Artykuł metodologiczny

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63939

⸱

25 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Computer Science and Engineering, Washington University in St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Streszczenie

Użycie Drosophila melanogaster (muszki owocowej) jako organizmu modelowego zapewniło znaczący postęp w wielu dziedzinach nauk biologicznych, od organizacji komórek i badań genomicznych po badania behawioralne. Ze względu na zgromadzoną wiedzę naukową, w ostatnich latach Drosophila została sprowadzona do dziedziny modelowania chorób człowieka, w tym chorób serca. W prezentowanej pracy opisano eksperymentalny system monitorowania i manipulowania funkcją serca w kontekście całego żywego organizmu przy użyciu światła czerwonego (617 nm) i bez procedur inwazyjnych. Kontrolę nad sercem uzyskano za pomocą narzędzi optogenetycznych. Optogenetyka łączy ekspresję światłoczułych transgenicznych opsyn i ich aktywację optyczną w celu regulacji interesującej tkanki biologicznej. W niniejszej pracy wykorzystano niestandardowy zintegrowany system obrazowania optycznej tomografii koherentnej (OCT) i stymulacji optogenetycznej do wizualizacji i modulacji funkcjonującego serca D. melanogaster w 3. stadium rozwoju larwy i wczesnej poczwarki. Podwójny system genetyczny UAS/GAL4 został wykorzystany do ekspresji halorodopsyny (eNpHR2.0) i przesuniętej ku czerwieni rodopsyny kanałowej (ReaChR), w szczególności w sercu muchy. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat przygotowania D. melanogaster do obrazowania OCT na żywo i stymulacji optogenetycznej. Opracowane w laboratorium oprogramowanie integracyjne przetworzyło dane obrazowe w celu stworzenia prezentacji wizualnych i ilościowych charakterystyk funkcji serca Drosophila. Wyniki wskazują na możliwość zainicjowania zatrzymania krążenia i bradykardii spowodowanej aktywacją eNpHR2.0 oraz wykonania stymulacji serca po aktywacji ReaChR.

Wprowadzenie

Pod koniec 2010 roku czasopismo Nature Methods wybrało optogenetykę jako Metodę Roku1. Wykorzystanie narzędzi genetycznych (transgenicznych opsyn) regulowanych światłem do kontrolowania tkanek biologicznych będących przedmiotem zainteresowania z niespotykaną precyzją i szybkością otworzyło wrota do nowych zastosowań. Do tej pory większość osiągnięć należy do neurobiologii. Technologia ta została wprowadzona jako nowa metoda precyzyjnej kontroli pojedynczych neuronów2 i przyczyniła się do osiągnięć w dziedzinie funkcji poznawczych żywego organizmu3. Od samego początku neuronaukowcy wykazywali zdolność do modulowania zachowania całego organizmu. Ekspresja i aktywacja światłem opsyny ChR2 w neuronach dopaminergicznych myszy powodowały ich aktywację i były wystarczające do napędzania warunkowania behawioralnego4. Optogenetyczne hamowanie podzbioru neuronów zawierających halorodopsynę NpHR2.0 dostarczanych do ogniska padaczkowego mózgu gryzonia spowodowało osłabienie napadów elektroencefalograficznych5.

Zastosowania optogenetyczne w kardiologii rozwijają się w stałym tempie6. ChR2 ulegał pomyślnej ekspresji w hodowli komórkowej kardiomiocytów i u myszy; Stymulację serca przeprowadzono za pomocą błysków niebieskiego światła (wykonanych przy użyciu wszczepionego włókna żywym zwierzętom)7. U danio pręgowanego ChR2 wyrażono i wykorzystano do identyfikacji obszaru serca powodującego rozrusznik serca; Aktywacja NpHR indukowała zatrzymanie akcji serca8. Optogenetyczne spacje serca mają unikalny potencjał do opracowywania nowych terapii stymulacji i resynchronizacji9. Ostatnio donoszono również o próbach stworzenia systemu terminacji autogennej arytmii10.

Szeroko zakrojone badania i rozwój nowych metod leczenia wymagają zastosowania różnych systemów modelowych, od hodowli komórkowych po ssaki. Serce kręgowca jest bardzo złożonym narządem. Kardiomiocyty (CM) stanowią jedną trzecią wszystkich komórek serca; Inne komórki obejmują neurony, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i komórki niepobudliwe (tj. Komórki śródbłonka, fibroblasty i komórki odpornościowe). Badania nad hodowlą komórek CM ograniczają przełożenie uzyskanych wyników na zastosowania medyczne u ludzi. Manipulacje genetyczne organizmów modelowych ssaków są ograniczone i czasochłonne. Mniejsze modele bezkręgowców mają wiele zalet; Ich układ sercowo-naczyniowy przenosi wszystkie niezbędne elementy histologiczne. Drosophila melanogaster (muszka owocowa) to prosty i potężny system modeli genetycznych do badania roli genów związanych z chorobami człowieka, w tym chorobami serca11,12,13. Muszki owocowe, jako zwierzęta krótkowieczne, stanowią doskonałą okazję do modelowania zmian funkcji serca zależnych od wieku lub choroby, które można śledzić przez całe życie14,15,16,17. Rurka serca muszki owocowej znajduje się na grzbietowej stronie jej ciała w odległości 200 μm od powierzchni naskórka, dzięki czemu światło widzialne lub bliskiej podczerwieni dociera do rurki serca. Ta cecha anatomiczna umożliwia nieinwazyjną stymulację optyczną serca Drosophila przy użyciu istniejących narzędzi optogenetycznych.

Aby monitorować serce Drosophila, opracowano niestandardowy system obrazowania optycznej tomografii koherentnej (SD-OCT) w domenie spektralnej ze zintegrowanym modułem wzbudzenia LED światła czerwonego18. Zmiany morfologiczne i rytmiczne w stosunkowo prostym sercu muszki owocowej można łatwo przeanalizować za pomocą tej nieinwazyjnej technologii obrazowania biomedycznego12,19,20,21. Dzięki zwiększonej wydajności sekcji optycznej i rozdzielczości przestrzennej w skali mikronów, OCT został z powodzeniem wykorzystany do badania struktury i monitorowania funkcji serca Drosophila na różnych etapach rozwoju, w tym larwy w trzecim stadium rozwojowym i wczesnej pupa18. System ten umożliwia również jednoczesne monitorowanie i stymulację stanu serca Drosophila u nienaruszonego zwierzęcia. Schemat systemu OCT jest pokazany w Rysunek 1. System SD-OCT wykorzystuje diodę superluminescencyjną (SLD) jako źródło światła (środkowa długość fali: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, patrz Tabela materiałów). Korzystając z soczewki obiektywowej 10x, system obrazowania OCT może osiągnąć rozdzielczość osiową ~4,4 μm w powietrzu i ~3,3 μm w tkance oraz rozdzielczość boczną ~2,8 μm, wystarczającą do rozpoznania drobnych szczegółów struktur serca muchy18,22. Sygnały interferencyjne światła odbitego od ramienia referencyjnego i ramienia próbki są wykrywane za pomocą spektrometru z kamerą do skanowania liniowego o rozdzielczości 2048 pikseli (maksymalna częstotliwość linii: 80 kHz, patrz tabela materiałów). Zmierzona czułość systemu wynosi ~95,1 dB. Każdy skan OCT w trybie B generuje obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie obrazu xz. Powtarzające się obrazy w trybie B są rejestrowane w tym samym miejscu, aby utworzyć obrazy w trybie M rejestrujące bijące serce przez ponad ~30 s18,22,23. Liczba klatek na sekundę dla obrazowania w trybie M wynosi ~125 klatek/s, co wystarcza do uchwycenia dynamiki bicia serca muszki owocowej.

Do optogenetycznej regulacji funkcji serca Drosophila, moduł oświetleniowy ze źródłem światła LED 617 nm jest zintegrowany z ramieniem próbki systemu SD-OCT. Światło stymulacyjne skupia się na plamce o średnicy ~2,2 mm na powierzchni próbki, w tej samej pozycji, co plamka ostrości obrazowania. Specjalnie napisane oprogramowanie służy do sterowania trybem oświetlenia (natężenie światła, szerokość impulsu i cykl pracy), regulacji częstotliwości stymulacji impulsów świetlnych oraz synchronizacji oświetlenia modułu LED i akwizycji obrazowania OCT w trybie M22.

Ostatnie publikacje opisywały system transgeniczny Drosophila składający się z czasowo regulowanych opsyn ChR2, ReaChR i eNpHR2.0 przy użyciu systemu genetycznego UAS/GAL4. Uzyskane wyniki wykazały zdolność do inicjowania zatrzymania akcji serca i bradykardii spowodowanych aktywacją eNpHR2.0 światłem czerwonym oraz stymulacji serca o wyższej częstotliwości spowodowanej aktywacją ChR2 światłem niebieskim. Podobne eksperymenty stymulacyjne przeprowadzono z inną rodopsyną kanałową, ReaChR, indukowaną przez oświetlenie światłem czerwonym22,23,24. Ekspresja opsyny we wszystkich opisanych eksperymentach była napędzana przez 24B-GAL4, gdzie ekspresję opsyny obserwowano w szerokim zakresie tkanek, w tym w kardiomiocytach i otaczających komórkach mięśniowych. W obecnym badaniu 24B-GAL4 został zastąpiony sterownikiem Hand-GAL4 w celu uzyskania specyficznej dla serca ekspresji opsyn eNpHR2.0 i ReaChR.

Ogólnie, przedstawione wyniki eksperymentalne pokazują możliwe do przywrócenia zatrzymanie akcji serca oraz indukowaną bradykardię i tachykardię choroby serca. Dostępny jest szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi tworzenia transgenicznych modeli Drosophila i prowadzenia jednoczesnego obrazowania OCT i eksperymentów z stymulacją optogenetyczną na żywych zwierzętach.

Protokół

Dla niniejszego badania, transgeniczna linia eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, linia transgeniczna ReaChR w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO i specyficzny dla serca sterownik GAL4 zawierający fragment regulatorowy genu ręki w[1118]; Użyto P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (ten zapas sterownika będzie oznaczony jako Hand-GAL4). y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 został użyty jako linia reporterska GFP. Wspomniane zapasy Drosophila zostały uzyskane z Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, patrz Tabela Materiałów) i utrzymywane w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 18 °C na standardowych podłożach z mąki kukurydzianej. Modele Drosophila opracowane w tym badaniu są dostępne na żądanie do wspólnej pracy.

1. Krzyżówki genetyczne Drosophila i przygotowanie pożywki

  1. Zmień równoważnik 3. chromosomu TM3 Sb[1] na TM6 Sb Tb, tworząc w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Patrz rysunek uzupełniający 1 dla schematu skrzyżowania. Zestaw krzyżówek w fiolkach ze zwykłą pożywką z mąki kukurydzianej.
    UWAGA: Obecność markera gruźlicy pozwala użytkownikom odróżnić larwy i poczwarki zawierające transgen opsyny i sterownik GAL4 od zwierząt zawierających opsynę, ale bez driver25.
  2. Krzyżówki genetyczne należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 25 °C i wilgotności 70% na specjalnie opracowanych pożywkach zawierających all-trans retinaI (ATR) (patrz tabela materiałów) w ciemności przez 5 dni w przypadku pobierania larw i 6 dni w przypadku pobierania poczwarek.
  3. Połącz pięć dziewiczych samic Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb i dwóch do trzech samców z zapasów UAS-opsin (eNpHR2.0 lub ReaChR) w jednej fiolce. Zobacz diagram krzyżowy dla opsyny eNpHR2.0 i ReaChR odpowiednio w Rysunek 2A i Rysunek 2B.
  4. Następnego dnia należy przygotować fiolki z pożywką zawierającą ATR.
    1. Przygotuj Semi-Defined Food zgodnie z instrukcjami BDSC26. Zamiast sacharozy i glukozy dodaj tylko sacharozę (5,14 g/100 ml). Schłodzić do ~60 °C przy ciągłym mieszaniu.
    2. Przygotować wąskie fiolki i dodać 50 μl 100 mM roztworu etanolu ATR do każdej fiolki.
    3. Za pomocą pipety serologicznej wyrzucić pokarm na muchy do wąskich fiolek na muchy, 5 ml na fiolkę. Wir z maksymalną prędkością przez 10 s.
    4. Podłącz fiolki i zawiń je w ciemną tkaninę, aby chronić je przed światłem. Pozostaw fiolki do wyschnięcia na co najmniej 12 godzin (przez noc).
  5. Następnego dnia przenieś muchy równomiernie składające jaja z Kroku 1.3. do fiolek z pokarmem zawierającym ATR (Krok 1.4.4.). Chronić stojaki z fiolkami przed światłem.
  6. Po 24-48 godzinach (w zależności od liczby złożonych jaj) wyrzuć rodziców, aby zapobiec przepełnieniu fiolki.
  7. Zbierz potomstwo inne niż gruźlica i użyj go do obrazowania serca.
    UWAGA: Różnice fenotypowe w stadiach larwalnych i poczwarkowych są pokazane w Rysunek 2C. Podsumowanie i przybliżony harmonogram etapów przygotowania próbki są pokazane na Rysunek 3.

2. Optogenetyczna kontrola serca Drosophila

  1. Pobrać larwę/poczwarkę UAS-opsin/Hand-GAL4 z fiolki (Krok 1.7), nałożyć chusteczkę i delikatnie zetrzeć podłoże z powierzchni ciała za pomocą pędzla malarskiego.
  2. Przygotuj szkiełko mikroskopowe i umieść na środku mały kawałek taśmy dwustronnej.
  3. Za pomocą pędzla lub cienkiej pęsety delikatnie umieść larwę/poczwarkę na powierzchni taśmy grzbietową stroną do góry i prostopadle do dłuższego boku szkiełka. Delikatnie dociśnij, aby przymocować larwę/poczwarkę do powierzchni taśmy.
  4. Ustaw szkiełko na stoliku do obrazowania, larwa/poczwarka skierowana w dół.
  5. Włącz źródło światła OCT za pomocą oprogramowania sterującego laserem (patrz Tabela materiałów). Otwórz niestandardowe oprogramowanie sterujące SD-OCT, a następnie kliknij okno Podgląd.
  6. Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu SD-OCT.
    UWAGA: Celem jest wyrównanie próbki w celu optymalnego obrazowania bijącego serca, tak aby wybór zakresu X i zakresu Y obejmował obszar serca. Na tym etapie zarówno liczba skanów A, jak i B-skanów wynosi 400. Zakres w kierunkach x i y wynosi ~490 μm i ~537 μm, co pokazuje odpowiednio dwa ortogonalne przekroje czynne serca (xz i yz).
  7. Użyj mikromanipulatorów, aby kontrolować sample stage, aby skupić się na sercu muchy. Dostosuj pozycję ogniskowej, aby zminimalizować odbicie światła od powierzchni naskórka muchy. Rozważ nałożenie oleju mineralnego na powierzchnię larwy/poczwarki, aby zminimalizować odbicia.
    UWAGA: Olej może zwiększać ryzyko przemieszczania się zwierząt poprzez pogorszenie właściwości klejących taśmy.
  8. Upewnij się, że serce muchy może być w pełni widoczne w oknie obrazu bez żadnych zniekształceń, zablokowania przez tkankę oraz istotnych cieni i odbić; w przeciwnym razie wróć do kroku 2.7.
  9. Ustaw parametry skanowania dla akwizycji obrazu OCT w trybie M.
    UWAGA: Liczba skanów A jest zmniejszona w porównaniu z krokiem 2.7. aby uzyskać większą liczbę klatek na sekundę, aby uchwycić dynamikę bicia serca muchy (kilka Hz). Liczba skanów B oznacza liczbę powtarzających się klatek dla obrazowania w trybie M, którą można dostosować w zależności od czasu nagrywania i dostępnej pamięci systemowej. W tym eksperymencie 128 skanów A może pozwolić na prędkość ~125 klatek / s, a 4,000 powtarzających się skanów B jest nagrywanych, co zapewnia ciągły zapis ~32 s.
  10. Uzyskaj pięć zestawów danych kontrolnych bez impulsów stymulacji światłem czerwonym, aby obliczyć tętno spoczynkowe (RHR).
  11. Zaprojektuj impuls świetlny do stymulacji stymulacji w niestandardowym oprogramowaniu sterującym OCT. W "Ustawieniach" dodaj zaprojektowane sekwencje impulsów świetlnych, aby kontrolować częstotliwość impulsów, szerokość impulsu, czas trwania stymulacji i czas oczekiwania zgodnie z różnymi protokołami stymulacji.
    UWAGA: RHR jest mierzony na podstawie eksperymentu kontrolnego bez oświetlenia światłem i używany do obliczania częstotliwości, z jaką światło powinno pulsować w eksperymentach z tachypacingiem i bradypacingiem22.
  12. Otwórz oprogramowanie sterownika światła (patrz Tabela materiałów), aby wygenerować impulsy światła czerwonego. Wybierz tryb impulsowy w "Wybór trybu". Kliknij dwukrotnie rysunek ustawień "Profil impulsu" i wybierz tryb obserwującego. Utrzymuj intensywność OFF na 0 i ustaw procent intensywności ON po obliczeniu rzeczywistej gęstości mocy.
    UWAGA: Impulsy świetlne stymulacji są wyzwalane sygnałem z oprogramowania sterującego OCT zgodnie z ustawieniami w kroku 2.12.
  13. Uzyskaj filmy w trybie M bijącego serca Drosophila ze stymulacją świetlną, klikając Acquire w oprogramowaniu sterującym OCT. Powtórz pomiary 5x.

3. Analiza obrazu

  1. Otwórz specjalnie opracowane oprogramowanie do segmentacji serca muchy.
  2. Kliknij Wybierz plik, a następnie wybierz plik do analizy w wyświetlonym graficznym interfejsie użytkownika.
  3. Wprowadź pionowe i poziome granice obszaru serca w pikselach w górnych polach tekstowych. Kliknij Zmień rozmiar. Za pomocą suwaka na dole upewnij się, że cały obszar serca jest widoczny i że wypełnia całe pudełko dla całej kolekcji. Jeśli tak nie jest, powtórz ten proces i dostosuj granice.
  4. Kliknij Przewiduj, aby przewidzieć region serca. Program przejdzie teraz przez każdy wycinek w kolekcji i wybierze region serca, co zajmie około 3 minut.
  5. Kliknij na HR Plot po zakończeniu prognozy. Spowoduje to otwarcie nowego okna wyświetlającego wykres obszaru serca w czasie. Upewnij się, że wybrano właściwe obszary szczytu lub doliny. Wybierz Pulse, a następnie HR, aby wygenerować ostateczną figurę, a parametry funkcjonalne zostaną jednocześnie zapisane w .csv plikach.

Wyniki

D. melanogaster wykazujące ekspresję światłoczułych opsyn czerwonych eNpHR2.0 lub ReaChR w rurce serca uzyskano poprzez otrzymanie potomstwa z krzyżówek każdej linii transgenicznej UAS-opsin z driverem Hand-GAL4. Specyficzność tkankowa drivera GAL4 została zweryfikowana poprzez obrazowanie ekspresji GFP (Rysunek 4). Do wykazania efektów aktywacji eNpHR2.0 i ReaChR światłem czerwonym wykorzystano stadia rozwojowe larwy 3. stadium oraz wczesnej poczwarki Drosophila. Zaplanowane impulsy światła czerwonego o długości fali ~617 nm, dostarczane za pomocą diody LED, oświetlały larwę/poczwarkę i aktywowały eNpHR2.0 oraz ReaChR w sercu. Chociaż raportowana maksymalna długość fali odpowiedzi dla NpHR wynosi ~580 nm, a dla ReaChR ~600 nm, naświetlanie światłem 617 nm może penetrować głębiej, zapewniając lepsze dostarczenie energii świetlnej do tkanki serca wykazującej ekspresję opsyn22.

Larwę/poczwar하겠습니다 została umieszczona na szkiełku mikroskopowym stroną grzbietową do dołu w ustawieniu mikroskopu odwróconego i oświetlona wiązką światła LED skierowaną na segment ciała A7. Przykłady obrazów przekroju poprzecznego ciała przedstawiono na Rysunku 5A oraz Rysunku 6A. Serce w nagraniach wideo składających się z 4 000 klatek (Filmy dodatkowe 1-6) widoczne jest jako kurczący się i rozkurczający kształt kolisty. W celu symulacji różnych stanów pracy serca zaprojektowano cztery typy impulsów świetlnych. Pojedynczy impuls trwający 10 s po 5 s czasu oczekiwania wywołał odwracalny zatrzymanie akcji serca indukowane przez eNpHR2.0, co pokazano na Rysunku 5B. Do stymulacji serca z częstotliwościami niższymi niż spoczynkowa częstotliwość pracy serca (RHR), pośredniczonej przez eNpHR2.0, zastosowano dwie sekwencje impulsów świetlnych o częstotliwościach stymulacji równych RHR/2 i RHR/4, trwające 8 s z 6 s przerwą pomiędzy nimi (Rysunek 5C). Cykl pracy każdej sekwencji impulsów świetlnych wynosił 90%. Taki schemat stymulacji świetlnej wywołał stan serca przypominający bradykardię. Schemat stymulacji mający na celu zwiększenie częstości pracy serca poprzez aktywację ReaChR składał się z trzech sekwencji impulsów świetlnych o częstotliwościach odpowiednio RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz i RHR + 1,5 Hz, przy szerokości impulsu wynoszącej 20 ms (Rysunek 5D). Ten schemat impulsów był ukierunkowany na wywołanie stanu tachykardii. Gęstość mocy światła podczas wszystkich eksperymentów wynosiła 7,49 mW/mm2. W eksperymentach kontrolnych nie zastosowano oświetlenia.

Każdy wariant eksperymentalny zarejestrowano pięć razy. Nagrania wideo serca muchy w trybie M zostały przetworzone na maski 2D przy użyciu oprogramowania FlyNet 2.027. Oprogramowanie to automatycznie segmentuje obszar serca w celu wygenerowania zestawów danych dotyczących funkcji serca. Program dostarcza maskę serca dla każdej klatki, którą w razie potrzeby można poprawić ręcznie, aby uzyskać dokładną kwantyfikację parametrów funkcjonalnych bijącego serca, takich jak czynność serca (HR), wymiar końcowodiastoliczny (EDD), wymiar końcosystoliczny (ESD), skrócenie frakcyjne (FR), powierzchnia końcowodiastoliczna (EDA), powierzchnia końcosystoliczna (ESA) i inne. Czynność serca mierzy się poprzez analizę powierzchni serca w czasie. Nagranie kontrolne bez impulsów światła służy do ustalenia bazowej częstości pracy serca (np. RHR) dla każdego zwierzęcia.

Rysunek 5B oraz Rysunek 6B przedstawiają 10 s zatrzymania akcji serca wywołanego aktywacją Hand>eNpHR2.0 za pomocą czerwonego światła (617 nm) odpowiednio u larwy i poczwarki. Po włączeniu czerwonego światła serce Drosophila przestało bić i pozostawało w tym stanie do końca naświetlania. Funkcja serca została przywrócona po wyłączeniu czerwonego światła. Zwierzęta, w których nie wyekspresowano opsyny (kontrola „no opsin”), nie reagowały na naświetlanie czerwonym światłem (Rysunek uzupełniający 2A oraz Rysunek uzupełniający 3A). Eksperymenty kontrolne z zwierzętami Hand>eNpHR2.0, w których nie zastosowano 10 s naświetlania czerwonym światłem (kontrola „no light”), wykazały prawidłowe bicie serca (Rysunek uzupełniający 4A oraz Rysunek uzupełniający 4C).

Z wykorzystaniem zwierząt Hand>eNpHR2.0 zastosowano impulsy czerwonego światła o częstotliwościach niższych niż RHR. Częstotliwość skurczów serca uległa zmniejszeniu po sygnałach świetlnych; ta wolniejsza akcja serca naśladuje jeden z rodzajów arytmii serca, czyli bradykardię (Rysunek 5C oraz Rysunek 6C odpowiednio dla larwy i poczwarki). Wolniejsze tempo pracy serca nie zaobserwowano w eksperymentach kontrolnych „bez opsyny” (Rycina uzupełniająca 2B i Rycina uzupełniająca 3B) oraz „bez światła” (Rycina uzupełniająca 4A i Rycina uzupełniająca 4C).

Zwiększenie częstości akcji serca można osiągnąć poprzez aktywację opsyny Hand>ReaChR za pomocą serii impulsów czerwonego światła o częstotliwości wyższej niż spoczynkowa częstość akcji serca (RHR) danego zwierzęcia. Larwy i poczwarki Hand>ReaChR poddano serii trzech pociągów impulsów świetlnych o różnych częstotliwościach stymulacji (np. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz). Uzyskane dane wyraźnie pokazują wzrost częstości akcji serca po impulsach świetlnych (Rysunek 5D oraz Rysunek 6D odpowiednio dla larwy i poczwarki). Stan serca wykazany w tych eksperymentach naśladuje tachykardię. Eksperymenty z kontrolą negatywną przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 2C, Rysunku uzupełniającym 3C oraz Rysunku uzupełniającym 4B,D.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wykazują możliwość nieinwazyjnej i specyficznej kontroli optogenetycznej rytmu serca na różnych etapach rozwoju w transgenicznych modelach zwierzęcych D. melanogaster.

Schemat optycznej tomografii koherencyjnej; konfiguracja lasera ze spektrometrem, sprzęgačem światłowodowym, ramieniem próbkowym i referencyjnym.
Rysunek 1: System obrazowania OCT zintegrowany z modułem LED 617 nm do optogenetycznej kontroli funkcji serca Drosophila. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schematy krzyżówek genetycznych z P{w[+mC]} i wyniki fenotypowe poczwarek Drosophila; układ eksperymentalny.
Rycina 2: Uzyskiwanie osobników D. melanogaster wykazujących ekspresję opsyny w sercu. (A) Schemat krzyżówki genetycznej. Samice Hand-GAL4/TM6 SbTb krzyżowano z samcami niosącymi eNpHR2.0. Powstałe potomstwo Hand-GAL4/eNpHR2.0 (oznaczone czerwoną gwiazdką) wyselekcjonowano do obrazowania OCT, a osobniki Hand-GAL4/TM6 Sb Tb odrzucono na podstawie ich fenotypu. (B) Schemat krzyżówki genetycznej. Samice Hand-GAL4/TM6 SbTb krzyżowano z samcami niosącymi ReaChR. Powstałe potomstwo Hand-GAL4/ReaChR (oznaczone czerwoną gwiazdką) wyselekcjonowano do obrazowania OCT, a osobniki Hand-GAL4/TM6 Sb Tb odrzucono na podstawie ich fenotypu. (C) Różnice fenotypowe między potomstwem Hand-GAL4/opsyna (czerwona gwiazdka) a Hand-GAL4/TM6 Tb. Zwierzęta niosące mutację genu Tb w chromosomie TM6 mają „tubby” (pękatą) sylwetkę ciała w porównaniu do normalnych larw lub poczwarek nieposiadających mutacji Tb. Panel lewy przedstawia larwy; panel prawy przedstawia wczesne poczwarki. Zdjęcia zawierają również linijkę z podziałką 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat hodowli much ilustrujący krzyżowanie Hand-GAL4/UAS-opin; 48-godzinna inkubacja; ochrona przed światłem.
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie i harmonogram procedur przygotowania do obrazowania. Linie rodzicielskie są utrzymywane w butelkach dla much; dziewicze samice i samce są krzyżowane w wąskich fiolkach wypełnionych standardową pożywką (oznaczoną kolorem żółtym). Muchy aktywnie składające jaja są przenoszone do fiolek z pożywką zawierającą ATR (kolor brązowy). Od tego etapu fiolki z rozwijającym się potomstwem muszą być przechowywane w ciemności. Larwy trzeciego stadium oraz wczesne poczwarki są zbierane ze ścianek fiolek w celu przeprowadzenia obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej tkanki naczyniowej rośliny; podkreśla wzory strukturalne, skala 1 mm.
Rycina 4: Wczesna pupa D. melanogaster wykazująca ekspresję UAS-GFP (BDSC 6658) sterowaną przez Hand-GAL4 (BDSC 48396). Wzorzec fluorescencji potwierdza swoistość sterownika Hand-GAL4 względem serca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza odpowiedzi serca; obraz mikroskopowy i wykres wpływu impulsu światła na częstotliwość i powierzchnię skurczów serca.
Rysunek 5: Symulacja zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u larwy D. melanogaster. (A) Obraz OCT przekroju poprzecznego ciała larwy. Serce widoczne jest jako okrąg poniżej powierzchni ciała. (B) Graficzna prezentacja odwracalnego zatrzymania akcji serca. Górny panel przedstawia czas (oś X) naświetlania czerwonym światłem (oś Y, procentowy poziom mocy źródła światła). Środkowy panel wskazuje zmianę powierzchni serca (oś Y, mikrometry kwadratowe) w czasie (oś X). Dolny panel pokazuje zmianę częstotliwości pracy serca (oś Y, herce) w czasie (oś X). (C) Graficzna prezentacja odwracalnej bradykardii pośredniczonej przez eNpHR2.0. Górny panel pokazuje impulsy naświetlania czerwonym światłem, wywołujące dwa okresy bradykardii: 50% RHR i 25% RHR. Zmiany powierzchni serca i częstotliwości pracy serca przedstawiono odpowiednio na panelach środkowym i dolnym. (D) Graficzna prezentacja stymulacji serca za pomocą aktywnego ReaChR. Górny panel pokazuje serię 20 ms impulsów czerwonego światła występujących z częstotliwościami RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz i RHR + 1,5 Hz. Skurcze serca następują zgodnie z częstotliwością impulsów światła, co pokazano na panelach środkowym i dolnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz z ultradźwięków i wykresy częstotliwości akcji serca podczas modulacji impulsami światła.
Rysunek 6: Symulacja zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u poczwarki D. melanogaster. (A) Obraz OCT w przekroju poprzecznym ciała poczwarki. Serce widoczne jest jako okrąg poniżej powierzchni ciała. (B) Graficzna prezentacja odwracalnego zatrzymania akcji serca. Górny panel przedstawia czas (oś X) naświetlania czerwonym światłem (oś Y, procentowy poziom mocy źródła światła). Środkowy panel wskazuje zmianę powierzchni serca (oś Y, mikrometry kwadratowe) w czasie (oś X). Dolny panel pokazuje zmianę częstotliwości akcji serca (oś Y, herce) w czasie (oś X). (C) Graficzna prezentacja odwracalnej bradykardii indukowanej przez eNpHR2.0. Górny panel pokazuje impulsy naświetlania czerwonym światłem, wywołujące dwa okresy bradykardii: 50% RHR oraz 25% RHR. Środkowy i dolny panel przedstawiają odpowiednio zmiany powierzchni serca i częstotliwości akcji serca. (D) Graficzna prezentacja stymulacji serca przez aktywowane ReaChR. Górny panel pokazuje serię 20 ms impulsów czerwonego światła o częstotliwościach RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz i RHR + 1.5 Hz. Skurcze serca następują zgodnie z częstotliwością impulsów światła, co pokazano na środkowym i dolnym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Krzyżówki genetyczne w celu zastąpienia chromosomu balansera TM3 Sb przez TM6 Sb Tb. Dziewice Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb skrzyżowano z samcami nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w+/ TM6 Sb Tb. Wyselekcjonowano potomstwo Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb, w tym dziewice i samce (selekcja na podstawie pigmentacji oczu w połączeniu z fenotypem tubby). Wybrane muchy poddano samozapłodnieniu w celu utworzenia stabilnej linii. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: W eksperymentach kontrolnych rytm serca larwy typu dzikiego (wt) nie zmienia się pod wpływem naświetlania czerwonym światłem. (A) Podczas naświetlania czerwonym światłem u larwy wt nie zaobserwowano zatrzymania akcji serca. Górny panel przedstawia obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas naświetlania. Środkowy i dolny panel przedstawiają obszar serca oraz częstotliwość pracy serca podczas 32 s czasu obrazowania. (B,C) Impulsy czerwonego światła nie zmieniają częstotliwości pracy serca u larwy wt. Górne panele przedstawiają obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas naświetlania. Środkowy i dolny panel przedstawiają obszar serca oraz częstotliwość pracy serca podczas 32 s czasu obrazowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: W eksperymentach kontrolnych rytm serca poczwarki typu dzikiego (wt) nie zmienia się pod wpływem naświetlania światłem czerwonym. (A) W larwie wt nie zaobserwowano zatrzymania akcji serca podczas naświetlania światłem czerwonym. Górny panel przedstawia obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas naświetlania. Środkowy i dolny panel przedstawiają pole powierzchni serca oraz częstość akcji serca podczas 32 s czasu obrazowania. (B,C) Impulsy światła czerwonego nie zmieniają częstości akcji serca u poczwarki wt. Górne panele przedstawiają obrazy serca w trybie M. Czerwona linia wskazuje czas naświetlania. Środkowy i dolny panel przedstawiają pole powierzchni serca oraz częstość akcji serca podczas 32 s czasu obrazowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Larwy i poczwarki D. melanogaster wykazujące ekspresję Hand>eNpHR2.0 lub Hand>ReaChR nie wykazują istotnych zmian HR podczas obrazowania OCT bez naświetlania światłem czerwonym. (A) Częstość uderzeń serca (HR) larwy Hand>eNpHR2.0. (B) Częstość uderzeń serca (HR) larwy Hand>ReaChR. (C) Częstość uderzeń serca (HR) poczwarki Hand>eNpHR2.0. (D) Częstość uderzeń serca (HR) poczwarki Hand>ReaChR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 1: Aktywowany eNpHR2.0 powoduje zatrzymanie akcji serca u larwy D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 2: Aktywowany eNpHR2.0 powoduje zatrzymanie akcji serca u poczwarki D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 3: Odwracalna bradykardia indukowana przez eNpHR2.0 u larwy D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 4: Odwracalna bradykardia indukowana eNpHR2.0 u poczwarki D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 5: Stymulacja rytmu serca przez aktywowany ReaChR u larwy D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 6: Stymulacja rytmu serca przez aktywowany ReaChR w poczwarce D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

W porównaniu z naszymi poprzednimi raportami, w których ekspresja opsyn była napędzana nie tylko w sercu, ale także w otaczających tkankach mięśniowych, w obecnej pracy wykorzystano sterownik specyficzny dla serca, Hand-GAL4. Ta nowa konfiguracja genetyczna Hand> opsyna stosowana do optogenetycznej regulacji serca dodatkowo potwierdza wcześniej zgłoszone wyniki i ustanawia lepszy model badań sercowo-naczyniowych Drosophila .

Przygotowanie podłoża ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia eksperymentów. Białka opsyny wymagają do działania liganda, all-trans retinalu (ATR)28. Muchy nie wytwarzają wystarczającej ilości ATR, więc ATR musi być uzupełniany do pożywki muchowej. W tym badaniu wcześniej zgłoszona żywność instant została zastąpiona pożywkami półzdefiniowanymi29. Nowa receptura pożywek zawierających ATR została wprowadzona w celu zapewnienia równomiernego rozprowadzania ATR. ATR nie rozpuszcza się w wodzie; gdy zapas ATR na bazie etanolu 100 mM jest dodawany do pożywki na bazie wody, jest on rozpraszany przez wirowanie fiolek zawierających ciepłe pożywki półzdefiniowane. Również wcześniej zgłaszane stężenie ATR zostało zmniejszone z 10 mM dla eNpHR2.0 i 3 mM dla ReaChR22 do 1 mM stężenia końcowego dla obu. Stężenie to jest wystarczające do zapewnienia prawidłowej funkcji eNpHR2.0 i ReaChR.

Istotnym elementem sukcesu eksperymentu jest ulepszone przetwarzanie danych za pomocą FlyNet 2.027. Laboratorium kontynuuje rozwój tego oprogramowania, aby poprawić zarówno wydajność obliczeniową, jak i dokładność algorytmu automatycznej segmentacji serca muchy. Maski przekrojowe wytwarzane przez to oprogramowanie służą do uzyskiwania danych fizjologicznych Drosophila , takich jak skrócenie frakcyjne i prędkość ściany serca. Takie podejście umożliwiło wydajną analizę danych przy minimalnym nadzorze człowieka, dzięki czemu charakterystyka funkcji serca w dużych zestawach danych obrazowania serca jest szybsza i bardziej wiarygodna.

Zawał mięśnia sercowego pozostaje główną przyczyną zgonów, a niedokrwienie mięśnia sercowego przyczynia się do dwóch trzecich wszystkich przypadków niewydolności serca, która szybko staje się jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności w Stanach Zjednoczonych30. Opracowywanie nowych środków terapeutycznych i wyrobów medycznych wymaga dogłębnej wiedzy na temat mechanizmów zaburzeń pracy serca na poziomie fizjologicznym i biochemicznym. Cele te można osiągnąć za pomocą organizmów modelowych. D. melanogaster stał się jednym z najbardziej niezawodnych i wydajnych modeli 31,32,33,34,35. W ramach tych prac stworzono symulowane modele zaburzeń serca Drosophila indukowanych przez nieinwazyjne podejście optogenetyczne. Rozwój nieinwazyjnych technologii optycznej stymulacji serca stanowi podstawę do opracowania alternatywy dla tradycyjnych elektrycznych urządzeń do stymulacji serca. Wykorzystanie OCT do obserwacji czynności serca w czasie rzeczywistym pozwala na dokładne scharakteryzowanie odpowiedniej fizjologii serca w modelach Drosophila w zaawansowanych badaniach, w tym badaniach przesiewowych kandydatów na leki. Obrazowanie OCT ma głębokość penetracji ~1 mm, co dobrze sprawdza się w badaniach serca Drosophila, ale ogranicza jego zastosowanie do charakteryzowania funkcji serca w większych modelach zwierzęcych. Co więcej, bezpośrednie przełożenie badań nad Drosophila na modele ssaków stanowi wyzwanie. Konieczne jest opracowanie nowych narzędzi optogenetycznych, aby poprawić czułość opsyn i przetłumaczyć je na różne systemy modelowe, w tym danio pręgowanego, myszy, szczury i organoidy ludzkiego serca, do badań sercowo-naczyniowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Andreyowi Komarovowi, Yuxuan Wangowi i Jiantao Zhu za pomoc w analizie danych oraz dziękują członkom laboratorium Zhou za ich cenne dyskusje. Prace w laboratorium dr Zhou były wspierane przez fundusz startowy z Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis, granty National Institutes of Health (NIH) R01-EB025209 i R01-HL156265 oraz Clayco Foundation Innovative Research Award.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
All-trans retinalCayman Chemicals18449
Bacto PeptoneGibco02-10-2025
Moduł sterujący źródłem światła BioLED, 4-kanałowyMigtex SystemsBLS-SA04-USCzęść modułu stymulacji optogenetycznej
Szerokopasmowy moduł źródła światłaSuperlumcBLMD-T-850-HPCzęść systemu obrazowania SD-OCT
Cobra-S Spektrometry 800 OCT  Wasatch PhotonicsCS800-840/180-80-OC2K-U3Część systemu obrazowania SD-OCT
Delikatne wycieraczki do zadańKimberly-Clark Profesjonalne34155tkanki
Drosophila agarGenesee Scientific66-103
Butelki do hodowli DrosophilaGenesee Scientific32-131
Oprogramowanie FlyNet 2.0Z-LabNiestandardowe oprogramowanie do segmentacji serca muchy i analizy funkcji serca opracowane w laboratorium Zhou
Źródła kolimatorów LED dużej mocyMigtex SystemsBLS-LCS-0617-03-22Część modułu stymulacji optogenetycznej
Nieaktywne suche drożdżeGenesee Scientific62-106
Preparaty mikroskopoweAmScopeBS-72P
Wąskie zatyczki do hodowli DrosophilaGenesee Scientific59-200
Wąskie fiolki do hodowli DrosophilaGenesee Scientific32-116SB
Trwała taśmadwustronna Zatyczki Scotch
do butelek DrosophilaGenesee Scientific59-194
Kwas propionowySigmaP1386-1L
SD-OCT Oprogramowanie sterująceZ-LabNiestandardowe oprogramowanie do akwizycji obrazu i kontroli stymulacji opracowane w laboratorium Zhou
SD-OCT i optogenetyczny system obrazowania i stymulacji optogenetycznejZ-LabObrazowanie i optogenetyczne systemy stymulacji opracowane w laboratorium Zhou (~ 50 tys. USD BOM)
SacharozaCarolina89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 41752eNpHR2.0 linia transgeniczna
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyOBloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 53748Linia transgeniczna ReaChR
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 48396Specyficzny dla serca sterownik GAL4 zawierający fragment regulatorowy genu ręki
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock #6658Linia reporterska GFP
Ekstrakt drożdżowyLab Scientific bioKEMIX978-907-4243

Bibliografia

  1. Nature Methods. Method of the Year 2010. Nature Methods. 8, 1(2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Tsai, H. -C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  5. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
  6. Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
  7. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  8. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  9. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
  10. Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
  11. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  12. Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  13. Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).
  14. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596(2009).
  15. Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
  16. Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).
  17. Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
  18. Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002(2016).
  19. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
  20. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
  21. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  22. Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
  23. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Science Advances. 1 (9), 1500639(2015).
  24. Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73(2019).
  25. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila melanogaster. , Elsevier. (1992).
  26. Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022).
  27. Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
  28. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  29. Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56(2019).
  31. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
  34. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  35. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele serca Drosophilaobrazowanie OCTstymulacja sercastymulacja czerwonym światłemaktywacja channelropsynyekspresja halorhodopsynysystem UAS GAL4modele arytmii serca
Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.