAGA: Stężenie glukozy jest wyznaczane metodą heksokinazy/G6PD. Próbki dializatu poddano analizie L-type Glu 2 przy użyciu analizatora biochemicznego (patrz Tabela materiałów). Jest to początkowe stężenie glukozy w dializacie.
  2. Zznieczulić myszy poprzez domięśniowy zastrzyk z Zoletil i ksylazyną (przygotowanymi w stosunku objętościowym 1:2, patrz Tabela materiałów) w dawce 20 µL/20 g masy ciała. Dodatkowo zastosować maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Wykonać instylację dootrzewnową (i.p.) roztworu do dializy (2 mL/20 g masy ciała).
  4. Po 30 min ocenić i zweryfikować głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu na uszczypnięcie palca. Następnie wykonać pionowe nacięcie w linii środkowej brzucha (poniżej wyrostka mieczowatego), otworzyć jamę brzuszną myszy i pobrać płyn z jamy otrzewnej za pomocą strzykawki (zdefiniowany jako „objętość 1”). Następnie zważyć czystą i suchą watę, włożyć ją do jamy brzusznej myszy w celu wchłonięcia pozostałego płynu otrzewnowego, a na koniec ponownie zważyć watę.
    UWAGA: Przyrost masy waty odpowiada masie pozostałego płynu otrzewnowego. Następnie przeliczyć ją na uzyskaną objętość (gęstość: 1 g/cm3; zdefiniowana jako „objętość 2”). Końcowa objętość dializatu to objętość 1 plus objętość 2.
  5. Użyć 0,5 mL próbki dializatu (końcowy dializat) do pomiaru stężenia glukozy. Jest to końcowe stężenie glukozy w dializacie.
  6. Obliczyć netto ultrafiltrację, korzystając ze wzoru15:
    Schemat równania stosunku objętości dializy, pokazujący zmianę objętości w układzie dializy dla analizy stężeń.
  7. Obliczyć przepuszczalność otrzewnej, korzystając z następującego wzoru15:
    Wzór na zmianę stężenia glukozy w dializie; równanie dla różnicy stężeń i objętości.

4. Przygotowanie tkanek mięśni ściany brzusznej oraz wątroby i analiza histologiczna

  1. Uśmierć myszy poprzez punkcję serca (flebotomię)3,16.
  2. Wykonaj nacięcie ściany brzusznej (1 cm x 1 cm) oraz całkowitą hepatektomię. Utkanki ściany brzusznej i wątroby myszy utrwalaj przez noc w 10% neutralnej buforowanej formalinie.
  3. Przygotuj skrawki parafiny o grubości 3 µm z mięśni ściany brzusznej i wątroby, a następnie przeprowadź analizę histologiczną zgodnie z uprzednio opublikowanym raportem17.
  4. Oceń otrzewną ścienną ściany brzusznej oraz otrzewną trzewną powierzchni wątroby myszy, wykorzystując morfometrię18.
  5. Przeprowadź analizy statystyczne przy użyciu oprogramowania do statystyki i tworzenia wykresów (patrz Tabela materiałów). Wszystkie dane przedstaw jako średnią ± SD i przeanalizuj pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu t19. Wartości z P < 0,05 zdefiniuj jako wyniki istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W Rycina 1A,Bścienna otrzewna ścian brzusznej była wyraźnie grubsza i bardziej zwłókniała w barwieniu trichromem Massona17co wskazuje, że w grupie eksponowanej na CG włóknienie otrzewnej jest bardziej nasilone niż w kontrolnej grupie z solą fizjologiczną (NS). W Rycina 2A,Bbrzuszna okładzina treścienna powierzchni wątroby była również wyraźnie grubsza i bardziej zwłókniała, co dowodzi, że w grupie ekspono...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu mysi model PD jest prezentowany przez wstrzyknięcie i.p. CG, a wyniki wykazały zwłóknienie otrzewnej i pogorszenie funkcjonalne w tym modelu, który naśladował stan pacjenta z PD.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, w celu wykonania iniekcji dożylnej CG lub NS, skóra ściany brzucha myszy musi zostać podniesiona za pomocą kleszczy, aby zapobiec uszkodzeniu narządów wewnątrzotrzewnowych wywołanym nakłuciem. Po drugie, podczas pobierania otrzewnej ściany j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy Shin-Han Tsengowi za krytyczną dyskusję i częściowe przeprowadzenie badania. Badanie to było wspierane przez EDAHP110003 i NCKUEDA110002 z Fundacji Badawczej Szpitala E-DA oraz Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung na Tajwanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologicznanormalna Y F Chemical Corp., Nowe Tajpej,
% neutralna buforowana formalinaTaiwan Burnett International Co., Ltd., Tajpej, Tajwan00002A
Automatyczny analizator biochemicznyHitachi Ltd., Tokio, JaponiaLabospect Series 008do oznaczania stężenia glukozy
Roztwór diglukonianu chlorheksydyny, 20% w H2OSigma-Aldrich, MO, USAC9394rozcieńczony do 0,1% z 15% etanolem do wstrzykiwań
EtanolAvantor Performance Materials, LLC, PA, USABAKR8006-05rozcieńczony do 15% solą fizjologiczną dla stężenia roboczego
Glukoza (Dianeal)Baxter International, Inc., IL, USAFNB9896Komercyjny roztwór do dializy (4,25%)
Oprogramowanie GraphPad Prism 8.0, Inc., CA, amerykański
test Glu 2 typu LFUJIFILM Wako, Japonia461-32403
Ksylazyna 20Juily Pharmaceutical Co., Ltd., Nowe Tajpej,Tajwan-Zoletil
50Virbac Laboratories, Carros, Francja-
Tajwan-10

Bibliografia

  1. Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
  2. Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
  3. Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030(2015).
  4. Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
  5. Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
  6. Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
  7. Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
  8. Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
  9. Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
  10. Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
  11. Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
  12. Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
  13. Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
  14. Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
  15. Karl, Z. J. T., et al. Peritoneal Equilibration Test. Peritoneal Dialysis International. 7 (3), 138-148 (1987).
  16. Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
  17. Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
  18. Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
  19. Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
  20. Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
  21. Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
  22. Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
  23. Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
  24. Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
  25. Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
  26. Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
  27. Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Włóknienie otrzewnejdializa otrzewnowamodel mysiwstrzyknięcie doszprytnoweprzepuszczalność otrzewnejbarwienie trichromem Massonatransport masy glukozywspółczynnik ultrafiltracjimodel zwierzęcy
Mysi model uszkodzenia otrzewnej wywołanego glukonianem chlorheksydyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.