Method Article

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

DOI:

10.3791/63923

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  , 
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) nabiera rozpędu w ostatnich latach, szczególnie od czasu wprowadzenia bezpośrednich detektorów elektronów, ulepszonych strategii automatycznej akwizycji, technik przygotowawczych, które rozszerzają możliwości tego, co mikroskop elektronowy może zobrazować w wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-ET i nowego oprogramowania do uśredniania subtomogramu. Ponadto pozyskiwanie danych staje się coraz bardziej usprawnione, dzięki czemu jest bardziej dostępne dla wielu użytkowników. Pandemia SARS-CoV-2 jeszcze bardziej przyspieszyła gromadzenie danych z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), zwłaszcza w przypadku krio-EMU pojedynczych cząstek, w wielu obiektach na całym świecie, zapewniając użytkownikom nieprzerwany dostęp do najnowocześniejszych instrumentów podczas pandemii. Dzięki niedawnym postępom w Tomo5 (oprogramowaniu do tomografii elektronowej 3D), zdalne gromadzenie danych cryo-ET stało się solidne i łatwe w obsłudze z dowolnego miejsca na świecie. Ten artykuł ma na celu przedstawienie szczegółowego przewodnika, zaczynając od konfiguracji zbierania danych w oprogramowaniu tomograficznym dla procesu (zdalnej) sesji zbierania danych cryo-ET ze szczegółowym rozwiązywaniem problemów. Protokół (zdalnego) gromadzenia danych jest dodatkowo uzupełniony o proces określania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej poprzez uśrednianie subtomogramu za pomocą emClarity, na przykładzie apoferrytyny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) jest powszechnie znana z okresu renesansu, który przyspieszył, stając się podstawowym i niezwykle użytecznym narzędziem w biologii strukturalnej. Rozwój i wykorzystanie bezpośrednich detektorów elektronów1,2,3, ulepszone mikroskopy i źródła elektronów3,4,5, ulepszenia automatyzacji/przepustowości6,7,8,9, oraz postępy obliczeniowe w analizie pojedynczych cząstek10,11,12,13,14 i tomografia15,16,17 są częściowo odpowiedzialne za niedawny sukces tej techniki. Te czynniki technologiczne rozwinęły zdolność cryo-EM do rozwiązywania biologicznych struktur makromolekularnych w warunkach kriogenicznych i natywnych. Rozdzielczości, które są łatwo osiągalne, są wystarczające do modelowania z atomową dokładnością i wysunęły tę technikę na czoło areny biologii strukturalnej. Redukcjonistyczne podejście do wyrażania i oczyszczania celu biologicznego od dawna okazuje się skuteczne w krystalografii makromolekularnej (MX) w podstawowych badaniach biologicznych, odkrywaniu leków i naukach translacyjnych. W ramach tego samego podejścia cryo-EM może teraz dostarczać wyniki, które są równoległe do badań MX o wysokiej rozdzielczości. Obecny duży sukces w dziedzinie krio-EM biologii strukturalnej nazywa się analizą pojedynczych cząstek (SPA), która polega na pozyskiwaniu obrazów projekcyjnych 2D typowych dla oczyszczonej próbki białka18 w celu uzyskania tysięcy widoków biologicznej makrocząsteczki19. Obrazy te (1) zawierają informacje z szeregu widoków, które w pełni reprezentują orientację celu w przestrzeni 3D oraz (2) uchwycą niejednorodność konformacyjną obiektu, którą można później rozdzielić i zbadać.

Alternatywnym podejściem do pozyskiwania tych obrazów projekcyjnych 2D próbek biologicznych, nawet in situ i bez oczyszczania, jest tomografia krioelektronowa (cryo-ET). Cryo-ET wykonuje serię zdjęć tego samego obiektu pod kątem nachylenia, mechanicznie obracając próbkę. W ten sposób projekcje 2D zebrane w SPA, reprezentujące ułożenie kątowe cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, są z natury zbierane w ramach eksperymentu obrazowania cryo-ET20. Serie nachylenia tomograficznego są następnie rekonstruowane w tomogram, który zawiera reprezentacje 3D obrazowanych kompleksów makromolekularnych. Charakter gromadzenia danych tomograficznych w pewnym stopniu zmniejsza zależność od uśredniania w celu uzyskania pełnej reprezentacji 3D cząsteczki ze zbioru obrazów 2D. Jednak ze względu na obecne projekty etapów, próbka jest zwykle nachylona od -60° do +60°, pozostawiając brakujące informacje w tomograficznej rekonstrukcji 3D wedge21.

Rekonstrukcje 3D w jednym tomogramie mają wtedy brakujący klin informacji i niski poziom sygnału do szumu. Poszczególne makrocząsteczki można ekstrahować jako subtomogramy i uśredniać razem, aby rozwiązać ten problem. Tam, gdzie każda makrocząsteczka w subtomogramie znajduje się w innej orientacji, brakujący klin jest zorientowany inaczej w każdym subtomogramie obiektu docelowego, więc uśrednianie na wielu kopiach uzupełnia informacje z powodu brakującego klina. Ostatnie osiągnięcia w przetwarzaniu obrazów podjęły również próbę wytrenowania sieci neuronowych sztucznej inteligencji, aby wypełniły brakujący klin znaczącymi danymi22. Ten proces uśredniania zwiększa również stosunek sygnału do szumu, podobnie jak w przypadku uśredniania w analizie pojedynczych cząstek, dzięki czemu poprawia się jakość i rozdzielczość rekonstrukcji. Jeśli cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania posiada symetrię, to również można ją zdefiniować i wykorzystać podczas uśredniania, co jeszcze bardziej poprawia rozdzielczość rekonstrukcji. Ekstrakcja objętości 3D makrocząsteczki z tomogramu do zestawu subtomogramów i ich późniejsze przetwarzanie jest znane jako uśrednianie subtomogramu (STA)23. W przypadku, gdy każdy subtomogram reprezentuje unikalną kopię badanej cząsteczki, każda niejednorodność strukturalna może być badana za pomocą przepływu pracy STA. Techniki klasyfikacyjne, powszechnie stosowane w przepływie pracy SPA, mogą być stosowane podczas STA w celu przeanalizowania stanów konformacyjnych kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania. Oprócz tego, że STA umożliwia rekonstrukcję w wysokiej rozdzielczości w cryo-ET, podejście to sprawia, że technika ta jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów strukturalnych makrocząsteczek w ich naturalnym środowisku komórkowym lub celów, które często nie są podatne na SPA24,25,26.

Tomografia elektronowa ma długą historię określania ultrastruktury 3D próbek komórkowych w temperaturze pokojowej27. Akwizycja widoków poprzez fizyczne przechylenie próbki dostarcza wystarczających informacji do rekonstrukcji 3D obiektu w skalach długości komórkowej i jest szczególnie ważna, gdy strukturom komórkowym brakuje regularności uśredniania. Komórki mogą być również zamrażane na podłożach do obrazowania krio-ET na krawędziach komórek, gdzie próbka jest wystarczająco cienka, aby była przezroczysta dla elektronów. W tych warunkach STA może być wykorzystany do określenia struktur makromolekularnych w środowisku komórkowym, aczkolwiek gdy próbka jest wystarczająco cienka, aby była przezroczysta dla elektronów28. Jednak w połączeniu z dodatkowymi technikami preparatywnymi, w tym kriokorelacyjną mikroskopią świetlną i elektronową (cryo-CLEM) oraz mieleniem skupionej wiązki jonów (cryo-FIB), cryo-ET może być używany do obrazowania wnętrza całych komórek w warunkach kriogenicznych29. Łączy to moc cryo-ET do badania ultrastruktury komórkowej z mocą STA do określania struktur kompleksów makromolekularnych in situ, jednocześnie identyfikując ich lokalizację komórkową30 i dostarczając migawki kompleksów zaangażowanych w procesy dynamiczne31. Zdolność tej techniki do obrazowania próbek komórkowych i wykorzystania STA w kilku badaniach podkreśliła moc tej techniki w rozwiązywaniu struktur makromolekularnych in situ, nawet w rozdzielczościach porównywalnych do SPA32. Kolejną korzyścią jest wiedza o pierwotnej lokalizacji makrocząsteczki, reprezentowanej przez ostateczną sklasyfikowaną rekonstrukcję 3D w tomogram30. Dlatego struktura makromolekularna może być skorelowana z ultrastrukturą komórkową. Te obserwacje w różnych skalach długości prawdopodobnie doprowadzą do ważnych odkryć, w których mechanizmy strukturalne mogą być skorelowane ze zmianami komórkowymi w kontekście badań funkcjonalnych.

Cryo-ET i STA umożliwiają zbieranie danych w trzech głównych przepływach pracy: tomografii molekularnej, komórkowej i lamello. Struktury oczyszczonych kompleksów makromolekularnych można określić za pomocą krio-ET za pomocą tomografii molekularnej. Określenie struktur białek w ich środowisku komórkowym, w którym komórka jest wystarczająco cienka, można określić jako tomografię komórkową. Niedawno, wraz z rozwojem celowania i mielenia kriogenicznego, te same techniki mogą być stosowane w przepływach pracy tomografii lamelowej w celu określenia struktur białkowych głęboko w komórce w ich naturalnym środowisku, ujawniając jednocześnie kontekst komórkowy, w którym te białka są obserwowane. W zależności od dostępnych pakietów oprogramowania i, co najważniejsze, w zależności od wymagań dotyczących próbki, można stosować różne strategie gromadzenia danych. Próbki molekularne lub nieprzylegające na miedzianej siatce TEM oczyszczonego białka zazwyczaj wymagają mniej obsługi, a zatem w idealnych przypadkach pozostają płaskie i nieuszkodzone. Tomogramy elektronowe można łatwo ustawić szeregowo na dziurawej siatce węglowej, aby szybko i systematycznie uzyskiwać dziesiątki do setek tomogramów. Najprostszym sposobem, w jaki użytkownicy mogą skonfigurować próbki tomografii molekularnej, w których białka są obficie obecne na siatce, byłoby użycie Tomo5 (oprogramowanie do tomografii elektronowej 3D użyte w niniejszym badaniu, patrz Tabela materiałów). Dostępne są również inne programy tomograficzne, takie jak Leginon9 i serialEM6; Oferują one więcej opcji konfiguracji dla bardziej spersonalizowanych podejść do zbierania danych, ale są bardziej złożone i w związku z tym mogą być trudniejsze w nawigacji, szczególnie dla użytkowników nowych w tomografii i użytkowników uzyskujących zdalny dostęp do sesji. W przypadku obiektu z dużą i zróżnicowaną bazą użytkowników, Tomo5 jest łatwy w obsłudze w środowisku zdalnym i do szkolenia użytkowników. W przypadku ogniw przylegających siatki zazwyczaj wymagają większej liczby etapów obsługi, a konieczność stosowania delikatnych siatek złotych zwiększa potrzebę lepszej staranności w strategiach obsługi i gromadzenia danych. Aby ułatwić znalezienie interesującego obszaru komórkowego i uniknąć okluzji od samej siatki przy dużych kątach nachylenia, korzystne jest również stosowanie większych rozmiarów oczek, ale kosztem tego, że są one z natury bardziej kruche. W przypadku próbek lameli kruchość próbki zależy od jakości blaszki, która może być zmienna. Czynniki te wydłużają czas konfiguracji i rozważania, ale zwiększona zdolność adaptacji i solidność ponownie sprawiają, że Tomo5 nadaje się do tego typu gromadzenia danych. Jednak dla każdego przepływu pracy istnieją wyspecjalizowane scenariusze zbierania danych. BISECT i PACE-tomo (oba działają w SerialEM) wprowadzają możliwość skryptowego przesuwania obrazu wiązki podczas akwizycji tomografii w celu zwiększenia szybkości pobierania tomogramu28, szczególnie w tomografii molekularnej. Montaże ze średnim powiększeniem (MMM) w SerialEM6,7,33 może lepiej identyfikować i precyzyjnie celować w cechy molekularne we wszystkich przepływach pracy, chociaż w chwili pisania tego tekstu funkcje te zaczynają być implementowane w Tomo5.

Podobnie jak SPA, cryo-ET i STA stają się coraz bardziej dostępne dzięki ulepszeniom oprogramowania do akwizycji i bogactwu dostępnych pakietów do uśredniania subtomogramów16,17,32,34,35,36,37,38. Ponadto, podczas pandemii, umożliwienie zdalnego dostępu do oprzyrządowania krio-EM stało się niezbędne do dalszego działania krajowych obiektów, takich jak Centrum Bioobrazowania Elektronów (eBIC) w Diamond Light Source (DLS) w Wielkiej Brytanii. Osiągnięcia te sprawiły, że cryo-ET stał się bardziej dostępny i solidny dla badaczy, którzy chcą wykorzystać tę technikę. Po uzyskaniu danych STA jest niezbędnym narzędziem do analizy powtarzających się obiektów w celu uzyskania rekonstrukcji w maksymalnej rozdzielczości i umożliwienia klasyfikacji heterogeniczności makromolekularnej. Obecny protokół ma na celu zapewnienie szczegółowego przewodnika po przygotowaniu mikroskopu krio-TEM do zbierania danych krio-ET oraz sposobu przeprowadzania uśredniania subtomogramowego przy użyciu emClarity na przykładzie zestawu danych tomografii molekularnej apoferrytyny. Korzystanie z emClarity (oprogramowanie do wysokorozdzielczej tomografii krioelektronowej i uśredniania subtomogramu, patrz Tabela materiałów) wymaga uruchamiania skryptów z wiersza poleceń, więc zakłada się poziom znajomości systemów Linux/UNIX.

Zdalne połączenie zależy od środowiska sieciowego w każdym instytucie/placówce. W eBIC zdalny system korzysta z programów, które umożliwiają zdalne zbieranie danych na temat określonej konfiguracji sieci używanej w Diamond. Zdalne połączenie z mikroskopem ułatwiają dwie platformy: NoMachine i TeamViewer (patrz tabela materiałów). Za pomocą programu NoMachine użytkownik może zalogować się do zdalnego pulpitu systemu Windows. Zdalny pulpit systemu Windows dostarczony przez NoMachine znajduje się w tej samej sieci co mikroskop, a zatem działa jako wirtualny komputer pomocniczy dla mikroskopu. Z wirtualnego komputera pomocniczego użytkownik łączy się z mikroskopem za pośrednictwem TeamViewer, zapewniając bezpośredni dostęp i kontrolę nad komputerem mikroskopu z uruchomionymi TUI i Tomo.

Obecny protokół składa się z dwóch części (krok 1 i krok 2). Krok 1 koncentruje się na zdalnym pozyskiwaniu danych cryo-ET za pomocą Tomo5 (oprogramowanie do tomografii elektronowej 3D). Przewodnik po (zdalnej) sesji rejestruje obrazy w coraz większych powiększeniach, aby ostatecznie umożliwić użytkownikowi skierowanie oprogramowania tomograficznego do docelowych obszarów próbek w celu zebrania danych tomograficznych. Rysunek 1 podsumowuje ten proces. Krok 2 zawiera szczegółowe informacje na temat przetwarzania danych cryo-ET STA za pomocą emClarity (oprogramowanie do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości i uśredniania subtomogramu). Rysunek 9 podsumowuje ten proces.

Protokół jest przeznaczony dla odbiorców zdalnych. Zakłada się, że osoba fizycznie stojąca przy mikroskopie i ładująca próbki dokonała bezpośredniego wyrównania i zajęła się strojeniem kamery oraz pozyskiwaniem danych referencyjnych. W przypadku tego protokołu zakłada się system soczewek z trzema kondensorami i automatycznym ładowaczem. Aby uzyskać bardziej szczegółowe wskazówki dotyczące oprogramowania do tomografii, szczegółowa instrukcja producenta jest dostępna w przycisku Start systemu Windows, z którego oprogramowanie zostało załadowane.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pakiety oprogramowania użyte w tym badaniu są częściowo dostępne za darmo (zobacz Tabelę materiałów).

1. Zdalna akwizycja danych cryo-ET za pomocą Tomo5

  1. Jeśli oprogramowanie nie jest załadowane, zacznij od uruchomienia tego oprogramowania z komputera serwera TEM (patrz tabela materiałów).
  2. Wykonaj wstępne kontrole i skonfiguruj warunki obrazowania, wybierając opcję Ustawienia wstępne.
    1. Rozpocznij konfigurację sesji, dostosowując parametry akwizycji obrazu w zakładce "Przygotowanie" w ustawieniach wstępnych (Rysunek 2A,B).
      1. Dostosuj "Powiększenie przeglądu", aby dopasować je do rozmiaru kwadratu siatki i dawki, aby uzyskać odpowiednie liczby.
        UWAGA: Jeśli odpowiednie powiększenie nie jest znane dla typu siatki, wróć do tego kroku po załadowaniu siatki.
      2. "Wysokość eucentryczna" i "Powiększenie wyszukiwania" mogą być takie same. Kliknij Szukaj w zakładce "Tomografia", aby ustawić pozycje i upewnić się, że powiększenie jest wystarczające, aby pokazać interesujący Cię znak rozpoznawczy i zmieścić obszar "Ekspozycja" i "Śledzenie/Ostrość" w polu widzenia (Rysunek 2C).
      3. Ustaw "Powiększenie ekspozycji" na żądany docelowy rozmiar piksela. Jeśli nie jest to znane, ustal to, dostosowując powiększenie do żądanego pola widzenia, aby dopasować je do obszaru zainteresowania.
    2. Skopiuj parametry akwizycji obrazu (Ekspozycja) do wszystkich innych ustawień wstępnych o dużym powiększeniu (Śledzenie, Dryf, Ostrość, Pierścień Thona, Zero straty). Aby to zrobić, naciśnij Set, aby ustawić "Ekspozycja" na mikroskopie i Pobierz, aby uzyskać "Ustawienia ekspozycji" dla wszystkich innych dużych powiększeń po wybraniu ich indywidualnie.
      1. Dostosuj czasy ekspozycji, szczególnie dla opcji "Ostrość" i "Śledzenie", aby uzyskać odpowiednią liczbę zliczeń, biorąc również pod uwagę grubość pod kątem 60°, czyli zarówno pod kątem 0°, jak i 60°, aby wystarczająca liczba elektronów przeszła przez próbkę, aby zapewnić silny sygnał do korelacji krzyżowej.
        UWAGA: Szacunkowo dobrym pierwszym pomiarem są czasy ekspozycji dla "Śledzenia" i "Ostrości" równe ustawieniu "Ekspozycja". Przykład obliczenia dawki dla ustawienia wstępnego "Ekspozycja" znajduje się w Rysunek 3. Ustaw obliczony czas ekspozycji dla ustawienia wstępnego "Ekspozycja" w zakładce "Przygotowanie".
    3. Dostosuj "Zero Loss Preset", aby użyć jaśniejszego i większego rozmiaru plamki (większy rozmiar plamki odpowiada mniejszej liczbie), ponieważ wymaga to większej dawki.
      UWAGA: To ustawienie wstępne najlepiej nadaje się do wyrównania szczeliny filtra energii, jeśli jest on zainstalowany w mikroskopie.
  3. Wykonaj zbieranie atlasu, wykonując poniższe czynności.
    1. Aby odebrać atlas, kliknij Nowa sesja w zakładce "Atlas", ustaw preferencje sesji, wprowadź ścieżkę zapisu i format wyjściowy, a następnie naciśnij Zastosuj. Wybierz Screening (Rysunek 4), a następnie zaznacz wszystkie atlasy, które chcesz pozyskać. Wybierz Zamknij zawory Col, aby pozostawić mikroskop bez nadzoru; Spowoduje to zamknięcie zaworów kolumnowych po zebraniu wszystkich wybranych atlasów. Aby rozpocząć projekcję, naciśnij przycisk Start.
    2. Sprawdź pojedynczy lub wiele atlasów pod kątem celów, klikając siatkę w lewym panelu w sekcji "Screening" (Rysunek 4), a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij myszą, aby poruszać się i przewijać środkiem, aby powiększać i pomniejszać. Wybierz siatkę do konfiguracji docelowej, wybierz ją i kliknij Załaduj próbkę z wnętrza oprogramowania.
    3. W przypadku kalibracji przesunięcia obrazu kontynuuj korzystanie z karty rastrowania atlasu, aby nawigować po załadowanej siatce. Znajdź możliwą do zidentyfikowania cechę, która będzie rozpoznawalna przy wszystkich ustawieniach powiększenia, np. kryształ lodu nakładający się na krawędź otworu lub inną rozpoznawalną cechę (Rysunek 5). Przejdź do tego kwadratu, klikając prawym przyciskiem myszy, a następnie "Przenieś scenę do kwadratu siatki".
      UWAGA: Stolik musi znajdować się na wysokości eucentrycznej, aby prawidłowo przeprowadzić kalibrację przesunięcia obrazu.
  4. Wykonaj kalibrację przesunięcia obrazu.
    1. W zakładce "Auto Functions" (Rysunek 6) ustaw ustawienie wstępne na "Wysokość eucentryczna", przejdź do "Auto-Eucentric by Stage Tilt" i naciśnij Start. Monitoruj okno stanu, aby upewnić się, że znalezienie wysokości eucentrycznej zakończyło się sukcesem i miej oko na dodatnie i ujemne obrazy pochylenia; Muszą one ze sobą korelować.
      UWAGA: Od wersji 5.8 oprogramowania Tomo kryterium akceptacji wysokości eucentrycznej może być modyfikowane; Wartość domyślna to 0,25 μm, a ustawienie jej na 0,5-0,8 μm daje większą swobodę. Wartości zależą od wydajności mikroskopu, ale zaleca się, aby były jak najmniejsze.
      1. Gdy znajduje się na wysokości eucentrycznej i jest ostra, wyśrodkuj stół montażowy na elemencie. Zbierz podgląd, korzystając z ustawienia wstępnego "Atlas". Ustaw wszystkie "Ustawienia wstępne" z zakładki "Przygotowanie". Następnie zwiększ powiększenie do pozycji Przegląd > funkcji środkowej > Podglądzie, a następnie powtórz "Wyszukaj powiększenie", a na końcu "Powiększenie ekspozycji".
    2. Jeśli funkcja pozostała wyśrodkowana podczas ustawiania ostrości, pomiń kalibrację przesunięcia obrazu. W przeciwnym razie, aby skalibrować przesunięcie obrazu, przejdź do zakładki "Przygotowanie", wybierz opcję Kalibruj przesunięcie obrazu i naciśnij Start (Rysunek 5). Spowoduje to iteracyjne wyrównanie mniejszych powiększeń do cechy wyśrodkowanej przy powiększeniu ekspozycji.
      UWAGA: Jeśli początkowe ustawienie wstępne "Ekspozycja" nie jest wyśrodkowane na tym etapie, do ponownego wyśrodkowania oprogramowanie użyje przesunięcia stage tylko na tym etapie.
      1. Naciśnij Kontynuuj, aby ustawić "Ekspozycja". Następnym pokazanym obrazem będzie "Ustawienie wstępne wyszukiwania". Aby skalibrować przesunięcie obrazu między ustawieniami wstępnymi, kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy w podglądzie "Szukaj" do miejsca, w którym znajduje się środek podglądu "Ekspozycja", a następnie naciśnij Ponownie uzyskaj (Rysunek 5). Kliknij Kontynuuj, aby przejść do następnej pary ustawień wstępnych.
        UWAGA: Jeśli podczas tej kalibracji zastosowano przesunięcie obrazu w powiększeniu atlasu, należy upewnić się, że atlas został ponownie uzyskany po zakończeniu kalibracji przesunięcia obrazu. Wybierz żądany atlas i naciśnij Resetuj wybrane w górnym panelu w zakładce "Atlas". Potwierdź i zacznij ponownie zdobywać ten atlas.
  5. Wykonaj konfigurację tomografii.
    1. Utwórz konfigurację zbierania danych tomografii w zakładce "Tomografia".
      UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, konfiguracja odbywa się w całości w zakładce "Tomografia".
    2. Rozpocznij nową sesję. W sekcji "Ustawienia sesji" dla próbek biologicznych wybierz Slab-like jako typ próbki i wybierz Batch i Low Dose, wybierz format wyjściowy i folder przechowywania, opcjonalnie dodaj odbiorcę wiadomości e-mail, a następnie naciśnij Apply.
      UWAGA: Pozycja menu "Pozycje wsadowe" staje się teraz dostępna (Rysunek 7A). Aktualnie załadowany atlas zostanie automatycznie zaimportowany. "Przegląd" i "Wyszukiwanie obrazów" można pobierać i przeglądać ponownie, aż do uzyskania nowego obrazu. Dodatkowo, od wersji 5.8, mapy wyszukiwania o wymiarach 3 x 3, 4 x 4 i 5 x 5 można zdobyć za pomocą opcji "Zdobądź mapę wyszukiwania", aby ułatwić znajdowanie i konfigurowanie celów. Odpowiadają one wersji montaży ze średnim powiększeniem.
    3. Aby ustawić cele, przejdź do "Strzałki Atlasu", znajdź interesujący Cię region i przejdź tam, wybierając opcje, które pojawiają się po kliknięciu prawym przyciskiem myszy. Zrób zdjęcie poglądowe, aby potwierdzić dobrą pozycję do eucentrycznej regulacji wysokości, a następnie naciśnij Auto Eucentryczny; Spowoduje to uruchomienie procedury Eucentric by Stage Tilt. Następnie ponownie uzyskaj nowy obraz przeglądu, aby zaktualizować wysokość eucentryczną.
      UWAGA: Przycisk "Auto Focus" nie powinien być potrzebny, jeśli pozycja znajduje się na wysokości eucentrycznej. Jeśli obraz wysokości eucentrycznej wydaje się znacznie nieostry, prawdopodobnie wysokość eucentryczna jest nieprawidłowa i musi zostać przerobiona (informacje na temat rozwiązywania problemów z wysokością eucentryczną można znaleźć w sekcji dyskusji).
    4. Sprawdź cel za pomocą ustawienia "Przegląd" przed ustawieniem pierwszej pozycji; wybierz ustawienie "Przegląd" i przechyl stolik do ±60°, aby sprawdzić, w jakiej odległości od pasków siatki można ustawić pozycje (Rysunek 8). Zrób to, wprowadzając żądaną wartość kąta nachylenia w oknie "Ustaw pochylenie" (Rysunek 8A).
    5. Sprawdź kwadrat "Przegląd" lub uzyskaną "Mapę wyszukiwania", przejdź do interesującego Cię regionu i naciśnij Zdobądź wyszukiwanie. Sprawdź obraz "Szukaj". Jeśli obszar zainteresowania nie jest wyśrodkowany, kliknij prawym przyciskiem myszy w żądanym miejscu, a następnie powtórz polecenie Przenieś etap tutaj i Uzyskaj obraz. Ustaw Tilt (°) na 0.00 (lub dowolny inny kąt początkowy, który stage może obsłużyć), aby zdefiniować kąt początkowy tomogramu.
      1. Dla pierwszego tomogramu wprowadź nazwę żądanej konwencji nazewnictwa tomogramu i Defocus, aby ustawić żądaną wartość rozmycia dla każdego tomogramu.
      2. Opcjonalnie, począwszy od wersji 5.8 Tomo, wartości rozmycia mogą być systematycznie zmieniane za jednym razem; w tym celu kliknij Wybierz pozycje, wybierz pozycje do zmiany lub zaznacz znacznik wyboru, aby wybrać wszystkie pozycje, a następnie kliknij Aktualizuj rozmycie i dostosuj parametry (Rysunek 7A).
    6. Dostosuj obszar "Ostrość" i "Śledzenie" (Rysunek 2C). Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby przeciągnąć obszary śledzenia i ostrości (żółte i niebieskie kółka). Upewnij się, że obszar śledzenia/ostrości znajduje się (głównie) na węglu lub innej odpowiedniej funkcji śledzenia, tj. funkcji podobnej do obszaru zainteresowania; Unikaj pęknięć, zanieczyszczenia lodem, zbyt grubych obszarów i pustych otworów.
      1. Wybierając ślepy węgiel bez wielu funkcji śledzenia, upewnij się, że obszar zaczyna się palić w połowie tomogramu, wybierając wystarczająco wysoką dawkę do skupienia i śledzenia, aby powoli spalać próbkę przy większych nachyleniach. Może to być korzystne dla utrzymania dokładności śledzenia. Upewnij się, że obszar śledzenia/ostrości nie odsłania późniejszego obszaru akwizycji.
        UWAGA: Uważaj na to, co jest blisko i co wejdzie w wiązkę. Unikaj obszarów z obiektami, które będą kolidować ze śledzeniem i/lub ekspozycją, w tym paskami siatki.
    7. Naciśnij Dodaj pozycję po ustawieniu wszystkich parametrów i zdefiniowaniu żądanego obszaru zainteresowania oraz "Ostrość" i "Śledzenie". Powtórz te czynności dla nowych celów.
      UWAGA: Aby sprawdzić, czy wysokość eucentryczna jest prawidłowo skalibrowana dla ustawionych pozycji partii, dostępnych jest kilka strategii. Zaleca się wybór jednego z nich w zależności od rodzaju wykonywanej sesji tomografii (molekularna, komórkowa, blaszkowa).
    8. W przypadku tomografii molekularnej, zakładając, że siatki są dość płaskie, a wysokość eucentryczna została wykonana w środku każdego kwadratu zawierającego pozycje docelowe, pomiń procedurę "Uściślij wszystko" (lub Uściślij wybrane, jeśli wybrano pozycje, Rysunek 7A). Jeśli Tomo ma problemy z procedurą automatycznego przechylania sceny przez eucentryczność, prawdopodobnie kliknij Pomiń eucentryczny.
      1. W przypadku próbek komórkowych lub lamelowych każda pozycja partii może znajdować się na innej wysokości z. Użyj opcji "Uściślij wszystko", aby zachować ostrożność, lub nie zaznaczaj opcji "Pomiń eucentryczny".
        UWAGA: "Uściślij wszystko" spowoduje iterację wszystkich tomogramów, które zostały ustawione lub wybrane za pomocą opcji "Wybierz pozycje"; Dostosuj wysokość eucentryczną i wykonaj śledzenie i ostrość przed pozyskaniem danych. Ta procedura może ujawnić wszelkie nakładające się ekspozycje z następnego obszaru ostrości/śledzenia tomogramu (Rysunek 7B), które należy rozważyć przed kontynuowaniem.
      2. Sprawdź i ponownie odwiedź kwadraty, które nie zostały doprecyzowane. Prawym przyciskiem myszy kliknij pozycję, która się nie powiodła, aby wyświetlić opcje. Jeśli wysokość eucentryczna nie powiedzie się, znajdź "Auto-eucentryczny przez pochylenie sceny" (krok 1.4.1.), uzyskaj nowy obraz "Szukaj", aby zaktualizować wysokość z i "Dodaj pozycję". Usuń pozycję, która zakończyła się niepowodzeniem/poprzednio zainicjowana. Kliknij opcję Pomiń eucentryczność, która została wykonana za pomocą opcji "Uściślij wszystko".
        UWAGA: Jeśli opcja "Uściślij wszystko" nie jest uruchomiona, nie wolno zaznaczać opcji "Pomiń eucentryczne". Tomo5 przeprowadzi eucentryczne udoskonalenie przed każdym tomogramem; W ten sposób pozycje, które nie przejdą eucentrycznego udoskonalenia, zostaną pominięte.
  6. Wykonaj funkcje automatyczne, wykonując poniższe czynności.
    1. Sprawdź ustawienia, aby wykonać wyrównanie za pomocą zakładki "Funkcje automatyczne", przechodząc w atlasie do obszaru węgla. Ustaw ten obszar na wysokości eucentrycznej i postępuj zgodnie z kolejnością wyrównań, jak podano poniżej.
      1. Uruchom auto-eucentryczność przez pochylenie stolika z ustawieniem "Wysokość eucentryczna".
      2. Uruchom procedurę autofokusa z ustawieniem wstępnym "Ostrość".
      3. Uruchom procedurę Autostigmate z ustawieniem wstępnym "Thon Ring".
      4. Uruchom procedurę Autocoma z ustawieniem wstępnym "Thon Ring".
      5. Wstaw żądaną aperturę obiektywu (Rysunek 6B), prawdopodobnie aperturę 100 μm, jako dobry kompromis dla zwiększonego kontrastu próbki i tylko małego odcięcia sygnału w bardzo wysokiej rozdzielczości.
      6. Powtórz procedurę Autostigmate po wprowadzeniu przysłony.
        UWAGA: Przy powiększeniach o rozmiarach pikseli około 3 A i niższych rozdzielczościach procedura Autocoma może zakończyć się niepowodzeniem; w takim przypadku sprawdź i wyrównaj Centrum obrotu Tomo w obszarze Bezpośrednie wyrównanie w interfejsie użytkownika TEM.
    2. Sprawdź, czy procedura automatycznego centrowania Zero-Loss działa na Twojej próbce. Przy ustawieniu "Zero strat" na rozsądnie wysoką dawkę (krok 1.2.3) procedura w funkcjach automatycznych z większym prawdopodobieństwem zakończy się sukcesem.
  7. Przeprowadzanie zbierania danych.
    1. Aby rozpocząć automatyczną akwizycję w zakładce "Tomografia", wybierz panel Akwizycji danych i ustaw żądane parametry (Rysunek 7C). Ustaw parametry akwizycji danych: Krok pochylenia (°), Maksymalny kąt dodatni (°), Maksymalny kąt ujemny (°), schemat śledzenia (zalecane: wybierz Śledź/Ostrość przed akwizycją). Wybierz Zamknij zawory kolumnowe dla eucentrycznego schematu wysokości.
      UWAGA: Rzadko używane parametry to "Dostosuj czas ekspozycji", "Dostosuj ZLP", "Użyj płytki fazy" i "Pauza po pochyleniu".
      1. Użyj opcji Dostosuj czas ekspozycji dla tomogramów, które nie są przeznaczone dla STA, aby wydłużyć czas ekspozycji przy określonym stosunku przy większych nachyleniach.
      2. Opcja Dostosuj ZLP uruchomi udoskonalenie ZLP po każdym tomogramie, bez względu na ustawioną okresowość. Jest powolny, czasami zawodzi bez oczywistych przyczyn i pomija zdobycie tej pozycji. Może być jednak przydatny w przypadku bardzo wąskich szczelin, tj. 3-5 eV na filtrze Selectris(X).
      3. Użyj płytki fazowej jest rzadko używany od czasu wprowadzenia DEDów z filtrami energii.
      4. Pause After Tilt wstrzymuje akwizycję, ale nie zezwala na żadne zmiany w oprogramowaniu.
    2. Dokładnie sprawdź parametry zbierania danych (w zakładce "Przygotowanie"), zaakceptuj obliczenie dawki i żądany schemat nachylenia, określ liczbę frakcji (Nr.) w ustawieniu "Ekspozycja", a następnie rozpocznij akwizycję.
      UWAGA: Liczba frakcji zależy od próbki, parametrów akwizycji i planowanych etapów przetwarzania końcowego, tj. STA a analiza morfologiczna, i musi być utrzymywana na poziomie, w którym korekcja ruchu i estymacja CTF dają wystarczający sygnał. Zakres 4-10 frakcji jest dobrym oszacowaniem, gdzie 4 jest bardziej odpowiednie dla grubszych próbek, a 10 dla cieńszych próbek molekularnych.
      1. Następnie kliknij Start, aby rozpocząć zbieranie danych i monitorować pierwsze pobranie tomogramu, aby upewnić się, że tomogramy zostały pobrane zgodnie z przeznaczeniem.
        UWAGA: Najnowsze wersje oprogramowania do tomografii mają dodatkową płytę odtwarzacza filmów w zakładce "Tomografia", w której można oglądać uzyskane tomogramy. Zachowaj cierpliwość podczas procesu ładowania.

2. Cryo-ET STA apoferrytyny przy użyciu emClarity

UWAGA: Tutaj oprogramowanie emClarity17 służy do zilustrowania wyznaczania struktury cryo-ET za pomocą STA. Rysunek 9 podsumowuje ten proces. Jako przykład przyjęto sześć serii nachylenia apoferrytyny (EMPIAR-10787). Zastosowano symetrię oktaedrylną, a ostateczna mapa miała rozdzielczość 2,86 A, uzyskaną z zaledwie 4800 cząstek i bliską częstotliwości Nyquista (2,68 A).

  1. Upewnij się, że pakiet oprogramowania emClarity 39 został pobrany i zainstalowany (patrz Spis materiałów). Zainstaluj IMOD dla oprogramowania processing40.
    UWAGA: Wymagana jest podstawowa znajomość poleceń systemu Linux. Bardziej szczegółowy samouczek można znaleźć w reference41, który jako przykład bierze zestaw danych rybosomów (EMPIAR-10304) i opisuje procedury krok po kroku. Dla różnych typów próbek białek dostępny jest również wcześniej opublikowany raport42.
  2. Przygotuj pliki wejściowe i katalogi.
    UWAGA: Surowe klatki zostały skorygowane ruchem przez MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (patrz Tabela materiałów). Obrazy z korekcją ruchu zostały ułożone w stos w celu wygenerowania serii pochylenia za pomocą newstack (IMOD) i ręcznie wyrównane ze śledzeniem łat za pomocą Etomo (patrz Tabela materiałów), a następnie emClarity. Aby uzyskać lepsze wyrównanie, zaleca się przeprowadzanie offsetów i kompensacji wychylenia w Etomo. Sześć serii przechyłów zostaje przemianowanych z TS1 na TS6. Poniżej znajdują się instrukcje i polecenia dla pierwszej serii przechyłu (TS1) jako przykład.
    1. Utwórz folder projektu.
      UWAGA: Najnowsza wersja oprogramowania to 1.5.3.11. Wszystkie powiązane dzienniki oprogramowania można znaleźć w lokalnym folderze projektu (.../logFile/emClarity.logfile).
    2. W folderze projektu utwórz kolejny nowy folder "fixedStacks" i przygotuj pliki wejściowe: TS1.fixed, TS1.xf i TS1.tlt.
      UWAGA: TS1.fixed: oryginalna seria pochyleń, znana również jako TS1.st w Etomo. TS1.xf: ten plik zawiera współrzędne transformacji po Etomo tiltalign. TS1.tlt: ten plik zawiera kąty nachylenia.
  3. Oszacuj rozmycie, wykonując poniższe czynności.
    1. Oblicz rozmycie. Zaktualizuj plik parametrów z mikroskopem i parametrami obrazowania zgodnie z tabelą uzupełniającą 1. Skopiuj plik parametrów do folderu projektu, zmień jego nazwę na param_ctf.m i uruchom: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.
      UWAGA: Szablon pliku parametrów można znaleźć w pliku uzupełniającym 1 lub w lokalnym katalogu instalacyjnym oprogramowania (.../emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/).
  4. Sprawdź wyniki szacowania CTF dla każdego stosu.
    1. Sprawdź wyrównane stosy (na przykład aliStacks/TS1_ali1.fixed) za pomocą 3dmod i upewnij się, że koraliki referencyjne zostały poprawnie usunięte.
    2. Upewnij się, że plik dziennika informuje, że ręczność jest poprawna, co można znaleźć w pliku logfile/emClarity.logfile (Rysunek 9).
    3. Sprawdź wartość rozmycia (na przykład fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) i upewnij się, że jest zgodna z teoretycznym oszacowaniem CTF.
  5. Zdefiniuj podregiony.
    1. Wygeneruj tomogram z pojemnikami. W folderze projektu uruchom: sh recScript2.sh -1.
      UWAGA: Mniejszy (rozmiar) tomogram dla każdego stosu będzie przechowywany w nowym folderze "bin10". Aby przyspieszyć ten proces, współrzędne jednego lub kilku podregionów można zdefiniować w tomogramie bin10. Plik skryptu będzie znajdował się w lokalnym katalogu instalacyjnym oprogramowania (.../emClarity_1.5.3.11/docs/).
    2. Określ granice, wybierając sześć punktów: xmin, xmax, ymin, ymax, zmin i zmax, aby utworzyć jeden podregion. W folderze "bin10" uruchom: 3dmod TS1_bin10.rec.
      UWAGA: Jeśli w jednej serii pochylenia mają zostać utworzone cztery podregiony, wybierz 6 × 4 = 24 punkty. Każdy stos musi mieć jeden plik modelu (*.mod) w folderze "bin10".
    3. Przekonwertuj pliki modelu na format emClarity. Spowoduje to utworzenie nowego zwiadu folderów. Przechowuj wszystkie współrzędne każdego podregionu w tym folderze. W folderze projektu uruchom: sh recScript2.sh TS1.
  6. Zbieraj cząstki.
    1. Znajdź szablon apoferrytyny do wybierania cząstek. Pobierz szablon z Banku Danych Mikroskopii Elektronowej (EMD-10101)44. Upewnij się, że rozmiar szablonu w pikselach jest zgodny z rozmiarem nieprzetworzonych danych. W folderze projektu uruchom: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu.
    2. Generowanie tomogramów z korekcją CTF do zbierania cząstek. W folderze projektu uruchom: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch.
    3. Uruchom zbieranie cząstek dla każdego podregionu. W przypadku zestawu danych apoferrytyny przeprowadź wyszukiwanie w szablonie w koszu bin6. Zmodyfikuj parametry Tmp_angleSearch (θna zewnątrz, Δna zewnątrz, θna wejściu, Δna w.), aby określić zakres kątów i interwały wyszukiwania w płaszczyźnie lub poza płaszczyzną w stopniach. W folderze projektu uruchom: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      UWAGA: W tym kroku zostanie wygenerowany folder "convmap_wedge_Type2_bin6". Plik csv znajdujący się w tym folderze (na przykład TS1_1_bin6.csv) zawiera wszystkie informacje o pobranych cząstkach.
    4. Usuń niewłaściwe cząsteczki za pomocą 3dmod. W folderze "convmap_wedge_Type2_bin6" uruchom: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.
      UWAGA: W tych obszarach często można znaleźć niewłaściwe cząstki obok krawędzi węgla lub zanieczyszczeń lodem. Kliknij prawym przyciskiem myszy niewłaściwe punkty i naciśnij Backspace na klawiaturze, aby je usunąć. W tym kroku upewnij się, że większość punktów fałszywie dodatnich została usunięta (Rysunek 10).
    5. Zmień nazwę folderu "convmap_wedge_Type2_bin6" na "convmap", ponieważ emClarity znajdzie informacje o podregionie w convmap w poniższych krokach.
  7. Zainicjuj projekt. W folderze projektu uruchom: emClarity init param0.m, aby utworzyć bazę danych dla emClarity, ApoF.mat.
  8. Wykonaj rekonstrukcję tomogramów przed STA i wyrównaniem. Aby wygenerować tomogramy podregionów skorygowane przez CTF w bin4, uruchom: emClarity ctf 3d param0.m.
    UWAGA: Tomogramy z korektą CTF (na przykład cache/TS1_1_bin4.rec) zostaną wygenerowane w nowym folderze "cache".
  9. Wykonaj STA i wyrównanie.
    1. Przeprowadzić uśrednianie przy użyciu podtomogramów skorygowanych o CTF, zaczynając od bin4. W folderze projektu uruchom: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment.
    2. Kontynuuj wyrównywanie i uruchom: emClarity alignRaw param0.m 0.
      UWAGA: Krok uśredniania generuje odniesienie, które zostanie użyte przez emClarity w tym kroku do wyrównania cząstek. Parametry Raw_angleSearch (θwyjście, Δwyjście, θwejście, Δwejście) można zmienić, aby ustawić zakres kątów i rozmiary kroków dla każdego cyklu. Ponieważ większość nieprawidłowych cząstek jest usuwana z bazy danych (Krok 2.6.4), te ustawienia kątowe dla wyrównania mogą zaczynać się od stosunkowo niewielkiego stopnia.
    3. Zaktualizuj parametry Raw_angleSearch i uruchom kilka dodatkowych cykli (kroki 2.9.1 i 2.9.2). Aby przyspieszyć ten proces, należy oddzielnie wykonywać wyrównanie w płaszczyźnie i poza płaszczyzną.
      UWAGA: Dla każdego binningu zaleca się uruchomienie wielu cykli i stopniowe zmniejszanie ustawień kątowych. W przypadku zbioru danych ApoF przeprowadzono pięć dodatkowych cykli w pojemniku 4, a dalsze szczegóły są dostępne w tabeli uzupełniającej 2. W przypadku cycle001 w folderze projektu uruchom polecenie: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, a następnie emClarity alignRaw param1.m 1.
    4. Oczyść nakładające się na siebie cząstki. W folderze projektu uruchom: emClarity removeDuplicates param5.m 5.
  10. Wykonaj uszlachetnianie serii Tilt za pomocą tomoCPR.
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.
    1. Uruchom tomoCPR, aby udoskonalić geometrię stosu. W folderze projektu uruchom: emClarity tomoCPR param5.m 5.
    2. Wygeneruj nowo wyrównane stosy i zaktualizuj pliki geometrii. W folderze projektu uruchom: emClarity ctf update param6.m.
      UWAGA: Upewnij się, że nowe pliki geometrii (na przykład fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) i nowo wyrównane stosy (na przykład aliStacks/TS1_ali2.fixed) są poprawnie wygenerowane.
    3. Utwórz nowe podtomogramy w bin2. W folderze projektu uruchom: emClarity ctf 3d param6.m.
      UWAGA: Po tym nastąpi kilka cykli uśredniania i wyrównania w pojemniku 2 (kroki 2.9.1, 2.9.2 i 2.9.3), zduplikowanego czyszczenia (krok 2.9.4) i opcjonalnie tomoCPR (krok 2.10). Ze względu na wysoką symetrię, kolejne pięć cykli w bin2 przeprowadzono dla apoferrytyny. Zaktualizuj parametry Raw_angleSearch dla każdego cyklu.
  11. Wykonaj ostateczną rekonstrukcję.
    1. Kontynuuj wykonywanie kilku cykli w pojemniku 1 i tomoCPR (krok 2.9 i krok 2.10). Kolejne 10 cykli w bin1 przeprowadzono dla zestawu danych apoferrytyny. Więcej szczegółów dotyczących poleceń i parametrów można znaleźć w Tabeli 2.
    2. Wykonaj ostateczną rekonstrukcję, łącząc dwie połówki zestawów danych. W folderze projektu uruchom polecenie: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, a następnie emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.
      UWAGA: Zostanie wygenerowana końcowa mapa (na przykład ze współczynnikiem B równym 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) Rysunek 11.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku próbek komórkowych i blaszkowych, strategia zbierania danych w dużej mierze zależy od próbki i celu badania obrazowego (Rysunek 1). Podejście do celowania zależy od tego, czy cel molekularny jest in situ, czy przygotowany z oczyszczonego kompleksu makromolekularnego do rekonstrukcji próbek o wysokiej rozdzielczości zawierających cele molekularne. W przypadku oczyszczonych kompleksów zeszklonych na dziurawych (węglowych) siatkach, celowanie może po prostu opierać się na obrazowaniu w otworach (węglowej) folii nośnej. W przypadku prac in situ podejście celujące wymaga wiedzy na temat lokalizacji jednostki molekularnej w oparciu o dane korelacyjne lub znane punkty orientacyjne o małym powiększeniu komórek. Punkty orientacyjne sieci komórkowej byłyby w idealnym przypadku identyfikowalne podczas robienia zdjęć przeglądowych i, jeśli są wystarczające do przybliżonej lokalizacji obszarów zainteresowania, mogą zapewnić szybki sposób potwierdzenia tożsamości celu za pomocą wyszukiwanego obrazu. Jeśli jednak obserwowalne zdarzenia są rzadkie, obrazy wyszukiwania w średnim powiększeniu mogą być potrzebne do zakwalifikowania celu jako poprawnego. Mapy wyszukiwania są montażami obrazów wyszukiwania w średnim powiększeniu, a tym samym mogą znacznie ułatwić znalezienie celu, gdzie można go uzyskać w powiększeniu, w którym widoczna jest interesująca nas cecha. Mapy wyszukiwania mogą być następnie przeglądane w celu znalezienia i ustawienia docelowych pozycji partii. W przypadku próbek zawierających cechy komórkowe do rekonstrukcji ultrastrukturalnej podejście do celowania jest podobne, choć w równym stopniu zależy od widoczności zdarzenia komórkowego przy różnych powiększeniach i jego rozpowszechnienia w próbce.

Strategia pozyskiwania danych musi być również brana pod uwagę; we wszystkich przypadkach cel badania w dużej mierze determinuje sposób zbierania danych. Do rekonstrukcji ultrastruktury komórkowej odpowiednie może być małe powiększenie (20-5 A/px) i duże pole widzenia, ale do rekonstrukcji szczegółów molekularnych lub szczegółów o wysokiej rozdzielczości wymagane są duże powiększenia (5-1 A/px). Zbiór danych zebrany z prędkością 1,5 A/px w idealnych warunkach będzie w stanie fizycznie wytworzyć rekonstrukcję z częstotliwością Nyquista wynoszącą 3,0 A/px; Jednak w rzeczywistości na jakość uzyskanej rekonstrukcji wpływa wiele czynników, w tym między innymi grubość, wielkość i niejednorodność próbki. Dokładne parametry obrazowania równoważą również powiększenie w oparciu o cel badania z polem widzenia, aby pomieścić wystarczającą ilość informacji. W tym artykule przedstawiono przypadek uśrednienia subtomogramu sięgający 2,86 A, ale dodatkowe badania17,42,43,44,45 przedstawiono w tabeli 1 w celu zilustrowania parametrów zbierania związanych z badaniami ukierunkowanymi na różne wyniki17,42,45,46.

Po ustaleniu przepływu pracy i systemu pozyskiwania danych dla cryo-ET, możliwe jest zbieranie danych z wielu różnych typów próbek. Przedstawiono tutaj reprezentatywne tomogramy różnych próbek: próbki molekularne, takie jak apoferrytyna (film 1), cienkie procesy komórkowe (film 2) i blaszki zmielone FIB grubej próbki komórkowej (film 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd konfiguracji przepływu pracy w tomografii. Przebieg obrazowania cryo-ET opisany w protokole jest pokazany jako schemat blokowy. Obrazy, które mają zostać uzyskane, są wyświetlane dla komórkowego i molekularnego przepływu pracy. Przedstawione nazewnictwo jest zgodne z konwencją Tomo5, chociaż większość programów do akwizycji tomografii ma wspólne zasady zbierania tych obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zakładka Przygotowanie i wyszukiwanie wstępnie ustawionych warunków. (A) Obraz ogólny całej zakładki. Ustawienia wstępne warunków obrazowania są ustawiane w tej zakładce, a "Kalibruj przesunięcie obrazu" i "Ustawienia filtra obrazu" można znaleźć w menu rozwijanym "Zadania". (B) Powiększenie listy rozwijanej "Ustawienia wstępne", gdzie można wybrać każde ustawienie wstępne dla indywidualnej konfiguracji warunków obrazowania. (C) Obraz przedstawiający odpowiednie powiększenie, aby dopasować zarówno ekspozycję, jak i obszar "Ostrość i śledzenie" do pola widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obliczanie dawki. Przykładowe obliczenia dawki dla możliwych schematów pozyskiwania tomogramu, w których szybkość dawki została zmierzona w próżni. Te dwa obliczenia określają czas naświetlania (s) dla każdego pochylenia, niezależnie od tego, czy celem jest optymalna dawka na pochylenie, czy optymalna dawka całkowita dla serii pełnego pochylenia. W przypadku uśredniania subtomogramu powszechną praktyką jest dążenie do optymalnej dawki na obraz pochylony w zakresie 3,0-3,5 e-/A 2. W obu przypadkach "Ułamki (Nr.)" są ustawione na 6, aby uzyskać ~0,5 e-/Å 2 dawki na klatkę filmu przechyłu, aby uzyskać wystarczający sygnał do przeprowadzenia korekcji ruchu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Zakładka Atlas. Obraz poglądowy zakładki "Atlas". Obraz został przycięty, aby uniknąć pustych miejsc w siatce. Menu "Zadania" zawiera preferencje ustawień sesji i miejsca wyboru siatki do indywidualnego wyboru wszystkich zinwentaryzowanych siatek oraz opcję pobrania pojedynczego atlasu po wyjęciu kasety z automatycznego ładowania. Wybrana siatka może zostać zresetowana, a następnie ponownie nabyta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Skalibrowane przesunięcia obrazu. Obraz przedstawia ekspozycję i wyszukiwany obraz. Czerwony krzyżyk na obrazie wyszukiwania to przesunięty znacznik w celu skorygowania przesunięcia między ekspozycją a wyszukiwaniem. Kalibrację przesunięcia obrazu należy ponowić na początku sesji lub po zmianie ustawień wstępnych warunków obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Automatyczne funkcje i przysłony. (A) Zakładka "Funkcje automatyczne" przedstawia menu rozwijane "Ustawienia wstępne" i wybór "Zadanie". Na niebiesko podkreślone jest ustawienie wstępne "Thon Ring" wymagane dla "Autostigmate" (również podkreślonego na niebiesko) i "Autocoma". Należy wybrać odpowiednie ustawienia wstępne dla każdego zadania, a następnie nacisnąć przycisk Start. (B) Otwory znajdują się w interfejsie użytkownika TEM. Wybierz żądaną "Przysłonę obiektywu" po wykonaniu funkcji automatycznych i uruchom "Autostygmatyzacja" z przysłoną w środku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przegląd zakładki Tomografia. Zdjęcia przedstawiają interfejs użytkownika Tomo 5.8. (A) Pozycje partii. Najnowsze funkcje przedstawione na obrazku: opcja "Pobierz mapę wyszukiwania"; Pozycje tomogramu są wyświetlane w widoku atlasu z opcją powiększania; podświetlona w prawym górnym rogu jest opcja "Wybierz pozycje"; poniżej wszystkie cztery pozycje zostały wybrane do parametrów "Aktualizuj rozmycie". (B) Na mapie wyszukiwania wybrane są trzy pozycje, oznaczone jako 1, 2 i 3. Pozycja 1 nie będzie stanowić problemu, gdy zostanie uruchomiona opcja "Uściślij wszystko". Jeśli jednak w ustawieniu o dużej gęstości docelowej, na przykład gdy wybrane są pozycje lameli, jak pokazano dla pozycji 2 i pozycji 3, wówczas "Uściślij wszystko" uruchomi procedurę "Śledzenie" i "Ostrość" w obszarze "Ekspozycja" pozycji 2, naświetlając cel przed uzyskaniem tomogramu. Typ siatki to R1.2/1.3. Podziałka liniowa = 1,2 μm. (C) Akwizycja danych. Wybrane pozycje ustawione w "Pozycjach wsadowych" można teraz zdobywać indywidualnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Definiowanie maksymalnego kąta nachylenia. Rysunek przedstawia krok po kroku podejście do określania maksymalnego zakresu nachylenia dla akwizycji tomogramu. (A) Podgląd 0° i mapa wyszukiwania na środku kwadratu siatki. Aby przetestować zakres nachylenia, kąt można ustawić w oprogramowaniu tomograficznym za pomocą opcji "Ustaw pochylenie (°)", wpisując żądaną wartość, a następnie naciskając Ustaw. (B) Stolik został przechylony do -60°, co pokazuje, że róg mapy wyszukiwania nie zostałby w pełni uchwycony pod kątem -60°. (C) Stolik został przechylony pod kątem 60°. Licząc otwory, które zniknęły pod kątem ±60°, można zorientować się w zakresie nachylenia kwadratu siatki. Podziałka = 2,5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: schemat blokowy emClarity. Schemat blokowy opisywał różne etapy uśredniania krio-subtomogramu. Podziałka liniowa = 50 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Dopasowywanie szablonów za pomocą emClarity. (A) Typowy mikrogram apoferrytyny na siatce pokrytej grafenem. Rozogniskowanie: −3,430 μm. (B) Wycinek tomogramu pokryty punktami modelu po wyszukaniu szablonu. (C) Widok rzutu górnego i (D) bocznego punktów modelu, wskazujący na pojedynczą płaską warstwę monorozproszonych cząstek apoferrytyny. Podziałka liniowa = 50 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Cryo-ET STA apoferrytyny. (A) Ostatnia mapa po 21 cyklach wyrównania pod tomogramem. (B) Wykres korelacji powłoki Fouriera (FSC) z końcowej mapy o zgłoszonej rozdzielczości 2,86 A, zawierający 38 stożków FSC. (C) Reprezentatywne mapy gęstości (wyposażone w model PDB 6s6147). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział pkt. Rozdział szt. ) Rozdział szt. ) szt. Rozdział okrążeń Rozdział
próbkaTyp Cryo-ETTΥ/pxZakres pochylenia (+/-)Stopień pochylenia (°)Zakres rozmycia (μm)Dawka całkowita (e-/TΥ2)rezolucjaNieprzetworzone daneodniesienie
ApoferrytynaOczyszczony/molekularny (STA)Klasa 1,346031,5 – 3,5Rozdział 102Z drugiej strony, 2,86EMPIAR-1078717 & ten artykuł
Knebel HIV-1Oczyszczony/molekularny (STA)Godzina 1,356031,5 – 3,961203.1EMPIAR-10164 (Przekaźnik EMPIAR-1016417
RybosomOczyszczony/molekularny (STA)2.16032,2 – 4,31207EMPIAR-10304 (Przekaźnik EMPIAR-1030442 Rozdział 42
Skok SARS-CoV-2Blaszka/molekularna (STA)Pytanie 2.1354 Rozdział 5432 – 712016EMPIAR-10753Rozdział 45
Struktura aksonu neuronuKomórkowy (ultrastrukturalny)Klasa 5,4660cyfra arabska3,5 – 590b.d.EMPIAR-10922Rozdział 47

Tabela 1: Parametry pobierania dla kilku badań krio-ET. Badania ukierunkowane na rekonstrukcję szczegółów molekularnych z białek oczyszczonych lub in situ w porównaniu z badaniem mającym na celu wyodrębnienie i segmentację ultrastrukturalnych cech komórkowych.

Film 1: Tomogram próbek apoferrytyny na normalnej siatce EM, a następnie zobrazowany za pomocą krio-TEM wyposażonego w kamerę o ultrawysokiej rozdzielczości z kompatybilnym filtrem. Serie Tilt zostały nabyte w schemacie symetrycznym dawki, z zakresem pochylenia 54° i całkowitą dawką 134 e-/A2 w oprogramowaniu do tomografii elektronowej. Podziałka = 50 nm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Tomogram pierwotnego neuronu wyhodowany na siatce EM, a następnie bezpośrednio zobrazowany za pomocą krio-TEM wyposażonego w kamerę o ultra-wysokiej rozdzielczości z kompatybilnym filtrem. Serie wychyleń zostały pozyskane w schemacie symetrycznym dawki, z zakresem pochylenia 60° i całkowitą dawką 120 e-/A2 w oprogramowaniu do tomografii elektronowej. Podziałka = 100 nm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 3: Tomogram cyjanobakterii na siatce EM, poddany mieleniu FIB, a następnie zobrazowany za pomocą krio-TEM wyposażonego w szybką kamerę i kompatybilny filtr. Serie wychylenia zostały nabyte w schemacie symetrycznym dawki, z zakresem pochylenia 50° i całkowitą dawką 120 e-/A2 w oprogramowaniu do tomografii elektronowej. Podziałka liniowa = 87,2 nm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Szablon pliku parametrów do szacowania rozmycia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Szczegóły dotyczące zbierania danych i konfiguracji mikroskopu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Lista poleceń w kolejności wykonywania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomo5 powiedział:
Opis przepływu pracy oprogramowania do tomografii podkreśla jeden potencjalny i najbardziej usprawniony sposób konfiguracji (zdalnej) sesji tomografii wsadowej. Chociaż oprogramowanie jest łatwe dla początkujących, początkowe doświadczenie w krio-EM i podstawowa wiedza na temat tomografii mogą pomóc w konfiguracji. Krytyczne kroki są wyróżnione w protokole i powinny pomóc w rozwiązywaniu problemów, nawet jeśli zastosowano inne podejście do konfiguracji. Postęp w oprogramowaniu ułatwi (zdalne) gromadzenie danych i sprawi, że cryo-ET będzie bardziej dostępny dla szerokiej bazy użytkowników. Poniżej opisano kilka porad i wskazówek, które mogą pomóc w rozwiązywaniu często spotykanych problemów.

Ważną kwestią do omówienia jest wybór siatek, ponieważ podczas przechylania próbki do ±60°, pręty siatki przy dużych nachyleniach mogą zasłaniać widok (Rysunek 8). W siatce TEM rozmiar siatki odnosi się do liczby kwadratów siatki na jednostkę długości siatki. Większe numery siatek mają więcej kwadratów siatki na jednostkę długości, większą gęstość kwadratów siatki i mniejsze kwadraty siatki, tj. siatka 400 siatek ma mniejsze kwadraty niż siatka 200 oczek. Dobrym wyborem siatek do tomografii są siatki 200 lub 300 siatek. Jak pokazano na rysunku 8, dostępny obszar do zebrania zmniejsza się wraz z nachyleniem siatki. Przy nachyleniu ±60° siatka o oczkach 300 będzie miała małe pole widzenia, na którym będzie można uzyskać pełny tomogram. Zaletą siatek o siatce 200 jest to, że większe kwadraty siatki przyspieszają konfigurację tomografii molekularnej, a przy zwiększonej powierzchni siatki kwadratowej jeden kwadrat prawdopodobnie wystarczy na nocną kolekcję. Wadą jest to, że siatki o oczkach 200 są bardziej delikatne, więc obsługa i przycinanie wymagają większej finezji.

Ponadto, w przypadku stosowania dziurawej folii nośnej (patrz tabela materiałów) na siatkach EM, odstępy między otworami muszą być brane pod uwagę przy ustawianiu obszaru ostrości i śledzenia w stosunku do obszaru ekspozycji. Idealnie, średnica wiązki przy pożądanym powiększeniu powinna być wystarczająco mała, aby pokryć obszar węglowy przylegający do obszaru ekspozycji wzdłuż osi nachylenia w celu optymalnego i szybkiego ustawienia. W ten sposób można uzyskać potencjalne obszary zainteresowania w każdym otworze.

Ponieważ eucentryczna procedura wysokości oprogramowania nie jest obecnie tak solidna, jak procedura serialEM, poniższe wskazówki mogą obejść ten problem. Jeśli określenie wysokości eucentrycznej nie powiedzie się przy użyciu ustawienia wysokości eucentrycznej, można zamiast tego użyć ustawienia wstępnego przeglądu i ponownie uruchomić "Auto-eucentryczne przez pochylenie stolika"; Może to rozwiązać problemy, jeśli wysokość eucentryczna jest daleko od 0. Jeśli to się powiedzie, można ponownie uruchomić "Auto-eucentryczny przez pochylenie sceny" z ustawieniami wstępnymi "Eucentryczna wysokość", aby poprawić precyzję. Jeśli to się nie powiedzie, można uruchomić "Auto-Eucentryczny przez pochylenie wiązki" z ustawioną wysokością eucentryczną, a następnie ponownie uruchomić "Auto-eucentryczny przez pochylenie sceny" lub ręcznie ustawić wysokość z skonsolidowaną przez "Auto-eucentryczną przez pochylenie wiązki" w interfejsie użytkownika TEM w ustawieniach "Stół montażowy". W przypadku stosowania siatek z powtarzającym się wzorem otworów, mogą one uniemożliwić identyfikację pojedynczego piku korelacji krzyżowej. Można spróbować zmienić ustawienie wysokości eucentrycznej na mniejsze przesunięcie rozmycia, takie jak −25 μm i/lub krótszy czas ekspozycji, aby zmniejszyć korelację krzyżową z układów otworów. Z drugiej strony, użycie siatek koronkowych/lameli może nie dostarczyć wystarczającego sygnału do silnego piku korelacji krzyżowej. Można spróbować zmienić ustawienie wysokości eucentrycznej na większe przesunięcie rozmycia, takie jak −75 μm i/lub wydłużony czas ekspozycji, aby zwiększyć pik korelacji krzyżowej. Inną opcją jest dostosowanie ustawień filtra obrazu; znajdziesz je w zakładce "Przygotowanie". Opcje dostosowywania ustawień filtra można ustawić dla niskiego (Przegląd/Kwadrat siatki), średniego (Wysokość eucentryczna) i dużego powiększenia (Śledzenie/Ostrość), aby znaleźć optymalny szczyt korelacji krzyżowej dla każdego ustawienia wstępnego. Wymagane dane wejściowe to jeden obraz, tj. pod kątem 0° i jeden pod kątem 5°, a następnie kliknięcie przycisku Porównaj , aby porównać oba obrazy. Zalecana wartość początkowa dla najdłuższej długości fali to jedna czwarta podziałki liniowej na obrazie, a dla najkrótszej długości fali to jedna czterdziesta skali paska. Jeśli szczyt nie zostanie solidnie zidentyfikowany, można zoptymalizować ustawienia, aż do znalezienia przekonującego szczytu. Nie ma potrzeby ponownego pozyskiwania obrazów za każdym razem; wystarczy nacisnąć "Porównaj". Jeśli TOMO nadal nie znajdzie automatycznie wysokości eucentrycznej, można użyć ręcznej kalibracji wysokości eucentrycznej. Należy wyśrodkować się na dość dużym kryszku lodu w powiększeniu ogólnym w zakładce "Przygotowanie", a następnie przejść do "Sterowania stolikiem" w interfejsie użytkownika TEM, ustawić alfę na -30° i dostosować wartość z stopnia, aby ponownie wyśrodkować kryształ za pomocą obrazu ekranu fluorescencyjnego. Wybranie ustawień "Wysoka rozdzielczość" i "Wysoki kontrast" w interfejsie użytkownika TEM sprawi, że będzie to proste (przyciski u dołu okna ekranu fluorescencyjnego). Opcjonalnie, jeśli istnieje dostęp do kamery z trybem na żywo, można to wykorzystać do określenia wysokości eucentrycznej; Będzie to łatwiejsze niż na ekranie fluorescencyjnym.

Największymi ograniczeniami w wersjach Tomo5 wcześniejszych niż 5.8 są brakujące montaże średniego powiększenia, brak symetrycznego schematu dawki oraz problemy związane z eucentrycznym znajdowaniem wysokości. Są one dostępne w serialEM, darmowym oprogramowaniu z szybkim rozwojem i wsparciem społeczności, solidną eucentryczną rutyną wysokości i opcją skryptu, tj. niestandardowym schematem symetrycznym dawki. Począwszy od wersji 5.8 w Tomo5, najczęściej spotykany problem ze znalezieniem wysokości eucentrycznej, tj. nieudane zapętlenie wokół docelowej wartości z, został rozwiązany poprzez wprowadzenie opcji ustawienia kryterium akceptacji wysokości eucentrycznej. Jednak przy różnych typach siatki i próbek zdecydowanie zaleca się dostosowanie ustawień filtra obrazu w celu odzwierciedlenia unikalnych warunków obrazowania poszczególnych sesji i uzyskania najlepszego możliwego piku korelacji krzyżowej w celu znalezienia wysokości eucentrycznej oraz aby obszar ostrości i śledzenia działał niezawodnie podczas akwizycji tomogramu.

Ogólnie rzecz biorąc, wiele obiektów szybko przystosowało się do pracy zdalnej podczas pandemii. Oprogramowanie Tomo5 zapewnia łatwy dostęp i przyjazną dla użytkownika drogę do tomografii, która doskonale nadaje się do zdalnej obsługi. Postępy poczynione w oprogramowaniu bez wątpienia będą nadal sprawiać, że zdalne gromadzenie danych i tomografia w ogóle staną się bardziej powszechne w społeczności.

emPrzejrzystość
Ponieważ emClarity wykorzystuje metodę wybierania cząstek opartą na szablonie, potrzebuje szablonu dla obiektu zainteresowania. Zbieranie cząstek (krok 2.6) jest bardzo czułe i ma kluczowe znaczenie dla końcowej struktury. Przed uśrednieniem i wyrównaniem (krok 2.9) należy dokładnie sprawdzić i ręcznie usunąć fałszywe alarmy. Jeśli szablon nie jest dostępny, emClarity może nie być łatwy w użyciu, ale możliwe jest użycie innego oprogramowania, na przykład Dynamo37 i PEET48, w celu utworzenia początkowego modelu.

W przypadku próbek niejednorodnych emClarity jest wyposażony w metodę klasyfikacji, która umożliwia użytkownikom skupienie się na określonych cechach w różnych skalach. Pomocne jest uruchomienie kilku cykli wyrównań przed klasyfikacją i uruchomienie go z wyższym pojemnikiem (takim jak pojemnik 4 lub pojemnik 3).

Aktualna wersja oprogramowania (V1.5.3.11) zawiera znaczące aktualizacje w porównaniu z pierwszą wersją (V1.0)17. Obejmują one między innymi kontrolę ręczności podczas szacowania CTF (krok 2.3); symetria dla wyrównań (CX, I, I2, O); obliczanie funkcji próbkowania 3D dla każdej cząstki (3DSF); przejście na MATLAB 2019a w celu zapewnienia kompatybilności i stabilności; i rekonstrukcja z wykorzystaniem surowych obrazów projekcyjnych (cisTEM). Oprogramowanie będzie nadal ulepszane dla różnych próbek, a najnowsze ogłoszenia można znaleźć w Internecie (patrz tabela materiałów).

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy firmie Diamond Light Source za dostęp i wsparcie urządzeń kriogenicznych w brytyjskim krajowym Centrum Bioobrazowania Elektronów (eBIC), finansowanych przez Wellcome Trust, MRC i BBRSC. Chcielibyśmy również podziękować Andrew Howe'owi za nabycie tomogramu Apoferritin (Film 1), Ishika Kumarowi za przygotowanie i nabycie tomogramu neuronowego (Film 2) oraz Craigowi MacGregorowi-Chatwinowi za tomogram blaszkowy Cyanobacteria (Film 3).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
TomographyThermo Fisher Scientific5.9.0Terminologia wewnętrzna: Tomo5 w dokumencie
TEM serwer ThermoFisher Scientific7.10.1
TIAThermo Fisher Scientific5.10.1
DigitalMicrographGatan3.44
emClarityOprogramowanie Open-Source1.5.3.11Oprogramowanie do wysokorozdzielczej tomografii krioelektronowej i uśredniania subtomogramu
Oprogramowanie IMODOpen-Source4.11Programy do modelowania, wyświetlania i przetwarzania obrazów wykorzystywane do rekonstrukcji 3D i modelowania obrazów mikroskopowych ze szczególnym uwzględnieniem danych z mikroskopii elektronowej
MotionCor2Free do użytku akademickiego1.1.0Program multi-GPU, który koryguje wywołany wiązką ruch próbki zarejestrowany
na stosach filmowych frakcjonowanych dawką
ETomoOpen-Source software4.11ETomo to interfejs do uruchamiania podzbioru poleceń IMOD i PEET. 
NoMachineNoMachine, freeware7.9.2Oprogramowanie do zdalnego pulpitu
TeamViewerTeamViewer AG-Oprogramowanie komputerowe do zdalnego dostępu i zdalnego sterowania
Materials
Quantifoil (dziurawa folia nośna) Siatki EMQuantifoil-Płaskafolia węglowa z predefiniowanym rozmiarem, kształtem i układem
otworówInstrumentation
Titan Kriosmikroskop Thermo Fisher ScientificTitan Krios G2
K3 i filtr energetyczny GIBGatan-Falcon
4 i filtr energii Selectris XThermo Fisher Scientific-
Website
Witryna 1: https://github.com/bHimes/emClarity/--Link do pobrania pakietu oprogramowania emClarity
Witryna 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/--Łącze do pobrania IMOD
Witryna 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial--Linkdo samouczka online emClarity
Witryna 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software--Link aby pobrać MotionCor2
Witryna 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki--Linkdo najnowszych ogłoszeń, w tym aktualizacji i poprawek błędów dla emClarity
Kamera

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bai, X. -C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461(2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166(2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121(2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364(2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. Mastronarde, D. N. The IMOD Home Page. , Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020).
  41. Frosio, T. GitHub: emClarity-tutorial. , Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021).
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. -P., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2. , Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016).
  44. Mills, D. J., Pfeil-Gardiner, O., Vonck, J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022).
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086(2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629(2021).
  47. Vonck, J., Pfeil-Gardiner, O., Mills, D. J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019).
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographyRemote Data CollectionSubtomogram AveragingTomo5 SoftwareDirect Electron DetectorsAutomated AcquisitionCTF EstimationTomogram ReconstructionParticle PickingApoferritin Dataset

Related Articles