Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Streszczenie

Niektóre funkcje komórek i tkanek działają w dynamicznej skali czasu od minut do godzin, które są słabo rozpoznawane przez konwencjonalne systemy hodowli. W ramach tych prac opracowano tani system bioreaktora perfuzyjnego, który umożliwia ciągłą perfuzję pożywki hodowlanej do modułu hodowli komórkowej i frakcjonowanie w module końcowym w celu pomiaru dynamiki w tej skali. System jest zbudowany prawie w całości z dostępnych na rynku części i może być równoległy w celu jednoczesnego przeprowadzania niezależnych eksperymentów na konwencjonalnych wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowych. W tym artykule wideo pokazano, jak zmontować konfigurację podstawową, która wymaga tylko jednej wielokanałowej pompy strzykawkowej i zmodyfikowanego kolektora frakcji do równoległego perfuzji do sześciu kultur. Przedstawiono również przydatne warianty konstrukcji modułowej, które pozwalają na kontrolowaną dynamikę stymulacji, takie jak impulsy substancji rozpuszczonej lub profile podobne do farmakokinetycznych. Co ważne, gdy sygnały substancji rozpuszczonej przechodzą przez system, są zniekształcone z powodu dyspersji substancji rozpuszczonej. Ponadto opisano metodę pomiaru rozkładów czasu przebywania (RTD) składników układu perfuzyjnego za pomocą znacznika przy użyciu MATLAB. Czujniki RTD są przydatne do obliczania, w jaki sposób sygnały substancji rozpuszczonej są zniekształcane przez przepływ w systemie wielokomorowym. System ten jest bardzo wytrzymały i powtarzalny, dzięki czemu badacze zajmujący się badaniami podstawowymi mogą go łatwo wdrożyć bez konieczności korzystania ze specjalistycznych zakładów produkcyjnych.

Wprowadzenie

Wiele ważnych procesów biologicznych zachodzi w hodowlach komórkowych i tkankowych w skali czasu od minut do godzin^1,2,3. Podczas gdy niektóre z tych zjawisk mogą być obserwowane i rejestrowane w sposób zautomatyzowany za pomocą mikroskopii poklatkowej⁴, bioluminescence¹ lub innych metod, eksperymenty polegające na pobieraniu próbek supernatantu do analizy chemicznej są często wykonywane ręcznie w statycznych hodowlach komórkowych. Ręczne pobieranie próbek ogranicza wykonalność niektórych badań ze względu na niedogodności związane z częstymi lub późniejszymi punktami czasowymi pobierania próbek. Do dalszych niedociągnięć metod hodowli statycznej należą eksperymenty polegające na kontrolowanych, przejściowych ekspozycjach na bodźce chemiczne. W hodowlach statycznych bodźce muszą być dodawane i usuwane ręcznie, a profile bodźców są ograniczone do skokowych zmian w czasie, podczas gdy zmiany pożywki również dodają i usuwają inne składniki pożywki, które mogą wpływać na komórki w niekontrolowany sposób⁵. Systemy fluidyczne mogą sprostać tym wyzwaniom, ale istniejące urządzenia stwarzają inne wyzwania. Urządzenia mikroprzepływowe wiążą się z zaporowymi kosztami specjalistycznego sprzętu i szkoleń do produkcji i użytkowania, wymagają metod mikroanalitycznych do przetwarzania próbek, a komórki są trudne do odzyskania z urządzeń po perfuzji⁶. Dla opisanych tutaj typów eksperymentów stworzono kilka systemów makrofluidycznych^7,8,9^,10, i są one zbudowane z wielu niestandardowych części wykonanych we własnym zakresie i wymagają wielu pomp lub kolektorów frakcji. Co więcej, autorzy nie są świadomi istnienia żadnych komercyjnie dostępnych systemów hodowli komórek z perfuzją makrofluidyczną innych niż bioreaktory zbiornikowe z mieszadłem do hodowli zawiesinowej, które są przydatne w bioprodukcji, chociaż nie są przeznaczone do modelowania i badania fizjologii.

Autorzy wcześniej opisywali projekt taniego systemu bioreaktora perfuzyjnego składającego się prawie wyłącznie z dostępnych na rynku części¹¹. Podstawowa wersja systemu umożliwia przechowywanie wielu kultur na płytce studzienkowej w inkubatorze CO₂ i ciągłe perfuzjowanie pożywką z pompy strzykawkowej, podczas gdy strumienie pożywki ściekowej z kultur są z czasem automatycznie frakcjonowane na próbki za pomocą kolektora frakcji z niestandardową modyfikacją. W ten sposób system ten umożliwia automatyczne pobieranie próbek supernatantu pożywki hodowlanej i ciągły dopływ substancji rozpuszczonej do kultur w czasie. System jest makrofluidyczny i modułowy i może być łatwo modyfikowany w celu zaspokojenia potrzeb nowatorskich projektów eksperymentalnych.

Ogólnym celem przedstawionej tutaj metody jest skonstruowanie, scharakteryzowanie i użycie systemu hodowli komórek perfuzyjnych, który umożliwia eksperymenty, w których mierzy się tempo wydzielania lub wchłaniania substancji przez komórki w czasie, i/lub komórki są narażone na precyzyjne, przejściowe sygnały substancji rozpuszczonej. W tym artykule wideo wyjaśniono, jak złożyć konfigurację podstawową, która jest w stanie perfować do sześciu kultur komórkowych jednocześnie za pomocą jednej pompy strzykawkowej i zmodyfikowanego kolektora frakcji. Przedstawiono również dwa użyteczne warianty systemu podstawowego, które wykorzystują dodatkowe pompy i części, aby umożliwić eksperymenty, które wystawiają komórki na przejściowe sygnały stężenia substancji rozpuszczonej, w tym krótkie impulsy i profile podobne do farmakokinetycznych¹², pokazane w Rysunek 1.

Rysunek 1: Trzy warianty projektu systemu perfuzyjnego. (Góra) Podstawowy system perfuzyjny. (Środek) System perfuzyjny z zaworem odcinającym dla wielu źródeł pożywki. (Na dole) System perfuzyjny ze zbiornikiem z mieszadłem naśladujący dobrze wymieszaną objętość dystrybucji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Z powodu rozproszenia i dyfuzji w przepływie, sygnały substancji rozpuszczonej stają się zniekształcone lub "rozmazane" podczas przemieszczania się przez system przepływu. Zniekształcenie to można określić ilościowo za pomocą rozkładów czasu przebywania (RTD)¹³. Ten artykuł wyjaśnia, jak przeprowadzać eksperymenty ze znacznikiem na komponentach systemu perfuzyjnego (Rysunek 2) i udostępnia skrypty MATLAB do generowania RTD na podstawie danych pomiarowych. Szczegółowe wyjaśnienie tej analizy można znaleźć w poprzednim artykule autorów¹¹. Dodatkowe skrypty MATLAB dopasowują odpowiednie funkcje do RTD i wyodrębniają parametry fizyczne, a także wykonują konwolucję sygnału za pomocą RTD, aby przewidzieć, w jaki sposób sygnał rozpuszczony wprowadzany przez użytkownika będzie propagowany i zniekształcany przez system perfuzyjny¹⁴.

Rysunek 2: Rozkłady czasu przebywania. Czujniki RTD elementów systemu przepływowego, takie jak ta długość rurki, są mierzone poprzez wprowadzenie impulsu znacznika do systemu i zmierzenie, w jaki sposób "rozmazuje się" on do czasu wyjścia do zebranych frakcji. Ten rysunek został zmodyfikowany z Erickson et al.¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotuj części do perfuzji na płytce studzienkowej

1. Przygotuj rurki
   1. Wytnij dwie długości silikonowej rurki (średnica wewnętrzna 1,6 mm) dla każdej hodowli komórkowej, która ma być perfekowana. Upewnij się, że element używany jako rurka przed inkubatorem jest wystarczająco długi, aby sięgać od pompy strzykawkowej do kultury komórkowej wewnątrz inkubatora oraz że dolny element może sięgać od kultury komórkowej do najdalej wysuniętej pozycji kolektora frakcji.
   2. Nadaj każdemu kawałkowi rurki unikalną etykietę na obu końcach za pomocą opisanej taśmy.
2. Przygotuj korki do płytki studzienki
   1. Zaopatrzyć się w jeden silikonowy korek dla każdej studzienki płytki studzienki, która ma być poddana perfuzji, o odpowiedniej średnicy, aby ściśle przylegała do studzienek z hermetycznym uszczelnieniem.
   2. Odetnij nadmiar materiału z dna korka tak, aby pasowały do studzienek, pozostawiając w środku miejsce na powietrze powyżej zamierzonego poziomu cieczy.
   3. Wciśnij dwie igły 18 G przez każdy korek, do góry i na zewnątrz od dołu, aby służyły jako wlot i wylot dla przepływu przez studnię, diametralnie naprzeciwko siebie, aby zmaksymalizować odległość między ich końcówkami w studni.
   4. Dostosuj wysokość igieł w zatkanej studzience, ponieważ wysokość igły wylotowej określi stabilną wysokość poziomu cieczy w studzience podczas perfuzji.
      UWAGA: Jeśli perfuzja zostanie rozpoczęta z igłą wylotową powyżej poziomu cieczy, płyn będzie gromadził się w studzience, aż poziom osiągnie igłę. Jeśli perfuzja rozpocznie się, gdy igła wylotowa znajduje się poniżej poziomu cieczy, poziom cieczy pozostanie stały, chyba że pęcherzyki powietrza wpadną do studni, co spowoduje obniżenie wysokości cieczy, aż osiągnie tę samą wysokość co igła wylotowa.
3. Zbierz dodatkowe części
   1. Zaopatrz się w jedną sterylną strzykawkę dla każdej hodowli komórkowej, która ma być poddana perfuzji, która jest wystarczająco duża, aby pomieścić wystarczającą ilość pożywki na całą perfuzję, plus dodatkową ilość pożywki do początkowego napełnienia rurki.
   2. Dla każdej kultury, która ma być perfprowadzona, należy uzyskać jeden żeński łącznik do zadzioru i dwa męskie do zadzioru Luer, a także dwie żeńskie i dwie męskie czapeczki Luer.
4. Oczyść i wysterylizuj części
   1. Jeśli części były używane wcześniej, wyczyść je, przetapiając je 0,1 N NaOH, a następnie spłucz wodą dejonizowaną.
   2. Poprzez autoklawowanie lub w inny sposób upewnij się, że wszystkie wymienione powyżej części są sterylne.

2. Wytnij laserowo wielogłowicowy dozownik i podłącz go do kolektora frakcji

1. Odtwórz model dozownika wielogłowicowego z Rysunek 3 w programie do projektowania wspomaganego komputerowo lub pobierz dostarczony plik DXF modelu (plik uzupełniający 1).
2. Użyj wycinarki laserowej, aby wyciąć wzór z arkusza akrylowego 1/8 cala.
3. Wykręć trzy mocujące głowicę dozującą do ruchomej podstawy kolektora frakcji.
4. Dopasuj trzy najmniejsze otwory w dozowniku wielogłowicowym do otworów na w ruchomej podstawie i wkręć z powrotem przez otwory, aby zamocować.
5. Wyreguluj dokręcenie trzech, aby ustawić dozownik wielogłowicowy pod kątem w górę iw dół, aż rząd otworów dozujących zrówna się z rurkami zbiorczymi pod nim.
6. Ostrożnie umieść końcówki do pipet o pojemności 300 μl w żądanych otworach, aby służyły jako końcówki dozujące.
   UWAGA: Kolektor frakcji może być używany bez dozownika wielogłowicowego do perfuzji pojedynczej kultury komórkowej.

3. Zmierz czujniki RTD komponentów i wykonaj konwolucję sygnału

1. Ustaw pompy i strzykawki dla impulsu znacznikowego, jak pokazano na Rysunek 2.
   1. Zaopatrz się w dwie jednokanałowe lub wielokanałowe pompy strzykawkowe.
   2. Wybierz rozwiązanie tła, które będzie reprezentować pożywkę, która będzie używana w systemie przepływu podczas eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Upewnij się, że roztwór tła ma podobne właściwości przenoszenia masy do podłoża. W wielu przypadkach woda dejonizowana jest odpowiednim wyborem.
   3. Wybierz substancję znacznikową, która będzie reprezentować substancję rozpuszczoną, która będzie przedmiotem zainteresowania podczas eksperymentów z hodowlą komórkową. Upewnij się, że znacznik ma podobne właściwości przenoszenia masy do substancji rozpuszczonej będącej przedmiotem zainteresowania, a jego stężenie musi być możliwe do zmierzenia. W wielu przypadkach barwnik spożywczy jest odpowiednim wyborem.
   4. Rozpuścić substancję znakującą w roztworze tła, aby uzyskać roztwór znacznikowy.
   5. Napełnić jedną strzykawkę roztworem tła i załadować ją do jednej pompy strzykawkowej. Napełnić kolejną strzykawkę roztworem znacznikowym i załadować ją do drugiej pompy strzykawkowej.
   6. Podłącz obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterokierunkowego zaworu odcinającego za pomocą złączy Luer.
   7. Zamknij kran do roztworu tła i pompuj roztwór znacznikowy do kranu, aż zacznie kapać z otwartego portu. Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki.
      UWAGA: Ważne jest, aby ruchoma belka pompy strzykawkowej została dociśnięta do tłoków strzykawki przed rozpoczęciem części eksperymentu z określonym czasem. Umożliwi to rozpoczęcie przepływu natychmiast po uruchomieniu pompy. W przeciwnym razie pompa może zostać uruchomiona, ale przepływ nie rozpocznie się, dopóki ruchomy pręt nie dogoni pozycji tłoka.
   8. Zamknąć zawór odcinający do roztworu znacznikowego i pompować roztwór tła do zaworu odcinającego, aż wszystkie pozostałe roztwory znacznikowe zostaną wypłukane z otwartego portu. Zatrzymać pompę i nie regulować dalej strzykawki.
2. Skonfiguruj interesujący Cię komponent systemu przepływu i kolektor frakcji
   1. Skonfiguruj komponent systemu przepływu żądany do analizy RTD. Upewnij się, że mierzony element jest zakończony kawałkiem rurki wylotowej o odpowiedniej długości i elastyczności, aby dotrzeć do kolektora frakcji podczas pracy.
   2. Włóż koniec rurki znajdującej się za nią do dozownika końcówki do pipet w dozowniku wielogłowicowym tak, aby był dobrze podłączony.
   3. Przymocuj otwarty port czterokierunkowego zaworu odcinającego do wlotu mierzonego elementu. Przepompuj roztwór tła przez składnik, aż zostanie całkowicie wypełniony, tak jak podczas eksperymentu z hodowlą komórkową, i zacznie kapać z końcówki dozującej kolektor frakcji. Zatrzymaj pompę.
3. Wstrzykiwanie impulsu znacznika, zbieranie frakcji i pomiar znacznika
   1. Ustawić pompę roztworu znacznikowego na żądane natężenie przepływu. Zamknąć zawór odcinający do roztworu tła i uruchomić przepływ roztworu znacznikowego. W tym samym czasie uruchom kolektor frakcji.
   2. Kontynuuj przepływ roztworu znacznika przez krótki okres czasu, aby przybliżyć impuls wejściowy znacznika. Stwierdzono, że czas trwania impulsu wynoszący 10 minut działa dobrze w przypadku czujników RTD przy natężeniu przepływu 1 ml/h,
      UWAGA: Jeśli impuls znacznika jest zbyt krótki, do przepływu nie dostanie się wystarczająca ilość znacznika, aby można go było zmierzyć. Jeśli impuls jest zbyt długi, nie będzie już przybliżał impulsu i zmieni kształt RTD.
   3. Pod koniec okresu impulsu roztworu znacznikowego zatrzymaj pompę roztworu znacznikowego. Szybko zamknij zawór odcinający do roztworu znacznikowego i rozpocznij przepływ roztworu tła z tą samą szybkością przepływu.
   4. Pozwolić, aby roztwór tła przepływał, a frakcje były zbierane, aż cały znacznik przejdzie przez system i przejdzie do zebranych frakcji.
   5. Zatrzymaj system i zmierz stężenie znacznika we frakcjach. Uwzględnij tylko te frakcje, które zostały dozowane w całości. Jeśli zbieranie zostanie zatrzymane w połowie zbierania ułamka, nie uwzględniaj tego ułamka.
4. Oblicz rozkład czasu przebywania (RTD) na podstawie danych pomiarowych w MATLAB
   UWAGA: Pisemne wyjaśnienie analizy przeprowadzonej przez ten skrypt MATLAB można znaleźć w poprzedniej publikacji autorów¹¹, a dyskusje na temat teorii są szeroko dostępne w literaturze¹³.
   1. Należy sporządzić plik .xlsx zawierający dane dotyczące stężenia w formacie arkusza kalkulacyjnego example_tracer_data.xlsx zamieszczonego w pliku uzupełniającym 2. Wprowadź wartości stężenia znacznika we frakcjach (dowolnych jednostkach) w porządku chronologicznym od lewej do prawej w wierszu 2. Wprowadź czas, jaki upłynął od początku impulsu do końca ostatniej frakcji w komórce A5, a następnie wprowadź długość impulsu znacznikowego w minutach w komórce A8.
   2. Zapisz plik .xlsx w katalogu MATLAB.
   3. Otwórz skrypt RTD_From_Data.m z pliku uzupełniającego 3 w edytorze MATLAB.
   4. Zastąp nazwę pliku .xlsx w nawiasach w pierwszym wierszu sekcji Załaduj dane skryptu nazwą nowego pliku danych .xlsx, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku skryptu. Uruchom skrypt.
   5. Upewnij się, że skrypt pomyślnie przeprowadza analizę RTD¹³, tworząc wykres RTD i zwracając wartość całki numerycznej nad RTD równą 1. Znajdź wektor czasu (t) i skojarzony wektor wartości RTD (Et) zapisany przez skrypt w katalogu MATLAB.
5. Dopasowywanie funkcji modelu do czujnika RTD w programie MATLAB
   1. Otwórz skrypt Fit_RTD_Function.m w edytorze MATLAB z pliku uzupełniającego 4.
   2. Wybierz jedną z trzech funkcji modelu z komentarzem, które mają być dopasowane do RTD: model dyspersji osiowej¹³, który pasuje do RTD dla przepływu laminarnego w rurach cylindrycznych; model CSTR¹³, który pasuje do dobrze wymieszanych zbiorników; oraz model n-CSTR ¹⁵, który w przybliżeniu pasuje do większych płyt studzienkowych. Aby dopasować inny model, który nie został tutaj uwzględniony, dodaj go do skryptu w tym samym formacie.
   3. Usuń komentarze w sekcji skryptu zawierającej model wybrany do dopasowania.
   4. Zmienić wartości początkowych przypuszczeń parametrów na wartości odpowiednie dla RTD.
   5. Uruchom skrypt, aby utworzyć wykres funkcji dopasowania nałożony na dane RTD i wydrukować wartości parametrów dopasowania dla tej funkcji. Jeśli dopasowanie jest bardzo słabe lub wystąpią błędy, zmień początkowe przypuszczenia parametru i ponownie uruchom skrypt.
6. Wykonaj konwolucję sygnału w MATLAB
   1. Wybierz jeden sygnał i jeden czujnik RTD lub dwa czujniki RTD do konwolucji.
   2. Otwórz skrypt Signal_Convolution.m z pliku uzupełniającego 5 w edytorze MATLAB.
   3. Dla każdego z dwóch sygnałów, które mają być konwojowane (tj. jeden sygnał i jeden czujnik czujnika czasu lub dwa czujniki RTD), należy zdefiniować jeden wektor równomiernie rozmieszczonych punktów czasowych w żądanych jednostkach i odpowiadający mu wektor wartości sygnału w tych czasach.
      UWAGA: Wektory obu sygnałów muszą mieć taką samą liczbę elementów i ten sam rozmiar kroków czasowych. Dlatego przydatne jest, aby RTD był funkcją ciągłą, która może być próbkowana dla dowolnej liczby punktów w dowolnym przedziale czasu.
   4. Wprowadź dwa sygnały do MATLAB i uruchom skrypt, aby uzyskać czas i wektory sygnału wyjściowego.

4. Ustaw podstawowy system perfuzyjny z komórkami w płytce studzienkowej

1. Przygotuj płytkę studzienki
   1. Upewnij się, że kultura na płytce studzienkowej ma odpowiednią głębokość podłoża do eksperymentu perfuzjowego. Wykonaj wszelkie końcowe zmiany pożywki, stymulacje lub inne kroki zgodnie z życzeniem przed rozpoczęciem perfuzji. Jeśli komórki zawiesiny są perfundowane, odwirować płytkę, aby upewnić się, że znajdują się na dnie.
   2. W sterylnych warunkach włożyć korki z igłami do kultur na płytce studzienki z podciągniętymi igłami. Po umieszczeniu korka opuść igły do żądanej wysokości w celu perfuzji, ponieważ wysokość igły wylotowej określa stabilny poziom płynu.
   3. Pokryj igły męskimi nasadkami Luer i trzymaj całą studzienkę w inkubatorze do czasu użycia.
2. Przygotować strzykawki i rurki poprzedzające
   1. W sterylnych warunkach napełnij jedną strzykawkę dla każdej kultury, która ma być perfuzjona, wystarczającą ilością pożywki na pożądany czas trwania perfuzji oraz wystarczającą ilością dodatkowego podłoża, aby napełnić rurkę znajdującą się przed nią.
   2. Podłącz rurkę wylotową do strzykawki za pomocą złącza Luer typu żeńskiego do zadziorowego. Na drugim końcu rurki włóż złącze Luer męsko-kolczaste.
   3. Dozować pożywkę ze strzykawki do momentu, gdy górna probówka zostanie całkowicie wypełniona medium.
   4. Zakryj otwarty koniec rurki żeńską nasadką Luer.
      UWAGA: W tym momencie wszystkie strzykawki z repliką muszą mieć dokładnie taką samą objętość. Jeśli ich objętości nie są równe, ich tłoki będą znajdować się w różnych pozycjach i nie wszystkie będą dobrze pasować do jednej wielokanałowej pompy strzykawkowej.
3. W sterylnych warunkach włóż złącze Luer męsko-kolczaste do jednego końca rurki wylotowej i przykryj je żeńską nasadką Luer.
4. Ostrożnie przynieś wszystkie przygotowane rurki, strzykawki i płytkę studzienkową do inkubatora, który będzie używany do perfuzji.
5. Umieścić pompę strzykawkową i kolektor frakcji w żądanych miejscach w pobliżu inkubatora. Umieść pompę strzykawkową na górze inkubatora lub w jego pobliżu, a kolektor frakcji umieść obok inkubatora, w pobliżu portu.
6. Zwiąż ze sobą zaślepione końce wszystkich rurek przed i za inkubatorem i wepchnij je z zewnątrz inkubatora do środka przez port.
7. Załadować strzykawki do pompy strzykawkowej i włożyć otwarte końce rurek znajdujących się za nią do końcówek pipet dozujących wielogłowicowego dozownika frakcji.
8. Wewnątrz inkubatora należy wciągnąć do inkubatora jak najwięcej luzu rurek wylotowych, aby zmaksymalizować długość przewodów, przez które przepływające medium może odbierać ciepło i CO2 z powietrza inkubatora. Trzymając je na miejscu, wyciągnij rurki znajdujące się za inkubatorem na tyle, aby były w stanie dotrzeć do najdalszego wysuniętego punktu kolektora frakcji, jednocześnie utrzymując zakryte końce wewnątrz inkubatora.
9. Dla każdej zatkanej studzienki szybko odkręć igły oraz rurki przed i za tą studnią i przymocuj je razem ze złączami Luer.
10. Po podłączeniu wszystkich części należy na krótko uruchomić pompę strzykawkową ze stosunkowo dużą prędkością, aby upewnić się, że wszystkie strumienie przepływają prawidłowo.
11. W tym momencie, jeśli pożądane jest rozpoczęcie eksperymentu z rurkami wylotowymi pełnymi medium, kontynuuj pracę pompy, aż wszystkie zostaną napełnione. W przeciwnym razie zatrzymaj pompę.
12. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej i częstotliwość zbierania frakcji i uruchom obie maszyny jednocześnie, aby rozpocząć eksperyment. Zbierz ułamki na żądany czas trwania eksperymentu.

5. Ustaw system perfuzyjny z kranem dla wielu źródeł medium

1. Wykonaj wszystkie kroki podrzędne z kroku 4.1 powyżej.
2. Przygotuj dwa podłoża do użycia w perfuzji, oznaczając pożywkę, która zostanie dozowana jako pierwszą, jako 1, a drugą jako pożywkę 2.
3. Aby każda kultura została poddana perfuzji, napełnij jedną strzykawkę wystarczającą ilością pożywki 1 na czas jej dozowania, plus wystarczającą objętość, aby początkowo napełnić system perfuzyjny. Napełnić drugą strzykawkę wystarczającą ilością pożywki 2 na czas jej dozowania.
4. Podłączyć obie strzykawki do dwóch z trzech portów czterokierunkowego krana odcinającego.
   UWAGA: Może być wymagany odcinek rurki do podłączenia strzykawek do zaworów odcinających.
5. Przygotować kran i strzykawki w podobny sposób, jak w krokach 3.1.7-3.1.8 powyżej, zamykając kran do pożywki 1 i dozując medium 2 do kranu do momentu, aż zacznie kapać z otwartego portu.
6. Zamknij kran do poziomu medium 2 i wlej medium 1 do zaworu odcinającego, aż cała pozostała pożywka 2 zostanie wypłukana z otwartego portu.
7. Podłącz rurkę wylotową do otwartego portu kurka za pomocą złącza Luer typu żeńskiego do zadziorowego. Na drugim końcu rurki włóż złącze Luer męsko-kolczaste.
8. Dozować pożywkę 1 ze strzykawki, aż górna probówka zostanie całkowicie wypełniona medium.
9. Postępuj zgodnie z krokami 4.3-4.11 powyżej, ładując obie strzykawki do oddzielnych pomp strzykawkowych i dozując tylko pożywkę 1.
10. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej dla pożywki 1 i częstotliwość zbierania frakcji, a następnie uruchom obie maszyny jednocześnie, aby rozpocząć eksperyment.
11. Gdy ma zostać zmienione źródło medium, należy szybko zatrzymać pompę strzykawkową dla medium 1, przekręcić zawór odcinający na medium 1 i uruchomić pompę strzykawkową dla medium 2. Jeśli zajdzie taka potrzeba później, przełącz źródło z powrotem na medium 1 w podobny sposób.
12. Zbierz ułamki na żądany czas trwania eksperymentu.

6. Ustaw system perfuzyjny z mieszadłem, aby naśladować farmakokinetykę

1. Należy uzyskać dane farmakokinetyczne dla leku będącego przedmiotem zainteresowania i upewnić się, że składa się on ze szczytu stężenia, po którym następuje wykładniczy rozpad
.
2. Po ustawieniu wartości szczytowej na czas 0 i usunięciu punktów danych przed szczytem, należy użyć skryptu Stirred_Tank_Fit.m (plik uzupełniający 6), aby dopasować równanie RTD zbiornika z mieszadłem do danych. Wprowadź v (pożądane natężenie przepływu perfuzji) i dane, które mają być dopasowane jako para wektorów bezpośrednio do skryptu, wraz z t i C odpowiednio dla wartości czasu i wartości stężenia. Uruchom skrypt, aby wydrukować parametr V, który jest wymaganą objętością zbiornika z mieszadłem.
3. Zaplanuj układ systemu perfuzyjnego tak, aby zawierał dwie pompy strzykawkowe i wytrząsarkę płytkową przed inkubatorem.
4. Zmierzyć RTD elementów systemu perfuzyjnego poza kranem i przeprowadzić splot sygnału RTD z różnymi czasami trwania impulsów i stężeniami leku, aby znaleźć odpowiedni profil farmakokinetyczny . W obliczeniach należy użyć równania RTD dopasowanego zbiornika z mieszadłem.
5. Wykonaj kroki 5.1-5.8 powyżej.
6. Użyj dodatkowej płytki studzienkowej o odpowiednim rozmiarze jako zbiornika z mieszadłem do konfiguracji. Każda studzienka może służyć jako zbiornik z mieszadłem dla jednej perfuzji kultury. Napełnij studzienkę wymaganą objętością podłoża, V i zatkaj studzienkę igłami początkowo podciągniętymi do góry, a następnie wepchniętymi na dno studzienki i zakryj igły.
7. Załadować strzykawki do pomp strzykawkowych i szybko podłączyć rurki ze strzykawek do zaślepionych igieł wlotowych mieszanych zbiorników. Następnie podłącz wloty rurki przed kulturą komórkową do igieł wylotowych mieszanych zbiorników.
8. Wykonaj kroki 5.9-5.10.
9. W żądanym czasie przełączyć się na pożywkę 2 zawierającą lek, zgodnie z opisem w kroku 5.11. Przełącz z powrotem na pożywkę 1 po zakończeniu infuzji leku.
10. Przejdź do kroku 5.12.

Rysunek 3: Dozownik wielogłowicowy. Konstrukcja dla wycinanego laserowo dozownika wielogłowicowego. Ten rysunek został zmodyfikowany z Erickson et al.¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

System perfuzji z wieloma źródłami pożywki z sekcji 5 protokołu został użyty do pomiaru dynamiki ekspresji genu reporterowego napędzanego przez czynnik transkrypcyjny kappa-light-chain-enhancer aktywowanych komórek B (NF-κB) w ludzkich komórkach embrionalnych nerek 293 (HEK293) w odpowiedzi na 1,5-godzinny impuls czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α). Komórki HEK293 stabilnie transdukowano za pomocą wektorów lentiwirusowych z konstruktem genu zawierającym lucyferazy Gaussia (GLuc), napędzanym przez promotor o nazwie N...

Dyskusja

W pracy opisano montaż i działanie systemu perfuzyjnej hodowli komórkowej z wieloma źródłami pożywki, co wykazano na konkretnym przykładzie, w którym mierzono dynamikę ekspresji genów sterowanych przez NF-κB w odpowiedzi na przejściowy impuls TNF-α. Zmierzono i zamodelowano RTD elementów systemu perfuzyjnego, a konwolucję sygnału wykorzystano do przewidywania zarówno ekspozycji komórek na impuls TNF-α, jak i rozkładu TNF-α w zebranych frakcjach środowiska ściekowego. Komórki wystawiono na działanie impulsu, a frakcje zbi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
18 Gauge 1 1/2- calowa jednorazowa igła sondy do użytku ze strzykawkami i automatami dozującymi	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-dołkowe przezroczyste płyty dolne, Corning	VWR	89091-010	Płytki do pomiaru stężeń barwnika w eksperymentach RTD i GLuc w eksperymencie z reprezentatywnymi wynikami.
BD  Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok, 5 ml	Fisher Scientific	14-829-45
Kolekcjoner frakcji BioFrac	Bio-Rad	7410002	Kolektor frakcji, który może być używany dla pojedynczego strumienia lub modyfikowany przy użyciu naszej metody, aby umożliwić zbieranie z wielu strumieni.
Przezroczysty, odporny na promieniowanie UV akryl o wysokiej wytrzymałości 12 "x 12" x 1/8 "	McMaster-Carr	4615T93	Ten arkusz jest cięty za pomocą wycinarki laserowej zgodnie z plikiem DXF w materiałach uzupełniających w celu wytworzenia wielogłowicowego dozownika, który można podłączyć do kolektora frakcji BioFrac.
NanoLight Technology	303	Coelenterazine	stosowany w teście bioluminescencji lucyferazy Gaussia w reprezentatywnych wynikach.
Płytki wielodołkowe Corning Costar z powłoką TC, rozmiar 48  studzienki, płyta polistyrenowa, studzienki z płaskim dnem	Millipore Sigma CLS3548		Służy do wzrostu i perfuzji komórek 293T w reprezentatywnych wynikach.
Corning  Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem, rozmiar 12 dołków	Fisher Scientific	720081	Może być zatkany i używany jako zbiornik z mieszadłem w celu uzyskania profili farmakokinetycznych w perfuzji. Może również zawierać komórki do perfuzji.
DMEM, wysoka zawartość glukozy	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laserowe	systemy tnące	Epilog Zing 24	Wycinarka laserowa służąca do produkcji wielogłowicowego dozownika z arkusza akrylowego. Można użyć innych wycinarek laserowych.
Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku, Luer-Lock, 20 ml	Fisher Scientific	14-955-460
Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku, Luer-Lock, 60 ml	Fisher Scientific	14-955-461
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129	Probówki do mikrowirówek do zbierania frakcji.
Marka rybacka  Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowego z okrągłym dnem i gładkim końcem	Fisher Scientific	14-961-26	Szklane rurki do zbierania frakcji.
Marka rybacka  Końcówki do pipet SureOne Micropoint, uniwersalne dopasowanie, bez filtra	Fisher Scientific	2707410	końcówki do pipet 300 ul, które najlepiej pasują do wielogłowicowego dozownika i rurki, pełniąc funkcję końcówek dozujących.
Gibco  DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu	Fisher Scientific	21600010	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami.
Wytrząsarka do miana Labline 4625	Marshall Scientific	Labline 4625 Wytrząsarka	orbitalna służąca do utrzymywania mieszanych zbiorników w stanie mieszanym.
Złączka Masterflex, poliwęglanowa, czterokierunkowy kran odcinający, męska blokada Luer, niesterylna; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Służy do łączenia wielu strumieni wlotowych do eksperymentów RTD i eksperymentów z hodowlami komórkowymi.
Złączka Masterflex, Poliwęglan, Prosta, Żeńska Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Złączka Masterflex, Polipropylen, Prosta, Żeńska Adaptery Luer na Króciec do węża, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Złączka Masterflex, Polipropylen, Prosta, Męska Luer Lock do adaptera króćca, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Złączka Masterflex, polipropylenowa, prosta, męska przejściówka Luer Lock na wtyczkę; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, silikon utwardzany platyną, L/S 14; 25 stóp	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Wersja R2019b. Można również stosować nowsze wersje. Niektóre starsze wersje mogą działać.
NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowa	New Era Pump Systems	NE-1600
Zestaw stojaków F1	Bio-Rad	7410010	Stojaki do przechowywania rurek zbiorczych w kolektorze frakcji.
Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa (eksprymowane HEK293),	Bio-Techne	10291-TA-020	stosowana do stymulacji komórek 293T w reprezentatywnych wynikach.
Zatyczki Saint Gobain Solid, silikon pionowy, Rozmiar: 00, Dół 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Pasuje do płytek 48-dołkowych.
Zatyczki Saint Gobain Solid, silikon pionowy, Rozmiar: 4 Dół 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Pasuje do płytek 12-dołkowych.
Wodorotlenek sodu, 10,0 N roztwór wodny APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
Oprogramowanie CAD SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	służące do tworzenia pliku DXF dozownika wielogłowicowego.
Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUX	Czytnik płytek	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Wkład bazowy Wilton Color Right Performance Color System, Blue	Michaels	10404779	Niebieski barwnik spożywczy zawierający Brilliant Blue FCF, używany jako znacznik w eksperymentach RTD. Widmo absorbancji osiąga szczyty przy 628 nm.