Method Article

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

DOI:

10.3791/63940

⸱

April 21st, 2022

 ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potranskrypcyjne modyfikacje RNA reprezentują niedostatecznie zbadaną warstwę regulacji translacji, która ostatnio została powiązana z plastycznością ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu opisano przygotowanie próbki i podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas w celu jednoczesnej charakterystyki licznych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranskrypcyjne (PTM) RNA reprezentują niedostatecznie zbadany mechanizm zaangażowany w regulację translacji w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Najnowsze dowody powiązały specyficzne modyfikacje neuronalnego RNA z paradygmatami uczenia się i pamięci. Niestety, konwencjonalne metody wykrywania tych cech epitranskryptomicznych są w stanie scharakteryzować tylko bardzo obfite modyfikacje RNA w tkankach masowych, co wyklucza ocenę unikalnych profili PTM, które mogą istnieć dla poszczególnych neuronów w aktywowanych obwodach behawioralnych. W tym protokole opisano podejście - analiza modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas (SNRMA-MS) - w celu jednoczesnego wykrywania i ilościowego oznaczania wielu zmodyfikowanych rybonukleozydów w pojedynczych neuronach. Podejście to zostało zweryfikowane przy użyciu pojedynczych neuronów morskiego Aplysia californica, rozpoczynając od izolacji chirurgicznej i leczenia enzymatycznego głównych zwojów OUN w celu odsłonięcia ciał komórek neuronów, a następnie ręcznej izolacji pojedynczego neuronu za pomocą ostrych igieł i mikropipety. Następnie przeprowadza się obróbkę mechaniczną i termiczną próbki w małej objętości buforu w celu uwolnienia RNA z pojedynczej komórki w celu późniejszego trawienia RNA. Zmodyfikowane nukleozydy są następnie identyfikowane i oznaczane ilościowo za pomocą zoptymalizowanej metody chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. SNRMA-MS jest wykorzystywany do ustalania wzorców modyfikacji RNA dla pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów z A. californica, które mają znane morfologie i funkcje. Przedstawiono przykłady jakościowych i ilościowych SNRMA-MS, które podkreślają niejednorodny rozkład modyfikacji RNA w poszczególnych neuronach w sieciach neuronowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje kanonicznych nukleozydów RNA są coraz częściej rozpoznawane ze względu na ich niezliczone role w regulacji translacji białek. Do tej pory zgłoszono ponad 150 unikalnych modyfikacji RNA, które różnią się złożonością, od metylacji, addycji heteroatomów, po koniugację z metabolitami komórkowymi1,2. Ten rozszerzony alfabet RNA, znany również jako epitranskryptom, jest generowany przez enzymatycznych pisarzy i jest odpowiedzialny za zmianę stabilności3, folding4 i wydajność translacji5,6 komórkowych RNA. Wybrane modyfikacje RNA mogą być również odwracane za pomocą gumek enzymatycznych7,8, podczas gdy inne są dołączane do RNA podstechiometrycznie9,10, renderując złożony krajobraz zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych sekwencji RNA w systemach biologicznych.

Na znaczenie modyfikacji RNA w funkcji biologicznej wskazuje nierówny rozkład modyfikacji w różnych organach i tkankach, w tym w podregionach ośrodkowego układu nerwowego (OUN)11. Ta niejednorodność chemiczna została powiązana z rozwojem OUN 12, stress response13 i plastycznością zależną od aktywności14. Podregiony OUN obejmują ponadto heterogeniczne populacje komórek, w których poszczególne komórki wykazują odrębne profile chemiczne15,16,17,18. Nawet pojedyncze komórki tego samego typu mogą wykazywać unikalne transkryptomy, częściowo ze względu na mikrośrodowiska tkankowe19 i stochastyczną ekspresję genów20. Jednakże, podczas gdy charakterystyka transkryptomu pojedynczej komórki jest nieco rutynowa, nie ma analogicznych metod ustalania epitranskryptomów pojedynczych komórek dla wielu modyfikacji RNA. Potrzebne są nowe podejścia, które są w stanie profilować rozkład modyfikacji RNA w poszczególnych komórkach, do kompleksowej analizy heterogeniczności komórkowej i wpływu regulacyjnego modyfikacji potranskrypcyjnych (PTM) w OUN i innych układach biologicznych.

Jednoczesny pomiar licznych modyfikacji RNA w masowych komórkach/tkankach jest łatwo realizowany za pomocą technik chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Do analizy LC-MS/MS zmodyfikowanych rybonukleozydów, RNA jest ekstrahowany z komórek (zwykle 103-10 6 komórek), oczyszczany przez wytrącanie i ponowne zawieszanie, a następnie trawiony do nukleozydów. Mieszanina próbek składająca się z kanonicznych i zmodyfikowanych nukleozydów jest następnie wstrzykiwana do systemu LC-MS w celu separacji i wykrycia analitu, co prowadzi do określenia pełnego zestawu modyfikacji RNA w organizmie21,22,23. LC-MS/MS został niedawno wykorzystany do określenia 26 modyfikacji RNA w OUN modelu neurobiologicznego Aplysia californica (A. californica). Obfitość niektórych z tych znaków epitranskryptomicznych wykazywała dynamikę zależną od czasu i regionu, która korelowała ze zmianami behawioralnymi w animal24. Jednak ze względu na ograniczoną czułość metody możliwe było wykrycie modyfikacji RNA tylko w próbkach zbiorczych zawierających >103 komórek. Te większe próbki prawdopodobnie ukrywały unikalne i funkcjonalnie ważne profile modyfikacji RNA poszczególnych komórek ze średnimi populacyjnymi. Chociaż dokładna kontrola warunków przygotowania próbki poprawiła granice wykrywalności modyfikacji RNA w próbkach o małej objętości25,26,27,28, nadal istnieje zapotrzebowanie na metody analityczne, które mogą wykrywać i określać ilościowo wiele zmodyfikowanych rybonukleozydów w pojedynczych komórkach.

Ten protokół wprowadza analizę modyfikacji RNA pojedynczego neuronu za pomocą spektrometrii mas (SNRMA-MS), która pozwala na wykrycie ponad tuzina modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach z OUN A. californica29. Podejście to polega na chirurgicznej izolacji pojedynczych, zidentyfikowanych komórek z głównych zwojów OUN, a następnie zoptymalizowanym przebiegu przygotowania próbki, obejmującym mechaniczną lizę komórek, denaturację RNA i hydrolizę enzymatyczną w buforze zgodnym ze stwardnieniem rozsianym. Identyfikacja i kwantyfikacja nukleozydów modyfikowanych po transkrypcji jest następnie realizowana za pomocą LC-MS/MS. SNRMA-MS zaspokaja niezaspokojoną potrzebę w dziedzinie analizy modyfikacji RNA, ułatwiając pozyskiwanie potranskrypcyjnych profili modyfikacji RNA dla pojedynczych neuronów i ma potencjał do przyszłego zastosowania w innych typach komórek.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów i roztworów

  1. Przygotuj sztuczną wodę morską (ASW) o stężeniu 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 22 mM MgCl2, 26 mMMgSO4 i 10 mM HEPES w wodzie uzyskanej z rygorystycznego systemu oczyszczania. Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą 1 M NaOH lub HCl. Zazwyczaj należy przygotować 1 l ASW i przechowywać w temperaturze 14 °C do momentu użycia.
  2. Przygotować roztwór antybiotyku ASW z 10 000 j./ml penicyliny G, 10 μg/μl streptomycyny i 10 μg/μl gentamycyny i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed eksperymentem rozmrozić i rozcieńczyć zamrożony roztwór podstawowy antybiotyków w stosunku 1:100 w 20-40 ml ASW. Końcowe stężenie antybiotyków w roboczym roztworze ASW wynosi 100 μg/ml penicyliny G, 100 μg/ml streptomycyny i 100 μg/ml gentamycyny.
  3. Przygotować bufor do trawienia RNA, łącząc 1 μl 10 μg/μl albuminy surowicy bydlęcej, 0,5 μl 0,5 μg/μl pentostatyny, 0,495 μl fosfatazy alkalicznej 2 U/μL, 1 μl fosfodiesterazy 0,1 U fosfodiesterazy I (w 10 mM MgCl2) i 0,38 μl endonukleazy z Serratia marcescens (25 U) na próbkę. W przypadku analizowania wielu próbek należy przygotować mieszankę wzorcową w oddzielnej probówce zawierającej objętość każdego odczynnika pomnożoną przez liczbę próbek do analizy, plus jeszcze jedną próbkę, aby uwzględnić przypadkową utratę odczynnika w wyniku etapów przenoszenia pipety.
  4. Przygotuj kilka ostrych igieł (szklanych lub metalowych) do ręcznej izolacji neuronów. Wykonaj metalowe igły we własnym zakresie poprzez elektrochemiczne trawienie drutu wolframowego, jak w30 lub kup je. Przygotować szklane igły z grubościennych lub standardowych kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. W przypadku niniejszej metody należy zachować średnicę końcówki igły w zakresie 1-5 μm, przy długości szyjki 100-150 μm.
    UWAGA: Wytwarzanie zarówno igieł metalowych, jak i szklanych można zoptymalizować w celu wytworzenia narzędzi, które odpowiadają indywidualnym potrzebom badacza i konkretnemu badanemu modelowi biologicznemu.

2. Izolacja pojedynczego neuronu

  1. Schłodzić roztwór 0,33 M MgCl2 do temperatury 14 °C. Za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml znieczulić A. californica (150-250 g) poprzez wstrzyknięcie roztworu MgCl2 do jamy ciała zwierzęcia. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy stosunku objętości roztworu (ml) do masy ciała zwierzęcia (g) w stosunku 1:3. Odczekaj około 3 minut, aż zwierzę się zrelaksuje, upewniając się, że nie wykazuje skurczów ciała w odpowiedzi na stymulację dotykową.
  2. Umieść zwierzę stroną brzuszną (stroną ze stopą) do góry na tacy preparcyjnej. Wypreparuj zwierzę za pomocą nożyczek chirurgicznych z jedną końcówką skierowaną w stronę zwierzęcia, ostrożnie wykonując podłużne cięcie przez stopę.
  3. Przypnij rostralną, ogonową i boczną stronę ciała zwierzęcia, aby odsłonić narządy wewnętrzne i zwoje OUN znajdujące się w jamie ciała. Odizoluj główne zwoje OUN od zwierzęcia poprzez chirurgiczne przecięcie nerwów i niektórych łączników pochodzących ze zwojów.
  4. Zanurzyć zwoje nerwowe w roztworze proteazy typu XIV ze Streptomyces griseus (10 mg/ml w roztworze antybiotyków ASW) i inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 minut lub 1 godzinę (w przypadku zwoju mózgowego).
    UWAGA: Czas trwania inkubacji zależy od pory roku, wielkości i kondycji zwierzęcia, a także docelowych neuronów. Izolacja niektórych neuronów wymaga dłuższej inkubacji niż innych i powinna być określona doświadczalnie.
  5. Przepłukać zwoje jaj 6x roztworem antybiotyków ASW i przenieść wszystkie zwoje jaj do naczynia pokrytego polimerem silikonowym wypełnionego roztworem antybiotyków ASW za pomocą polipropylenowej pipety transferowej, która została przycięta do otworu ~5 mm. Traktować pipetę 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w ASW, aby zminimalizować przywieranie zwojów do pipety (opcjonalnie). Zwoje jaj powinny być zanurzone w ASW przez cały czas.
    UWAGA: Leczenie enzymatyczne zmniejsza stabilność mechaniczną neuronów i otaczającej tkanki łącznej, w wyniku czego błony neuronalne mogą zostać uszkodzone w wyniku wystawienia na działanie powietrza podczas przenoszenia zwojów.
  6. Przypnij zwoje nerwowe i użyj mikronożyczek i drobnych kleszczy, aby usunąć osłonki ganglionu. Przy wystarczająco silnym leczeniu enzymatycznym do usuwania osłon należy użyć szklanych lub metalowych igieł.
  7. Wizualnie zidentyfikuj neurony A. californica, które Cię interesują. W niniejszej pracy badano następujące komórki: R2 w zwoju brzusznym, LPl1 w zwoju opłucnej, komórki śródmózgowe (MCC) w zwoju mózgowym oraz komórki B2 w zwoju policzkowym. Wykonaj obrazy optyczne wszystkich preparatów nerwowych i zwojowych za pomocą skalibrowanego mikroskopu przy 20-krotnym powiększeniu całkowitym, aby określić rozmiary i objętości każdego typu komórek.
  8. Za pomocą wyciągniętej szklanej kapilary lub ostrych igieł wolframowych ostrożnie odizoluj zidentyfikowaną komórkę od dużego zwoju.
  9. Pobrać niewielką ilość (1 μl) ASW do plastikowej mikropipety, a następnie przenieść wyizolowaną komórkę do probówki z próbką do PCR zawierającej 4 μl 0,365 M octanu amonu (pH 9,2). W przypadku ślepej próby należy pobrać 5 μl podwielokrotności roztworu antybiotyków ASW z naczynia zawierającego ganglion i wymieszać z buforem wytrawiającym (opisanym poniżej).

3. Liza komórek i trawienie RNA dla SNRMA-MS

  1. Poddaj lizie izolowane neurony poprzez wielokrotne zasysanie i dozowanie za pomocą mikropipety (średnica wewnętrzna ~100 μm) w 0,365 M octanu amonu. Niektóre mniejsze komórki mogą nie pęknąć od razu; Aby je zlizować, należy przyłożyć nacisk do średnicy komórki za pomocą wyciągniętej szklanej kapilary.
  2. Za pomocą termocyklera podgrzać próbki z następującym programem temperatury: 95 °C przez 3 minuty, 10 °C przez 3 minuty, trzymać w temperaturze 10 °C. Wyjmij probówkę z termocyklerem.
  3. Dodać 3,375 μl buforu do trawienia RNA do każdej próbki i wymieszać roztwór za pomocą mikropipety, pobierając i dozując roztwór kilka razy. Użyj miniaturowej wirówki stołowej o sile 2700 x g przez 30 s, aby odwirować wszelkie kropelki cieczy przylegające do ścianek probówki do PCR.
  4. Inkubować próbki w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, a następnie utrzymywać je w temperaturze 10 °C (podgrzewana pokrywa ustawiona w pozycji ON). Natychmiast po schłodzeniu próbki do temperatury 10 °C przenieść 7 μl roztworu do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek wyposażonej w wkładkę o pojemności 250 μl, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w probówce automatycznego podajnika próbek.

4. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas

UWAGA: Analizuj trawienie pojedynczych neuronów i autentyczne zmodyfikowane wzorce nukleozydów za pomocą systemu LC-MS/MS wyposażonego w źródło jonizacji elektrorozpylania i sześcioportowy zawór przełączający.

  1. Aby przygotować układ LC do separacji kanonicznych i zmodyfikowanych nukleozydów, należy zrównoważyć kolumnę C18 (150 mm x 2,1 mm, wielkość cząstek 2,2 μm, średnica porów 120 A) z 99% ruchomą fazą A (5 mM octanu amonu, pH 5,6) i 1% fazą ruchomą B (60/40 faza ruchoma A/acetonitryl (ACN)) przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min przez 12 minut w temperaturze 36 °C. Do przygotowania mobilności należy użyć rozpuszczalników klasy LC-MS Fazy.
  2. Podczas gdy LC równoważy się, skalibrować spektrometr masowy, wprowadzając 1 mM roztwór octanu sodu w 50/50 ACN/woda do spektrometru masowego za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 5 μl/min. Po kalibracji ponownie podłącz przepływ LC do spektrometru mas.
  3. Zaprogramować następujące parametry gradientu liniowego: 1% B przez 0-5 min, 5% B po 9 min, 7% B po 11 min, 10% B po 13 min, 15% B po 32 min, 40% B po 38 min, 50% B po 43 min, 100% B po 50 min, 100% B po 60 min, 1% B po 61 min, i 12-minutowe przywrócenie równowagi przy 1% B przed następnym wstrzyknięciem.
  4. Uruchomić przyrząd MS w trybie dodatnim z następującymi parametrami: napięcie kapilarne ustawione na 4 500 V, temperatura suszenia 275 °C, gaz suszący N2 5 l/min i gaz nebulizujący 1 bar. Ustawić zawór przełączający na marnotrawstwo przez pierwsze 2 minuty analizy i na źródło przez pozostałą część cyklu.
  5. Zbieraj widma masowe w zakresie m/z 110-600. Wybierz jony do dysocjacji wywołanej zderzeniem przy 35-40 eV w czasie cyklu 3 s, korzystając z preferowanej listy mas skonstruowanej przy użyciu database2 i okna izolacji ± 0,5. Użyj aktywnego wykluczenia, aby wykluczyć jony z fragmentacji po trzech widmach.
  6. Ustaw dynamiczną akwizycję widm MS/MS dla jonów o intensywności powyżej i poniżej 50 000 zliczeń odpowiednio przy 4 Hz i 1 Hz oraz minimalny próg selekcji jonów na poziomie 1 990 zliczeń.
  7. Dla ilościowych SNRMA-MS należy skonstruować krzywe kalibracyjne przy użyciu obszarów pików wyekstrahowanego chromatogramu jonowego (EIC) uzyskanych dla zmodyfikowanych wzorców nukleozydów przy co najmniej pięciu stężeniach, aby umożliwić interpolację nieznanych stężeń endogennego analitu.
    UWAGA: Neurony uzyskane od zwierząt o masie ciała 150-250 g zazwyczaj wymagają krzywych kalibracyjnych dla zmodyfikowanych nukleozydów w zakresie od 0,02 pmol do 2 pmol, ale wartości te mogą się różnić w zależności od czułości instrumentu.

5. Analiza danych

  1. Wygeneruj EIC dla zmodyfikowanych nukleozydów (m/z z wartości bazy danych2). Zweryfikuj tożsamość przypuszczalnie zmodyfikowanych nukleozydów, porównując ich widma MS2 i charakterystykę retencji LC z wartościami bazy danych2. Tabela 1 zawiera listę typowych modyfikacji RNA wykrytych w pojedynczych neuronach A. californica.
  2. Ręcznie całkuj piki odpowiadające zmodyfikowanym i kanonicznym nukleozydom i zapisuj te wartości w arkuszu kalkulacyjnym. Znormalizować obszar piku dla każdego zmodyfikowanego nukleozydu sumą obszarów pików dla kanonicznej cytydyny, urydyny i guanozyny wykrytych w próbce.
    UWAGA: Adenozyna nie jest objęta normalizacją ze względu na jej rolę w OUN jako dynamicznego neuromodulatora31.
  3. Skonstruuj macierz danych składającą się z każdej próbki pojedynczego neuronu i odpowiadających jej znormalizowanych obszarów pików dla zmodyfikowanych nukleozydów, które wykazywały stosunek sygnału do szumu >10. Wykonaj analizę składowych głównych (PCA) i wyświetl pierwsze dwie składowe główne na wykresie punktacji. Skonstruować liniowe krzywe kalibracyjne z obszarów pików EIC uzyskanych z szeregowego rozcieńczania wzorców nukleozydów i obliczyć stężenia wykrytych analitów.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SNRMA-MS polega na ręcznym izolowaniu zidentyfikowanych neuronów do małych objętości próbek w celu lizy, trawienia i analizy LC-MS/MS (Rysunek 1A). Ten proces rutynowo wykrywał ponad tuzin modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach z OUN A. californica (Figura 1B), reprezentująca pokrycie prawie połowy znanego epitranskryptomu tego zwierzęcia24 w pojedynczej komórce. Na przykład poddanie neuronu LPl1 (średnica ~500 μm) SNRMA-MS spowodowało wykrycie modyfikacji 15 ± 1 RNA (n = 3). Zmodyfikowane nukleozydy zostały pozytywnie zidentyfikowane na podstawie trzech atrybutów: właściwości retencji LC, dokładna masa i profile fragmentacji MS2 w porównaniu z wartościami podanymi w bazie danych2. Tabela 1 przedstawia listę wszystkich modyfikacji RNA wykrytych w neuronie LPl1. Kwadrupolowy spektrometr masowy czasu przelotu o wysokiej rozdzielczości wykorzystany w tych eksperymentach umożliwił uzyskanie dokładności masowej 4 ppm, a także wykrycie charakterystycznego jonu fragmentacyjnego MS2 na m/z 164 dla zmodyfikowanego nukleozydu N6,6-dimetyloadenozyny (m66A, Rysunek 1B). W połączeniu z danymi dotyczącymi separacji LC, które zgadzają się z wynikami zdeponowanymi w bazie danych (m66A eluuje po N6-metyloadenozynie (m6A)), podejście SNRMA-MS wykazało prawidłowe przypisanie zmodyfikowanych tożsamości nukleozydów.

Platforma SNRMA-MS może być wykorzystana do tworzenia profili modyfikacji RNA pojedynczych neuronów i badania ich związku z tkankami masowymi. Neurony R2 to duże (~500 μm średnicy) komórki cholinergiczne, które znajdują się w zwoju brzusznym. SNRMA-MS wykorzystano do analizy modyfikacji RNA w neuronach R2, a także otaczającego go zwoju brzusznego (Figura 2A). Znormalizowane obszary pików dla modyfikacji RNA w każdej próbce neuronu/zwoju (n = 7) wykorzystano jako dane wejściowe dla PCA, ujawniając, że neurony R2 wykazują odrębne profile modyfikacji RNA w porównaniu ze zwojami, w których się znajdują (Figura 2B). Świadczą o tym punkty danych dla neuronów R2 i zwojów brzusznych zajmujących różne regiony wykresu wyniku PCA. Dalsze wsparcie dla unikalnych zmodyfikowanych wzorców nukleozydów uzyskano z oddzielnej kohorty zwierząt (n = 7), w której przeprowadzono porównania parami dla 13 modyfikacji RNA, które były powszechnie wykrywane zarówno w pojedynczych neuronach, jak i w tkance masowej (Figura 2C). Dwa zmodyfikowane nukleozydy, pseudourydyna (Ψ) i 2'-O-metyloguanozyna (Gm), występowały w znacznie większej obfitości w zwojach brzusznych w porównaniu z neuronami R2. Przeglądając podzbiór modyfikacji RNA ze wskazanymi parami neuron-zwój R2, wszystkie zwoje brzuszne wykazywały wyższe poziomy Ψ i Gm, a wszystkie neurony R2 z wyjątkiem jednego miały wyższą obfitość 2'-O-metyloloadenozyny (Am) niż odpowiadający im ganglion (Rysunek 2D). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki SNRMA-MS ujawniają po raz pierwszy, że profile modyfikacji RNA pojedynczych komórek mogą różnić się od komórek masowych w tej samej tkance.

Korzystanie z SNRMA-MS do badania modelowego zwierzęcia A. californica daje unikalną okazję do scharakteryzowania profili modyfikacji RNA w zidentyfikowanych, funkcjonalnie odrębnych neuronach. Modyfikacje RNA oceniano za pomocą SNRMA-MS w czterech zidentyfikowanych komórkach: R2 i LPl1 (homologiczne, cholinergiczne komórki zaangażowane w obronne uwalnianie śluzu)32, MCC (serotoninergiczne modulacyjne neurony zaangażowane w odżywianie)33 i komórki B2 (neurony peptydergiczne zaangażowane w ruchliwość jelit)34. PCA sześciu modyfikacji RNA w tych zidentyfikowanych neuronach, wyizolowanych natychmiast po leczeniu enzymatycznym lub hodowanych w preparacie zwojowym przez 48 godzin, wykazało stabilność i dynamikę epitranskryptomów pojedynczych komórek. Modyfikacje RNA w funkcjonalnie różnych komórkach utworzyły unikalne klastry na wykresie wyników, podczas gdy homologiczne neurony R2 / LPl1 grupowały się razem (Figura 3A). Wykres obciążenia pokazuje, że różnice były przede wszystkim spowodowane obfitością izomerów pozycyjnych metyladenozyny, w tym 2'-O-metyloloadenozyny (Am) i N1-metylodenozyny (m1A) (Rysunek 3B). W tej samej analizie porównano świeżo wyizolowane komórki z komórkami hodowanymi in situ (tj. w odpowiednich zwojach jajowych) przez 48 godzin. Jak pokazano na wykresie punktacji PCA, funkcjonalnie różne komórki można było odróżnić na podstawie ich profili modyfikacji RNA.

Ilościowy SNRMA-MS może być używany do określania bezwzględnych ilości wybranych modyfikacji RNA, dla których dostępne są autentyczne standardy. Zewnętrzne krzywe kalibracyjne zostały wygenerowane dla m1A, Ψ, 2'-O-metylocytydyny (Cm), Am i m6A, a ilość każdego zmodyfikowanego nukleozydu w parach komórek MCC i R2 / LPl1 określono przez interpolację (Rysunek 4A-E). Wewnątrzkomórkowe ilościm1Ai Ψ w dwóch parach symetrycznych MCC okazały się podobne, natomiast większe różnice w ilościach tych modyfikacji zaobserwowano w trzech parach komórek R2/LPl1. Aby uwzględnić różnice wynikające z fizycznej wielkości badanych komórek, ilości modyfikacji RNA znormalizowano za pomocą objętości komórek obliczonych na podstawie optycznego pomiaru średnic komórek w celu uzyskania wewnątrzkomórkowych stężeń zmodyfikowanych nukleozydów. Zaobserwowano istotne różnice w wewnątrzkomórkowych stężeniach Cm i Am między MCC a neuronami R2/LPl1. Ogólnie rzecz biorąc, SNRMA-MS umożliwia zarówno jakościowe, jak i ilościowe profilowanie modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy SNRMA-MS i wykrywanie wielokrotnych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach przez LC-MS/MS. (A) Fotografie zdemaskowanego zwoju policzkowego i izolacji pojedynczego neuronu w probówce z próbką. Podziałka = 200 μm, strzałki wskazują zidentyfikowaną komórkę B1. Przedstawiono również schemat procedury przygotowania próbki do analizy LC-MS/MS. (B) Nałożone EIC do modyfikacji RNA w pojedynczym neuronie LPl1, z wstawką pokazującą widma MS1 i MS2 dla N6, N6-dimetyloadenozyny (m66A). W tabeli 1 przedstawiono wartości m/z używane do generowania EIC dla zmodyfikowanych nukleozydów. Ten rysunek został zmodyfikowany z29. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: SNRMA-MS rozróżnia profile modyfikacji RNA pojedynczych neuronów i tkanki objętościowej. (A) Schemat ośrodkowego układu nerwowego A. californica i przepływu pracy do analizy neuronów R2 i otaczającego je zwoju brzusznego. Na zdjęciu zwój brzuszny i neuron R2 (wstrzyknięty barwnikiem Fast Green dla widoczności). (B) Względne obszary pików z 13 modyfikacji RNA wykorzystano do wygenerowania wykresów wyniku PCA (na górze) i obciążenia (na dole). (C) Porównanie parami modyfikacji RNA w zwoju brzusznym i neuronie R2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD) ±1, *p < 0,05, ***p < 5 x 10−4, sparowany test t z poprawką Bonferroniego-Holma. (D) Porównanie wybranych modyfikacji RNA z panelu C, w którym pary R2-zwoje brzuszne dla każdego zwierzęcia są pokazane za pomocą linii kropli. Ten rysunek został zmodyfikowany z29. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Profilowanie modyfikacji RNA w zidentyfikowanych, funkcjonalnie różnych neuronach od OUN A. californica. (A) wykres wyniku PCA dla MCC oraz komórek B2, R2 i LPl1, które zostały świeżo wyizolowane lub wyizolowane po hodowli in situ przez 48 godzin (oznaczone jako cMCC, cB2, cR2, cLPl1), oraz (B) wykresy ładowania dla sześciu modyfikacji RNA powszechnie wykrywanych w tych komórkach. Ten rysunek został zmodyfikowany z29. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ilościowe SNRMA-MS w neuronach A. californica. Ilościowe SNRMA-MS podaje bezwzględne ilości i stężenia wewnątrzkomórkowe dla kilku zmodyfikowanych nukleozydów w pojedynczych, zidentyfikowanych neuronach A. californica. Fotografie (A) lewego i prawego MCC (odpowiednio LMCC i RMCC) w zwoju mózgowym oraz (B) R2 w zwoju brzusznym i LPl1 w zwoju opłucnej. Komórki są zakreślone, aby zwiększyć widoczność. Liniowe wykresy kalibracyjne dla (C) m1A i (D) Ψ (trójkąty) używane do interpolacji zmodyfikowanych ilości nukleozydów w pojedynczych komórkach (kolorowe kropki). Pary komórek z każdego zwierzęcia są oznaczone jako 1-3. (E) Wewnątrzkomórkowe stężenia pięciu zmodyfikowanych nukleozydów w parach komórek MCC i R2/LPl1. Grube linie łączą pary komórek. *p < 0,05, **p < 0,005, sparowany test t z korekcją Bonferroniego-Holma, n = 2 zwierzęta (łącznie cztery komórki) dla MCC i n = 3 zwierzęta (łącznie sześć komórek) dla R2/LPl1. Ten rysunek został zmodyfikowany z29. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt. ) szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt. szt. pkt. pkt.
Modyfikacja RNAskrótKolejność elucji (C18)m/z dla EICm/z dla MS2
dihydrourydynaD1247.09Rozdział 115
pseudourydynaYcyfra arabska245.08209/179/155
3-metylocytydynam3C (Przedsiębiorstwo m3C)3258,11126 Rozdział 126
N1-metyloadenozynam1A4282,12150
5-metylocytydynam5C5258,11126 Rozdział 126
N7-metyloguanozynam7G (Łańcuch M7G6298,12Rozdział 166
2'-O-metylocytydynacentymetr7258,11Rozdział 112
inozynaI6A8Nr 269.09Rozdział 137
2'-O-metyloguanozynaGm9298,12152 Rozdział 152
N2-metyloguanozynaSieć m2G10298,12Rozdział 166
N2,N2,N7-trimetyloguanozynaZobacz materiał m227G11326,15Rozdział 194
N2,N2,-dimetyloguanozynam22G12312,13 pkt.180
2'-O-metyloadenozynaAm13282,12136
N6-metyloadenozynam6A14282,12150
N6,N6-dimetyloadenozynaZobacz materiał m66A15296,14Rozdział 164
N6-izopentenyloadenozynaSilnik i6A16336,17204/136/148

Tabela 1: Wykryto modyfikacje RNA w pojedynczych neuronach A. californica. Podano atrybuty do charakterystyki zmodyfikowanych nukleozydów, w tym kolejność retencji LC, m/z do generowania EIC i odpowiadające im fragmenty CID.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SNRMA-MS wykorzystuje zoptymalizowane podejście do przygotowania próbek, co skutkuje niewielką, kompatybilną z MS objętością próbki, która może być dostarczona na platformę LC-MS. Wstępna enzymatyczna obróbka wstępna zwojów OUN decyduje zarówno o łatwości, z jaką można je wyjąć, jak i o trwałości pojedynczych neuronów podczas izolacji. Zwój mózgowy często wymaga przedłużonego leczenia enzymatycznego ze względu na stosunkowo grubą osłonkę w porównaniu ze zwojami policzkowymi, opłucnowymi i brzusznymi. Poszczególni badacze wykonujący izolacje pojedynczych neuronów mogą mieć różne preferencje co do tego, jak trwała powinna być osłonka przy użyciu mikronożyczek i cienkich kleszczy. Ważne jest jednak, aby zwoje nerwowe nie były nadmiernie trawione, ponieważ może to prowadzić do utraty ich integralności strukturalnej, utraty informacji o położeniu, które są krytyczne dla identyfikacji komórek docelowych i/lub lizy komórek. Po wyizolowaniu ze zwoju ważne jest, aby upewnić się, że minimalna objętość pożywki izolacyjnej jest zasysana podczas przenoszenia neuronu do probówki z próbką. Pożywka ASW zawiera wysokie stężenie soli, które mogą zakłócać działanie enzymów trawiennych podczas hydrolizy RNA, a także rozcieńczają próbkę.

Podczas etapu lizy mechanicznej często zdarza się, że duże neurony (o średnicy >250 μm) pękają po wielokrotnym przechodzeniu przez mikropipetę. Mniejsze neurony mogą wymagać dodatkowej uwagi, aby zapewnić lizę komórek, która zwykle polega na uciskaniu szklanej kapilary na komórkę. W takim przypadku możliwe jest, że częściowa objętość buforu próbki zostanie wciągnięta do kapilary z powodu sił kapilarnych. Objętość tę można dostarczyć z powrotem do probówki z próbką, wywierając nacisk na koniec szklanej kapilary, aby upewnić się, że żadna próbka nie zostanie utracona.

Najlepsze wyniki uzyskuje się, włączając etap ogrzewania przed dodaniem enzymów do trawienia RNA. Jest to prawdopodobne, ponieważ ogrzewanie w temperaturze 95 °C denaturuje drugorzędowe struktury RNA, które mogą utrudniać aktywność RNaz35 i zmniejszać ilość nukleozydów uwalnianych z biopolimerów RNA. Wcześniej przeprowadzono eksperymenty kontrolne z użyciem próbek wzbogaconych stabilną metioniną znakowaną izotopowo w celu zbadania, czy artefakty modyfikacji RNA wywołane ciepłem były przyczyną zwiększonych obszarów pików obserwowanych dla modyfikacji RNA w stosunku do protokołu SNRMA-MS bez ciepła29. Nie zaobserwowano takiego znakowania, co wskazuje, że lepsze sygnały modyfikacji RNA przy użyciu zoptymalizowanej metody SNRMA-MS wynikały z lepszego trawienia RNA.

Konwencjonalne metody izolowania całkowitego RNA z komórek obejmują ekstrakcję ciecz-ciecz (LLE) za pomocą chloroformu fenolowego, a następnie wytrącanie RNA, przemywanie i ponowne zawieszanie. Podejścia te okazały się przydatne w eksperymentach z reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją, w których ekspresja wybranych genów może być łatwo monitorowana w zidentyfikowanych neuronach A. californica 36,37. Jednak metody LLE nie są w stanie odzyskać wystarczającej ilości RNA do wykrycia zmodyfikowanych rybonukleozydów przez LC-MS, podczas gdy opisana tutaj metoda SNRMA-MS umożliwia wykrycie licznych modyfikacji RNA29. W celu oceny profili modyfikacji określonych typów RNA (np. rRNA, tRNA, mRNA) w próbkach tkanek / komórek objętościowych zastosowano ekstrakcję do fazy stałej wymiany anionowej24, wzbogacanie oparte na sondzie hybrydyzacyjnej38 i frakcjonowanie chromatograficzne39, ale podobne metody nie są jeszcze dostępne do oczyszczania RNA pojedynczej komórki. Opracowanie metod frakcjonowania RNA, które są w stanie wyizolować określone typy RNA z pojedynczych komórek, dostarczyłoby dodatkowych informacji na temat funkcji modyfikacji RNA.

SNRMA-MS ujawniła wcześniej niescharakteryzowaną heterogeniczność w krajobrazie modyfikacji RNA pojedynczych neuronów u A. californica i można sobie wyobrazić, że podobnie odmienne profile PTM istnieją w komórkach ssaków. Ponieważ komórki ssaków są stosunkowo małe w porównaniu z dużymi neuronami A. californica analizowanymi w tym protokole, konieczne są ulepszenia w obsłudze małych objętości próbek, aby ułatwić obniżenie granic wykrywalności. Chociaż obecnie SNRMA-MS jest ograniczony do objętości ~5 μl, oczekuje się, że znaczną poprawę można osiągnąć poprzez włączenie do przepływu pracy urządzeń do obsługi cieczy mikroprzepływowych. Co więcej, wdrożenie zautomatyzowanych lub półautomatycznych izolacji komórek zwiększyłoby przepustowość próbek i umożliwiłoby analizę modyfikacji RNA pojedynczych komórek w większych populacjach komórek. Dzięki połączeniu z nanoprzepływowymi separacjami LC27 możliwe będzie scharakteryzowanie znaczników epitranskryptomicznych w jeszcze mniejszych komórkach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Institute on Drug Abuse w ramach Award No. P30DA018310 oraz National Human Genome Research Institute w ramach Award no. RM1HG010023. K.D.C. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium podoktorskiego Instytutu Beckmana. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agencji finansujących.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Aplysia californicaNational Resource for Aplysia (Miami, FL)150– 250 g (dorosły)
Sprzęt stołowy
Ściągacz kapilarny do szkłaSutterP-97
Milli-QMiniwirówka Millipore
do probówek PCRLW ScientificZS-1
Mikroskop optycznyZeissStemi 2000C
TermocyklerTechneEW-93945-01
HPLC kolumna i materiały eksploatacyjne
Uznanie RSLC 120 C18Thermo Scientific71399
Thermo ScientificC4011-13
LC i MS Oprzyrządowanie i oprogramowanie
Oprogramowanie DataAnalysis 4.4Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLCThermo ScientificWyposażony w odgazowywacz online, automatyczny podajnik próbek i termostatowaną komorę kolumny
Impact HD UHR QqTOF spektrometr masowyBrukerWyposażony w źródło
ESI RStudioRStudio
Narzędzia do mikrodysekcji
Mikronożyczki bardzo drobne vanny 3,5"RobozRS-5640
Igły wolframoweRobozRS-6065
Odczynniki/materiały
kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetano-sulfonowy (HEPES)FisherScientificH3375
Fosfataza alkalicznaWorthington Biochemical Corp.
Octan amonuHoneywell17836
Benzonaza (endonukleaza z S. marcescens)EMD Millipore70746-4
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901
Siarczan gentamycynyFisher ScientificG1264
Chlorek magnezuSigma-AldrichM9272
Siarczan magnezuSigma-Aldrich208094
Mieszanina testowa nukleozydówSigma-Aldrich47310-U
Penicylina GSigma-AldrichP7794
PentostatynaSigma-AldrichSML0508
Fosfodiesterazy IWorthington Biochemical Corp.
Proteaza typu XIV od Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
Chlorek soduSigma-AldrichS9888
Standardowe kapilary szklaneAM Systems6260001 mm śr. śr., średnica wewnętrzna 0,5 mm, 4 w
siarczanie streptomycynySigma-AldrichS9137
System oczyszczania wody Fiolki z autosamplerem LS004081LS003926

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 195-201 (2011).
  2. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).
  3. Kimura, S., Waldor, M. K. The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).
  4. Helm, M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).
  5. Rezgui, V. A. N., et al. tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).
  6. Shanmugam, R., et al. Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences. Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).
  7. Jia, G., et al. N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).
  8. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  9. Krogh, N., et al. Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).
  10. Babaian, A., et al. Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer. Cell Reports. 31 (5), 107611(2020).
  11. Chang, M., et al. Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain. Open Biology. 7 (9), 170166(2017).
  12. Wang, C. -X., et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development. PLOS Biology. 16 (6), 2004880(2018).
  13. Engel, M., et al. The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation. Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).
  14. Widagdo, J., et al. Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice. Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).
  15. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  16. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  17. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).
  18. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).
  19. Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
  20. Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).
  21. Chan, C. T. Y., et al. A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress. PLOS Genetics. 6 (12), 1001247(2010).
  22. Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA. ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).
  23. Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo. Nature Communications. 12 (1), 389(2021).
  24. Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization. ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).
  25. Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D'Amico, A., Agris, P. F. Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells. Nucleic Acids Research. 44 (3), 26(2016).
  26. Huang, W., et al. Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).
  27. Sarin, L. P., et al. Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels. RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).
  28. Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).
  29. Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution. Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).
  30. Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips. Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).
  31. Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science. 369 (6508), (2020).
  32. Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).
  33. Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells. Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).
  34. Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).
  35. Crain, P. F. Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry. Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).
  36. Kadakkuzha, B. M., et al. Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia. BMC Genomics. 14 (1), 880(2013).
  37. Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075(2014).
  38. Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).
  39. Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS. RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA ModificationsSingle Neuron AnalysisMass SpectrometryLiquid ChromatographyPost Transcriptional ModificationsNeuronal RNA ProfilingModified NucleosidesCentral Nervous SystemNeuron IsolationEpitranscriptomic Analysis

Related Articles