Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63935

⸱

20 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Streszczenie

Niektóre funkcje komórek i tkanek działają w dynamicznej skali czasu od minut do godzin, które są słabo rozpoznawane przez konwencjonalne systemy hodowli. W ramach tych prac opracowano tani system bioreaktora perfuzyjnego, który umożliwia ciągłą perfuzję pożywki hodowlanej do modułu hodowli komórkowej i frakcjonowanie w module końcowym w celu pomiaru dynamiki w tej skali. System jest zbudowany prawie w całości z dostępnych na rynku części i może być równoległy w celu jednoczesnego przeprowadzania niezależnych eksperymentów na konwencjonalnych wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowych. W tym artykule wideo pokazano, jak zmontować konfigurację podstawową, która wymaga tylko jednej wielokanałowej pompy strzykawkowej i zmodyfikowanego kolektora frakcji do równoległego perfuzji do sześciu kultur. Przedstawiono również przydatne warianty konstrukcji modułowej, które pozwalają na kontrolowaną dynamikę stymulacji, takie jak impulsy substancji rozpuszczonej lub profile podobne do farmakokinetycznych. Co ważne, gdy sygnały substancji rozpuszczonej przechodzą przez system, są zniekształcone z powodu dyspersji substancji rozpuszczonej. Ponadto opisano metodę pomiaru rozkładów czasu przebywania (RTD) składników układu perfuzyjnego za pomocą znacznika przy użyciu MATLAB. Czujniki RTD są przydatne do obliczania, w jaki sposób sygnały substancji rozpuszczonej są zniekształcane przez przepływ w systemie wielokomorowym. System ten jest bardzo wytrzymały i powtarzalny, dzięki czemu badacze zajmujący się badaniami podstawowymi mogą go łatwo wdrożyć bez konieczności korzystania ze specjalistycznych zakładów produkcyjnych.

Wprowadzenie

Wiele istotnych procesów biologicznych zachodzi w hodowlach komórkowych i tkankowych w skali czasowej od minut do godzin1,2,3. Chociaż niektóre z tych zjawisk można obserwować i rejestrować w sposób zautomatyzowany, wykorzystując mikroskopię poklatkową4, bioluminescencję1 lub inne metody, eksperymenty obejmujące pobieranie próbek supernatantu hodowli do analizy chemicznej są często przeprowadzane ręcznie w statycznych hodowlach komórkowych. Pobieranie próbek manualnie ogranicza wykonalność niektórych badań ze względu na niedogodności związane z częstym pobieraniem próbek lub koniecznością robienia tego poza godzinami pracy. Dalsze niedoskonałości metod hodowli statycznych obejmują eksperymenty z kontrolowaną, przejściową ekspozycją na bodźce chemiczne. W hodowlach statycznych bodźce muszą być dodawane i usuwane ręcznie, a profile bodźców ograniczają się do zmian skokowych w czasie; ponadto wymiany pożywki powodują dodawanie i usuwanie innych składników medium, co może wpływać na komórki w sposób niekontrolowany5. Systemy fluidyczne mogą rozwiązać te problemy, jednak istniejące urządzenia stwarzają inne wyzwania. Urządzenia mikrofluidyczne wiążą się z wysokimi kosztami specjalistycznego sprzętu i szkolenia niezbędnego do ich produkcji i użytkowania, wymagają mikroanalitycznych metod przetwarzania próbek, a odzyskanie komórek z urządzeń po perfuzji jest utrudnione6. Stworzono niewiele systemów makrofluidycznych dla rodzajów eksperymentów opisanych w niniejszej pracy7,8,9,10, a są one zbudowane z wielu niestandardowych części wykonanych wewnętrznie i wymagają zastosowania wielu pomp lub kolektorów frakcji. Co więcej, autorom nie są znane żadne dostępne komercyjnie makrofluidyczne systemy perfuzyjne do hodowli komórkowych, poza bioreaktorami z mieszadłem do hodowli w zawiesinie, które są użyteczne w bioprodukcji, lecz nie są zaprojektowane do modelowania i badania fizjologii.

Autorzy opisali wcześniej projekt niskokosztowego systemu bioreaktora perfuzyjnego, składającego się niemal w całości z części dostępnych w handlu1. Podstawowa wersja systemu umożliwia utrzymanie wielu kultur w płytce wielodołkowej w inkubatorze CO2 i ich ciągłą perfuzję pożywką za pomocą pompy strzykawkowej, podczas gdy strumienie pożywki odpływowej z kultur są automatycznie frakcjonowane na próbki w czasie za pomocą kolektora frakcji z niestandardową modyfikacją. W ten sposób system ten umożliwia zautomatyzowane pobieranie próbek supernatantu pożywki hodowlanej oraz ciągłe dostarczanie substancji rozpuszczonych do kultur w czasie. System jest makrofluidyczny i modułowy, dzięki czemu można go łatwo modyfikować w celu dostosowania do potrzeb nowych projektów eksperymentalnych.

Ogólnym celem zaprezentowanej tutaj metody jest skonstruowanie, scharakteryzowanie i wykorzystanie perfuzyjnego systemu hodowli komórkowych, który umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, w których mierzone są szybkości sekrecji lub absorpcji substancji przez komórki w czasie i/lub w których komórki są eksponowane na precyzyjne, przejściowe sygnały rozpuszczonych substancji. Niniejszy artykuł wideo wyjaśnia, jak złożyć podstawowy układ, który pozwala na jednoczesną perfuzję do sześciu hodowli komórkowych przy użyciu jednej pompy strzykawkowej i zmodyfikowanego kolektora frakcji. Przedstawiono również dwa użyteczne warianty systemu podstawowego, wykorzystujące dodatkowe pompy i elementy, które umożliwiają przeprowadzanie eksperymentów polegających na wystawianiu komórek na przejściowe sygnały stężenia substancji, w tym krótkie impulsy oraz profile przypominające kinetykę farmakologiczną12, co pokazano na Rysunku 1.

figure-introduction-1
Rycina 1: Trzy warianty konstrukcji systemu perfuzyjnego. (Góra) Podstawowy system perfuzyjny. (Środek) System perfuzyjny z kurkiem do obsługi wielu źródeł pożywki. (Dół) System perfuzyjny z mieszadłowym zbiornikiem do symulacji dobrze wymieszanej objętości dystrybucji. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

W wyniku dyspersji i dyfuzji wewnątrz przepływu sygnały substancji rozpuszczonej ulegają zniekształceniu lub „rozmyciu” podczas przemieszczania się przez układ przepływowy. Zniekształcenie to można określić ilościowo przy użyciu rozkładów czasu przebywania (RTD)13. Niniejszy artykuł wyjaśnia, jak przeprowadzać eksperymenty z użyciem znacznika na poszczególnych komponentach systemu perfuzji (Rycina 2) oraz dostarcza skrypty MATLAB do generowania RTD z pomiarowych danych. Szczegółowe wyjaśnienie tej analizy znajduje się w poprzedniej publikacji autorów1. Dodatkowe skrypty MATLAB dopasowują odpowiednie funkcje do RTD i wyodrębniają parametry fizyczne, a także wykonują splot sygnałów z wykorzystaniem RTD, aby przewidzieć, w jaki sposób wprowadzony przez użytkownika sygnał substancji rozpuszczonej będzie się rozprzestrzeniać i zniekształcać w systemie perfuzji14.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Rozkłady czasu przebywania. RTD komponentów systemu przepływowego, takich jak ten odcinek rurki, mierzy się poprzez wprowadzenie impulsu znacznika do systemu i pomiar stopnia jego „rozmycia” w momencie przedostania się do zbieranych frakcji. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Ericksona i współpracowników1. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie elementów do perfuzji płytki wielodołkowej

  1. Przygotowanie przewodów
    1. Odciąć dwa odcinki przewodu silikonowego (średnica wewnętrzna 1,6 mm) dla każdej hodowli komórkowej przeznaczonej do perfuzji. Należy upewnić się, że odcinek służący jako przewód dopływowy jest wystarczająco długi, aby sięgać od pompy strzykawkowej do hodowli komórkowej wewnątrz inkubatora, a odcinek odpływowy może sięgać od hodowli komórkowej do najdalej wysuniętej pozycji kolektora frakcji.
    2. Oznaczyć każdy odcinek przewodu unikalną etykietą na obu końcach, używając taśmy oznakowującej.
  2. Przygotowanie korków do płytki wielodołkowej
    1. Przygotować jeden korek silikonowy dla każdego dołka płytki przeznaczonego do perfuzji, o odpowiedniej średnicy, aby ściśle pasował dołków i zapewniał szczelność powietrzną.
    2. Odciąć nadmiar materiału z dołu korków, aby pasowały dołków, pozostawiając wewnątrz przestrzeń na powietrze powyżej planowanego poziomu cieczy.
    3. Przez każdy korek przeciągnąć dwie tępe igły 18 G, od góry dołu, aby służyły jako wlot i wylot przepływu przez dołek; igły powinny być ustawione przeciwlegle, aby zmaksymalizować odległość między ich końcówkami wewnątrz dołka.
    4. Dostosować wysokość igieł w zakorkowanym dołku, ponieważ wysokość igły odpływowej zdeterminuje stabilny poziom cieczy w dołku podczas perfuzji.
      UWAGA: Jeśli perfuzja zostanie rozpoczęta z igłą odpływową powyżej poziomu cieczy, ciecz będzie gromadzić się w dołku, aż poziom osiągnie wysokość igły. Jeśli perfuzja zostanie rozpoczęta z igłą odpływową poniżej poziomu cieczy, poziom cieczy pozostanie stały, chyba że do dołka wpłyną pęcherzyki powietrza, co spowoduje obniżenie poziomu cieczy aż do wysokości igły odpływowej.
  3. Gromadzenie dodatkowych elementów
    1. Przygotować jedną sterylną strzykawkę dla każdej hodowli komórkowej przeznaczonej do perfuzji, wystarczająco dużą, aby pomieścić ilość medium niezbędną na całą perfuzję oraz dodatkową ilość medium do początkowego wypełnienia przewodów.
    2. Dla każdej hodowli przeznaczonej do perfuzji przygotować jeden łącznik Luer typu female-to-barb i dwa łączniki Luer typu male-to-barb, a także dwie zaślepki Luer żeńskie i dwie zaślepki Luer męskie.
  4. Czyszczenie i sterylizacja elementów
    1. Jeśli elementy były wcześniej używane, należy je wyczyścić poprzez przemycie 0,1 N NaOH, a następnie spłukać wodą dejonizowaną.
    2. Za pomocą autoklawowania lub innej metody zapewnić sterylność wszystkich wymienionych powyżej elementów.

2. Wytnij laserowo dozownik wielogłowicowy i przymocuj go do kolektora frakcji

  1. Odtwórz model dozownika wielogłowkowego z Rysunku 3 w programie do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) lub pobierz dostarczony plik modelu DXF (Plik uzupełniający 1).
  2. Użyj wycinarki laserowej, aby wyciąć projekt z arkusza akrylu o grubości 1/8 in.
  3. Wyjmij trzy śruby mocujące głowicę dozującą do ruchomej podstawy kolektora frakcji.
  4. Wyrównaj trzy najmniejsze otwory w dozowniku wielogłowkowym z otworami na śruby w ruchomej podstawie, a następnie wkręć śruby z powrotem przez otwory, aby zamocować element.
  5. Dostosuj zaciśnięcie trzech śrub, aby nachylić dozownik wielogłowkowy w górę lub w dół, aż rząd otworów dozujących zostanie wyrównany z znajdującymi się poniżej probówkami odbiorczymi.
  6. Ostrożnie włóż końcówki do pipet o pojemności 30 μL przez odpowiednie otwory, aby służyły jako końcówki dozujące.
    ​UWAGA: Kolektor frakcji można stosować bez dozownika wielogłowkowego do perfuzji pojedynczej hodowli komórkowej.

3. Pomiar RTD komponentów i wykonanie splotu sygnału

  1. Przygotuj pompy i strzykawki do podania impulsu znacznika, zgodnie z ilustracją w Rysunek 2.
    1. Należy przygotować dwie jednokanałowe lub wielokanałowe pompy strzykawkowe.
    2. Wybierz roztwór tła, który będzie reprezentował ośrodek stosowany w systemie przepływowym podczas eksperymentów z kulturami komórkowymi. Należy upewnić się, że roztwór tła posiada właściwości transportu masy zbliżone do właściwości ośrodka. W wielu przypadkach odpowiednim wyborem jest woda dejonizowana.
    3. Należy wybrać substancję znacznika reprezentującą substancję rozpuszczoną, która będzie przedmiotem badań podczas eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Należy upewnić się, że znacznik posiada właściwości transportu masy zbliżone do właściwości substancji rozpuszczonej oraz że możliwe jest zmierzenie jego stężenia. W wielu przypadkach odpowiednim wyborem jest barwnik spożywczy.
    4. Rozpuścić substancję znacznika w roztworze tła, aby przygotować roztwór znacznika.
    5. Napełnić jedną strzykawkę roztworem tła i umieścić ją w pierwszej pompie strzykawkowej. Napełnić drugą strzykawkę roztworem znacznika i umieścić ją w drugiej pompie strzykawkowej.
    6. Połącz obie strzykawki z dwoma z trzech portów czterodrożnego kranu za pomocą złączy Luer.
    7. Zamknij kurek do roztworu tła i pompuj roztwór znacznika do kurka, aż zacznie on wyciekać przez otwarty otwór. Zatrzymaj pompę i nie koryguj już położenia tłoka strzykawki.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem etapów eksperymentu objętych pomiarem czasu należy upewnić się, że ruchomy rygiel pompy strzykawkowej jest dociśnięty do tłoków strzykawki. Pozwoli to na natychmiastowe rozpoczęcie przepływu po uruchomieniu pompy. W przeciwnym razie pompa może zostać uruchomiona, lecz przepływ nie rozpocznie się, dopóki ruchomy rygiel nie dotrze do pozycji tłoka.
    8. Zamknąć kurek do roztworu znacznika i pompować roztwór tła do kurka, aż cały pozostały roztwór znacznika zostanie wypłukany z otwartego otworu. Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki.
  2. Przygotuj wybrany element układu przepływowego oraz kolektor frakcji.
    1. Przygotuj komponent systemu przepływowego przeznaczony do analizy RTD. Upewnij się, że mierzony komponent kończy się odcinkiem rurki odpływowej o odpowiedniej długości i elastyczności, umożliwiającej dotarcie do kolektora frakcji podczas pracy urządzenia.
    2. Wprowadź końcówkę przewodu odpływowego do dyszera końcówek pipet w wielogłowicowym dozowniku w taki sposób, aby połączenie było szczelne.
    3. Podłącz otwarty port czterodrożnego kranu do wlotu mierzonego komponentu. Pompuj roztwór tła przez komponent, aż zostanie on całkowicie wypełniony w taki sposób, jak podczas eksperymentu z hodowlą komórkową, i aż roztwór zacznie kapać z końcówki dozującej kolektora frakcji. Zatrzymaj pompę.
  3. Wstrzyknij impuls znacznika, zbierz frakcje i zmierz poziom znacznika
    1. Ustaw pompę dla roztworu znacznika na pożądaną prędkość przepływu. Zamknij kurek do roztworu tła i rozpocznij przepływ roztworu znacznika. Jednocześnie uruchom kolektor frakcji.
    2. Kontynuuj przepływ roztworu znacznika przez krótki czas, aby przybliżyć podanie znacznika w formie impulsu. Ustalono, że czas trwania impulsu wynoszący 10 min jest odpowiedni dla RTD przy szybkości przepływu 1 ml/h.
      UWAGA: Jeśli impuls znacznika będzie zbyt krótki, do przepływu dostanie się zbyt mała ilość znacznika, aby można go było zmierzyć. Jeśli impuls będzie zbyt długi, przestanie on odpowiadać impulsowi delta i zmieni kształt RTD.
    3. Po zakończeniu okresu podawania impulsu roztworu znacznika należy wyłączyć pompę roztworu znacznika. Należy szybko zamknąć kurek doprowadzający roztwór znacznika i uruchomić przepływ roztworu tła z tą samą prędkością przepływu.
    4. Należy pozwolić na przepływ roztworu tła i zbieranie frakcji aż do momentu, gdy cały znacznik przejdzie przez system i zostanie zawarty w zebranych frakcjach.
    5. Zatrzymaj system i zmierz stężenie znacznika w frakcjach. Uwzględnij tylko te frakcje, które zostały pobrane w całości. Jeśli proces zbierania zostanie zatrzymany w trakcie pobierania frakcji, nie należy jej uwzględniać.
  4. Obliczanie rozkładu czasu przebywania (RTD) z danych pomiarowych w programie MATLAB
    UWAGA: Pisemny opis analizy przeprowadzonej za pomocą tego skryptu MATLAB znajduje się w poprzedniej publikacji autorów11a dyskusje na temat teorii są powszechnie dostępne w literaturze13.
    1. Utwórz plik .xlsx zawierający dane o stężeniu w formacie arkusza example_tracer_data.xlsx dostarczonego w Plik uzupełniający 2Wprowadź wartości stężeń znacznika w frakcjach (w dowolnych jednostkach) w kolejności chronologicznej od lewej do prawej wierszu 2. W komórce A5 wprowadź czas, który upłynął od rozpoczęcia impulsu do końca ostatniej frakcji, a w komórce A8 wprowadź czas trwania impulsu znacznika w minutach.
    2. Zapisz plik .xlsx w katalogu MATLAB.
    3. Otwórz skrypt RTD_From_Data.m, z Plik uzupełniający 3w edytorze MATLAB.
    4. Zmień nazwę pliku .xlsx w nawiasach w pierwszej linii Wczytywanie danych sekcję skryptu z nazwą nowego pliku danych .xlsx, zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku skryptu. Uruchom skrypt.
    5. Upewnij się, że skrypt pomyślnie przeprowadza analizę RTD13generując wykres RTD i zwracając wartość całki numerycznej z RTD równą 1. Należy odnaleźć wektor czasu (t) oraz powiązany z nim wektor wartości RTD (Et) zapisane przez skrypt w katalogu MATLAB.
  5. Dopasowanie funkcji modelu do RTD w programie MATLAB
    1. Otwórz skrypt Fit_RTD_Function.m w edytorze MATLAB z Plik uzupełniający 4.
    2. Wybierz jedną z trzech zakomentowanych funkcji modelu do dopasowania do RTD: model dyspersji osiowej13, który pasuje do rozkładów czasu przebywania (RTD) dla przepływu laminarnego w rurkach cylindrycznych; model CSTR13, który dobrze pasuje do zbiorników z dobrym mieszaniem; oraz model n-CSTR15, co w przybliżeniu pasuje do większych płytek wielodołkowych. Aby dopasować inny model, który nie został tutaj uwzględniony, należy dodać go do skryptu w tym samym formacie.
    3. Usuń komentarze w sekcji skryptu zawierającej model wybrany do dopasowania.
    4. Zmień wartości wartości początkowych dla parametrów na takie, które są odpowiednie dla RTD.
    5. Uruchom skrypt, aby wygenerować wykres funkcji dopasowania nałożony na dane RTD oraz wydrukować wartości parametrów dopasowania dla tej funkcji. Jeśli dopasowanie jest bardzo słabe lub wystąpią błędy, zmień wartości początkowe parametrów i ponownie uruchom skrypt.
  6. Wykonanie splotu sygnałów w programie MATLAB
    1. Wybierz jeden sygnał i jedno RTD lub dwa RTD do splotu.
    2. Otwórz skrypt Signal_Convolution.m z Plik uzupełniający 5w edytorze MATLAB.
    3. Dla każdego z dwóch sygnałów podlegających splotowi (tj. jednego sygnału i jednej funkcji RTD lub dwóch funkcji RTD) należy zdefiniować jeden wektor równomiernie rozłożonych punktów czasowych w wybranych jednostkach oraz odpowiadający mu wektor wartości sygnału w tych punktach czasowych.
      UWAGA: Wektory dwóch sygnałów muszą posiadać taką samą liczbę elementów oraz takie same kroki czasowe. Dlatego korzystne jest przedstawienie RTD jako funkcji ciągłej, z której można pobrać próbki dla dowolnej liczby punktów w dowolnym odstępie czasu.
    4. Wprowadź dwa sygnały do programu MATLAB i uruchom skrypt, aby uzyskać wektory czasu i sygnału dla sygnału wyjściowego.

4. Konfiguracja podstawowego systemu perfuzji z komórkami w płytce wielodołkowej

  1. Przygotowanie płytki wielodobowej
    1. Należy upewnić się, że hodowle w płytce mają odpowiednią głębokość medium do eksperymentu perfuzyjnego. Przed rozpoczęciem perfuzji należy przeprowadzić końcowe wymiany medium, stymulacje lub inne wymagane kroki. W przypadku perfuzji komórek w zawiesinie należy odwirować płytkę, aby komórki osiadły na dnie.
    2. W warunkach sterylnych należy wprowadzić do hodowli w płytce korki z igłami, trzymając igły w pozycji wysuniętej w górę. Po umieszczeniu korka należy opuścić igły na wysokość pożądaną dla perfuzji, ponieważ wysokość igły wylotowej determinuje stabilny poziom cieczy.
    3. Igły należy zabezpieczyć nasadkami Luer (male) i przechowywać całą płytkę w inkubatorze do momentu użycia.
  2. Przygotowanie strzykawek i przewodów doprowadzających
    1. W warunkach sterylnych należy napełnić strzykawkę dla każdej perfundowanej hodowli ilością medium wystarczającą na pożądany czas trwania perfuzji, z dodatkową objętością niezbędną do wypełnienia przewodów doprowadzających.
    2. Przewód doprowadzający należy przymocować do strzykawki za pomocą konektora Luer (female-to-barb). Na drugim końcu przewodu należy zamocować konektor Luer (male-to-barb).
    3. Należy dozować medium ze strzykawki, aż przewód doprowadzający zostanie całkowicie wypełniony.
    4. Otwarty koniec przewodu należy zabezpieczyć nasadką Luer (female).
      UWAGA: Wszystkie powielone strzykawki muszą mieć w tym momencie dokładnie taką samą objętość. Jeśli objętości będą nierówne, tłoki znajdą się w różnych pozycjach, co uniemożliwi ich prawidłowe zamocowanie w wielokanałowej pompie strzykawkowej.
  3. W warunkach sterylnych należy włożyć konektor Luer (male-to-barb) do jednego końca przewodów odprowadzających i zabezpieczyć go nasadką Luer (female).
  4. Należy ostrożnie przenieść wszystkie przygotowane przewody, strzykawki oraz płytkę do inkubatora, który będzie wykorzystywany do perfuzji.
  5. Pompę strzykawkową i kolektor frakcji należy ustawić w odpowiednich miejscach obok inkubatora. Pompę należy umieścić na górze lub w pobliżu inkubatora, a kolektor frakcji obok inkubatora, w pobliżu otworu dostępowego.
  6. Należy zebrać zabezpieczone końce wszystkich przewodów doprowadzających i odprowadzających, a następnie wprowadzić je zewnątrz do wnętrza inkubatora przez otwór dostępowy.
  7. Strzykawki należy załadować do pompy strzykawkowej, a otwarte końce przewodów odprowadzających włożyć do końcówek pipet dozujących w wielogłowicowym dozowniku kolektora frakcji.
  8. Wewnątrz inkubatora należy wciągnąć jak największy zapas przewodów doprowadzających, aby zmaksymalizować długość odcinka, na którym płynące medium może przejąć ciepło i CO2 z powietrza w inkubatorze. Przytrzymując je w tej pozycji, należy wysunąć przewody odprowadzające z inkubatora na tyle, aby mogły one dotrzeć do najdalej wysuniętego punktu kolektora frakcji, zachowując jednocześnie zabezpieczone końce wewnątrz inkubatora.
  9. Dla każdego otworu z korkiem należy szybko zdjąć nasadki z igieł oraz z przewodów doprowadzających i odprowadzających i połączyć je za pomocą konektorów Luer.
  10. Po połączeniu wszystkich elementów należy krótko uruchomić pompę strzykawkową z relatywnie wysoką prędkością, aby upewnić się, że wszystkie strumienie płyną prawidłowo.
  11. W tym momencie, jeśli pożądane jest rozpoczęcie eksperymentu z przewodami odprowadzającymi wypełnionymi medium, należy kontynuować pracę pompy aż do ich całkowitego napełnienia. W przeciwnym razie należy zatrzymać pompę.
  12. Należy ustawić szybkość przepływu pompy strzykawkowej oraz częstotliwość zbierania frakcji i uruchomić oba urządzenia jednocześnie, aby rozpocząć eksperyment. Frakcje należy zbierać przez pożądany czas trwania eksperymentu.

5. Konfiguracja systemu perfuzji z kranikiem do wielu źródeł pożywki

  1. Wykonaj wszystkie podpunkty kroku 4.1 opisanego powyżej.
  2. Przygotuj dwa podłoża do wykorzystania w perfuzji, oznaczając podłoże, które zostanie podane jako pierwsze, jako 1, a drugie jako podłoże 2.
  3. Dla każdej hodowli poddawanej perfuzji napełnij jedną strzykawkę ilością podłoża 1 wystarczającą na czas jego podawania, plus objętość niezbędną do początkowego wypełnienia systemu perfuzyjnego. Napełnij drugą strzykawkę ilością podłoża 2 wystarczającą na czas jego podawania.
  4. Podłącz obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterodrożnego kurka.
    UWAGA: Może być wymagany odcinek rurki do połączenia strzykawek z kurkami.
  5. Przygotuj kurek i strzykawki w sposób podobny do kroków 3.1.7-3.1.8 opisanych powyżej, zamykając kurek dla podłoża 1 i podając podłoże 2 do kurka, aż zacznie ono kapać z otwartego portu.
  6. Zamknij kurek dla podłoża 2 i podaj podłoże 1 do kurka, aż całe pozostałe podłoże 2 zostanie wypłukane z otwartego portu.
  7. Podłącz rurkę doprowadzającą do otwartego portu kurka za pomocą żeńskiego konektora Luer do kolca. Na drugim końcu rurki umieść męski konektor Luer do kolca.
  8. Podawaj podłoże 1 ze strzykawki, aż rurka doprowadzająca zostanie całkowicie wypełniona podłożem.
  9. Przejdź do kroków 4.3-4.1 opisanych powyżej, umieszczając obie strzykawki w oddzielnych pompach strzykawkowych i podając wyłącznie podłoże 1.
  10. Ustaw prędkość przepływu pompy strzykawkowej dla podłoża 1 oraz częstotliwość zbierania frakcji, a następnie uruchom obie maszyny jednocześnie, aby rozpocząć eksperyment.
  11. W momencie zmiany źródła podłoża szybko zatrzymaj pompę strzykawkową dla podłoża 1, przekręć kurek tak, aby zamknąć dopływ podłoża 1 i uruchom pompę strzykawkową dla podłoża 2. Jeśli będzie to wymagane w dalszej części, przełącz źródło z powrotem na podłoże 1 w analogiczny sposób.
  12. Zbieraj frakcje przez pożądany czas trwania eksperymentu.

6. Konfiguracja systemu perfuzyjnego z mieszalnikiem w celu naśladowania farmakokinetyki

  1. Pozyskaj dane farmakokinetyczne dla interesującego leku i upewnij się, że składają się one z piku stężenia, po którym następuje spadek wykładniczy.
  2. Po ustawieniu piku jako czas 0 i usunięciu punktów danych sprzed piku, użyj skryptu Stirred_Tank_Fit.m (Plik uzupełniający 6), aby dopasować równanie RTD dla zbiornika z mieszadłem do danych. Wprowadź v (pożądaną szybkość przepływu perfuzji) oraz dane do dopasowania jako parę wektorów bezpośrednio do skryptu, wraz z t i C odpowiednio dla wartości czasu i stężeń. Uruchom skrypt, aby wyświetlić parametr V, który jest wymaganą objętością zbiornika z mieszadłem.
  3. Zaprojektuj układ systemu perfuzyjnego, aby uwzględnić dwie pompy strzykawkowe i wstrząsarkę do płytek przed inkubatorem.
  4. Zmierz RTD komponentów systemu perfuzyjnego za kurkiem i przeprowadź splot sygnałów RTD z różnymi czasami trwania impulsu leku oraz stężeniami, aby znaleźć odpowiedni profil farmakokinetyczny. W tym obliczeniu wykorzystaj dopasowane równanie RTD dla zbiornika z mieszadłem.
  5. Przejdź do kroków 5.1-5.8 opisanych powyżej.
  6. Wykorzystaj dodatkową płytkę wielodołkową o odpowiednim rozmiarze jako zbiornik z mieszadłem dla układu. Każdy dołek może służyć jako zbiornik z mieszadłem dla jednej kultury perfuzyjnej. Napełnij dołek wymaganą objętością pożywki, V, a następnie zatkaj dołek igłami, które początkowo powinny być wysunięte do góry, a następnie dociśnięte do dna dołka, i zabezpiecz igły nasadkami.
  7. Załaduj strzykawki do pomp strzykawkowych i szybko podłącz przewody ze strzykawek do zabezpieczonych nasadkami igieł wlotowych zbiorników z mieszadłem. Następnie podłącz wloty rurek doprowadzających do hodowli komórkowej do igieł wylotowych zbiorników z mieszadłem.
  8. Przejdź do kroków 5.9-5.10.
  9. W wybranym czasie przełącz się na podawanie pożywki 2 zawierającej lek, zgodnie z opisem w kroku 5.1. Powróć do pożywki 1 po zakończeniu infuzji leku.
  10. Przejdź do kroku 5.12.

figure-protocol-1
Rycina 3: Wielogłowicowy dozownik. Projekt wycinanego laserowo wielogłowicowego dozownika. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie opracowania Erickson i wsp.1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do pomiaru dynamiki ekspresji genu reporterowego sterowanego przez czynnik jądrowy kappa-light-chain-enhancer aktywowanych limfocytów B (NF-κB) czynnik transkrypcyjny w ludzkich komórkach embrionalnej nerki 293 (HEK293) w odpowiedzi na 1,5-godzinny impuls czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α). Komórki HEK293 zostały stabilnie transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych z konstruktem genowym zawierającym lucyferazę Gaussia (GLuc), sterowaną przez promotor zwany NFKB zawierający NF-κelement odpowied...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy opisano montaż i działanie systemu perfuzyjnej hodowli komórkowej z wieloma źródłami pożywki, co wykazano na konkretnym przykładzie, w którym mierzono dynamikę ekspresji genów sterowanych przez NF-κB w odpowiedzi na przejściowy impuls TNF-α. Zmierzono i zamodelowano RTD elementów systemu perfuzyjnego, a konwolucję sygnału wykorzystano do przewidywania zarówno ekspozycji komórek na impuls TNF-α, jak i rozkładu TNF-α w zebranych frakcjach środowiska ściekowego. Komórki wystawiono na działanie impulsu, a frakcje zbi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie zostało przeprowadzone dzięki wsparciu w ramach grantów nr R01EB012521, R01EB028782 i T32 GM008339 od National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18 Gauge 1 1/2- calowa jednorazowa igła sondy do użytku ze strzykawkami i automatami dozującymiGrainger5FVK2
293T CellsATCCCRL-3216HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-dołkowe przezroczyste płyty dolne, CorningVWR89091-010Płytki do pomiaru stężeń barwnika w eksperymentach RTD i GLuc w eksperymencie z reprezentatywnymi wynikami.
BD  Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok, 5 mlFisher Scientific14-829-45
Kolekcjoner frakcji BioFrac Bio-Rad7410002Kolektor frakcji, który może być używany dla pojedynczego strumienia lub modyfikowany przy użyciu naszej metody, aby umożliwić zbieranie z wielu strumieni.
Przezroczysty, odporny na promieniowanie UV akryl o wysokiej wytrzymałości 12 "x 12" x 1/8 "McMaster-Carr4615T93Ten arkusz jest cięty za pomocą wycinarki laserowej zgodnie z plikiem DXF w materiałach uzupełniających w celu wytworzenia wielogłowicowego dozownika, który można podłączyć do kolektora frakcji BioFrac.
NanoLight Technology303Coelenterazinestosowany w teście bioluminescencji lucyferazy Gaussia w reprezentatywnych wynikach.
Płytki wielodołkowe Corning Costar z powłoką TC, rozmiar 48  studzienki, płyta polistyrenowa, studzienki z płaskim dnemMillipore Sigma CLS3548Służy do wzrostu i perfuzji komórek 293T w reprezentatywnych wynikach.
Corning  Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem, rozmiar 12 dołkówFisher Scientific720081Może być zatkany i używany jako zbiornik z mieszadłem w celu uzyskania profili farmakokinetycznych w perfuzji. Może również zawierać komórki do perfuzji.
DMEM, wysoka zawartość glukozyThermoFisher Scientific11965126
Epilog Zing 24 Laserowesystemy tnąceEpilog Zing 24Wycinarka laserowa służąca do produkcji wielogłowicowego dozownika z arkusza akrylowego. Można użyć innych wycinarek laserowych.
Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku, Luer-Lock, 20 mlFisher Scientific14-955-460
Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku, Luer-Lock, 60 mlFisher Scientific14-955-461
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 mlFisher Scientific05-408-129Probówki do mikrowirówek do zbierania frakcji.
Marka rybacka  Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowego z okrągłym dnem i gładkim końcemFisher Scientific14-961-26Szklane rurki do zbierania frakcji.
Marka rybacka  Końcówki do pipet SureOne Micropoint, uniwersalne dopasowanie, bez filtraFisher Scientific2707410końcówki do pipet 300 ul, które najlepiej pasują do wielogłowicowego dozownika i rurki, pełniąc funkcję końcówek dozujących.
Gibco  DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezuFisher Scientific21600010Sól fizjologiczna buforowana fosforanami.
Wytrząsarka do miana Labline 4625Marshall ScientificLabline 4625 Wytrząsarkaorbitalna służąca do utrzymywania mieszanych zbiorników w stanie mieszanym.
Złączka Masterflex, poliwęglanowa, czterokierunkowy kran odcinający, męska blokada Luer, niesterylna; 10/PKCole-ParmerEW-30600-04Służy do łączenia wielu strumieni wlotowych do eksperymentów RTD i eksperymentów z hodowlami komórkowymi.
Złączka Masterflex, Poliwęglan, Prosta, Żeńska Luer x Cap; 25/PKMasterflexUX-45501-28
Złączka Masterflex, Polipropylen, Prosta, Żeńska Adaptery Luer na Króciec do węża, 1/16"Cole-ParmerEW-45508-00
Złączka Masterflex, Polipropylen, Prosta, Męska Luer Lock do adaptera króćca, 1/16" IDCole-ParmerEW-45518-00
Złączka Masterflex, polipropylenowa, prosta, męska przejściówka Luer Lock na wtyczkę; 25/PKMasterflexEW-30800-30
Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, silikon utwardzany platyną, L/S 14; 25 stópMasterflexEW-96410-14
MATLABMathWorksR2019bWersja R2019b. Można również stosować nowsze wersje. Niektóre starsze wersje mogą działać.
NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowaNew Era Pump SystemsNE-1600
Zestaw stojaków F1Bio-Rad7410010Stojaki do przechowywania rurek zbiorczych w kolektorze frakcji.
Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa (eksprymowane HEK293),Bio-Techne10291-TA-020stosowana do stymulacji komórek 293T w reprezentatywnych wynikach.
Zatyczki Saint Gobain Solid, silikon pionowy, Rozmiar: 00, Dół 10.5mmSaint GobainDX263015-50Pasuje do płytek 48-dołkowych.
Zatyczki Saint Gobain Solid, silikon pionowy, Rozmiar: 4 Dół 21mmSaint GobainDX263027-10Pasuje do płytek 12-dołkowych.
Wodorotlenek sodu, 10,0 N roztwór wodny APHA; 1 LSpectrum ChemicalsS-395-1LT
Oprogramowanie CAD SolidWorksDassault SystemsSolidWorkssłużące do tworzenia pliku DXF dozownika wielogłowicowego.
Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUXCzytnik płytekThermoFisher ScientificVL0000D0
Wkład bazowy Wilton Color Right Performance Color System, BlueMichaels10404779Niebieski barwnik spożywczy zawierający Brilliant Blue FCF, używany jako znacznik w eksperymentach RTD. Widmo absorbancji osiąga szczyty przy 628 nm.
Natywny substrat cytokina CF .

Bibliografia

  1. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  2. Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).
  3. Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).
  4. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
  5. Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
  6. Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
  7. Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).
  8. Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
  9. Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
  10. Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
  11. Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).
  12. Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
  13. Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
  14. Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
  15. Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615(2019).
  16. Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
  17. Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
  18. Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
  19. Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
  20. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
  21. Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozk ad czasu przebywaniapompa strzykawkowakolektor frakcjimodel dyspersji osiowejp ytka wielodo kowaroztw r znacznikadyspersja substancji rozpuszczonej
Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.