Artykuł metodologiczny

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

DOI:

10.3791/63939

⸱

25 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Computer Science and Engineering, Washington University in St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie Drosophila melanogaster (muszki owocowej) jako organizmu modelowego zapewniło znaczący postęp w wielu dziedzinach nauk biologicznych, od organizacji komórek i badań genomicznych po badania behawioralne. Ze względu na zgromadzoną wiedzę naukową, w ostatnich latach Drosophila została sprowadzona do dziedziny modelowania chorób człowieka, w tym chorób serca. W prezentowanej pracy opisano eksperymentalny system monitorowania i manipulowania funkcją serca w kontekście całego żywego organizmu przy użyciu światła czerwonego (617 nm) i bez procedur inwazyjnych. Kontrolę nad sercem uzyskano za pomocą narzędzi optogenetycznych. Optogenetyka łączy ekspresję światłoczułych transgenicznych opsyn i ich aktywację optyczną w celu regulacji interesującej tkanki biologicznej. W niniejszej pracy wykorzystano niestandardowy zintegrowany system obrazowania optycznej tomografii koherentnej (OCT) i stymulacji optogenetycznej do wizualizacji i modulacji funkcjonującego serca D. melanogaster w 3. stadium rozwoju larwy i wczesnej poczwarki. Podwójny system genetyczny UAS/GAL4 został wykorzystany do ekspresji halorodopsyny (eNpHR2.0) i przesuniętej ku czerwieni rodopsyny kanałowej (ReaChR), w szczególności w sercu muchy. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat przygotowania D. melanogaster do obrazowania OCT na żywo i stymulacji optogenetycznej. Opracowane w laboratorium oprogramowanie integracyjne przetworzyło dane obrazowe w celu stworzenia prezentacji wizualnych i ilościowych charakterystyk funkcji serca Drosophila. Wyniki wskazują na możliwość zainicjowania zatrzymania krążenia i bradykardii spowodowanej aktywacją eNpHR2.0 oraz wykonania stymulacji serca po aktywacji ReaChR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pod koniec 2010 roku czasopismo Nature Methods wybrało optogenetykę jako Metodę Roku1. Wykorzystanie narzędzi genetycznych (transgenicznych opsyn) regulowanych światłem do kontrolowania tkanek biologicznych będących przedmiotem zainteresowania z niespotykaną precyzją i szybkością otworzyło wrota do nowych zastosowań. Do tej pory większość osiągnięć należy do neurobiologii. Technologia ta została wprowadzona jako nowa metoda precyzyjnej kontroli pojedynczych neuronów2 i przyczyniła się do osiągnięć w dziedzinie funkcji poznawczych żywego organizmu3. Od samego początku neuronaukowcy wykazywali zdolność do modulowania zachowania całego organizmu. Ekspresja i aktywacja światłem opsyny ChR2 w neuronach dopaminergicznych myszy powodowały ich aktywację i były wystarczające do napędzania warunkowania behawioralnego4. Optogenetyczne hamowanie podzbioru neuronów zawierających halorodopsynę NpHR2.0 dostarczanych do ogniska padaczkowego mózgu gryzonia spowodowało osłabienie napadów elektroencefalograficznych5.

Zastosowania optogenetyczne w kardiologii rozwijają się w stałym tempie6. ChR2 ulegał pomyślnej ekspresji w hodowli komórkowej kardiomiocytów i u myszy; Stymulację serca przeprowadzono za pomocą błysków niebieskiego światła (wykonanych przy użyciu wszczepionego włókna żywym zwierzętom)7. U danio pręgowanego ChR2 wyrażono i wykorzystano do identyfikacji obszaru serca powodującego rozrusznik serca; Aktywacja NpHR indukowała zatrzymanie akcji serca8. Optogenetyczne spacje serca mają unikalny potencjał do opracowywania nowych terapii stymulacji i resynchronizacji9. Ostatnio donoszono również o próbach stworzenia systemu terminacji autogennej arytmii10.

Szeroko zakrojone badania i rozwój nowych metod leczenia wymagają zastosowania różnych systemów modelowych, od hodowli komórkowych po ssaki. Serce kręgowca jest bardzo złożonym narządem. Kardiomiocyty (CM) stanowią jedną trzecią wszystkich komórek serca; Inne komórki obejmują neurony, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i komórki niepobudliwe (tj. Komórki śródbłonka, fibroblasty i komórki odpornościowe). Badania nad hodowlą komórek CM ograniczają przełożenie uzyskanych wyników na zastosowania medyczne u ludzi. Manipulacje genetyczne organizmów modelowych ssaków są ograniczone i czasochłonne. Mniejsze modele bezkręgowców mają wiele zalet; Ich układ sercowo-naczyniowy przenosi wszystkie niezbędne elementy histologiczne. Drosophila melanogaster (muszka owocowa) to prosty i potężny system modeli genetycznych do badania roli genów związanych z chorobami człowieka, w tym chorobami serca11,12,13. Muszki owocowe, jako zwierzęta krótkowieczne, stanowią doskonałą okazję do modelowania zmian funkcji serca zależnych od wieku lub choroby, które można śledzić przez całe życie14,15,16,17. Rurka serca muszki owocowej znajduje się na grzbietowej stronie jej ciała w odległości 200 μm od powierzchni naskórka, dzięki czemu światło widzialne lub bliskiej podczerwieni dociera do rurki serca. Ta cecha anatomiczna umożliwia nieinwazyjną stymulację optyczną serca Drosophila przy użyciu istniejących narzędzi optogenetycznych.

Aby monitorować serce Drosophila, opracowano niestandardowy system obrazowania optycznej tomografii koherentnej (SD-OCT) w domenie spektralnej ze zintegrowanym modułem wzbudzenia LED światła czerwonego18. Zmiany morfologiczne i rytmiczne w stosunkowo prostym sercu muszki owocowej można łatwo przeanalizować za pomocą tej nieinwazyjnej technologii obrazowania biomedycznego12,19,20,21. Dzięki zwiększonej wydajności sekcji optycznej i rozdzielczości przestrzennej w skali mikronów, OCT został z powodzeniem wykorzystany do badania struktury i monitorowania funkcji serca Drosophila na różnych etapach rozwoju, w tym larwy w trzecim stadium rozwojowym i wczesnej pupa18. System ten umożliwia również jednoczesne monitorowanie i stymulację stanu serca Drosophila u nienaruszonego zwierzęcia. Schemat systemu OCT jest pokazany w Rysunek 1. System SD-OCT wykorzystuje diodę superluminescencyjną (SLD) jako źródło światła (środkowa długość fali: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, patrz Tabela materiałów). Korzystając z soczewki obiektywowej 10x, system obrazowania OCT może osiągnąć rozdzielczość osiową ~4,4 μm w powietrzu i ~3,3 μm w tkance oraz rozdzielczość boczną ~2,8 μm, wystarczającą do rozpoznania drobnych szczegółów struktur serca muchy18,22. Sygnały interferencyjne światła odbitego od ramienia referencyjnego i ramienia próbki są wykrywane za pomocą spektrometru z kamerą do skanowania liniowego o rozdzielczości 2048 pikseli (maksymalna częstotliwość linii: 80 kHz, patrz tabela materiałów). Zmierzona czułość systemu wynosi ~95,1 dB. Każdy skan OCT w trybie B generuje obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie obrazu xz. Powtarzające się obrazy w trybie B są rejestrowane w tym samym miejscu, aby utworzyć obrazy w trybie M rejestrujące bijące serce przez ponad ~30 s18,22,23. Liczba klatek na sekundę dla obrazowania w trybie M wynosi ~125 klatek/s, co wystarcza do uchwycenia dynamiki bicia serca muszki owocowej.

Do optogenetycznej regulacji funkcji serca Drosophila, moduł oświetleniowy ze źródłem światła LED 617 nm jest zintegrowany z ramieniem próbki systemu SD-OCT. Światło stymulacyjne skupia się na plamce o średnicy ~2,2 mm na powierzchni próbki, w tej samej pozycji, co plamka ostrości obrazowania. Specjalnie napisane oprogramowanie służy do sterowania trybem oświetlenia (natężenie światła, szerokość impulsu i cykl pracy), regulacji częstotliwości stymulacji impulsów świetlnych oraz synchronizacji oświetlenia modułu LED i akwizycji obrazowania OCT w trybie M22.

Ostatnie publikacje opisywały system transgeniczny Drosophila składający się z czasowo regulowanych opsyn ChR2, ReaChR i eNpHR2.0 przy użyciu systemu genetycznego UAS/GAL4. Uzyskane wyniki wykazały zdolność do inicjowania zatrzymania akcji serca i bradykardii spowodowanych aktywacją eNpHR2.0 światłem czerwonym oraz stymulacji serca o wyższej częstotliwości spowodowanej aktywacją ChR2 światłem niebieskim. Podobne eksperymenty stymulacyjne przeprowadzono z inną rodopsyną kanałową, ReaChR, indukowaną przez oświetlenie światłem czerwonym22,23,24. Ekspresja opsyny we wszystkich opisanych eksperymentach była napędzana przez 24B-GAL4, gdzie ekspresję opsyny obserwowano w szerokim zakresie tkanek, w tym w kardiomiocytach i otaczających komórkach mięśniowych. W obecnym badaniu 24B-GAL4 został zastąpiony sterownikiem Hand-GAL4 w celu uzyskania specyficznej dla serca ekspresji opsyn eNpHR2.0 i ReaChR.

Ogólnie, przedstawione wyniki eksperymentalne pokazują możliwe do przywrócenia zatrzymanie akcji serca oraz indukowaną bradykardię i tachykardię choroby serca. Dostępny jest szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi tworzenia transgenicznych modeli Drosophila i prowadzenia jednoczesnego obrazowania OCT i eksperymentów z stymulacją optogenetyczną na żywych zwierzętach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla niniejszego badania, transgeniczna linia eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, linia transgeniczna ReaChR w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO i specyficzny dla serca sterownik GAL4 zawierający fragment regulatorowy genu ręki w[1118]; Użyto P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (ten zapas sterownika będzie oznaczony jako Hand-GAL4). y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 został użyty jako linia reporterska GFP. Wspomniane zapasy Drosophila zostały uzyskane z Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, patrz Tabela Materiałów) i utrzymywane w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 18 °C na standardowych podłożach z mąki kukurydzianej. Modele Drosophila opracowane w tym badaniu są dostępne na żądanie do wspólnej pracy.

1. Krzyżówki genetyczne Drosophila i przygotowanie pożywki

  1. Zmień równoważnik 3. chromosomu TM3 Sb[1] na TM6 Sb Tb, tworząc w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Patrz rysunek uzupełniający 1 dla schematu skrzyżowania. Zestaw krzyżówek w fiolkach ze zwykłą pożywką z mąki kukurydzianej.
    UWAGA: Obecność markera gruźlicy pozwala użytkownikom odróżnić larwy i poczwarki zawierające transgen opsyny i sterownik GAL4 od zwierząt zawierających opsynę, ale bez driver25.
  2. Krzyżówki genetyczne należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 25 °C i wilgotności 70% na specjalnie opracowanych pożywkach zawierających all-trans retinaI (ATR) (patrz tabela materiałów) w ciemności przez 5 dni w przypadku pobierania larw i 6 dni w przypadku pobierania poczwarek.
  3. Połącz pięć dziewiczych samic Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb i dwóch do trzech samców z zapasów UAS-opsin (eNpHR2.0 lub ReaChR) w jednej fiolce. Zobacz diagram krzyżowy dla opsyny eNpHR2.0 i ReaChR odpowiednio w Rysunek 2A i Rysunek 2B.
  4. Następnego dnia należy przygotować fiolki z pożywką zawierającą ATR.
    1. Przygotuj Semi-Defined Food zgodnie z instrukcjami BDSC26. Zamiast sacharozy i glukozy dodaj tylko sacharozę (5,14 g/100 ml). Schłodzić do ~60 °C przy ciągłym mieszaniu.
    2. Przygotować wąskie fiolki i dodać 50 μl 100 mM roztworu etanolu ATR do każdej fiolki.
    3. Za pomocą pipety serologicznej wyrzucić pokarm na muchy do wąskich fiolek na muchy, 5 ml na fiolkę. Wir z maksymalną prędkością przez 10 s.
    4. Podłącz fiolki i zawiń je w ciemną tkaninę, aby chronić je przed światłem. Pozostaw fiolki do wyschnięcia na co najmniej 12 godzin (przez noc).
  5. Następnego dnia przenieś muchy równomiernie składające jaja z Kroku 1.3. do fiolek z pokarmem zawierającym ATR (Krok 1.4.4.). Chronić stojaki z fiolkami przed światłem.
  6. Po 24-48 godzinach (w zależności od liczby złożonych jaj) wyrzuć rodziców, aby zapobiec przepełnieniu fiolki.
  7. Zbierz potomstwo inne niż gruźlica i użyj go do obrazowania serca.
    UWAGA: Różnice fenotypowe w stadiach larwalnych i poczwarkowych są pokazane w Rysunek 2C. Podsumowanie i przybliżony harmonogram etapów przygotowania próbki są pokazane na Rysunek 3.

2. Optogenetyczna kontrola serca Drosophila

  1. Pobrać larwę/poczwarkę UAS-opsin/Hand-GAL4 z fiolki (Krok 1.7), nałożyć chusteczkę i delikatnie zetrzeć podłoże z powierzchni ciała za pomocą pędzla malarskiego.
  2. Przygotuj szkiełko mikroskopowe i umieść na środku mały kawałek taśmy dwustronnej.
  3. Za pomocą pędzla lub cienkiej pęsety delikatnie umieść larwę/poczwarkę na powierzchni taśmy grzbietową stroną do góry i prostopadle do dłuższego boku szkiełka. Delikatnie dociśnij, aby przymocować larwę/poczwarkę do powierzchni taśmy.
  4. Ustaw szkiełko na stoliku do obrazowania, larwa/poczwarka skierowana w dół.
  5. Włącz źródło światła OCT za pomocą oprogramowania sterującego laserem (patrz Tabela materiałów). Otwórz niestandardowe oprogramowanie sterujące SD-OCT, a następnie kliknij okno Podgląd.
  6. Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu SD-OCT.
    UWAGA: Celem jest wyrównanie próbki w celu optymalnego obrazowania bijącego serca, tak aby wybór zakresu X i zakresu Y obejmował obszar serca. Na tym etapie zarówno liczba skanów A, jak i B-skanów wynosi 400. Zakres w kierunkach x i y wynosi ~490 μm i ~537 μm, co pokazuje odpowiednio dwa ortogonalne przekroje czynne serca (xz i yz).
  7. Użyj mikromanipulatorów, aby kontrolować sample stage, aby skupić się na sercu muchy. Dostosuj pozycję ogniskowej, aby zminimalizować odbicie światła od powierzchni naskórka muchy. Rozważ nałożenie oleju mineralnego na powierzchnię larwy/poczwarki, aby zminimalizować odbicia.
    UWAGA: Olej może zwiększać ryzyko przemieszczania się zwierząt poprzez pogorszenie właściwości klejących taśmy.
  8. Upewnij się, że serce muchy może być w pełni widoczne w oknie obrazu bez żadnych zniekształceń, zablokowania przez tkankę oraz istotnych cieni i odbić; w przeciwnym razie wróć do kroku 2.7.
  9. Ustaw parametry skanowania dla akwizycji obrazu OCT w trybie M.
    UWAGA: Liczba skanów A jest zmniejszona w porównaniu z krokiem 2.7. aby uzyskać większą liczbę klatek na sekundę, aby uchwycić dynamikę bicia serca muchy (kilka Hz). Liczba skanów B oznacza liczbę powtarzających się klatek dla obrazowania w trybie M, którą można dostosować w zależności od czasu nagrywania i dostępnej pamięci systemowej. W tym eksperymencie 128 skanów A może pozwolić na prędkość ~125 klatek / s, a 4,000 powtarzających się skanów B jest nagrywanych, co zapewnia ciągły zapis ~32 s.
  10. Uzyskaj pięć zestawów danych kontrolnych bez impulsów stymulacji światłem czerwonym, aby obliczyć tętno spoczynkowe (RHR).
  11. Zaprojektuj impuls świetlny do stymulacji stymulacji w niestandardowym oprogramowaniu sterującym OCT. W "Ustawieniach" dodaj zaprojektowane sekwencje impulsów świetlnych, aby kontrolować częstotliwość impulsów, szerokość impulsu, czas trwania stymulacji i czas oczekiwania zgodnie z różnymi protokołami stymulacji.
    UWAGA: RHR jest mierzony na podstawie eksperymentu kontrolnego bez oświetlenia światłem i używany do obliczania częstotliwości, z jaką światło powinno pulsować w eksperymentach z tachypacingiem i bradypacingiem22.
  12. Otwórz oprogramowanie sterownika światła (patrz Tabela materiałów), aby wygenerować impulsy światła czerwonego. Wybierz tryb impulsowy w "Wybór trybu". Kliknij dwukrotnie rysunek ustawień "Profil impulsu" i wybierz tryb obserwującego. Utrzymuj intensywność OFF na 0 i ustaw procent intensywności ON po obliczeniu rzeczywistej gęstości mocy.
    UWAGA: Impulsy świetlne stymulacji są wyzwalane sygnałem z oprogramowania sterującego OCT zgodnie z ustawieniami w kroku 2.12.
  13. Uzyskaj filmy w trybie M bijącego serca Drosophila ze stymulacją świetlną, klikając Acquire w oprogramowaniu sterującym OCT. Powtórz pomiary 5x.

3. Analiza obrazu

  1. Otwórz specjalnie opracowane oprogramowanie do segmentacji serca muchy.
  2. Kliknij Wybierz plik, a następnie wybierz plik do analizy w wyświetlonym graficznym interfejsie użytkownika.
  3. Wprowadź pionowe i poziome granice obszaru serca w pikselach w górnych polach tekstowych. Kliknij Zmień rozmiar. Za pomocą suwaka na dole upewnij się, że cały obszar serca jest widoczny i że wypełnia całe pudełko dla całej kolekcji. Jeśli tak nie jest, powtórz ten proces i dostosuj granice.
  4. Kliknij Przewiduj, aby przewidzieć region serca. Program przejdzie teraz przez każdy wycinek w kolekcji i wybierze region serca, co zajmie około 3 minut.
  5. Kliknij na HR Plot po zakończeniu prognozy. Spowoduje to otwarcie nowego okna wyświetlającego wykres obszaru serca w czasie. Upewnij się, że wybrano właściwe obszary szczytu lub doliny. Wybierz Pulse, a następnie HR, aby wygenerować ostateczną figurę, a parametry funkcjonalne zostaną jednocześnie zapisane w .csv plikach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D. zwierzęta melanogasterowe wykazujące ekspresję wrażliwych na czerwone światło opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w probówce serca zostały wygenerowane przez uzyskanie potomstwa ze skrzyżowania każdej linii transgenicznej UAS-opsin i sterownika Hand-GAL4. Swoistość tkankową sterownika GAL4 zweryfikowano za pomocą obrazowania ekspresji GFP (Figura 4). Wykorzystano larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym i wczesne stadia rozwojowe poczwarki, aby zademonstrować efekty aktywacji eNpHR2.0 i ReaChR przez światło czerwone. Zaprojektowane impulsy światła czerwonego o długości ~617 nm, dostarczane przez diodę LED, oświetliły larwę/poczwarkę i aktywowały eNpHR2.0 i ReaChR w sercu. Chociaż zgłaszana maksymalna długość fali odpowiedzi NpHR wynosi ~580 nm, a ReaChR wynosi ~600 nm, oświetlenie światłem 617 nm może przenikać głębiej dzięki zwiększonemu dostarczaniu energii świetlnej w kierunku tkanki serca wyrażającej opsynę22.

Zamontowana na szkiełku mikroskopowym grzbietem do dołu w układzie odwróconego mikroskopu, larwa/poczwarka była oświetlona wiązką światła LED skierowaną na segment ciała A7. Przykładowe obrazy przekrojów poprzecznych ciała są pokazane w Rysunek 5A i Rysunek 6A. Serce pojawia się jako kurczący się i rozszerzający się okrągły kształt w nagraniach wideo składających się z 4000 klatek (Filmy uzupełniające 1-6). Aby naśladować różne choroby serca, zaprojektowano cztery rodzaje impulsów świetlnych. Pojedynczy impuls trwający 10 s po 5 sekundach czasu oczekiwania powodował możliwe do przywrócenia zatrzymanie akcji serca wywołane przez eNpHR2.0, jak pokazano na Rysunek 5B. W przypadku stymulacji serca przy częstotliwościach wolniejszych niż tętno spoczynkowe (RHR), w której pośredniczy eNpHR2.0, zastosowano dwie sekwencje impulsów świetlnych o częstotliwościach stymulacji równych RHR/2 i RHR/4 trwające 8 s z czasem oczekiwania 6 s pomiędzy nimi (Rysunek 5C). Cykl pracy każdej sekwencji impulsów świetlnych wynosił 90%. Ten schemat stymulacji światłem spowodował stan serca przypominający bradykardię. Wzorzec stymulacji w celu zwiększenia częstości akcji serca w wyniku aktywacji ReaChR składał się z trzech sekwencji impulsów świetlnych o częstotliwościach odpowiednio RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz i RHR + 1,5 Hz, o szerokości impulsu 20 ms (Rysunek 5D). Ten schemat pulsu miał na celu wywołanie tachykardii serca. Gęstość mocy światła wynosiła 7,49 mW/mm2 podczas wszystkich eksperymentów. W eksperymentach kontrolnych nie ustawiono oświetlenia świetlnego.

Każdy eksperymentalny wariant został zarejestrowany pięć razy. Filmy w trybie M z sercem muchy zostały przetworzone na maski 2D za pomocą FlyNet 2.027. To oprogramowanie automatycznie segmentuje obszar serca w celu wytworzenia zestawów danych dotyczących funkcji serca. Program zapewnia maskę serca w każdej klatce, którą w razie potrzeby można dodatkowo skorygować ręcznie, aby wygenerować dokładną kwantyfikację parametrów funkcjonalnych bijącego serca, takich jak tętno (HR), wymiar końcoworozkurczowy (EDD) i wymiar końcowoskurczowy (ESD), skrócenie frakcyjne (FR), obszar końcoworozkurczowy (EDA), obszar końcowoskurczowy (ESA) itp. Tętno jest mierzone poprzez analizę obszaru serca w czasie. Film kontrolny bez impulsów świetlnych służy do ustalenia wyjściowego tętna (np. RHR) dla każdego zwierzęcia.

Rysunek 5B i Rysunek 6B pokazuje zatrzymanie akcji serca o długości 10 s spowodowane aktywacją Hand>eNpHR2.0 za pomocą czerwonego światła (617 nm) odpowiednio u larwy i poczwarki. Po włączeniu czerwonego światła serce Drosophila przestało bić i pozostało w tym stanie do końca świecenia światłem. Funkcja serca została przywrócona po wyłączeniu czerwonego światła. Zwierzęta, które nie miały wyrażonej opsyny (kontrola "brak opsyny"), nie reagowały na oświetlenie światłem czerwonym (rysunek uzupełniający 2A i rysunek uzupełniający 3A). Eksperymenty kontrolne ze zwierzętami Hand>eNpHR2.0, w których 10-sekundowe oświetlenie światłem czerwonym nie było włączone (kontrola "brak światła"), wykazały normalne bicie serca (rysunek uzupełniający 4A i rysunek uzupełniający 4C).

Używając zwierząt >Hand>eNpHR2.0, zastosowano impulsy światła czerwonego o częstotliwościach niższych niż RHR. Częstotliwość skurczów serca zmniejszyła się po sygnałach świetlnych; to wolniejsze tętno naśladuje jeden rodzaj arytmii serca, bradykardię (Ryc. 5C i Rycina 6C odpowiednio dla larw i poczwarek). Wolniejszego tempa pracy serca nie zaobserwowano w eksperymentach kontrolnych "bez opsyny" (rysunek uzupełniający 2B i rysunek uzupełniający 3B) oraz w eksperymentach kontrolnych "bez światła" (rysunek uzupełniający 4A i rysunek uzupełniający 4C).

Zwiększenie tętna można osiągnąć poprzez aktywację opsyny >Hand>ReaChR za pomocą pociągów impulsów światła czerwonego o częstotliwości wyższej niż RHR danego zwierzęcia. Serię trzech ciągów impulsów świetlnych o różnych częstotliwościach stymulacji (np. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) zastosowano na sercach larw i poczwarek Hand>ReaChR. Uzyskane dane wyraźnie pokazują przyspieszone tętno po impulsach świetlnych (Rysunek 5D i Rysunek 6D odpowiednio dla larwy i poczwarki). Stan serca wykazany w tych eksperymentach naśladuje tachykardię. Eksperymenty kontroli ujemnej przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2C, rysunku uzupełniającym 3C i rysunku uzupełniającym 4B,D.

Ogólnie, wyniki pokazują wykonalność nieinwazyjnej i specyficznej optogenetycznej kontroli rytmu serca na różnych etapach rozwoju w transgenicznych modelach zwierzęcych D. melanogaster.

figure-results-1
Rysunek 1: System obrazowania OCT zintegrowany z modułem LED 617 nm do optogenetycznej kontroli funkcji serca Drosophila. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Generowanie zwierząt D. melanogaster wyrażających opsynę w sercu. (A) Genetyczny diagram krzyżowy. Samice Hand-GAL4/TM6 SbTb skrzyżowano z samcami nosicielami eNpHR2.0. Powstałe w ten sposób potomstwo Hand-GAL4/eNpHR2.0 (oznaczone czerwoną gwiazdą) zebrano do obrazowania OCT, a Hand-GAL4/TM6 Sb Tb odrzucono na podstawie ich wyglądu fenotypowego. (B) Genetyczny schemat krzyżowy. Samice Hand-GAL4/TM6 SbTb skrzyżowano z samcami noszącymi ReaChR. Powstałe w ten sposób potomstwo Hand-GAL4/ReaChR (oznaczone czerwoną gwiazdą) zebrano do obrazowania OCT, a Hand-GAL4/TM6 Sb Tb odrzucono na podstawie ich wyglądu fenotypowego. (C) Różnice fenotypowe między potomstwem Hand-GAL4/opsin (czerwona gwiazda) a potomstwem Hand-GAL4/TM6 Tb. Zwierzęta będące nosicielami mutacji genu Tb na chromosomie TM6 mają "pulchny" kształt ciała w porównaniu z normalnymi larwami lub poczwarkami bez Tb. Lewy panel pokazuje larwy; Prawy panel pokazuje wczesne poczwarki. Obrazy zawierają również linijkę z oznaczeniami 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schematyczna prezentacja i chronologia procedur przygotowania obrazowania. Stado rodzicielskie jest trzymane w butelkach na muchy; Dziewicze samice i samce krzyżuje się w wąskich fiolkach wypełnionych zwykłym pokarmem (oznaczonym żółtym kolorem). Aktywnie składające jaja muchy są przenoszone do fiolek zawierających pożywki ATR (pokazane na brązowo). Od tego etapu fiolki z rozwijającym się potomstwem należy przechowywać w ciemności. Larwy w trzecim stadium rozwojowym i wczesne poczwarki są pobierane ze ścianek fiolki w celu obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: D. melanogaster wczesna poczwarka wyrażająca UAS-GFP (BDSC 6658) napędzana przez Hand-GAL4 (BDSC 48396). Wzór fluorescencji potwierdza swoistość serca sterownika Hand-GAL4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Symulacja zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u larw D. melanogaster. (A) Obraz OCT przekroju poprzecznego ciała larw. Serce pojawia się jako okrąg pod powierzchnią ciała. (B) Graficzne przedstawienie możliwego do przywrócenia zatrzymania krążenia. Górny panel pokazuje czas (oś X) podświetlenia światłem czerwonym (oś Y, procent poziomu mocy źródła światła). Środkowy panel wskazuje zmianę obszaru serca (oś Y, mikrometry kwadratowe) w czasie (oś X). Dolny panel pokazuje zmianę tętna (oś Y, herce) w czasie (oś X). (C) Graficzna prezentacja możliwej do odtworzenia bradykardii za pośrednictwem eNpHR2.0. Górny panel pokazuje impulsy oświetlenia światłem czerwonym, wywołujące dwa okresy bradykardii: 50% RHR i 25% RHR. Obszar serca i zmiany tętna są pokazane odpowiednio na środkowym i dolnym panelu. (D) Graficzne przedstawienie stymulacji serca za pomocą aktywowanego ReaChR. Górny panel pokazuje serię impulsów światła czerwonego o długości 20 ms występujących przy częstotliwościach RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz i RHR + 1,5 Hz. Skurcze serca podążają za częstotliwościami impulsów świetlnych, jak pokazano na środkowym i dolnym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Symulacja zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u poczwarki D. melanogaster. (A) Obraz OCT przekroju poprzecznego poczwarki. Serce pojawia się jako okrąg pod powierzchnią ciała. (B) Graficzne przedstawienie możliwego do przywrócenia zatrzymania krążenia. Górny panel pokazuje czas (oś X) podświetlenia światłem czerwonym (oś Y, procent poziomu mocy źródła światła). Środkowy panel wskazuje zmianę obszaru serca (oś Y, mikrometry kwadratowe) w czasie (oś X). Dolny panel pokazuje zmianę tętna (oś Y, herce) w czasie (oś X). (C) Graficzna prezentacja możliwej do odtworzenia bradykardii za pośrednictwem eNpHR2.0. Górny panel pokazuje impulsy oświetlenia światłem czerwonym, wywołujące dwa okresy bradykardii: 50% RHR i 25% RHR. Środkowy i dolny panel pokazują odpowiednio obszar serca i zmiany tętna. (D) Graficzne przedstawienie stymulacji serca za pomocą aktywowanego ReaChR. Górny panel pokazuje serię impulsów czerwonego światła o długości 20 ms przy częstotliwościach RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz i RHR + 1,5 Hz. Skurcze serca podążają za częstotliwościami impulsu świetlnego, jak pokazano na środkowym i dolnym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Krzyżówki genetyczne w celu zastąpienia chromosomu równoważącego TM3 Sb chromosomem TM6 Sb Tb. Dziewicze samice Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb zostały skrzyżowane z samcami nub-GAL4NP3537 tub-GAL80w+/ TM6 Sb Tb samców. Wybrano potomstwo Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb, w tym dziewicze samice i samce, (badanie przesiewowe pod kątem pigmentowanych oczu w połączeniu z pulchnym kształtem ciała). Wybrane muchy zostały samodzielnie skrzyżowane w celu stworzenia stabilnego stada. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: W eksperymentach kontrolnych, rytm serca larwy typu dzikiego (wt) nie zmienia się po oświetleniu światłem czerwonym. (A) Nie zaobserwowano zatrzymania akcji serca podczas oświetlenia światłem czerwonym u larwy wt. Górny panel pokazuje obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas oświetlenia. Środkowy i dolny panel pokazują obszar serca i tętno w czasie obrazowania 32 s. (B,C) Impulsy czerwonego światła nie zmieniają tętna u larw wt. Górne panele pokazują obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas oświetlenia. Środkowy i dolny panel pokazują obszar serca i tętno w czasie obrazowania 32 s. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: W eksperymentach kontrolnych, rytm serca poczwarki typu dzikiego (wt) nie zmienia się po zapaleniu czerwonym światłem. (A) Nie zaobserwowano zatrzymania akcji serca podczas oświetlenia światłem czerwonym u larw wt. Górny panel pokazuje obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas oświetlenia. Środkowy i dolny panel pokazują obszar serca i tętno w czasie obrazowania 32 s. (B,C) Impulsy światła czerwonego nie zmieniają tętna w poczwarce WT. Górne panele pokazują obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas oświetlenia. Środkowy i dolny panel pokazują obszar serca i tętno w czasie obrazowania 32 s. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

>Rysunek uzupełniający 4: Larwy i poczwarki D. melanogaster wyrażające Hand>eNpHR2.0 lub Hand>ReaChR nie wykazują znaczących zmian HR podczas obrazowania OCT bez oświetlenia światłem czerwonym. (A) Tętno larwy Hand>eNpHR2.0. (B) Tętno larwy Hand>ReaChR. (C) Tętno poczwarki Hand>eNpHR2.0. (D) Tętno poczwarki Hand>ReaChR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo 1: Aktywowany eNpHR2.0 powoduje zatrzymanie akcji serca u larwy D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo 2: Aktywowany eNpHR2.0 powoduje zatrzymanie akcji serca u poczwarki D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo 3: Odtworzona bradykardia za pośrednictwem eNpHR2.0 u larwy D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo 4: Odtworzona bradykardia za pośrednictwem eNpHR2.0 w poczwarce D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo 5: Stymulacja serca przez aktywowany ReaChR u larwy D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo 6: Stymulacja serca przez aktywowany ReaChR u poczwarki D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z naszymi poprzednimi raportami, w których ekspresja opsyn była napędzana nie tylko w sercu, ale także w otaczających tkankach mięśniowych, w obecnej pracy wykorzystano sterownik specyficzny dla serca, Hand-GAL4. Ta nowa konfiguracja genetyczna Hand> opsyna stosowana do optogenetycznej regulacji serca dodatkowo potwierdza wcześniej zgłoszone wyniki i ustanawia lepszy model badań sercowo-naczyniowych Drosophila .

Przygotowanie podłoża ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia eksperymentów. Białka opsyny wymagają do działania liganda, all-trans retinalu (ATR)28. Muchy nie wytwarzają wystarczającej ilości ATR, więc ATR musi być uzupełniany do pożywki muchowej. W tym badaniu wcześniej zgłoszona żywność instant została zastąpiona pożywkami półzdefiniowanymi29. Nowa receptura pożywek zawierających ATR została wprowadzona w celu zapewnienia równomiernego rozprowadzania ATR. ATR nie rozpuszcza się w wodzie; gdy zapas ATR na bazie etanolu 100 mM jest dodawany do pożywki na bazie wody, jest on rozpraszany przez wirowanie fiolek zawierających ciepłe pożywki półzdefiniowane. Również wcześniej zgłaszane stężenie ATR zostało zmniejszone z 10 mM dla eNpHR2.0 i 3 mM dla ReaChR22 do 1 mM stężenia końcowego dla obu. Stężenie to jest wystarczające do zapewnienia prawidłowej funkcji eNpHR2.0 i ReaChR.

Istotnym elementem sukcesu eksperymentu jest ulepszone przetwarzanie danych za pomocą FlyNet 2.027. Laboratorium kontynuuje rozwój tego oprogramowania, aby poprawić zarówno wydajność obliczeniową, jak i dokładność algorytmu automatycznej segmentacji serca muchy. Maski przekrojowe wytwarzane przez to oprogramowanie służą do uzyskiwania danych fizjologicznych Drosophila , takich jak skrócenie frakcyjne i prędkość ściany serca. Takie podejście umożliwiło wydajną analizę danych przy minimalnym nadzorze człowieka, dzięki czemu charakterystyka funkcji serca w dużych zestawach danych obrazowania serca jest szybsza i bardziej wiarygodna.

Zawał mięśnia sercowego pozostaje główną przyczyną zgonów, a niedokrwienie mięśnia sercowego przyczynia się do dwóch trzecich wszystkich przypadków niewydolności serca, która szybko staje się jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności w Stanach Zjednoczonych30. Opracowywanie nowych środków terapeutycznych i wyrobów medycznych wymaga dogłębnej wiedzy na temat mechanizmów zaburzeń pracy serca na poziomie fizjologicznym i biochemicznym. Cele te można osiągnąć za pomocą organizmów modelowych. D. melanogaster stał się jednym z najbardziej niezawodnych i wydajnych modeli 31,32,33,34,35. W ramach tych prac stworzono symulowane modele zaburzeń serca Drosophila indukowanych przez nieinwazyjne podejście optogenetyczne. Rozwój nieinwazyjnych technologii optycznej stymulacji serca stanowi podstawę do opracowania alternatywy dla tradycyjnych elektrycznych urządzeń do stymulacji serca. Wykorzystanie OCT do obserwacji czynności serca w czasie rzeczywistym pozwala na dokładne scharakteryzowanie odpowiedniej fizjologii serca w modelach Drosophila w zaawansowanych badaniach, w tym badaniach przesiewowych kandydatów na leki. Obrazowanie OCT ma głębokość penetracji ~1 mm, co dobrze sprawdza się w badaniach serca Drosophila, ale ogranicza jego zastosowanie do charakteryzowania funkcji serca w większych modelach zwierzęcych. Co więcej, bezpośrednie przełożenie badań nad Drosophila na modele ssaków stanowi wyzwanie. Konieczne jest opracowanie nowych narzędzi optogenetycznych, aby poprawić czułość opsyn i przetłumaczyć je na różne systemy modelowe, w tym danio pręgowanego, myszy, szczury i organoidy ludzkiego serca, do badań sercowo-naczyniowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Andreyowi Komarovowi, Yuxuan Wangowi i Jiantao Zhu za pomoc w analizie danych oraz dziękują członkom laboratorium Zhou za ich cenne dyskusje. Prace w laboratorium dr Zhou były wspierane przez fundusz startowy z Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis, granty National Institutes of Health (NIH) R01-EB025209 i R01-HL156265 oraz Clayco Foundation Innovative Research Award.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
All-trans retinalCayman Chemicals18449
Bacto PeptoneGibco02-10-2025
Moduł sterujący źródłem światła BioLED, 4-kanałowyMigtex SystemsBLS-SA04-USCzęść modułu stymulacji optogenetycznej
Szerokopasmowy moduł źródła światłaSuperlumcBLMD-T-850-HPCzęść systemu obrazowania SD-OCT
Cobra-S Spektrometry 800 OCT  Wasatch PhotonicsCS800-840/180-80-OC2K-U3Część systemu obrazowania SD-OCT
Delikatne wycieraczki do zadańKimberly-Clark Profesjonalne34155tkanki
Drosophila agarGenesee Scientific66-103
Butelki do hodowli DrosophilaGenesee Scientific32-131
Oprogramowanie FlyNet 2.0Z-LabNiestandardowe oprogramowanie do segmentacji serca muchy i analizy funkcji serca opracowane w laboratorium Zhou
Źródła kolimatorów LED dużej mocyMigtex SystemsBLS-LCS-0617-03-22Część modułu stymulacji optogenetycznej
Nieaktywne suche drożdżeGenesee Scientific62-106
Preparaty mikroskopoweAmScopeBS-72P
Wąskie zatyczki do hodowli DrosophilaGenesee Scientific59-200
Wąskie fiolki do hodowli DrosophilaGenesee Scientific32-116SB
Trwała taśmadwustronna Zatyczki Scotch
do butelek DrosophilaGenesee Scientific59-194
Kwas propionowySigmaP1386-1L
SD-OCT Oprogramowanie sterująceZ-LabNiestandardowe oprogramowanie do akwizycji obrazu i kontroli stymulacji opracowane w laboratorium Zhou
SD-OCT i optogenetyczny system obrazowania i stymulacji optogenetycznejZ-LabObrazowanie i optogenetyczne systemy stymulacji opracowane w laboratorium Zhou (~ 50 tys. USD BOM)
SacharozaCarolina89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 41752eNpHR2.0 linia transgeniczna
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyOBloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 53748Linia transgeniczna ReaChR
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 48396Specyficzny dla serca sterownik GAL4 zawierający fragment regulatorowy genu ręki
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock #6658Linia reporterska GFP
Ekstrakt drożdżowyLab Scientific bioKEMIX978-907-4243

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nature Methods. Method of the Year 2010. Nature Methods. 8, 1(2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Tsai, H. -C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  5. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
  6. Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
  7. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  8. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  9. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
  10. Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
  11. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  12. Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  13. Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).
  14. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596(2009).
  15. Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
  16. Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).
  17. Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
  18. Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002(2016).
  19. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
  20. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
  21. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  22. Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
  23. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Science Advances. 1 (9), 1500639(2015).
  24. Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73(2019).
  25. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila melanogaster. , Elsevier. (1992).
  26. Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022).
  27. Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
  28. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  29. Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56(2019).
  31. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
  34. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  35. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drosophila Heart ModelsOCT ImagingHeart PacingRed Light StimulationChannelrhodopsin ActivationHalorhodopsin ExpressionUAS GAL4 SystemCardiac Arrhythmia Models

Powiązane artykuły