Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

DOI:

10.3791/63932

⸱

5 maja 2022

 , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mięśni gładkich (SMC) pośredniczą w skurczu dróg oddechowych i tętnicy wewnątrzpłucnej, odpowiednio modyfikując opór przepływu powietrza i krążenie płucne, odgrywając tym samym kluczową rolę w homeostazie układu płucnego. Deregulacja kurczliwości SMC przyczynia się do wielu chorób płuc, w tym astmy i nadciśnienia płucnego. Jednak ze względu na ograniczony dostęp do tkanek i brak systemów hodowli w celu utrzymania fenotypów SMC in vivo, mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozregulowanej kurczliwości SMC w tych chorobach pozostają w pełni zidentyfikowane. Precyzyjnie wycięty plasterek płuca (PCLS) oferuje model ex vivo, który pozwala obejść te trudności techniczne. Jako żywy, cienki wycinek tkanki płucnej, PCLS zachowuje SMC w naturalnym otoczeniu i umożliwia śledzenie in situ skurczu SMC i wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2 +, która reguluje kurczliwość SMC. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania PCLS dla myszy, który zachowuje nienaruszone drogi oddechowe i tętnice śródpłucne. Protokół ten obejmuje dwa podstawowe kroki przed poddaniem płata płuca krojeniu: napełnienie dróg oddechowych agarozą o niskiej temperaturze topnienia przez tchawicę i napełnienie naczyń płucnych żelatyną przez prawą komorę. PCLS przygotowany przy użyciu tego protokołu może być wykorzystany do testów biologicznych w celu oceny regulacji skurczu SMC za pośrednictwem Ca2 + zarówno w drogach oddechowych, jak i wewnątrzpłucnych przedziałach tętniczych. Protokół ten, zastosowany do mysich modeli chorób układu oddechowego, umożliwia funkcjonalne badanie SMC, zapewniając w ten sposób wgląd w mechanizm leżący u podstaw deregulacji kurczliwości SMC w chorobach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórka mięśni gładkich (SMC) jest głównym typem komórek strukturalnych w płucach, głównie rezydującym w ścianie środkowej dróg oddechowych i naczyń płucnych. SMC kurczą się, aby zmienić kaliber światła, regulując w ten sposób przepływ powietrza i krwi1,2. Dlatego regulacja skurczowa SMC jest niezbędna do utrzymania homeostazy wentylacji powietrznej i krążenia płucnego. Natomiast nieprawidłowa kurczliwość SMC wywołuje obturacyjne choroby dróg oddechowych lub naczyń płucnych, takie jak astma i tętnicze nadciśnienie płucne. Jednak ocena funkcjonalna SMC płuc została zakwestionowana przez ograniczony dostęp do tkanki płucnej, zwłaszcza tych małych dróg oddechowych i mikronaczyń w dystalnej części płuca2,3. Obecne rozwiązania opierają się na testach pośrednich, takich jak pomiar oporu przepływu powietrza za pomocą Flexivent w celu odzwierciedlenia zwężenia dróg oddechowych oraz sprawdzanie ciśnienia krwi tętniczej płucnej za pomocą cewnikowania prawego serca w celu oceny skurczu naczyń płucnych < sup class="xref">4,5. Jednak te pośrednie testy mają wiele wad, takich jak zakłócenia spowodowane czynnikami strukturalnymi, brak uchwycenia przestrzennej różnorodności reakcji dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych w całej skali płuc6,7 i nieodpowiednie do mechanistycznego badania regulacji skurczu na poziomie komórkowym. W związku z tym w badaniu SMC in vitro zastosowano alternatywne podejścia wykorzystujące izolowane komórki pierwotne, paski mięśni tchawicy/oskrzeli8,9 lub duże segmenty naczyniowe10. Niemniej jednak metody te mają również ograniczenia. Na przykład, szybka adaptacja fenotypowa pierwotnych SMC w warunkach hodowli11,12 sprawia, że ekstrapolacja wyników z hodowli komórkowej do warunków in vivo jest problematyczna. Ponadto fenotyp kurczliwości SMC w izolowanych bliższych drogach oddechowych lub segmentach naczyniowych może nie reprezentować SMC w dystalnym płucu 6,7. Co więcej, pomiar siły mięśniowej na poziomie tkanki pozostaje oddzielony od zdarzeń molekularnych i komórkowych, które są niezbędne do mechanistycznego wglądu w regulację skurczu.

Precyzyjnie wycięty wycinek płuca (PCLS), żywy wycinek tkanki płucnej, stanowi idealne narzędzie ex vivo do charakteryzowania płucnych SMC w mikrośrodowisku zbliżonym do in vivo (tj. zachowana wielokomórkowa architektura i interakcja)13. Odkąd dr Placke i dr Fisher po raz pierwszy wprowadzili przygotowanie wycinków płuc z napompowanych agarozą płuc szczurów i chomików w latach 80. XX wieku14,15, technika ta jest stale rozwijana, aby zapewnić PCLS wyższą jakość i większą wszechstronność w badaniach biomedycznych. Jedną ze znaczących ulepszeń jest poprawa zachowania tętnicy płucnej poprzez wlew żelatyny oprócz napełniania płuc agarozą przez tchawicę. W rezultacie, zarówno drogi oddechowe, jak i tętnice płucne pozostają nienaruszone w PCLS do oceny ex vivo16. Co więcej, PCLS jest żywotny przez dłuższy czas w hodowli. Na przykład mysie PCLS nie miały znaczących zmian w żywotności i metabolizmie komórek przez co najmniej 12 dni w hodowli, a także zachowywały kurczliwość dróg oddechowych przez okres do 7 dni17. Ponadto PCLS utrzymuje drogi oddechowe lub naczynia o różnej wielkości do testów skurczu i rozluźnienia. Co więcej, wewnątrzkomórkową sygnalizację Ca2 + SMC, czynnik determinujący kurczliwość komórek, można oznaczyć za pomocą barwników reporterowych Ca2 + obrazowanych za pomocą mikroskopu konfokalnego lub 2-fotonowego13.

Biorąc pod uwagę szerokie zastosowanie modelu mysiego w badaniach płuc, opisano tutaj szczegółowy protokół przygotowania mysich PCLS z nienaruszonymi drogami oddechowymi i tętnicami wewnątrzpłucnymi do badań płuc ex vivo. Korzystając z przygotowanych PCLS, pokazaliśmy następnie, jak oceniać reakcje dróg oddechowych i tętnic płucnych na bodźce zwężające lub rozluźniające. Ponadto opisano również metodę ładowania PCLS barwnikiem reporterowym Ca2 +, a następnie obrazowania sygnalizacji Ca2 + SMC związanych z reakcjami kurczliwymi lub zwiotczającymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cała opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Ogólnego w Massachusetts. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57/B6 typu dzikiego w wieku 8 tygodni.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przygotuj roztwór roboczy.
    1. Przygotuj 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS, z Ca2+ i Mg2+ oraz pH zrównoważone z 20 mM HEPES, patrz Tabela Materiałów). Użyj roztworu HBSS, aby przygotować i przetworzyć PCLS. Utrzymuj roztwór HBSS w niskiej temperaturze na lodzie podczas przygotowywania PCLS.
  2. Przygotować pożywkę hodowlaną PCLS, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle i F-12 (DMEM-F12) firmy Dulbecco środkiem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (stosunek objętości 1:100, patrz tabela materiałów).
  3. Przygotuj 1,5% roztwór agarozy i 6% żelatyny.
    1. Zmieszać niskotemperaturową topnienia (LMP) agarozę lub żelatynę w proszku (patrz tabela materiałów) z roztworem HBSS oddzielnie w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml (lub probówkach o pojemności 50 ml, jeśli objętość roztworu >10 ml) do końcowych stężeń.
      UWAGA: Całkowita objętość roztworu agarozy = 5 ml / mysz x liczba myszy; roztwór żelatyny = 2 ml / mysz x liczba myszy.
    2. Podgrzej probówki z roztworem we wrzącej wodzie, aż proszek całkowicie się rozpuści. Roztwory agarozy i żelatyny przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.
      UWAGA: Lampa grzewcza na stole preparacyjnym może być przydatna, aby utrzymać ciepło w środowisku pracy i zapobiec krzepnięciu roztworu agarozy przed wstrzyknięciem do płuca myszy.
  4. Zanurz wszystkie narzędzia do preparowania, w tym nożyczki do preparowania, dwie pary zakrzywionych kleszczy do mikropreparowania i parę kleszczy hemostatycznych w 70% roztworze etanolu na co najmniej 20 minut w celu sterylizacji.
  5. Miej w pogotowiu wibratomium (patrz Tabela materiałów), aby pokroić tkankę płucną na cienkie plasterki.
  6. Trzymaj odwrócony mikroskop z kontrastem fazowym z kamerą CCD do oceny reakcji skurczu dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych oraz specjalnie skonstruowany laserowy skaningowy mikroskop konfokalny (patrz Tabela materiałów) do oceny sygnalizacji Ca2 + w płucnych SMCs18.

2. Napełnianie płuc myszy roztworem agarozy i żelatyny

  1. Poddaj mysz eutanazji.
    1. Umieść mysz w plastikowej komorze (około 750 cm3) z 5% izofluranem. Trzymaj mysz w komorze, dopóki nie przestanie oddychać przez co najmniej 1 min.
      UWAGA: Inne pierwotne metody eutanazji, takie jak dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (240 mg/kg) i ksylazyny (32 mg/kg)19 lub pentobarbital (0,3 ml)20, mogą być stosowane jako alternatywa dla wziewnego izofluranu.
    2. Umieść ciało myszy na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Unieruchom ciało na miejscu, przytrzymując ogon, przednie łapy i głowę igłami strzykawkowymi 25 G, a następnie zdezynfekuj ciało sprayem 70% etanolu.
    3. Rozetnij brzuch myszy nożyczkami chirurgicznymi (nacięcie, ~2 cm długości x 2 cm szerokości). Następnie odetnij aortę brzuszną, aby zmniejszyć objętość krwi.
  2. Napompuj płaty płuc, wykonując poniższe czynności.
    1. Ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej wzdłuż mostka i obustronnej dolnej klatki piersiowej powyżej przepony i obserwuj, jak płaty płuc zapadają się, gdy otwiera się jama klatki piersiowej.
    2. Usuń część obustronnych brzusznych klatek piersiowych, aby odsłonić serce. Unikaj uszkodzenia płuc, kierując ostrą końcówkę nożyczek z dala od tkanki płucnej.
    3. Użyj kleszczy, aby oddzielić grasicę i tkankę miękką w szyi myszy, aby odsłonić tchawicę.
    4. Wyciąć mały otwór (o średnicy 1,2 mm) w górnym końcu tchawicy, umożliwiając przejście końcówki cewnika dożylnego w kształcie litery Y o gramaturze 20 G (patrz tabela materiałów).
    5. Podłącz jeden port adaptera cewnika w kształcie litery Y ze strzykawką o pojemności 3 ml napełnioną 0,5 ml powietrza, a drugi port ze strzykawką o pojemności 3 ml napełnioną 2 ml ciepłego 1,5% roztworu agarozy (42 °C).
    6. Wstrzyknąć roztwór agarozy, aby napełnić cewnik, a następnie wepchnąć cewnik przez wstępnie nacięty otwór do tchawicy na długość 5-8 mm.
    7. Powoli wstrzykiwać roztwór agarozy w ilości około 1 ml/5 s. Płuco rozszerzy się wzdłuż osi proksymalnej do dystalnej. Należy przerwać wstrzykiwanie, gdy krawędź każdego płata płuca jest napompowana.
      UWAGA: Nie należy nadmiernie pompować płuca, ponieważ może to spowodować ich pęknięcie. Objętość roztworu agarozy do nadmuchania całego płuca młodej dorosłej myszy wynosi około 1,3 ± 0,1 ml.
    8. Wstrzyknąć 0,2-0,3 ml powietrza z drugiej strzykawki, aby wepchnąć resztki agarozy w cewniku i przewodzących drogach oddechowych do dystalnej przestrzeni pęcherzyków płucnych.
    9. Przytnij tchawicę parą zakrzywionych kleszczy hemostatycznych (patrz Tabela materiałów).
  3. Wypełnij naczynia płucne.
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml ciepłą 6% żelatyną. Podłącz do cewnika żyłowego skóry głowy z igłą, napełnij cewnik roztworem żelatyny, a następnie nakłuj igłą prawą komorę w pobliżu dolnej ściany.
    2. Wbić igłę w prawą komorę na 2-3 mm długości i skierować końcówkę igły do głównej tętnicy płucnej.
    3. Wstrzyknąć powoli 0,2 ml roztworu żelatyny do prawej komory i tętnic płucnych.
      UWAGA: Płaty płuc wydają się nieco jaśniejsze przy odpowiednim napompowaniu żelatyny.
    4. Trzymać igłę na miejscu przez 5 minut po wstrzyknięciu, schłodzić płaty płuc, wylewając lodowaty roztwór HBSS na serce i płuca, a następnie umieścić ciało z deską separacyjną w lodówce o temperaturze 4 °C lub na lodzie na łącznie 10 minut.
    5. Usuń płuco i serce myszy z otaczających tkanek łącznych za pomocą nożyczek. Następnie oddziel każdy płat płuca i trzymaj je w roztworze HBSS na lodzie.

3. Podział płatów płuc na cienkie plasterki

  1. Przytnij i przymocuj płat płuca na górze kolumny próbki za pomocą superglue i ustaw płat (Rysunek 1A, B) tak, aby kierunek cięcia był prostopadły do większości dróg oddechowych od hili do powierzchni płuc.
  2. Użyj wibratomu ze świeżą, cienką żyletką, aby pokroić płat płuc na plastry o wielkości 150 μm. Zbierz plastry na sterylnych szalkach Petriego o średnicy 100 mm wypełnionych zimnym roztworem HBSS.
    UWAGA: Ustaw odpowiednią prędkość ruchu ostrza i częstotliwość oscylacji przed rozpoczęciem krojenia. Typowym ustawieniem dla Compresstom jest poziom prędkości 4 i poziom oscylacji 4.
  3. Przenieś plastry na szalki Petriego wypełnione pożywką hodowlaną DMEM/F-12 (20 plastrów/15 ml pożywki/szalkę) i trzymaj je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc przed eksperymentami.
    UWAGA: Mysie PCLS mogą być utrzymywane w hodowli przez około 7 dni bez utraty reakcji kurczliwości dróg oddechowych17. Długowieczność tętnic płucnych nie została dokładnie oceniona. Z naszych obserwacji wynika, że zachowują nienaruszoną strukturę i wazoreakcję przez co najmniej 3 dni w pożywce DMEM/F12. W celu długotrwałego przechowywania, mysie PCLS można umieścić w kriowialach wypełnionych pożywką DMEM/F12 zawierającą 10% DMSO (5 plastrów w 1 ml pożywki na fiolkę), zamrożone w pojemniku wypełnionym alkoholem izopropylowym w temperaturze -80 °C przez noc i kriokonserwowane w ciekłym azocie przez tygodnie lub miesiące21.

4. Analiza reakcji skurczowych wewnątrzpłucnych dróg oddechowych i tętnic

  1. Umieścić PCLS w 24-dołkowej płytce hodowlanej wypełnionej HBSS, po jednej w każdym dołku. Zlokalizuj PCLS na środku studzienki, a następnie usuń roztwór HBSS za pomocą pipety.
  2. Znajdź docelowe drogi oddechowe i naczynie w plastrze pod mikroskopem, a następnie przykryj plasterek nylonową siatką z wstępnie wyciętym centralnym otworem (o średnicy 2-3 mm), aby odsłonić obszar docelowy.
  3. Połóż pustą metalową podkładkę na siatce, aby utrzymać plastry na miejscu (Rysunek 2A).
  4. Dodać 600 μl roztworu HBSS, aby zanurzyć PCLS. Odpocznij plasterek przez 10 minut, a następnie zapisz podstawowe obrazy dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych.
  5. Wywołać skurcz dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych, ostrożnie odsysając ślepą próbę roztworu HBSS za pomocą pipety i dodając 600 μl HBSS z agonistą, takim jak 1 μM metacholiny (MCh) lub 10 nM endoteliny (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Stymulacja KCl jako standard zestawu narzędzi nie jest wymagana przed ekspozycją na metacholinę lub endotelinę. 100 mM stymulacji KCl w drogach oddechowych myszy wywołuje tylko mały i nieregularny skurcz dróg oddechowych (10%-15%)20. Podobnie, stymulacja metacholiną nie jest obowiązkowa, ponieważ potwierdziliśmy, że ten sam agonista, na przykład metacholina lub serotonina, wywołuje podobny skurcz dróg oddechowych przy pierwszej i powtarzającej się ekspozycji20,22.
  6. Obserwuj reakcję pod mikroskopem, aż zmiana obszaru światła osiągnie stan równowagi, a następnie zapisz obrazy dróg oddechowych lub naczyń do analizy.
  7. Usunąć MCh lub roztwór endoteliny za pomocą pipety i dodać nowy 600 μl roztwór HBSS o tym samym stężeniu agonistycznym i środku zwiotczającym; obserwować i rejestrować rozluźnienie dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych.
  8. Określ ilościowo reakcję dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych, wykonując poniższe czynności.
    1. Załaduj obrazy do sponsorowanego przez NIH bezpłatnego oprogramowania FIDŻI.
    2. Wybierz opcję Wielokąt na pasku narzędzi, aby obrysować światło dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych na każdej klatce.
    3. Wybierz opcję Analizuj > ustaw pomiary > obszarze.
    4. Wybierz pozycję Analizuj > Mierz, aby określić ilościowo obszar zainteresowania. Wyniki są wyświetlane w osobnym oknie do analizy statystycznej.

5. Analiza sygnalizacji Ca2+ SMC dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych

  1. Przygotować bufor ładujący barwnik Ca2+.
    1. Rozpuść barwnik Ca2+, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (patrz tabela materiałów), 50 μg (jedna fiolka) w 10 μl DMSO.
    2. Rozpuść 0,2 g proszku Pluronic F-12 (patrz Tabela materiałów) w 1 ml DMSO, aby uzyskać 20% roztwór Pluronic.
    3. Zmieszać 10 μl 20% roztworu pluronowego z 10 μl roztworu barwnika Ca2+ DMSO.
    4. Sporządzić bufor ładujący barwnikCa2+, dodając 20 μl mieszaniny do 2 ml roztworu HBSS z 200 μM sulfobromoftaleiny (patrz tabela materiałów).
  2. Umieścić 15 mysich PCLS w 2 ml buforu ładującego Ca2+ i inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Następnie przenieś plastry do 2 ml roztworu HBSS ze 100 μM sulfobromoftaleiny na dodatkowe 30 minut w celu deestryfikacji barwnika fluorescencyjnego w temperaturze pokojowej.
  3. Wykryj sygnalizację Ca2+ SMC.
    1. Umieść plastry Ca2+ obciążone barwnikiem na dużym szkle nakrywkowym.
    2. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml smarem silikonowym o wysokiej próżni. Wyciśnij smar przez igłę o sile 18 g, aby narysować dwie równoległe linie w poprzek szkła nakrywkowego powyżej i poniżej plastra.
    3. Przykryj plasterek nylonową siatką między dwiema liniami tłuszczu. Umieść drugą szklankę nakrywkową na wierzchu siatki, aby wytworzyć komorę uszczelnioną smarem po bokach ( Rysunek 3A).
      UWAGA: Nylonowa siatka jest niezbędna, aby plasterek był przymocowany do dolnego szkiełka nakrywkowego, a tym samym pozostawał w odległości roboczej odwróconego obiektywu o dużej wielkości, takiego jak 40-krotny olej.
    4. Dodać HBSS lub roztwór agonisty do komory z jednego końca, pipetując ręcznie lub za pomocą systemu perfuzyjnego. Usunąć płyn z komory, odsysając z drugiego końca bibułę lub próżnię w przypadku ciągłej perfuzji płynu.
    5. Umieść komorę PCLS na stoliku mikroskopu. Wykrywanie sygnalizacji Ca2+ SMC23 za pomocą specjalnie zbudowanego rezonansowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z szybkością skanowania laserowego 15 lub 30 obrazów/s.
      UWAGA: Alternatywnie, szybki komercyjny skaningowy mikroskop konfokalny z laserem, powszechnie dostępny obecnie, może być stosowany w teście sygnalizacji Ca2 + płucnych SMC w PCLS.
  4. Określ ilościowo fluorescencję Ca2+ w SMC.
    1. Załaduj nagraną sekwencję obrazów na FIJI i wybierz Typ > obrazu > 8-bitową skalę szarości.
    2. Wybierz zaznaczenie prostokąta na pasku narzędzi i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 5 x 5 pikseli w komórce mięśni gładkich.
    3. Wybierz opcję Analizuj > Ustaw pomiary > Średnia wartość szarości, reprezentująca intensywność fluorescencjiCa2+.
    4. Jeśli pozycja ROI zmienia się wraz ze skurczem SMC, wybierz Analizuj > Zmierz intensywność fluorescencji Ca2+ klatka po klatce.
    5. Jeśli zwrot z inwestycji w SMC pozostaje w podobnej pozycji w stosie obrazów, wybierz Stosy obrazów > > Zmierz stos natężenia fluorescencji Ca2+.
      UWAGA: Można podłączyć specjalnie napisane makro, aby śledzić zwrot z inwestycji w SMC, gdy porusza się on ze skurczem w stosie obrazów i automatycznie mierzy intensywność Ca>2+ (wartość szarości) ROI klatka po klatce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preparat PCLS na myszy, zachowujący nienaruszone wewnątrzpłucne drogi oddechowe i tętnice
PCLS o grubości 150 μm zaobserwowano pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym. W płucach myszy przewodzącym drogom oddechowym towarzyszą tętnice wewnątrzpłucne, biegnące od wnęki do płuca obwodowego. Reprezentatywny pakiet płucno-tętniczy dróg oddechowych u myszy PCLS pokazano na Rysunek 2B. Drogi oddechowe można łatwo zidentyfikować za pomocą prostopadłościennych komórek nabłonkowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie PCLS składa się z kilku kluczowych etapów. Po pierwsze, konieczne jest jednorodne napompowanie płata płuca, aby uniknąć zmian sztywności tkanek spowodowanych nierównomiernym rozmieszczeniem agarozy. Ponieważ płynna agaroza szybko żeluje się w cienkich cewnikach lub drogach oddechowych w temperaturze poniżej 37 °C, wynikający z tego defekt wypełnienia w dystalnym polu płuc może zwiększyć dysproporcję sztywności tkanki płucnej i spowodować rozerwanie tkanki podczas sekcji wibratomowej. Dlatego można praktykow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD309626
15 ml sterylne probówki wirówkoweCelltreat229411
Strzykawka 3 mlBD309585
50 ml sterylne probówki wirówkoweCelltreat229422
Acetylo-beta-metacholinaMillipore Sigma62-51-1
Antybiotyk-znieczulaczThermo Fisher15240-062
Kamera CCDNikonNikon Ds-Ri2
Osłona OkularFisher Scientific12-548-5CP; 12-548-5PP
Fiolki kriogeniczneFisher Scientific430488
Wykonany na zamówienie laserowy skaningowySzczegóły w Referencje 18
DMEM/F12Fisher ScientificMT-10-092-CM
Endothelin 1Millipore SigmaE7764
Drobne nożyczki preparacyjneFisher ScientificNC9702861
Pojemnik do zamrażaniaSigma-AldrichC1562
Żelatyna ze skóry świniSigma-Aldrich9000-70-8
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher
Kleszczyk hemostatycznyFisher Scientific16-100-117
HEPESThermo Fisher15630080
Smar silikonowy wysokopróżniowyFisher Scientific146355d
Alkohol izopropylowySigma-AldrichW292907-1KG-K
Podkładki metaloweHome Depot Product Authority800442Everbilt Podkładki płaskie #10
Kleszczyk do mikropreparacjiSigma-AldrichF4142
Igła do żył skóry głowy (25 G)EXELINT26708
NOC-5Cayman Chemical16534
Siatka nylonowaDostawa komponentówU-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AMLife Technologieso-6807
Kontrast fazowy mikroskopNikonNikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127Thermo FisherP-6867
ŻyletkiPersonnaPersonna Dwustronna krawędź Żyletki w białym opakowaniu 100 sztuk
SulfobromophthaleinSigma-AldrichS0252
SuperglueKrazy GlueKrazy Glue, uniwersalny
Ultrapure low Temperatura topnienia agarozyThermo Fisher16520050
VibratomePrecyzyjnyVF 310-0Z
VibratomePrecyzyjnySKU-VM-CB12.5-NC
Probówka na próbkę wibratomuPrecyzyjnajednostka produktu SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Cewnik dożylny w kształcie litery YBD383336BD Zamknięty cewnik dożylny Saf-T-Intima
Aparat mikroskop konfokalny 14025092 blok chłodzący

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172(2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252(2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636(2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Airway Smooth MuscleIntrapulmonary ArterySmooth Muscle ContractilityCalcium ImagingConfocal MicroscopyPulmonary CirculationEx Vivo Lung ModelAirway ContractionPulmonary Hypertension

Powiązane artykuły