Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63919

⸱

23 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje mikroskopię fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych oraz zautomatyzowane metody wspomagane oprogramowaniem, aby wizualizować i precyzyjnie określać ilościowo proliferujące i uśpione pasożyty Trypanosoma cruzi oraz limfocyty T w nienaruszonych, oczyszczonych organach i tkankach. Techniki te zapewniają wiarygodny sposób oceny wyników leczenia i oferują nowe informacje na temat interakcji pasożyt-gospodarz.

Streszczenie

Choroba Chagasa to zaniedbana patologia, która dotyka miliony ludzi na całym świecie, głównie w Ameryce Łacińskiej. Czynnik choroby Chagasa, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), jest obligatoryjnym pasożytem wewnątrzkomórkowym o zróżnicowanej biologii, który infekuje kilka gatunków ssaków, w tym ludzi, powodując patologie serca i układu pokarmowego. Wiarygodne wykrywanie zakażeń T. cruzi in vivo było od dawna potrzebne, aby zrozumieć złożoną biologię choroby Chagasa i dokładnie ocenić wyniki schematów leczenia. Obecny protokół demonstruje zintegrowany proces automatycznego oznaczania ilościowego komórek zakażonych T. cruzi w zrekonstruowanych, oczyszczonych narządach zrekonstruowanych w 3D. Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi pozwala na dokładną wizualizację i ilościowe określenie aktywnie proliferujących i uśpionych pasożytów T. cruzi oraz komórek efektorowych układu odpornościowego w całych narządach lub tkankach. Z powodzeniem wdrożono również linię produkcyjną CUBIC-HistoVision w celu uzyskania jednolitego znakowania oczyszczonych narządów za pomocą przeciwciał i barwników jądrowych. Oczyszczanie tkanek w połączeniu z barwieniem immunologicznym 3D zapewnia bezstronne podejście do kompleksowej oceny protokołów leczenia farmakologicznego, poprawy zrozumienia organizacji komórkowej tkanek zakażonych T. cruzi i oczekuje się, że przyspieszy odkrycia związane z odpowiedziami immunologicznymi anty-T. cruzi, uszkodzeniem tkanek i naprawą w chorobie Chagasa.

Wprowadzenie

Choroba Chagasa, wywoływana przez pasożytniczego pierwotniaka T. cruzi, jest jedną z najbardziej zaniedbanych chorób tropikalnych na świecie, powodując około 13 000 zgonów rocznie. Infekcja często postępuje od ostrego do przewlekłego stadium, powodując patologię serca u 30% pacjentów, w tym zaburzenia rytmu serca, niewydolność serca i nagłą śmierć1,2. Pomimo silnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza wywołanej przeciwko pasożytowi w ostrej fazie, niewielka liczba pasożytów przewlekle utrzymuje się przez całe życie gospodarza w tkankach takich jak serce i mięśnie szkieletowe. Kilka czynników, w tym opóźniony początek adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych i obecność niereplikujących się form pasożyta, może przyczynić się do zdolności T. cruzi do uniknięcia całkowitej eliminacji przez układ odpornościowy3,4,5,6. Co więcej, niereplikujące się uśpione formy pasożyta wykazują niską podatność na leki trypanobójcze i mogą być częściowo odpowiedzialne za niepowodzenie leczenia obserwowane w wielu przypadkach7,8.

Rozwój nowych technik obrazowania daje możliwość uzyskania wglądu w przestrzenne rozmieszczenie pasożytów w zakażonych tkankach i ich związek z komórkami odpornościowymi zaangażowanymi w ich kontrolę. Cechy te mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia procesów zwalczania pasożytów przez układ odpornościowy i śledzenia rzadkich uśpionych pasożytów obecnych w tkankach przewlekłych.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi (LSFM) jest jedną z najbardziej wszechstronnych i bezstronnych metod obrazowania 3D dużych tkanek lub narządów bez cienkiego przekroju. Mikroskopy z arkuszami świetlnymi wykorzystują cienki arkusz światła tylko do wzbudzania fluoroforów w płaszczyźnie ogniskowej, zmniejszania fotowybielania i fototoksyczności próbek oraz rejestrowania obrazów tysięcy warstw tkanek za pomocą ultraszybkich kamer. Wysoki poziom przezroczystości tkanek niezbędny do prawidłowej penetracji światła laserowego w tkankach uzyskuje się poprzez homogenizację współczynnika załamania światła (RI) po delipidacji i odbarwieniu tkanek, co zmniejsza rozpraszanie światła i pozwala uzyskać wysokiej jakości obrazy9,10,11.

Metody oczyszczania tkanek zostały opracowane do obrazowania całych myszy12,13,14, organoids15,16,17, narządy wyrażające markery fluorescencyjne reportera18,19,20,21,22,23, a ostatnio ograniczona liczba tkanek ludzkich24. Obecne metody oczyszczania tkanek dzielą się na trzy rodziny: (1) metody oparte na rozpuszczalnikach organicznych, takie jak protokoły DISCO25,26, (2) metody oparte na hydrożelu, takie jak CLARITY27, oraz metody wodne, takie jak CUBIC (Clear, Unstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29. Protokoły CUBIC utrzymują kształt narządu i integralność tkanek, zachowując fluorescencję endogennych białek reporterowych. Najnowsza aktualizacja tej techniki, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), pozwala również na wykrywanie epitopów za pomocą przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie i znakowania DNA28.

W obecnym protokole, zastosowano potok CUBIC do wykrywania T. cruzi wyrażających białka fluorescencyjne w oczyszczonych, nienaruszonych tkankach myszy. Optycznie przezroczyste tkanki zobrazowano LSFM, zrekonstruowano w 3D, a dokładną całkowitą liczbę zakażonych komórek T. cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T na narząd automatycznie określono ilościowo. Protokół ten został również z powodzeniem przyjęty w celu uzyskania jednolitego znakowania oczyszczonych narządów przeciwciałami i plamami jądrowymi. Podejścia te są niezbędne do zrozumienia ekspansji i kontroli T. cruzi u zakażonych gospodarzy i są przydatne do pełnej oceny chemo- i immunoterapii choroby Chagasa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi akredytacyjnymi Stowarzyszenia na rzecz Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. Protokół użytkowania zwierząt (kontrola zakażenia T. cruzi u myszy-A2021 04-011-Y1-A0) został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgia. Klasa B6. C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6. Do niniejszego badania wykorzystano myszy Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J i C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (samice, 1-2 miesiące). Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Zakażenie, perfuzja i rozwarstwienie

  1. Dootrzewnowo zakażać myszy trypomastigotami pochodzącymi z kultur tkankowych szczepu T. cruzi Colombiana (DTU TcI) lub Brazylii (DTU TcV) wykazującym ekspresję odpowiednio białek fluorescencyjnych tdTomato lub GFP. Dawka infekcji może wynosić od 50 000 do 200 000 trypomastigotów rozcieńczonych w 100 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat generowania pasożytów reporterowych i mysich modeli infekcji są dostępne w Canavaci et al.29 oraz Bustamante et al.30.
  2. Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla o natężeniu przepływu 3-7 l/min. Gdy tylko zwierzęta przestaną wykazywać odruch pedałowania, wykonaj podłużne nacięcie przez skórę od brzucha w kierunku mostka. Następnie odetnij ścianę ciała od brzucha i kontynuuj przez żebra po obu stronach klatki piersiowej, aż mostek będzie mógł zostać podniesiony, odsłaniając serce.
  3. Zgodnie z opisem w Rysunek 1, wykonaj 2,5 mm nacięcie w prawej małżowinie usznej serca i zbierz drenującą krew za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 1 ml.
  4. Włóż igłę motylkową (podłączoną do jednego końca systemu perfuzyjnego) do wierzchołka lewej komory, aż dotrze do aorty wstępującej. Użyj kleju na bazie żelu (patrz Tabela materiałów), aby uszczelnić otwór wlotowy wokół igły i utrzymać igłę na miejscu podczas perfuzji.
  5. Przelej myszy30 z 50 ml zimnej heparyny-PBS (pH 7,4, 10 U/ml heparyny) lub do momentu, gdy płyn, który wydostaje się z myszy w kierunku tacki zbiorczej, będzie wolny od krwi.
  6. Perfuzja z 50 ml zimnego 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA) (pH 7,4) w PBS.
    UWAGA: Utrwalanie tkanek PFA jest prawdopodobnie jednym z krytycznych etapów protokołu, szczególnie w celu utrzymania struktur epitopowych i późniejszego immunowykrywania. PFA rozkłada się z czasem, dlatego musi być świeżo przygotowany. pH roztworu jest również ważne, aby uniknąć nadmiernego utrwalenia, które może prowadzić do słabego oczyszczania tkanek.
    UWAGA: PFA jest umiarkowanie toksyczny w kontakcie ze skórą. Ostra ekspozycja jest również silnie drażniąca dla nosa, oczu i gardła. Długotrwałe narażenie na niskie poziomy w powietrzu lub skórze może powodować podrażnienia skóry, takie jak zapalenie skóry i swędzenie oraz problemy z oddychaniem podobne do astmy. Nosić ochronę twarzy i oczu i nie wdychać kurzu, gazu, mgły, oparów ani oparów.
    1. Po perfuzji PFA należy przeprowadzić perfuzję myszy ze 100 ml buforu CUBIC-P, aby osiągnąć poziomy klarowania wymienione w kroku 1.5.
    2. Aby przygotować bufor CUBIC-P, rozpuść 10% N-butylodietanoloaminy, 5% Triton X-100 i 5% 1-N-Metyloimidazol w wodzie podwójnie destylowanej lub użyj dostępnych w handlu koktajli (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Kroki 1.6.1.-1.6.2. są zalecane tylko w przypadku narządów o dużej pigmentacji, takich jak serce i nerki, ponieważ wymagają etapu wstępnego oczyszczania w celu uzyskania zwiększonego poziomu przezroczystości. Po użyciu CUBIC-P należy przeprowadzić sekcję narządów i przejść bezpośrednio do kroku 2: Oczyszczanie tkanek.
  7. Wypreparuj próbki tkanek/narządów30 do zobrazowania i utrwalić je w 4% (w/v) PFA w PBS (~10 ml / cały narząd) przez noc (ON) w temperaturze 4 °C z delikatnym potrząsaniem (nie więcej niż 5 x g) w probówkach stożkowych o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Wszystkie inkubacje od tego czasu muszą być wykonywane na probówkach ułożonych poziomo w temperaturze 20-30 °C, chronionych przed światłem.
  8. Przemyć próbkę w 10 ml PBS (uzupełnionego 0,05% azydkiem sodu (NaN3) przez 3 godziny (trzy razy) w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym wstrząsaniem (5 x g).
    UWAGA: Tkanki można zamrozić przez inkubację w 10 ml 30% sacharozy w PBS z delikatnym wstrząsaniem (5 x g) w temperaturze 4 °C ON w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Po opadnięciu tkanek na dno probówki, zanurz je w związku OCT i utrzymuj w temperaturze -80 °C. Rozmrażaj w temperaturze pokojowej, aż związek OCT całkowicie się rozpuści, a następnie umyj w PBS (~10 ml / cały narząd) w temperaturze 4 °C z delikatnym potrząsaniem (5 x g) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przejdź do kroku 2.

2. Oczyszczanie tkanek

UWAGA: Wszystkie oczyszczania tkanek wykonane w tej pracy zostały wykonane przy użyciu protokołu CUBIC I22. Użyto trzech różnych koktajli: CUBIC-P do delipidacji i szybkiej dekoloryzacji podczas perfuzji, CUBIC-L do delipidacji i odbarwiania oraz CUBIC-R do dopasowania RI. Barwienie DNA i barwienie immunologiczne przeprowadzono przy użyciu odpowiednio zestawu do barwienia jądrowego CUBIC-HV 1 3D i zestawu do barwienia immunologicznego CUBIC-HV 1 3D (patrz tabela materiałów).

  1. Zanurz poszczególne narządy w 10 ml 50% rozcieńczonego wodą CUBIC-L (patrz Tabela Materiałów) z delikatnym potrząsaniem (5 x g) w temperaturze RT (ON) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Trzymaj rurki płasko na płycie wytrząsającej.
    UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, narządy są utrzymywane w tej samej probówce, a roztwory są pobierane za pomocą systemu próżniowego. Aby przygotować CUBIC-L, rozpuść 10% N-butylodietanoloaminy i 10% Triton X-100 w podwójnie destylowanej wodzie za pomocą dostępnych w handlu koktajli (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: CUBIC-L powoduje poważne uszkodzenie oczu. Nosić ochronę oczu i twarzy. Zutylizować do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
  2. Zanurz próbkę w 10 ml 100% CUBIC-L na 6 dni (odświeżając roztwór w 3 dniu).
    UWAGA: Pod koniec tego okresu inkubacji tkanki muszą być prawie całkowicie przezroczyste.
  3. Przemywać przezroczyste narządy PBS (uzupełnionym 0,05% NaN3) przez 2 godziny (trzy razy) w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (5 x g). Przenieś chusteczki do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml przy każdym myciu, aby usunąć Triton X-100.
    UWAGA: Zgodnie z opisem w Rysunek 2B, jeśli celem eksperymentu jest wizualizacja endogennie wyrażonych białek reporterowych z transgenicznych pasożytów T. cruzi lub myszy (Rysunek 2C-F), pomiń kroki 3, 4 i 5 i przejdź bezpośrednio do kroku 6.

3. Barwienie DNA

  1. Rozcieńczyć dostępny w handlu barwnik kwasu nukleinowego (patrz Tabela materiałów) w 5 ml buforu barwiącego (zawartego w zestawie) w rozcieńczeniu 1/2,500.
  2. Zanurzyć tkankę w roztworze barwnika jądrowego i inkubować w temperaturze 37 °C z delikatnym obracaniem przez 5 dni w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml w pozycji stojącej.
  3. Myć 15 ml buforu do barwienia jądrowego 3D (dołączonego do zestawu) przez 2 godziny (trzy razy) w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem (5 x g).
    UWAGA: Inne barwniki DNA mogą być stosowane w tych stężeniach i czasach inkubacji: DAPI (w zestawie): 1/200, 5 dni inkubacji; BOBO-1: 1/400, 5 dni inkubacji; Jodek propidyny (PI) (w zestawie): 1/100, 3 dni inkubacji; RedDot2: 1/250, 3 dni inkubacji. Jeśli konkretnym celem eksperymentu jest wizualizacja zarówno białek reporterowych o ekspresji endogennej, jak i użycie barwienia jądrowego, pomiń kroki 4 i 5 i przejdź bezpośrednio do kroku 6.

4. Trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)

UWAGA: Trawienie hialuronidazą w ECM musi być przeprowadzone, aby ułatwić prawidłowe przenikanie przeciwciał do głębokich obszarów tkanek28.

  1. Zanurzyć poszczególne narządy w 15 ml buforu reakcyjnego hialuronidazy na 2 godziny w temperaturze 37 °C w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w pozycji płaskiej, chronionej przed światłem.
    UWAGA: Aby przygotować bufor reakcyjny hialuronidazy, rozpuścić 10 mM CAPSO; 150 mM chlorku sodu (NaCl) i 0,05% NaN3 (patrz Tabela materiałów) w wodzie podwójnie destylowanej i dostosować pH do 10.
  2. Przygotować roztwór enzymatyczny, mieszając 75 μl 20 mg/ml hialuronidazy z 425 μl buforu reakcyjnego hialuronidazy. Aby przygotować 20 mg/ml hialuronidazy, należy rozpuścić hialuronidazę w 50 mM buforu węglanowego, 150 mM NaCl, 0,01% BSA i 0,05% NaN3 (patrz tabela materiałów). Doprowadzić pH do 10 i podwielokrotność w objętości 77 μl w temperaturze -30 °C.
  3. Odrzucić bufor reakcyjny hialuronidazy za pomocą pipety i zanurzyć narząd w roztworze enzymatycznym (500 μl w stożkowej probówce o pojemności 15 ml) w pozycji stojącej, chronionej przed światłem przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (5 x g).
  4. Przemyć próbkę w 15 ml hialuronidazowego buforu do przemywania w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w pozycji poziomej, chronionej przed światłem, przez 2 godziny (trzykrotnie) w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (5 x g).
    1. Aby przygotować bufor do płukania hialuronidazą, rozpuść 50 mM buforu węglanowego, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 5% (v/v) metanolu i 0,05% NaN3. Dostosuj pH do 10. Aby przygotować 10x bulion buforu węglanowego-NaCl, rozpuść 2.96 g węglanu sodu, 1.86 g wodorowęglanu sodu i 8.77 g NaCl w 100 ml podwójnie destylowanej wody z 0.05% NaN3 (patrz tabela materiałów) i dostosuj pH do 10.

5. Barwienie immunologiczne

  1. Oznacz układ naczyniowy za pomocą przeciwciał anty-α-SMA (alfa-aktyna małych mięśni, patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Wygeneruj pierwszorzędowy plus sprzężony kompleks przeciwciał drugorzędowych fragmentu Fab. Rozpocznij tę reakcję 1,5 godziny przed zabiegiem barwienia.
      1. Obliczyć wymaganą ilość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych (zmieszać w stosunku wagowym 1:0,5).
        UWAGA: W przypadku pierwszorzędowego przeciwciała anty-α-SMA potrzeba 3,5 μg do znakowania całego serca lub fragmentu mięśni szkieletowych o podobnych wymiarach. Dla produktu o stężeniu 2,5 mg/ml potrzebne jest 3,5/2,5 = 1,4 μl roztworu przeciwciał. W przypadku wtórnego fragmentu Fab przeciwciała AlexaFluor 647 przeciwko myszy, 1,75 μg jest potrzebne do znakowania całego serca lub fragmentu mięśni szkieletowych o podobnych wymiarach. Dla produktu o stężeniu 1,7 mg/ml potrzebne jest 1,75/1,7 = 1 μl roztworu przeciwciał.
      2. Wymieszać przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w bursztynowej probówce o pojemności 2 ml i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. W celu wymiany buforu zmieszać 7,5 ml 2x HV1 3D buforu do barwienia immunologicznego (dołączonego do zestawu, patrz tabela materiałów) z 7,5 ml podwójnie destylowanej wody i zanurzyć próbkę tkanki na 1,5 godziny w temperaturze 32 °C z delikatnym wstrząsem (5 x g) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w pozycji poziomej. Reakcję tę należy rozpocząć jednocześnie jako wytworzenie kompleksu przeciwciał (1,5 godziny przed zabiegiem barwienia immunologicznego).
  2. Wykonaj barwienie immunologiczne 3D, wykonując poniższe czynności.
    1. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml przygotować roztwór do barwienia przeciwciał zgodnie z plikiem uzupełniającym 1.
    2. Pobrać próbkę tkanki z pożywki do wymiany buforowej (etap 5.1.2) i zanurzyć ją w roztworze barwiącym przeciwciała. Inkubować tkanki pojedynczo przez 1 tydzień w temperaturze 32 °C, delikatnie potrząsając (5 x g) probówek w pozycji stojącej, chronionej przed światłem. Uszczelnij rurkę folią parafinową, aby uniknąć parowania.
    3. Przesunąć do temperatury 4 °C i inkubować w pozycji stojącej.
    4. Schłodzić 1x HV1 3D immunologicznie barwiący bufor płuczący (dołączony do zestawu, patrz tabela materiałów) do 4 °C i przemyć próbkę 15 ml buforu (dwa razy) przez 30 minut w temperaturze 4 °C z delikatnym wstrząsaniem (5 x g). Utrzymać probówki stożkowe o pojemności 15 ml w pozycji poziomej do kroku 5.2.7.
    5. Rozcieńczyć formalinę do 1% w 1x HV1 3D immunologicznie barwiący bufor płuczący i zanurzyć próbkę w 8 ml roztworu na 24 godziny w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (5 x g).
    6. Inkubować w świeżym 1% roztworze formaliny przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (5 x g).
    7. Myć w 15 ml PBS przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, delikatnie wstrząsając (5 x g).
  3. Wzmocnij sygnał tdTomato za pomocą przeciwciał przeciwko białku czerwonej fluorescencji (RFP), wykonując poniższe czynności.
    1. Postępuj zgodnie z tymi samymi czasami inkubacji i temperaturami, jak w kroku 5.2.2. Obliczyć ilość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych (patrz tabela materiałów) i wymieszać je w stosunku wagowym 1:0,5.
      UWAGA: W przypadku pierwszorzędowego przeciwciała anty-RFP potrzeba 5 μg do znakowania całego serca lub fragmentu mięśni szkieletowych o podobnych wymiarach. Dla produktu o stężeniu 1,25 mg/ml wymagane jest 5/1,25 = 4 μl roztworu. W przypadku wtórnego fragmentu Fab przeciwciała Alexa Fluor 647 przeciwko królikowi potrzeba 2,5 μg do znakowania całego serca lub fragmentu mięśni szkieletowych o podobnych wymiarach. Dla produktu o stężeniu 1,5 mg/ml potrzebne jest 2,5/1,5 = 1,7 μl roztworu.
    2. Przygotować roztwór do barwienia przeciwciał, jak wspomniano w pliku uzupełniającym 1.
  4. Wzmocnij sygnały GFP za pomocą nanociał anty-GFP, wykonując poniższe czynności.
    1. Postępuj zgodnie z tymi samymi czasami inkubacji i temperaturami, jak wspomniano w kroku 5.2.2.
      UWAGA: Nanociała anty-GFP (patrz tabela materiałów) są sprzężone z Alexa Fluor 647, więc wytwarzanie kompleksu przeciwciał jest niepotrzebne.
    2. Przygotować roztwór do barwienia przeciwciał, jak wspomniano w pliku uzupełniającym 1.

6. Dopasowanie RI

  1. Zanurzyć przezroczyste organy w 5 ml 50% rozcieńczonego wodą roztworu CUBIC-R+ (patrz Tabela materiałów) w temperaturze RT (ON) z delikatnym potrząsaniem (5 x g) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Utrzymuj probówki w pozycji stojącej podczas całego etapu dopasowywania RI.
    UWAGA: Roztwory CUBIC R+ z recyklingu z poprzednich eksperymentów mogą być ponownie wykorzystane (do czterech razy) na tym etapie. Aby przygotować roztwór CUBIC-R+, należy rozpuścić 45% 2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolonu (antypiryny), 30% nikotynamidu lub N-metylonikotinamidu i 0,5% N-butylodietanoloaminy w wodzie podwójnie destylowanej lub użyć dostępnego w handlu buforu CUBIC-R+ (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: CUBIC-R+ powoduje podrażnienie skóry, poważne podrażnienie oczu i uszkodzenie narządów. Nosić rękawice ochronne i zapewnić ochronę oczu i twarzy. Nie wdychać kurzu, oparów, gazów, mgły ani oparów. Utylizować do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
  2. Zastąp 50% CUBIC-R+ 5 ml 100% CUBIC-R+ i inkubuj, delikatnie wstrząsając (5 x g) w temperaturze pokojowej przez 2 dni. Następnie przenieś tkanki na stos niestrzępiących się chusteczek i ostrożnie obróć chusteczki, aby usunąć roztwór CUBIC-R+ z powierzchni narządów przez 5 minut.

7. Montaż

  1. Po wysuszeniu tkanek przenieść je do 5 ml roztworu montażowego (RI = 1,520) (patrz Tabela materiałów) na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej i inkubować je (ON) w temperaturze pokojowej. Często obracaj tkanki, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, szczególnie na powierzchni narządów.
    UWAGA: Organy mogą być przechowywane przez ponad 6 miesięcy w roztworze montażowym lub CUBIC-R+.
  2. Przyklej tkanki do uchwytu próbki mikroskopu za pomocą kleju żelowego na bazie cyjanoakrylanu.
  3. Zanurz próbki w mikroskopowej kuwecie kwarcowej wypełnionej 120 ml roztworu montażowego i zobrazuj je poprzecznie do ich osi podłużnej. Przyklej serce z wierzchołkiem i aortą ustawionymi poziomo.
    UWAGA: Oczyszczone i zamontowane narządy można podzielić za pomocą wibratomu i zobrazować w dużym powiększeniu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Osadź narządy w 2% agarozie i wytnij odcinki o wielkości 100-500 μm. Narządy można również ciąć ręcznie ostrym ostrzem w celu uzyskania skrawków grubych tkanek (>1000 μm). Po pokrojeniu na plasterki umieść je na szalkach Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem, zamontuj za pomocą tego samego roztworu montażowego, uszczelnij lakierem do paznokci i zobrazuj za pomocą mikroskopu konfokalnego.

8. Akwizycja obrazu

  1. Zobrazuj zamontowane próbki za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi (patrz Tabela materiałów). Ustaw powiększenie i rozmiar kroku między poszczególnymi warstwami na 3 μm i użyj prawych i lewych laserów arkuszowych o grubości 5 μm i szerokości 100%. Ustaw stały czas naświetlania na 50-100 ms i dostosuj moc lasera od 10% do 80% w zależności od intensywności sygnału fluorescencji.
    1. Do jednoczesnego wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję tdPomidor i uśpionych amastigotów barwionych DiR (Rysunek 2C) należy użyć odpowiednio kanałów czerwonego (Ex/Em 561/620-660 nm) i podczerwonego (Ex/Em 785/845-55 nm). Do jednoczesnego wykrywania limfocytów T i pasożytów wykazujących ekspresję tdPomidor u myszy reporterowej CD8 (Rysunek 2D), użyj odpowiednio kanału zielonego (Ex/Em 488 / 525-50 nm) i czerwonego.
    2. Do testów koinfekcji (Rysunek 2E), a także do wspólnego wykrywania pasożytów wyrażających GFP u myszy reporterowych jąder (Rysunek 2F), użyj odpowiednio kanału zielonego i czerwonego. Do wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję tdPomidor, barwnika jądrowego i naczyń krwionośnych serca (Rysunek 3B, C) należy używać odpowiednio kanałów czerwonego, zielonego i dalekiej czerwieni (Ex/Em 640/680-730 nm).
    3. Wykrywanie przeciwciał anty-RFP z kanałem dalekiej czerwieni i nanociał anty-GFP za pomocą kanału zielonego (Rysunek 3D).
  2. Przekonwertuj uzyskane stosy obrazów TIFF i zrekonstruuj narządy w 3D za pomocą oprogramowania Imaris v9.7.2 (patrz tabela materiałów).

9. Rekonstrukcja powierzchni i kwantyfikacja za pomocą oprogramowania Imaris

  1. Wybierz narzędzie algorytmu wykrywania powierzchni i uruchom kreatora w oprogramowaniu do analizy obrazu.
  2. Wykonaj wstępną analizę w obszarze zainteresowania 3D (losowo wybranym), a następnie zastosuj ją do całej rekonstrukcji narządu 3D. Po wybraniu obszaru zainteresowania (ROI) wybierz kanał do analizy, odznacz przycisk wygładzania i wybierz odejmowanie tła.
    UWAGA: Odejmowanie tła oblicza unikalną lokalną wartość tła dla każdego woksela i odejmuje ją od oryginalnej wartości piksela. Średnica największej kuli, która mieści się w obiekcie, musi wynosić do 200 μm dla komórek zakażonych T. cruzi, 10 μm dla limfocytów T i 5 μm dla pojedynczych pasożytów.
  3. Użyj histogramu, aby dostosować klasyfikację, a lista rozwijana filtrów , aby wybrać pomiary do klasyfikacji.
    UWAGA: Użyj histogramu, aby dostosować klasyfikację: zalecane są pomiary eliptyczności (spłaszczonej) i sferyczności.
  4. Zakończ pracę kreatora, naciśnij przycisk statystyk i pobierz całkowitą liczbę komórek zainfekowanych pasożytami lub limfocytów T jako liczbę odłączonych komponentów na punkt czasowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Utkane tkanki poddano procesowi CUBIC, płucząc je w PBS w celu usunięcia utrwalaczy, a następnie inkubowano z koktajlami CUBIC-L – zasadowym roztworem buforowym aminowych alkoholi, które ekstrahują pigmenty i lipidy z tkanki, co prowadzi do jej odbarwienia przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkankowej. Przez tkanki widoczne są linie siatki na papierze, co wskazuje na prawidłowe przejrzyszczenie organów. (Rycina 2A)Po delipidacji tkanki przemyto i zanurzono odpowiednio ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Brak szeroko zakrojonego obrazowania pasożytów i odpowiedzi immunologicznej całego narządu ogranicza zrozumienie złożoności interakcji gospodarz-pasożyt i utrudnia ocenę terapii choroby Chagasa. W niniejszym badaniu wykorzystano linię CUBIC do oczyszczenia i barwienia nienaruszonych narządów i tkanek myszy zakażonych T. cruzi.

W tym badaniu przetestowano wiele protokołów oczyszczania tkanek (PACT32, ECi33, FLASH34...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Etsuo Susaki za cenną pomoc i zalecenia dotyczące protokołów oczyszczania tkanek i barwienia immunologicznego. Jesteśmy również wdzięczni M. Kandasamy z CTEGD Biomedical Microscopy Core za wsparcie techniczne z wykorzystaniem LSFM i obrazowania konfokalnego. Dziękujemy również wszystkim członkom Tarleton Research Group za pomocne sugestie w trakcie tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-metyloimidazolMillipore Sigma616-47-7
2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolon (antypirynaTCID1876
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anty-mysi fragment FabImmuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anty-królik Fragment FabJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anty-GFP, nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anty-RFPRockland600-401-379
anty-&alfa;-SMASigmaA5228
B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J myszSzczep laboratoryjny Jackson#007914Nazwa zwyczajowa: Ai14 , Ai14D lub Ai14 (RCL-tdT)-D
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J MyszJackson LaboratoryStrain #007914Nazwa zwyczajowa: Ai14 , Ai14D lub Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 JodekThermoFisher ScientificB3582
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma#A7906
Mysz C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Szczeplaboratoryjny Jackson#032080Pospolity Nazwa: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Chusteczki czyszczące Kimwipes  Kimberly-ClarkT8788
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 Zestaw do barwienia immunologicznego 3DTCIC3699
CUBIC-HV 1 Zestaw do barwienia jądrowego 3DTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Superglue żelowy na bazie cyjanoakrylanuScotch571605
DiR (DiIC18(7); jodek 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindotrikarbocyjaniny) Firma: BiotiumBiotium#60017
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Probówki wirówkowe 15 mlCorning
Probówki wirówkowe Falcon 50  mlCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparynaThermoFisher ScientificJ16920. BBR
HialuronidazaSigma#H3884 lub #H4272
Imaris Konwerter plików x64BitPlanev9.2.0
Oprogramowanie ImarisBitPlanev9.3
Oprogramowanie ImSpectorLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Igła do iniekcji dożylnych 23-GSartori, Minisart Filtr strzykawkowy16534
Chusteczki KimwipesNiestrzępiące się Mikroskop
świetlnymMiltenyi BiotecULtramicroscope II Metanol
ThermoFisher Scientific041838.K2
Końcówki do mikropipet, 10 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1,000 &mikro; LAxygenT-300, T-200-Y i T-1000-B
Zmotoryzowany dozownik do pipetFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Rozwiązanie montażoweTCIM3294
N-butylodietanoloaminaTCIB0725
NikotynamidTCIN0078
N-metylonikotinamidTCIM0374
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich158127
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Daleko-czerwona plama jądrowaBiotium#40061
System perfuzji SacrificeLeica10030-380
NożyczkiNarzędzia do nauki91460-11
Pipety serologiczneCostar Sterile4488
Inkubator z wytrząsaniemTAITECBR-43FM MR
Azydek sodu (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Węglan sodu (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Chlorek sodu (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Zielona plama kwasu nukleinowegoThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Jackson : , , , , CLS430791fluorescencyjny z arkuszem System obrazowania

Bibliografia

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039(2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369(2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982(2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

choroba Chagasaobrazowanie 3Dklarowanie tkanekmikroskopia arkusza wiat awizualizacja limfocyt w Timmunostainowaniekwantyfikacja paso yt wklarowane organy
Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.