Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63904

⸱

18 maja 2022

 , 
1Laboratory of Plant Cell Growth Mechanisms, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS

W tym artykule

Podsumowanie

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Streszczenie

Właściwości mechaniczne pierwotnych ścian komórkowych decydują o kierunku i tempie wzrostu komórek roślinnych, a tym samym o przyszłym rozmiarze i kształcie rośliny. Opracowano wiele wyrafinowanych technik pomiaru tych właściwości; jednak mikroskopia sił atomowych (AFM) pozostaje najwygodniejsza do badania elastyczności ściany komórkowej na poziomie komórkowym. Jednym z najważniejszych ograniczeń tej techniki jest to, że można badać tylko powierzchowne lub izolowane żywe komórki. W tym artykule przedstawiono zastosowanie mikroskopii sił atomowych do badania właściwości mechanicznych pierwotnych ścian komórkowych należących do tkanek wewnętrznych ciała roślinnego. Protokół ten opisuje pomiary pozornego modułu Younga ścian komórkowych w korzeniach, ale metoda może być również stosowana do innych organów roślinnych. Pomiary są wykonywane na skrawkach materiału roślinnego pochodzącego z wibratomu w płynnej komórce, co pozwala (i) uniknąć stosowania roztworów plazmolizujących lub impregnacji próbki woskiem lub żywicą, (ii) przyspieszyć eksperymenty oraz (iii) zapobiec odwodnieniu próbki. Można badać zarówno antyklinalne, jak i peryklinalne ściany komórkowe, w zależności od tego, jak próbka została podzielona na sekcje. Różnice we właściwościach mechanicznych różnych tkanek można zbadać w jednej sekcji. W protokole opisano zasady planowania badań, zagadnienia związane z przygotowaniem próbek i pomiarami, a także sposób doboru krzywych siła-odkształcenie w celu uniknięcia wpływu topografii terenu na uzyskiwane wartości modułu sprężystości. Metoda nie jest ograniczona wielkością próby, ale jest wrażliwa na wielkość komórek (tj. komórki o dużym świetle są trudne do zbadania).

Wprowadzenie

Właściwości mechaniczne ściany komórkowej rośliny decydują o kształcie komórki i jej zdolności do wzrostu. Na przykład, rosnąca końcówka łagiewki pyłkowej jest bardziej miękka niż nierosnące części tej samej łagiewki1. Powstawanie zawiązków na merystemie Arabidopsis jest poprzedzone miejscowym spadkiem sztywności ścian komórkowych w miejscu przyszłego primordium2,3. Ściany komórkowe hipokotylu Arabidopsis, które są równoległe do głównej osi wzrostu i rosną szybciej, są bardziej miękkie niż te, które są prostopadłe do tej osi i rosną wolniej4,5. W korzeniu kukurydzy przejściu komórek od podziału do wydłużenia towarzyszył spadek modułów sprężystości we wszystkich tkankach korzenia. Moduły pozostały niskie w strefie wydłużenia i wzrosły w strefie późnego wydłużenia6.

Pomimo dostępności różnych metod, duże ilości informacji biochemicznych i genetycznych na temat biologii ściany komórkowej uzyskiwane corocznie są rzadko porównywane z mechanicznymi właściwościami ścian komórkowych. Na przykład mutanty w genach związanych ze ścianą komórkową często mają zmieniony wzrost i rozwój4,7,8, ale rzadko są opisywane w kategoriach biomechaniki. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest trudność w przeprowadzaniu pomiarów na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest obecnie podstawowym podejściem do takich analiz9.

W ostatnich latach przeprowadzono liczne badania nad biomechaniką ściany komórkowej roślin oparte na AFM. Właściwości mechaniczne ścian komórkowych tkanek zewnętrznych rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis2,3,4,5,10,11 and onion12, a także hodowanych komórek13,14,15, zostały objęte dochodzeniem. Jednak powierzchowne komórki rośliny mogą mieć ściany komórkowe, których właściwości mechaniczne różnią się od właściwości tkanek wewnętrznych6. Ponadto komórki roślinne są poddawane ciśnieniu przez turgor, co czyni je sztywniejszymi. Aby pozbyć się wpływu ciśnienia turgoru, badacze muszą użyć roztworów plazmolizujących2,3,4,5,10,11 lub zdekomponować uzyskane wartości na wkład turgoru i ściany komórkowej12. Pierwsze podejście prowadzi do odwodnienia próbki i zmienia grubość oraz właściwości ściany komórkowej16, podczas gdy drugie podejście wymaga dodatkowych pomiarów i skomplikowanej matematyki i dotyczy tylko komórek o stosunkowo prostym kształcie12. Właściwości ściany komórkowej tkanek wewnętrznych można ocenić na kriosekcjach17 lub skrawkach materiału roślinnego nasączonego żywicą8. Obie metody wiążą się jednak z odwodnieniem i/lub impregnacją próbek, co nieuchronnie prowadzi do zmian właściwości. Właściwości izolowanych lub hodowanych komórek są trudne do odniesienia do fizjologii całej rośliny. Zarówno uprawa, jak i izolacja komórek roślinnych może wpływać na właściwości mechaniczne ich ścian komórkowych.

Przedstawiona tutaj metoda uzupełnia wyżej wymienione podejścia. Za jego pomocą można badać pierwotne ściany komórkowe dowolnej tkanki i na każdym etapie rozwoju rośliny. Przekroje i obserwacje AFM przeprowadzono w cieczy, co pozwala uniknąć odwodnienia próbki. Problem turgoru został rozwiązany w miarę cięcia komórek. W protokole opisano pracę z korzeniami kukurydzy i żyta, ale każda inna próbka może być zbadana, jeśli nadaje się do cięcia wibratomowego.

Opisane tutaj badania AFM zostały przeprowadzone przy użyciu techniki siły-objętości. Różne instrumenty używają różnych nazw dla tej metody. Jednak podstawowa zasada jest taka sama; Mapę siły i objętości próbki uzyskuje się za pomocą sinusoidalnego lub trójkątnego ruchu wspornika (lub próbki) w celu osiągnięcia określonej siły obciążenia w każdym analizowanym punkcie, przy jednoczesnym rejestrowaniu ugięcia wspornika18. Wynik łączy w sobie obraz topograficzny powierzchni i układ krzywych siła-odległość. Każda krzywa służy do obliczania odkształcenia, sztywności, modułu Younga, przyczepności i rozpraszania energii w określonym punkcie. Podobne dane można uzyskać za pomocą spektroskopii siłowej punkt po punkcie po skanowaniu w trybie kontaktowym19, chociaż jest to bardziej czasochłonne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki do pomiarów AFM

  1. Materiał roślinny: Nasiona kukurydzy (Zea mays L.) i żyta (Secale cereale L.) sterylizować 0,35% roztworem NaOCl przez 10 min, przemyć 3x wodą destylowaną, a następnie rosnąć hydroponicznie w ciemności w temperaturze 27 °C odpowiednio przez 4 dni i 2 dni. Do eksperymentu wykorzystano korzenie pierwotne.
  2. Przygotowanie roztworów i próbki do przekroju wibratomu
    1. Przygotuj roztwór agarozy do zatapiania korzeni, rozpuszczając 3% (w/w) agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie za pomocą kuchenki mikrofalowej.
      UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w wodzie. Jeśli do badania wymagany jest bufor lub jakikolwiek inny rodzaj pożywki, lepiej jest użyć tego samego podłoża do przygotowania agarozy, podczas sekcji oraz w płynnej komorze AFM, aby uniknąć uszkodzenia próbki.
    2. Wylać 4 mm warstwę stopionej 3% agarozy na dno szalki Petriego (średnica = 35 mm) i pozostawić do lekkiego ostygnięcia, aby zapobiec termicznemu uszkodzeniu próbki.
    3. Umieść trzy lub cztery małe kawałki (o długości około 5 mm) badanego organu roślinnego poziomo na agarozie.
      UWAGA: Próbki powinny być do połowy zanurzone, ale nie zanurzone w warstwie agarozy. Jeśli próbka nie jest zanurzona, może wydostać się z agarozy podczas cięcia wibratomem. Jeśli próbka opadnie na dno, będzie zbyt blisko krawędzi sekcji i stanie się niewygodna dla dalszych kroków.
    4. Gdy na wierzchu pierwszej warstwy agarozy pojawi się cienki, półstały film (30-60 s), ostrożnie wylej drugą warstwę na wierzch.
      UWAGA: Dolna warstwa agarozy nie powinna całkowicie zastygnąć. W przeciwnym razie obie warstwy mogą oddzielić się od siebie podczas dalszej pracy.
    5. Po całkowitym zestaleniu agarozy wytnij blok zawierający próbkę. Uformuj blok w sześciokątną ściętą ostrosłup, aby zapewnić jego stabilność podczas dalszego cięcia (Rysunek 1A).
      UWAGA: Próbka może być zorientowana pionowo lub poziomo w tym bloku, w zależności od rodzaju wymaganego przekroju. Przygotowując blok, pozostaw 2-3 mm agarozy wokół próbki. W tym przypadku wycinek próbki zostanie zatrzymany przez warstwę 3% agarozy, co ułatwi jej dalsze unieruchomienie (Rysunek 1B).
  3. Dzielenie próbki na sekcje za pomocą wibratomu
    1. Przyklej blok do etapu wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Umieść stolik w wibratomie tak, aby jeden z rogów piramidy był skierowany w stronę ostrza wibratomu. Wlej wodę do wanny wibratomowej.
    2. Ustaw parametry przekroju (grubość przekroju, prędkość ostrza i częstotliwość drgań) i odetnij próbkę.
      UWAGA: Należy stosować przekroje o grubości od 200 do 400 μm. Zbyt cienki przekrój może wprowadzać błędy w ocenie właściwości mechanicznych, natomiast zbyt gruby przekrój jest podatny na pękanie. Do korzeni żyta i kukurydzy zastosowano prędkość ostrza 1,3 mm·s-1 i częstotliwość oscylacji 90 Hz.
    3. Za pomocą cienkiej szczotki przenieś sekcję z łaźni wodnej na szklane szkiełko i umieść kroplę wody na sekcji, aby zapobiec jej wyschnięciu. Sprawdź jakość przekroju pod mikroskopem świetlnym.
      UWAGA: Przekroje ukośne nie mogą być używane do pomiaru modułu sprężystości. Ściany komórkowe muszą być prostopadłe do płaszczyzny przekroju, w przeciwnym razie mogą się wyginać lub wyginać pod końcówką AFM.
  4. Unieruchomienie sekcji do pomiarów AFM (Rysunek 1B)
    1. Wylej warstwę stopionej agarozy o stężeniu 1% (m/m) (~1 ml) na dno nasadki szalki Petriego za pomocą pipety.
      UWAGA: Upewnij się, że boki nasadki szalki Petriego nie uniemożliwiają zbliżenia się końcówki do próbki. Warstwa agarozy powinna mieć grubość 1 mm i powinna pokrywać całe dno czapki.
    2. Po zestaleniu się 1% agarozy usuń nadmiar wody z sekcji, doprowadzając bibułę filtracyjną do jej krawędzi.
      UWAGA: Nie dotykaj części roślinnej papierem, aby uniknąć uszkodzenia i całkowitego wyschnięcia próbki.
    3. Ostrożnie przenieś sekcję od szkiełka do środka nasadki szalki Petriego za pomocą pędzla. Używając pipety o pojemności 20 μl, ostrożnie dodaj 1% agarozy wokół sekcji (Rysunek 1B).
      UWAGA: 1% agaroza nie powinna dostać się na samą próbkę. Powinien zakrywać tylko krawędzie 3% warstwy agarozy, która utrzymuje okaz rośliny. 1% agaroza powinna tworzyć małe pagórki na krawędziach tej 3% warstwy agarozy. Duże pagórki mogą uniemożliwić wspornikowi zbliżenie się do próbki.
    4. Wlać wodę lub inny roztwór, który ma być użyty do AFM, do nasadki szalki Petriego z unieruchomioną sekcją.

2. Przygotowanie i kalibracja AFM

UWAGA: Metoda siła-objętość AFM generuje przestrzennie rozdzielczą tablicę krzywych siła-odległość uzyskana w każdym punkcie badanego obszaru. Uzyskaj wszystkie parametry dla trybu siła-objętość (sztywność wspornika, IOS itp.) w trybie kontaktowym. Podobne procedury dla przyrządów innych producentów zostały opisane wcześniej10,20.

  1. Wybierz odpowiedni typ wspornika.
    UWAGA: Sztywność wspornika musi być porównywalna ze sztywnością próbki21. Wspornik, który jest znacznie sztywniejszy niż próbka, nie będzie się zbytnio uginał, podczas gdy wspornik, który jest zbyt miękki, nie zdeformuje wystarczająco próbki. Typowa częstotliwość rezonansowa powinna być wystarczająca do kołysania wspornika w cieczy (tj. wynosić co najmniej kilkadziesiąt kHz). Powierzchnia kontaktu powinna być mała w porównaniu z rozmiarem ściany komórkowej, ponieważ zakłada się, że próbka badana w obliczeniach modułu Younga jest nieskończoną półprzestrzenią. Do korzeni żyta i kukurydzy stosowano następujące wsporniki: ostre wsporniki o typowej częstotliwości rezonansowej 60 kHz, średniej stałej sprężystości 1,5 N·m-1 i promieniu wierzchołka 10 nm lub wsporniki kuliste o typowej częstotliwości rezonansowej 75 kHz, średniej stałej sprężystości 2,8 N·m-1, i promieniu wierzchołka 150 nm.
  2. Włącz urządzenie AFM i związane z nim oprogramowanie (tabela materiałów). Zamontuj wspornik na uchwycie końcówki do kuwety cieczowej. Umieść kroplę płynu na końcówce, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na końcówce podczas zanurzania jej w płynie.
    UWAGA: W przypadku tworzenia się pęcherzyków, płyn można usunąć za pomocą precyzyjnej chusteczki, a następnie umieścić nową kroplę.
  3. Zamontuj uchwyt końcówki na głowicy skanującej.
  4. Umieścić twardą próbkę (świeże szkiełko podstawowe) w nasadce płytki Petriego. Wlej do niego płyn, upewniając się, że zakrywa szkiełko. Umieść głowicę skanującą na stoliku i podnieś próbkę tak, aby płyn zakrył wspornik.
  5. Wybierz zakładkę Głowice z rozwijanego menu Narzędzia. Upewnij się, że wybrano głowicę skanującą dla ogniwa cieczowego.
  6. Kliknij przycisk Celowanie, aby otworzyć okno Celowanie laserowe. Kliknij przycisk Kamera, aby otworzyć okno Mikroskop optyczny. Umieść laser na końcówce wspornika, używając na głowicy AFM i okienka mikroskopu optycznego w celu orientacji.
  7. Wybierz tryb Semicontact z menu rozwijanego w głównym oknie programu.
  8. Otwórz zakładkę Rezonans i wybierz typ używanego wspornika w menu Sondy. Kliknij przycisk Auto, aby określić częstotliwość rezonansową.
    UWAGA: Jeśli używanego wspornika nie ma na liście, otwórz Narzędzia > Paszport sondy. Utwórz nowy plik, wprowadź parametry wspornika i zapisz go. Następnie wybierz go z menu rozwijanego Sondy.
  9. Wybierz tryb kontaktu z menu rozwijanego w głównym oknie programu.
  10. Kliknij przycisk N_Force Cal, aby otworzyć okno kalibracji wspornika. Wybierz używany wspornik i kliknij przycisk Sweep, a następnie przycisk Spect Meas, aby określić stałą sprężystości wspornika za pomocą procedury strojenia termicznego. Zamknij okno.
  11. Ustaw wartość zadaną na 1 nA. Otwórz kartę Approach (Podejście) i kliknij przycisk Landing (Lądowanie), aby zbliżyć się do próbki.
  12. Otwórz kartę Skanowanie. Ustaw częstotliwość skanowania na 0,5 Hz. Kliknij przycisk Obszar i ustaw rozmiar skanowania na 10 μm x 10 μm, a punkt skanowania na 256 x 256. Kliknij przycisk Uruchom i zeskanuj około 20 linii, aby sprawdzić, czy na szkle nie ma zanieczyszczeń. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć skanowanie bez utraty danych.
  13. Otwórz zakładkę Krzywe. Ustaw parametry wycofania i podejścia odpowiednio do 500 nm i -100 nm.
  14. Wybierz ostatni skan z menu rozwijanego Wybierz klatkę, aby obserwować powierzchnię.
  15. Znajdź czysty obszar na szkle i wskaż punkt, w którym należy wykonać krzywą siła-odkształcenie, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać krzywą. Zapisz od trzech do pięciu krzywych siły w różnych miejscach na skanie.
  16. Kliknij przycisk Dane, aby otworzyć okno analizy i wybrać ramkę z krzywą siła-odkształcenie.
  17. Kliknij przycisk Pair Markers i wskaż liniową część krzywej retrakcji, aby obliczyć stosunek sygnału DFL do przemieszczenia, czyli odwrotnej czułości optycznej (IOS, nA nm-1) lub czułości ugięcia.
  18. Powtórz krok 2.17 dla wszystkich zarejestrowanych krzywych i zapisz wszystkie obliczone wartości stosunku sygnału DFL do przemieszczenia. Powinny być takie same.
  19. Zamknij okno analizy, kliknij kartę Podejście, a następnie przycisk Usuń, aby wycofać sondę z próbki.

3. Akwizycja danych

  1. Przeprowadzić próbkę pod wspornikiem AFM za pomocą mikroskopu optycznego. Kliknij kartę Approach, a następnie przycisk Landing, aby zbliżyć się do próbki w trybie kontaktowym z wartością zadaną 1 nA.
  2. Kliknij kartę Skanowanie, a następnie przycisk Obszar. Wybierz rozmiar obszaru 70 μm x 70 μm do skanowania.
  3. Kliknij przycisk Przesuń sondę i sprawdź cały obszar skanowania, przesuwając po nim skaner. Na podstawie stopnia wysunięcia skanera znajdź najwyższy punkt.
  4. Otwórz kartę Approach, a następnie kliknij przycisk Usuń, aby wycofać się z próbki. Używając najwyższego punktu jako celu, kliknij przycisk Lądowanie, aby ponownie zbliżyć się do próbki. Następnie ponownie sprawdź powierzchnię, klikając przycisk Przesuń sondę i przesuwając po niej skaner. Żaden z punktów w obszarze nie powinien wymagać całkowitego podniesienia skanera.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby zakres z skanera przekraczał różnicę wysokości próbki. Dopuszczalne jest jednak, jeśli niektóre punkty w obszarze skanowania znajdują się poniżej pojemności skanera. Jednocześnie takich punktów nie powinno być wiele. Duże obszary, do których skaner nie może dotrzeć, mogą spowodować przerwanie skanowania.
  5. Ustaw częstotliwość skanowania na 0,5 Hz. Ustaw rozmiar skanowania na 70 μm x 70 μm, a punkt skanowania na 64 x 64. Kliknij przycisk Uruchom i zeskanuj, aby sprawdzić powierzchnię próbki i jej ewentualne zanieczyszczenie agarozą.
    UWAGA: Jeśli próbka ma komórki o dużym prześwicie, rozmiar obszaru skanowania można zmniejszyć lub należy go przesunąć tak, aby na skanie było więcej ścian komórkowych.
  6. Kliknij przycisk Włącz w górnej części okna głównego, aby wyłączyć pętlę informacji zwrotnych.
  7. Wybierz tryb HDPlus (metoda wymuszonej głośności) z menu rozwijanego w głównym oknie programu. Pojawi się dodatkowe okno (okno HD).
  8. Ustaw wartość SetPoint na 0,1 nA w głównym oknie programu.
  9. W zakładce Main okna HD należy ustawić parametry skanowania (amplitudę i częstotliwość sinusoidalnego ruchu wspornika) odpowiednie dla badanej próbki.
    UWAGA: Każdy rodzaj próbki i wspornika wymaga doboru parametrów skanowania. Konieczne są pewne wstępne eksperymenty. W przypadku korzeni kukurydzy lub żyta stosowano ostre i kuliste wsporniki o amplitudzie 400 nm i częstotliwości 300 Hz.
  10. Otwórz zakładkę Dźwięki w oknie HD i wprowadź częstotliwość rezonansową wspornika.
  11. Otwórz zakładkę Quant w oknie HD i wprowadź IOS, sztywność wspornika oraz promień i kąt końcówki. Wybierz model kontaktu, który będzie używany do obliczeń w zależności od geometrii końcówki.
    UWAGA: Model DMT bierze pod uwagę siłę adhezji istniejącą między sondą a próbką i jest najczęściej stosowany w mechanobiologii21.
  12. Otwórz kartę Scan (Skanowanie) w oknie HD i wybierz sygnały, które mają być nagrywane. Wybierz kierunek, w którym nagrywany jest sygnał. Zaznacz pole Objętość siły, aby uzyskać zapis wszystkich krzywych siły.
    UWAGA: Zapisz sygnał modułu sprężystości zarówno w kierunku do przodu, jak i do tyłu. Dostarczy to więcej punktów do obliczenia.
  13. Kliknij przycisk Wyłącz w górnej części głównego okna programu, aby włączyć pętlę sprzężenia zwrotnego.
  14. Kliknij przycisk PhaseCorr w głównym oknie HD, aby skorygować czułość układu optycznego.
  15. Zakładka vs Time w głównym oknie HD prezentuje funkcję sygnału DFL w funkcji czasu w czasie rzeczywistym; wybierz części tej funkcji, które będą używane do wyznaczania poziomu linii bazowej i dopasowania modelu kontaktowego do dalszych obliczeń.
  16. Ustaw wartość punktu skanowania na 256 x 256 w oknie głównym programu. Ustaw częstotliwość skanowania na 0,2 Hz i kliknij przycisk Uruchom, aby zeskanować próbkę.
  17. Po zatrzymaniu skanowania kliknij przycisk Włącz w górnej części okna głównego, aby wyłączyć pętlę sprzężenia zwrotnego.
  18. Wybierz tryb kontaktu z menu rozwijanego, otwórz kartę Podejście i kliknij przycisk Usuń, aby wycofać się z próbki.
  19. Kliknij przycisk Dane, aby otworzyć oprogramowanie analityczne i zapisać dane wyjściowe.
  20. Pod koniec dnia pomiaru zdejmij uchwyt końcówki wspornikowej z głowicy i ostrożnie spłucz go kilka razy ultraczystą wodą. Za każdym razem usuń wodę precyzyjnym ściereczką.

4. Ocena danych i przetwarzanie końcowe

UWAGA: Nie polegaj na wartościach modułu sprężystości obliczanych automatycznie. Ponieważ powierzchnia jest bardzo zróżnicowana pod względem wysokości, wiele krzywych artefaktów powinno zostać usuniętych.

  1. Otwórz zapisany plik w oprogramowaniu do analizy.
  2. Zaznacz ramkę HDForceVolume.
  3. Przytrzymaj naciśnięty Ctrl i wybierz jedną klatkę wizualną uzyskaną w tym samym kierunku skanowania. Kliknij przycisk Załaduj mapę zewnętrzną, aby zobaczyć, gdzie znajdują się ściany komórkowe.
    UWAGA: Każda mapa sygnału może być używana jako ramka wizualna, ale najłatwiejszym sposobem może być użycie mapy sygnału DFL (różne instrumenty mogą odnosić się do niej jako sygnału odchylenia lub sygnału błędu).
  4. Sprawdź wartości sztywności InvOptSens (IOS) i wspornika w zakładce Główne.
  5. Otwórz zakładkę Dodatkowe i sprawdź parametry końcówki oraz model kontaktu.
  6. Kliknij różne punkty na ścianach komórkowych w ramce wizualnej i wybierz tylko te krzywe, które są dobrze opisane przez model. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.
  7. Zapisz uzyskane wartości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowe mapy modułu sprężystości i DFL, a także krzywe siły uzyskane dla korzeni żyta i kukurydzy za pomocą opisanego sposobu, przedstawiono na Rysunku 2. Rysunek 2A przedstawia mapy modułu sprężystości i DFL uzyskane w przekroju poprzecznym korzenia głównego żyta. Białe obszary na mapie modułu (Rysunek 2A, po lewej) odpowiadają błędnemu zawyżeniu modułu Younga wynikającemu z osiągnięcia przez skaner limitu w kierunku z. Obraz ten ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Właściwości mechaniczne pierwotnych ścian komórkowych określają kierunek i tempo wzrostu komórek roślinnych, a tym samym przyszłą wielkość i kształt rośliny. Przedstawiona tu metoda oparta na AFM uzupełnia istniejące techniki, które są wykorzystywane do badania właściwości ścian komórkowych roślin. Pozwala na zbadanie elastyczności ścian komórkowych, które należą do wewnętrznych tkanek rośliny. Za pomocą przedstawionej metody zmapowano właściwości mechaniczne ścian komórkowych w różnych tkankach rosnącego korzenia kukury...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Dmitrijowi Suslovowi (Uniwersytet Państwowy w Sankt Petersburgu, Sankt Petersburg, Rosja) i Prof. Mirze Ponomarevej (Tatarski Instytut Naukowo-Badawczy Rolnictwa, FRC KazSC RAS, Kazań, Rosja) za dostarczenie nasion kukurydzy i żyta. Prezentowana metoda została opracowana w ramach projektu Rosyjskiej Fundacji Nauki nr 18-14-00168 przyznanego LK. Część prac (uzyskanie prezentowanych wyników) została wykonana przez AP przy wsparciu finansowym z zadania rządowego dla FRC Kazańskie Centrum Naukowe RAS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza, niska temperatura topnieniaHelikonB-5000-0.1do utrwalania próbki
Szczotka-do sekcji ruchomych
WspornikiNanoTools, NiemcyNT_B150_v0020-5Model: Biosfera B150-FM
WspornikiNT-MDT, RosjaFMG01/50Model: FMG01
Klej cyjanoakrylowy-do wibratomia
Szkiełka szkiełkoweHeinz Herenz1042000do kalibracji wibratomii i AFM
Oprogramowanie ImageAnalysis P9NT-MDT, Rosja-do analizy danych
Mikroskop epifluorescencyjny Leica DM1000Leica Biosystems, Niemcy11591301do kontroli przekrojów
NaOCl-do sterylizacji nasion
Oprogramowanie Nova PX 3.4.1NT-MDT, Rosja-do eksperymentów prowadzonych Mikroskop
NTEGRA Prima ze sterownikiem HDNT-MDT, Rosja-do AFM i akwizycji danych szalka
Petriego 35 mmThermo Fisher Scientific153066do utrwalania próbek
Pipeta z końcówką 1000 i mikro; LPipeta Thermo Fisher Scientific4642092-Tip
2-20 &mikro; LThermo Fisher Scientific
4642062-Ultraczysta woda---
Vibratome Leica VT 1000SLeica Biosystems, Niemcy1404723512do cięcia próbek

Bibliografia

  1. Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
  2. Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813(2013).
  3. Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
  4. Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161(2018).
  5. Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
  6. Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
  7. Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83(2013).
  8. Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
  9. Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
  10. Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).
  11. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
  12. Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
  13. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
  14. Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
  15. Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
  16. Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
  17. Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
  18. Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
  19. Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172(2019).
  20. Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674(2019).
  21. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  22. Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzrost kom rek ro linnychmodu Youngasekcjonowanie w wibrotomieelastyczno ciany kom rkowejkrzywe si a odkszta cenieAFM w trybie kontaktowymbiomechanika tkanek ro linnych
Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.