Artykuł metodologiczny

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63943

⸱

8 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, University of New South Wales, 2School of Chemistry, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales, 3School of Biomedical Engineering, University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Streszczenie

Strukturalnie, tkanka kostna jest nieorganiczno-organicznym kompozytem zawierającym metabolicznie aktywne komórki osadzone w hierarchicznej, wysoce zmineralizowanej matrycy. Ta organizacja jest trudna do odtworzenia ze względu na niejednorodne środowisko kości. Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych (COBICS) to technika biodruku oparta na mikrożelu, która w unikalny sposób odwzorowuje mineralną i komórkową strukturę kości. COBICS drukuje złożone, biologicznie istotne konstrukty bez konieczności stosowania protektorowych materiałów podporowych lub trudnych etapów obróbki końcowej (np. promieniowania i spiekania w wysokiej temperaturze), które są dwoma największymi wyzwaniami w produkcji addytywnej konstruktów mimetycznych kości. Technika ta jest możliwa dzięki swobodnemu wytłaczaniu nowego atramentu na bazie fosforanu wapnia w zawiesinie mikrożelu na bazie żelatyny. Właściwości plastyczności zawiesiny umożliwiają osadzanie się i podtrzymywanie wydrukowanej struktury kostnej. Sieciowanie UV i nanowytrącanie następnie "blokują" go w miejscu. Możliwość drukowania nanostrukturalnej ceramiki mimetycznej kości w biomateriałach obciążonych komórkami zapewnia czasoprzestrzenną kontrolę nad makro- i mikroarchitekturą oraz ułatwia wytwarzanie w czasie rzeczywistym złożonych konstruktów kostnych w warunkach klinicznych.

Wprowadzenie

Kość posiada niezwykłe zdolności regeneracyjne, będąc jedną z niewielu struktur w organizmie, które mogą ulec wygojeniu poprzez odtworzenie prawidłowego składu komórkowego, orientacji i wytrzymałości mechanicznej, aż do osiągnięcia krytycznej wielkości ubytku, przy której endogenna zdolność do gojenia zostaje upośledzona1. Kość, wraz z chrząstką i więzadłami, wspiera i umożliwia ruch ciała, jednocześnie magazynując minerały i tłuszcze oraz produkując komórki krwi. Jako twarda, gęsta tkanka łączna, kość składa się głównie z fazy nieorganicznej, wody oraz materiału organicznego złożonego przede wszystkim z włókien kolagenowych2. Komórki są zatopione w tej silnie zmineralizowanej macierzy włókien kolagenu I i kryształów hydroksyapatytu (HA), tworząc strukturę hierarchiczną3.

Złożona organizacja tej tkanki sprawia, że wytwarzanie syntetycznych alternatyw odtwarzających heterogeniczne mikro- i nanostruktury środowiska kostnego jest wyjątkowo trudne3. W tym celu zaproponowano zastosowanie różnorodnych materiałów, w tym bioceramiki, hydrożeli z komórkami oraz materiałów syntetycznych, jako rozwiązań do tworzenia macierzy kostnych. Wśród technik wytwarzania rusztowań w ostatnim czasie pojawiły się i zyskały znaczną uwagę środowiska inżynierii tkankowej techniki oparte na druku 3D, dzięki ich niezwykłej zdolności do tworzenia wysoce zaawansowanych i precyzyjnych struktur, co daje duże nadzieje na opracowanie terapii dostosowanych do konkretnego pacjenta4,5,6. Hydrożele stały się najpopularniejszym wyborem w roli imitacji macierzy i biotuszów, ponieważ mogą być drukowane wraz z komórkami i cząsteczkami bioaktywnymi, co pozwala na generowanie funkcjonalnych konstruktów6. Jednakże hydrożele nie posiadają właściwości funkcjonalnych kości, takich jak wytrzymałość mechaniczna oraz silnie zwapniona, nieorganiczna faza zawierająca metabolicznie aktywne komórki.

Ceramiczne rusztowania drukowane w technologii 3D zazwyczaj wymagają etapów postprocesowych, takich jak spiekanie, obróbka w wysokiej temperaturze lub stosowanie agresywnych chemikaliów, które muszą zostać dokładnie wypłukane przed zastosowaniami in vitro lub in vivo5. Aby wyeliminować te ograniczenia, Lode i wsp.7 opracowali niedawno pastę na bazie α-fosforanu trójwapniowego utworzoną z hydroksyapatytu, którą można drukować i utwardzać w warunkach fizjologicznych. Materiał ten wciąż jednak nie może być drukowany wraz z żywymi komórkami, ponieważ wymaga obróbki końcowej w wilgotnym środowisku oraz następnego długotrwałego zanurzenia w roztworze wodnym.

Alternatywnie, zaproponowano zastosowanie hydrożeli z zatopionymi komórkami i wbudowanymi cząstkami nieorganicznymi jako zamiennika dla trójwymiarowej macierzy kostnej8,9. Pomimo ich dużej zdolności do wspierania żywotności komórek, nie są one w stanie odtworzyć środowiska gęsto zmineralizowanej tkanki kostnej. Thrivikarman i wsp.10 zastosowali podejście biomimetyczne, w którym wykorzystano przesycone medium wapnia i fosforu wraz z analogiem białka niekolagenowego, aby lepiej naśladować nanoskalowe osadzanie apatytu. Niemniej jednak ich konstrukty wciąż nie pozwalają na wytworzenie sztywnych struktur 3D o architekturze w skali mikro i makro przypominającej kość.

Niniejsze badanie odnosi się do tych braków poprzez opracowanie strategii drukowania w celu wytworzenia konstrukcji naśladujących kość, w fazach nieorganicznej i organicznej, które są zdolne do integracji zarówno komórek, jak i czynników wzrostu1. COBICS w unikalny sposób odtwarza strukturę mineralną i komórkową kości przy użyciu techniki biodruku opartego na mikrożelach. Przedstawiony protokół opisuje proces syntezy ceramicznego tuszu kostnego oraz mikrożeli na bazie żelatyny, a następnie łączenia ich z komórkami, co umożliwia stworzenie COBICS. Proces rozpoczyna się od syntezy głównego materiału prekursorowego tuszu kostnego. Następnie syntetyzowany jest sieciowalny hydrożel, z którego formowane są mikrożele. Na koniec tusz kostny jest nanoszony wszechkierunkowo w kąpieli wspierającej z mikrożeli zawierających komórki (Rycina 1).

Atrament kostny można drukować w dowolnej zawiesinie mikrogeli o odpowiednich charakterystykach granicy płynności, czyli zdolności do przejścia w stan płynny przy określonej prędkości ścinania i późniejszego podtrzymywania osadzonej struktury. Wykazano dwa elastyczne podejścia: zawiesinę składającą się z mikrogeli żelatynowych oraz zawiesinę składającą się z mikrogeli żelatyny modyfikowanej metakrylanem (GelMA). Pierwsza zawiesina rozpuszcza się po podniesieniu temperatury do 37 °C, co jest podstawą techniki FRESH (freeform reversible embedding of suspended hydrogels)12, natomiast drugą można poddać fotousieciowaniu po drukowaniu, co skutecznie „zszywa” mikigele i unieruchamia wydrukowany atrament kostny w miejscu. Niniejsze badanie koncentruje się na wykorzystaniu GelMA jako matrycy, ponieważ zapewnia ona unikalną zaletę w postaci możliwości wspierania wzrostu komórek przy jednoczesnym drukowaniu in situ złożonych struktur naśladujących kość. Ostatecznie podejście to umożliwia generowanie złożonych modeli tkanek o wysokim stopniu biomimetyzmu, co ma szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz inżynierii regeneracyjnej.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat procesu. (A) Bioatrament kostny jest syntetyzowany, zaczynając od syntezy α-fosforanu trójwapniowego, a następnie łączy się go z glicerolem, polisorbatem 80 i fosforanem amonu dwuzasadowym. (B) Mikropełgelowe GelMA są wytwarzane metodą emulsji woda-w-oleju. Uzyskane mikrożele są następnie (C) hydratowane i (D) łączone z komórkami. Kompozyty komórkowo-mikrożelowe są następnie wykorzystywane jako łoże granulowane, w którym osadzany jest bioatrament kostny. (E) Cała konstrukcja zostaje następnie sieciowana promieniami UV i przeniesiona do inkubatora w celu hodowli. Skróty: α-TCP = α-fosforan trójwapniowy; GelMA = żelatyna modyfikowana metakrylanem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wytwarzanie tuszu kostnego

  1. Synteza fosforanu trójwapniowego α
    1. Odważyć proszki wodorofosforanu wapnia (CaHPO4) i węglanu wapnia (CaCO3) w stosunku molowym Ca:P 3:2. Za pomocą szpatułki dokładnie zhomogenizować oba proszki.
    2. Przenieść mieszaninę proszku wodorofosforanu wapnia i węglanu wapnia do tyglowa z cyrkonu w taki sposób, aby nie był on wypełniony bardziej niż w 75%.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczeń, należy użyć nowego tygla lub tygla wcześniej używanego do wytwarzania tego samego materiału. W celu oczyszczenia przepłukać 10% etanolem i pozostawić do całkowitego wyschnięcia w dygestorium przed dodaniem proszków.
    3. Przenieść tygiel do pieca. Nagrzać do 1 40 °C z szybkością 5 °C/min i wytrzymać przez 3 h.
    4. Przerwać reakcję poprzez wyjęcie tygla z pieca i pozostawienie go na bloku ogniotrwałym. Pozostawić do całkowitego ochłodzenia przed manipulacją.
      UWAGA: Należy używać kleszczy do tygli o odpowiedniej długości i zapewnić odpowiednią ochronę termiczną.
    5. Za pomocą moździerza i tłuczka rozbić i zmielić spieczony α-TCP w taki sposób, aby uzyskane ziarna miały maksymalną wielkość 20 µm.
      UWAGA: Należy użyć standardowego sita ze stali nierdzewnej, aby zapewnić prawidłową wielkość cząstek.
    6. Dalsze mielenie ziaren przeprowadzić w młynie planetarnym w dwóch etapach. Najpierw dodać kulki z cyrkonu stabilizowanego itrem o średnicy 3 mm w stosunku wagowym kulek do proszku 8:1, a następnie 100% etanol w stosunku wagowym etanolu do proszku 3:1. Zamknąć szczelnie pokrywę i mielić przez 2 h przy 180 rpm.
    7. Zebrać zawiesinę i oddzielić kulki, używając 10% etanolu do przemywania.
    8. Suszyć zawiesinę w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 24 h.
    9. Dodać wysuszony proszek do pojemników mielących z kulkami z cyrkonu o średnicy 1 mm i 10% etanolem w tych samych stosunkach wagowych co w pierwszym etapie. Mielić przez 2 h przy 180 rpm, oddzielić i wysuszyć.
      UWAGA: Cała procedura syntezy przedstawiona jest na Rysunku 1A.
  2. Formułowanie tuszu kostnego
    1. Aby przygotować tusz kostny, dodać 2 g proszku α-TCP do pojemnika młyna kulowego zawierającego 630 µL glicerolu i 130 µL polisorbatu 80, stale mieszając szpatułką.
    2. Dodać 10 mg fosforanu amonu dwuzasadowego ((NH4)2HPO4, APD) i wymieszać do połączenia.
      UWAGA: Nadmierne pozostałości faz ciekłych pozostawione na szpatułce spowodują zachwianie proporcji składników tuszu, a w konsekwencji zmienią kinetykę wiązania.
    3. Dodać kulkę z cyrkonu o średnicy 25 mm, zamknąć szczelnie pokrywę i umieścić w młynie planetarnym na 60 min przy 180 rpm, przerywając proces w połowie, aby szpatułką zebrać materiał ze ścianek pojemnika.
    4. Za pomocą szpatułki nabić tusz do strzykawki 1 mL. Odpowiednio owinąć, aby uniknąć kontaktu z wilgocią. Przechowywać w temperaturze −20 °C, jeśli nie zostanie użyty natychmiast.
  3. Charakterystyka mikrostruktury tuszu kostnego
    1. Nadrukować tusz kostny w wodzie dejonizowanej i pozostawić do związania na 5 min.
    2. Przemyć próbkę 3x 10% etanolem i pozostawić do całkowitego wyschnięcia.
    3. Pokryć cienką warstwą (grubość 15 nm) złota.
    4. Wykonać mikrografie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym przy napięciu przyspieszającym 5 kV.

2. Przygotowanie zawiesin mikrożeli do druku

  1. Synteza GelMA
    UWAGA: Niniejsza procedura została przetestowana dla wielkości partii obejmujących 10 g i 20 g żelatyny. W tej metodzie szczegółowo opisano pomiary dla partii z użyciem 10 g.
    1. Przygotuj 10% w/w roztwór żelatyny typu A (wieprzowa, Bloom 300) w 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), odważając 10 g żelatyny i dodając ją do kolby stożkowej z 90 mL PBS. Podgrzewaj do 50 °C przy mieszaniu, aż żelatyna całkowicie się rozpuści.
    2. Dodaj 5,796 mL bezwodnika metakrylowego. Zamknij kolbę stożkową gumowym korkiem i kontynuuj mieszanie w ciemności w temperaturze 50 °C przez 90 min.
      OSTRZEŻENIE: Bezwodnik metakrylowy jest toksyczny w przypadku wdychania lub połknięcia oraz działa drażniąco na skórę i oczy. Pracuj wyłącznie w dygestorium i stosuj odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE).
    3. Zatrzymaj reakcję poprzez dwukrotne rozcieńczenie zawartości kolby stożkowej za pomocą PBS.
    4. Przelej zawartość do probówek 50 mL i wiruj przy 3 0 × g w temperaturze pokojowej przez 3 min, aby usunąć niezreagowany bezwodnik metakrylowy.
    5. Dializuj nadsącz wewnątrz celulozowych probówek dializacyjnych o odcięciu 14 kDa przeciwko wodzie dejonizowanej w 40 °C przez 5 dni przy delikatnym mieszaniu. Wymieniaj wodę dejonizowaną każdego dnia.
    6. Przygotuj do przechowywania, przelewając do probówek 50 mL, zamykając korek i umieszczając w lodówce na 12 h. Przechowuj w lodówce do 7 dni.
    7. Zamroź za pomocą ciekłego azotu i natychmiast liofilizuj przez 5 dni w temperaturze −54 °C i pod ciśnieniem 0,4 mbar.
      UWAGA: Upewnij się, że probówki zawierają nie więcej niż 40 mL cieczy podczas zamrażania. Po zamrożeniu zastąp korek pokryciem umożliwiającym wymianę gazową, takim jak delikatna chusteczka do zadań specjalnych zabezpieczona gumką recepturką.
    8. Przechowuj powstałą piankę w zamrażarce w temperaturze −20 °C do czasu wykorzystania przy syntezie zawiesiny mikrożeli.
  2. Synteza mikrożeli GelMA
    UWAGA: Mikrożele są syntetyzowane przy użyciu metody emulsji woda-w-oleju13 (Rysunek 2). Metoda ta została przetestowana dla objętości roztworu GelMA od 1 do 10 mL. Ten sam protokół można zastosować do syntezy mikrożeli żelatynowych używanych do drukowania samodzielnych wydruków kostnych.
    1. Przygotuj 10% w/w roztwór GelMA w PBS, odważając liofilizowaną GelMA, dodając ją do probówki z PBS i podgrzewając w kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C aż do pełnej hydratacji.
    2. Do zlewki dodaj 37 mL oleju na każdy 1 mL roztworu GelMA, upewniając się, że zlewka nie jest wypełniona w więcej niż 65%.
    3. Ustaw system dwu-zlewkowy na płycie grzejnej z mieszaniem magnetycznym, umieszczając zlewkę zawierającą olej wewnątrz większej zlewki.
      UWAGA: Wielkość obu zlewek powinna być taka, aby lód mógł być łatwo wrzucany w przestrzeń między ich ściankami. Układ przedstawiono na Rysunku 2.
    4. Podgrzej do 40 °C przy mieszaniu.
      UWAGA: Upewnij się, że wir nie jest turbulentny i ma głębokość około 1/3 wysokości oleju w zlewce.
    5. Napełnij strzykawkę roztworem GelMA i dodawaj go kroplami do mieszanego oleju przez filtr 0,45 µm. Pozostaw emulsję do ustabilizowania przez 10 min.
    6. Obniż temperaturę emulsji do 15 °C, aby termicznie ustabilizować sfery, dodając kruszony lód w przestrzeń między dwiema zlewkami.
    7. Dodaj aceton do wirującej emulsji w stosunku objętościowym 1:1 roztworu GelMA do acetonu.
      UWAGA: Dodawaj aceton delikatnie przez lejek, aby uniknąć rozbicia emulsji. Mieszaj przez 60 min.
    8. Przelej zawartość zlewki do probówek 50 mL, pamiętając o wypłukaniu ścianek zlewki acetonem. Pozostaw na 20 min, aby odwodnione mikrożele opadły na dno.
    9. Odlej nadsącz i przemyj co najmniej 2x acetonem.
      UWAGA: Nadsącz powinien być klarowny.
    10. Zgrupuj zawartość w jednej probówce, dopełnij acetonem i sonikuj przez 10 s. Przemyj 2x acetonem.
    11. Przechowuj w acetonie w temperaturze pokojowej do czasu drukowania.
  3. Przygotowywanie zawiesiny mikrożeli GelMA do drukowania
    1. Przygotuj 1% w/w roztwór GelMA w zmodyfikowanej pożywce Eagle'a z dodatkiem Dulbecco (DMEM), odważając liofilizowaną GelMA do probówki, dodając DMEM i podgrzewając w kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C aż do pełnej hydratacji.
    2. Odparuj aceton z odwodnionych mikrożeli i odważ powstały proszek do probówki. Dodaj aceton i przenieś do środowiska sterylnego.
    3. Aby utworzyć zawiesinę mikrożeli, odparuj aceton i dodaj DMEM, 1% w/w roztwór GelMA w DMEM oraz 2,5% w/w roztwór inicjatora fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP), aby uzyskać końcową frakcję upakowania 30%. Pozostaw do pełnej hydratacji przez co najmniej 12 h w temperaturze pokojowej. Przechowuj w lodówce do 7 dni. Przed użyciem doprowadź do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Objętości tych odczynników opierają się na suchej masie mikrożeli i mogą być obliczone za pomocą równań w Tabeli 1.

Równanie
x = masa suchych mikrogeli (mg)
Objętość 1% m/m GelMA w DMEM, a (µL)a = 21,93x
Objętość DMEM, b (µL)b = 8,73x
Objętość 2,5% w/w roztworu LAP, c (µL)c = 0,6267x
Całkowita objętość otrzymanej zawiesiny mikrożelu (µL)a + b + c

Tabela 1: Równania służące do obliczania objętości odczynników wymaganych do hydratacji zawiesin mikrogelu GelMA. Skróty: GelMA = metakrylan żelatyny; LAP = fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat metody emulsji olejowej stosowanej do syntezy mikrożeli. Układ z podwójnym zlewkiem przedstawia zlewka zawierającego mieszaną (wskazano strzałką) emulsję, umieszczony wewnątrz większego zlewka w celu umożliwienia chłodzenia. Skrót: GelMA = metakrylan żelatyny Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Drukowanie bioatramentu kostnego do zawiesin komórkowych

UWAGA: Mikrzele oparte na żelatynie wspierają adhezję wielu różnych typów komórek, co sprawia, że podejście to jest odpowiednie dla pojedynczych i wielu komórek wewnątrz macierzy mikrzele. Niniejszy protokół opisuje procedurę wykorzystania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs), ponieważ jest to popularny i odporny typ komórek w inżynierii tkanki mięśniowo-szkieletowej.

  1. Kulturować ADSC w niskoglukozowym DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do uzyskania konfluencji.
  2. Oddzielić ADSC od kolby do hodowli tkanek poprzez usunięcie medium, przemycie sterylnym PBS i inkubację w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z 0,25% trypsyny przez 3 min.
  3. Zestalić komórki poprzez wirowanie przy 150 × g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Policzyć komórki i obliczyć 5 × 105 komórek na każdy 1 mL mikrogeli GelMA. Odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej przenieść do osobnej probówki i zestalić w opisany wyżej sposób.
  5. Ostrożnie usunąć za pomocą pipety jak największą ilość supernatantu, pozostawiając jedynie pellet komórkowy. Dodać do pelletu wymaganą objętość zawiesiny mikrogeli i delikatnie aspirować, aby zapewnić równomierny rozkład komórek.
    UWAGA: Jeśli w zawiesinie znajdują się nadmiarowe pęcherzyki powietrza, delikatnie odwirować w celu ich usunięcia, a następnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie rozmieścić komórki.
  6. Wprowadzić zawiesinę mikrogeli z komórkami do reaktora za pomocą pipety.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wydrukowano w technologii 3D reaktory o wymiarach 10 mm x 10 mm x 3 mm i pojemności 10 µL.
  7. Nanieść bioatrament kostny (bone-ink) za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 23 G.
    UWAGA: Można to wykonać za pomocą drukarki 3D, albo poprzez doposażenie systemu ekstruzji umożliwiającego druk bezpośrednio ze strzykawki 1 mL, albo poprzez załadowanie bioatramentu kostnego bezpośrednio do wkładu ekstruzyjnego drukarki (Rysunek 3).
  8. sieciować konstrukt z mikrogeli GelMA zawierający komórki i bioatrament kostny za pomocą lampy do sieciowania UV (405 nm) przez 90 s. Natychmiast przenieść do odpowiednio dopasowanej płytki wielodołkowej i przykryć pełnym DMEM.
    ​UWAGA: Wspomniane wydrukowane w 3D reaktory mieszczą się w 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowej.
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wymienić medium hodowlane po 24 h, a następnie co 48-72 h zgodnie z potrzebami.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Schematyczna reprezentacja procedury COBICS przedstawiająca hydratację mikrogeli, inkorporację komórek oraz późniejszy druk bio-tuszu kostnego w zawiesinie mikrogeli zawierającej komórki. Skróty: COBICS = ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions; GelMA = żelatyna metakryloiloowa. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

4. Ocena żywotności i proliferacji komórek

  1. Aby ocenić cytotoksyczność bioatramentu kostnego, przechowywać konstrukty COBICS z komórkami w pełnej pożywce hodowlanej. Przeprowadzić test Live Dead po 24 h, 72 h i 120 h (lub w innych odpowiednich punktach czasowych).
  2. W każdym punkcie czasowym przemyć konstrukty PBS, a następnie dodać roztwór DMEM bez fenolu zawierający 4 mM kalceiny i 2 mM bromku etydium. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  3. Przemyć PBS i przenieść do szalki z szklanym dnem w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego przy widmach Ex/Em 494/517 nm i 528/617 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technologia COBICS pozwala na drukowanie złożonych, biologicznie istotnych konstrukcji bez konieczności stosowania materiałów wsporczych do poświęcenia lub drastycznych etapów postprocesowania (np. napromieniowania i spiekania w wysokiej temperaturze), które stanowią dwa z największych wyzwań w addytywnym wytwarzaniu konstrukcji naśladujących kość. Aby zademonstrować formowanie złożonych struktur kostnych za pomocą COBICS oraz współdrukowanie komórek w zawiesinach mikrogelu, wykonano reprezentatywne obrazy kompozytów kos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika druku 3D COBICS została opracowana, aby umożliwić wytwarzanie zmineralizowanych struktur przypominających kości poprzez wytłaczanie do sieciowalnej zawiesiny mikrożelu zawierającej żywe komórki. Technika ta została zastosowana do degradowalnej zawiesiny mikrożelu, a komórki wykazują dobrą żywotność, zdolność do rozprzestrzeniania się i różnicowania osteogennego w systemie11. Kluczowym wyznacznikiem sukcesu konstruktów tworzonych tą techniką jest prawidłowa synteza tuszu kostnego na bazie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Narodowej Radzie Zdrowia i Badań Medycznych (Grant nr. GNT1111694 i GNT1141602) oraz Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr FT180100417, FL150100060 i CE14100036). Autorzy pragną podziękować Zakładowi Obrazowania Biomedycznego na Uniwersytecie Nowej Południowej Walii. Rysunki zostały utworzone za pomocą programów Biorender.com, Adobe Photoshop i Adobe Illustrator i zostały wyeksportowane w ramach płatnej subskrypcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wytłaczarka do drukarki 3DHyrel3DEMO-25
50 ml probówki wirówkoweFalconBDAA352070
Absolutny etanol 100% denaturowanyChem-Supply
AcetonChem-Supply154871
tygiel z tlenku glinuCoors
Fosforan amonu dwuzasadowy (NaHPO4)SigmaA5764
Autodesk Fusion 360Autodesk
Szafa bezpieczeństwa biologicznego poziom 2
Węglan wapniaSigma239216
Wodorofosforan wapnia (CaHPO4)SigmaC7263
Kolby do hodowli komórkowychCorningużywane różne objętości
Celulozowe probówki do dializy, odcięcie 14 kDaSigmaD9777
Eppendorf5430R
WirówkaSigma3-16KL
Końcówka dozująca, 23 GNordson7018302
DMEM, niska glukoza, pirogronianThermo FIsher11885084
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermo FIsher
Piec elewatorowyDrukarka wielogłowicowa Labec
Engine HRHyrel3D
Płodowa surowica bydlęcaBovogen
Żelatyna typu A, ze skóry świńskiejSigmaG2500
Końcówki ze stali nierdzewnej ogólnego przeznaczeniaNordson EF
GlycerolSigmaG9012
Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowejATCCPCS-500-011
LSM 800 Mikroskop konfokalnyZEISS
(Alpha 1-4 LDplus)Christ101541
Magnetyczna płyta grzejna i mieszadło
Bezwodnik metakrylowySigma276685
Mini 2 Biurkowa drukarka 3DLulzBot
Parafilm folia uszczelniającaParafilmPM996
Penicylina-StreptomycynaThermo FIsher15140122
Planetarny młyn
Planetarny
Monooleinian polioksyetylenoorbitanu Tween-80SigmaP6224
Skanowanie mikroskop elektronowyFEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM
Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadańKimtech18813156
Standardowe sito testowe
Olej słonecznikowyCommunity Co
Trypsin-EDTA 0,25% czerwieni fenolowejThermo FIsher25200056
ZEN Microscope SoftwareZEISS
Zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków InvitrogenL3224
DMEM, niski poziom glukozy, bez czerwieni fenolowej Thermo Fisher11054020
Wirówka 14190144 Liofilizator kulowysłoik do młyna kulowegoze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
  2. Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757(2020).
  3. Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041(2016).
  4. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  5. Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660(2019).
  6. Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986(2021).
  7. Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
  8. Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209(2019).
  9. Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014(2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520(2019).
  11. Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216(2021).
  12. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).
  13. Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490(2014).
  14. Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ceramiczny biodruktusz z fosforanu wapniamikropelety GelMAregeneracja ko cimezenchymalne kom rki macierzystesieciowanie UVzawiesina mikropelet w

Powiązane artykuły