Artykuł metodologiczny

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63943

⸱

8 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, University of New South Wales, 2School of Chemistry, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales, 3School of Biomedical Engineering, University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Streszczenie

Strukturalnie, tkanka kostna jest nieorganiczno-organicznym kompozytem zawierającym metabolicznie aktywne komórki osadzone w hierarchicznej, wysoce zmineralizowanej matrycy. Ta organizacja jest trudna do odtworzenia ze względu na niejednorodne środowisko kości. Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych (COBICS) to technika biodruku oparta na mikrożelu, która w unikalny sposób odwzorowuje mineralną i komórkową strukturę kości. COBICS drukuje złożone, biologicznie istotne konstrukty bez konieczności stosowania protektorowych materiałów podporowych lub trudnych etapów obróbki końcowej (np. promieniowania i spiekania w wysokiej temperaturze), które są dwoma największymi wyzwaniami w produkcji addytywnej konstruktów mimetycznych kości. Technika ta jest możliwa dzięki swobodnemu wytłaczaniu nowego atramentu na bazie fosforanu wapnia w zawiesinie mikrożelu na bazie żelatyny. Właściwości plastyczności zawiesiny umożliwiają osadzanie się i podtrzymywanie wydrukowanej struktury kostnej. Sieciowanie UV i nanowytrącanie następnie "blokują" go w miejscu. Możliwość drukowania nanostrukturalnej ceramiki mimetycznej kości w biomateriałach obciążonych komórkami zapewnia czasoprzestrzenną kontrolę nad makro- i mikroarchitekturą oraz ułatwia wytwarzanie w czasie rzeczywistym złożonych konstruktów kostnych w warunkach klinicznych.

Wprowadzenie

Kość posiada niezwykłe zdolności regeneracyjne i jest jedną z niewielu struktur w organizmie, która może goić się poprzez odtwarzanie swojego normalnego składu komórkowego, orientacji i wytrzymałości mechanicznej, aż do osiągnięcia krytycznej wielkości ubytku, przy której endogenna zdolność do gojenia zostaje upośledzona1. Kość, wraz z chrząstką i więzadłami, wspiera i umożliwia ruchy ciała, jednocześnie magazynując minerały i tłuszcze oraz produkując komórki krwi. Jako twarda, gęsta tkanka łączna, kość składa się głównie z fazy nieorganicznej, wody oraz materiału organicznego złożonego przede wszystkim z włókien kolagenowych2. Komórki są zatopione w tej silnie zmineralizowanej macierzy z włókien kolagenu I i kryształów hydroksyapatytu (HA), tworząc strukturę hierarchiczną3.

Złożona organizacja tej tkanki sprawia, że wytwarzanie syntetycznych alternatyw odtwarzających heterogeniczne mikro- i nanostruktury kostne jest wyjątkowo trudne3. W tym celu zaproponowano szereg materiałów, w tym bioceramiki, hydrożele z zawieszonymi komórkami oraz materiały syntetyczne, jako rozwiązania pozwalające na stworzenie macierzy kostnej. Wśród technik wytwarzania rusztowań, techniki oparte na druku 3D pojawiły się niedawno i zyskały dużą uwagę środowiska inżynierii tkankowej ze względu na ich niezwykłą zdolność do tworzenia wysoce zaawansowanych i precyzyjnych struktur, co daje duże nadzieje na zastosowanie terapii spersonalizowanych4,5,6. Hydrożele stały się najpopularniejszym wyborem jako imitacje macierzy i bioatramenty, ponieważ można je drukować wraz z komórkami i cząsteczkami bioaktywnymi, tworząc funkcjonalne konstrukty6. Jednakże hydrożelom brakuje właściwości funkcjonalnych kości, takich jak wytrzymałość mechaniczna oraz silnie zwapniona faza nieorganiczna zawierająca metabolicznie czynne komórki.

Ceramiczne rusztowania drukowane w 3D zazwyczaj wymagają etapów postprocessingu, takich jak spiekanie, obróbka w wysokiej temperaturze lub stosowanie agresywnych chemikaliów, które muszą zostać dokładnie usunięte przed zastosowaniami in vitro lub in vivo5. Aby rozwiązać te ograniczenia, Lode i wsp.7 opracowali niedawno pastę na bazie α-fosforanu trójwapniowego utworzoną z hydroksyapatytu, którą można drukować i utwardzać w warunkach fizjologicznych. Materiał ten nadal nie może być jednak drukowany wspólnie z żywymi komórkami, ponieważ wymaga obróbki w wilgotnym środowisku i późniejszej długotrwałej immersji w roztworze wodnym.

Alternatywnie, jako zamiennik dla trójwymiarowej macierzy kostnej, zaproponowano hydrożele z zatopionymi komórkami i wbudowanymi cząstkami nieorganicznymi8,9. Mimo ich dużej zdolności do podtrzymywania żywotności komórek, nie są one w stanie odtworzyć środowiska gęsto zmineralizowanej tkanki kostnej. Thrivikarman i wsp.10 przyjęli podejście biomimetyczne, w którym zastosowano przesycone medium wapnia i fosforu wraz z analogiem białka niekolagenowego, aby lepiej naśladować nanoskalowe osadzanie apatytu. Jednakże ich konstrukty nadal nie pozwalają na generowanie sztywnych struktur 3D o architekturze w skali mikro- i makroskopowej przypominającej kość.

Niniejsze badanie odnosi się do tych niedociągnięć poprzez opracowanie strategii drukowania w celu wytworzenia konstruktów naśladujących kość, w fazach nieorganicznej i organicznej, które są zdolne do integracji zarówno komórek, jak i czynników wzrostu11. COBICS w unikalny sposób odtwarza mineralną i komórkową strukturę kości, wykorzystując technikę biodruku opartą na mikrożelach. Przedstawiony protokół opisuje proces syntezy ceramicznego biotuszu kostnego i mikrożeli na bazie żelatyny, a następnie łączenie ich z komórkami, co umożliwia stworzenie COBICS. Proces rozpoczyna się od syntezy głównego materiału prekursorowego biotuszu kostnego. Następnie syntetyzowany jest sieciowalny hydrożel, z którego formowane są mikrożele. Na koniec biotusz kostny jest nanoszony wielokierunkowo w kąpieli wspierającej z mikrożeli zawierających komórki (Rysunek 1).

Tusz kostny może być drukowany w dowolnej zawiesinie mikrogeli o odpowiednich charakterystykach granicy płynięcia, czyli zdolności do upłynnienia przy określonej szybkości ścinania i późniejszego podtrzymania naniesionej struktury. Zademonstrowano dwa elastyczne podejścia: zawiesinę składającą się z mikrogeli żelatynowych oraz zawiesinę składającą się z mikrogeli żelatyny modyfikowanej metakrylanem (GelMA). Pierwsza zawiesina rozpuszcza się po podniesieniu temperatury do 37 °C, co jest podstawą techniki FRESH (freeform reversible embedding of suspended hydrogels)12, podczas gdy druga może zostać fotousieciowana po druku, co skutecznie „zszywa” mikistele i unieruchamia wydrukowany tusz kostny. Niniejsze badanie koncentruje się na wykorzystaniu GelMA jako matrycy, ponieważ zapewnia ona unikalną zaletę w postaci możliwości wspierania wzrostu komórek dzięki drukowaniu in situ złożonych struktur biomimetycznych imitujących kość. Ostatecznie podejście to umożliwia generowanie złożonych modeli tkanek o wysokim stopniu biomimetyzmu, co ma szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób, odkrywaniu leków i inżynierii regeneracyjnej.

Proces wytwarzania tuszu kostnego, synteza α-TCP, schemat hydratacji mikrożeli, druk 3D z użyciem tuszu kostnego.
Rysunek 1: Schemat przebiegu prac. (A) Tusz kostny jest syntetyzowany, zaczynając od syntezy α-fosforanu trójwapniowego i jego późniejszego połączenia z glicerolem, polisorbatem 80 oraz dwuzasadowym fosforanem amonu. (B) Mikrożele GelMA są wytwarzane metodą emulsji woda w oleju. Uzyskane mikrożele są następnie (C) hydratowane i (D) łączone z komórkami. Kompozyty komórka-mikrożel są następnie wykorzystywane jako łoże granularne, w którym osadzany jest tusz kostny. (E) Cała konstrukcja jest następnie sieciowana promieniami UV i przenoszona do inkubatora w celu hodowli. Skróty: α-TCP = α-fosforan trójwapniowy; GelMA = metakrylan żelatyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja tuszu kostnego

  1. Synteza α-fosforanu trójwapniowego
    1. Odważyć proszki wodorofosforanu wapnia (CaHPO4) i węglanu wapnia (CaCO3) w molowym stosunku Ca:P wynoszącym 3:2. Za pomocą szpatułki dokładnie zhomogenizować oba proszki.
    2. Przenieść mieszaninę proszków wodorofosforanu wapnia i węglanu wapnia do tygla cyrkonowego tak, aby był on wypełniony w maksymalnie 75% swojej objętości.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczeń, należy użyć nowego tygla lub tygla wcześniej wykorzystanego do otrzymywania tego samego materiału. W celu oczyszczenia opłukać tygiel 100% etanolem i pozostawić do wyschnięcia w dygestorium przed dodaniem proszków.
    3. Przenieść tygiel do pieca. Nagrzać do 1 400 °C z szybkością 5 °C/min i utrzymać tę temperaturę przez 3 h.
    4. Przerwać reakcję poprzez wyjęcie tygla z pieca i pozostawienie go na bloku ogniotrwałym. Pozostawić do całkowitego ostygnięcia przed manipulacją.
      UWAGA: Należy używać kleszczy do tygli o odpowiedniej długości i zapewnić właściwą ochronę termiczną.
    5. Za pomocą moździerza i tłuczka rozbić i zmielić spieczony α-TCP w taki sposób, aby otrzymane granulaty miały maksymalną wielkość 200 µm.
      UWAGA: Należy użyć standardowego sita ze stali nierdzewnej, aby zapewnić prawidłową wielkość cząstek.
    6. Dalsze mielenie granulatów przeprowadzić w młynie planetarnym w dwóch etapach. Najpierw dodać kulki z cyrkonu stabilizowanego itrem o średnicy 3 mm w stosunku masowym kulek do proszku 8:1, a następnie 100% etanol w stosunku masowym etanolu do proszku 3:1. Zamknąć szczelnie pokrywę i mielić przez 2 h przy 180 rpm.
    7. zebrać zawiesinę i oddzielić kulki, używając 100% etanolu do przemycia.
    8. Wysuszyć zawiesinę w suszarce w temperaturze 120 °C przez 24 h.
    9. Wsypać wysuszony proszek do naczyń mielących z kulkami cyrkonowymi o średnicy 1 mm i 100% etanolem w tych samych stosunkach masowych co w pierwszym etapie. Mielić przez 2 h przy 180 rpm, oddzielić i wysuszyć.
      UWAGA: Cała procedura syntezy została przedstawiona na Rysunku 1A.
  2. Przygotowanie tuszu kostnego (bone-ink)
    1. W celu przygotowania tuszu kostnego dodać 2 g proszku α-TCP do naczynia młyna kulowego zawierającego 630 µL glicerolu i 130 µL polisorbatasu 80, cały czas mieszając szpatułką.
    2. Dodać 100 mg fosforanu amonu dwuzasadowego ((NH4)2HPO4, APD) i wymieszać.
      UWAGA: Nadmierna ilość pozostałości faz ciekłych na szpatułce spowoduje zachwianie proporcji składników tuszu, a tym samym zmianę kinetyki wiązania.
    3. Dodać kulkę cyrkonową o średnicy 25 mm, zamknąć szczelnie pokrywę i umieścić naczynie w młynie planetarnym na 60 min przy 180 rpm, przerywając proces w połowie czasu w celu zebrania osadów ze ścianek naczynia za pomocą szpatułki.
    4. Za pomocą szpatułki napełnić strzykawkę 1 mL tuszem. Odpowiednio owinąć strzykawkę, aby uniknąć kontaktu z wilgocią. Jeśli tusz nie zostanie użyty natychmiast, przechowywać w temperaturze −20 °C.
  3. Charakterystyka mikrostruktury tuszu kostnego
    1. Wydrukować tusz kostny w wodzie dejonizowanej i pozostawić do związania na 5 min.
    2. Przemyć próbkę 3x 100% etanolem i pozostawić do całkowitego wyschnięcia.
    3. Pokryć cienką warstwą złota (grubość 15 nm).
    4. Wykonać mikrofotografie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową przy napięciu przyspieszenia 5 kV.

2. Przygotowanie zawiesin mikrogeli do drukowania

  1. Synteza GelMA
    UWAGA: Procedura ta została przetestowana dla partii o masie 10 g i 20 g żelatyny. Niniejsza metoda szczegółowo opisuje pomiary dla partii wykorzystującej 10 g.
    1. Przygotować 10% (m/m) roztwór żelatyny typu A (świńska, stopień Bloom 300) w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), odważając 10 g żelatyny i dodając ją do kolby stożkowej z 90 mL PBS. Podgrzewać do 50 °C podczas mieszania, aż żelatyna całkowicie się rozpuści.
    2. Dodać 5,796 mL bezwodnika metakrylowego. Zamknąć kolbę stożkową gumowym korkiem i kontynuować mieszanie w ciemności w temperaturze 50 °C przez 90 min.
      OSTROŻNIE: Bezwodnik metakrylowy jest toksyczny w przypadku inhalacji lub połknięcia oraz działa drażniąco na skórę i oczy. Należy go używać wyłącznie w dygestorium i stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej.
    3. Przerwać reakcję, rozcieńczając zawartość kolby stożkowej dwukrotnie za pomocą PBS.
    4. Przelać do probówek 50 mL i wirować przy 3 000 × g w temperaturze pokojowej przez 3 min, aby usunąć niezreagowany bezwodnik metakrylowy.
    5. Dializować nadsącz w celu oczyszczania w rurkach do dializy celulozowej o odcięciu 14 kDa przeciwko wodzie dejonizowanej w temperaturze 40 °C przez 5 dni przy łagodnym mieszaniu. Wodę dejonizowaną wymieniać codziennie.
    6. Przygotować do przechowywania, przelewając do probówek 50 mL, szczelnie zamykając korek i umieszczając w lodówce na 12 h. Przechowywać w lodówce do 7 dni.
    7. Zamrozić przy użyciu ciekłego azotu i niezwłocznie liofilizować przez 5 dni w temperaturze −54 °C i pod ciśnieniem 0,4 mbar.
      UWAGA: Upewnić się, że probówki zawierają nie więcej niż 40 mL cieczy podczas mrożenia. Po zamrożeniu zastąpić korek pokryciem umożliwiającym wymianę gazową, takim jak delikatna chusteczka do zadań precyzyjnych przymocowana gumką recepturką.
    8. Przechowywać powstałą piankę w zamrażarce w temperaturze −20 °C do momentu rozpoczęcia syntezy zawiesiny mikrogelu.
  2. Synteza mikrogeli GelMA
    UWAGA: Mikrogele są syntetyzowane przy użyciu metody emulsji woda-w-oleju13 (Rycina 2). Metoda ta została przetestowana dla objętości roztworu GelMA od 1 do 10 mL. Ten sam protokół można zastosować do syntezy mikrogeli żelatynowych używanych do drukowania samodzielnych wydruków kostnych.
    1. Przygotować 10% (m/m) roztwór GelMA w PBS, odważając liofilizowaną GelMA, dodając ją do probówki z PBS i podgrzewając w kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C do pełnego nawodnienia.
    2. Dodać 37 mL oleju na każdy 1 mL roztworu GelMA do zlewki, dbając o to, aby była wypełniona maksymalnie w 65%.
    3. Przygotować system dwuzlewkowy na płycie grzewczej z mieszaniem magnetycznym, umieszczając zlewkę z olejem w większej zlewce.
      UWAGA: Wielkość obu zlewek powinna być taka, aby lód mógł być łatwo wsypywany w przestrzeń między ich ściankami. Układ przedstawiono na Rycini 2.
    4. Podgrzewać do 40 °C podczas mieszania.
      UWAGA: Upewnić się, że wir nie jest turbulentny i ma głębokość wynoszącą około 1/3 wysokości oleju w zlewce.
    5. Napełnić strzykawkę roztworem GelMA i dodawać go kroplowo do mieszanego oleju przez filtr 0,45 µm. Pozostawić emulsję do wyrównania na 10 min.
    6. Obniżyć temperaturę emulsji do 15 °C w celu termicznej stabilizacji sfer, dodając kruszony lód w przestrzeni między dwiema zlewkami.
    7. Dodać aceton do wirującej emulsji w stosunku objętościowym 1:11 roztworu GelMA do acetonu.
      UWAGA: Dodawać aceton ostrożnie przez lejek, aby uniknąć rozbicia emulsji. Mieszać przez 60 min.
    8. Przelać zawartość zlewki do probówek 50 mL, pamiętając o przemyciu ścianek zlewki acetonem. Pozostawić na 20 min, aby odwodnione mikrogele osiadły na dnie.
    9. Odlać nadsącz i przemyć co najmniej 2x acetonem.
      UWAGA: Nadsącz powinien być przejrzysty.
    10. Zgromadzić w jednej probówce, dopełnić acetonem i poddać sonikacji przez 10 s. Przemyć 2x acetonem.
    11. Przechowywać w acetonie w temperaturze pokojowej do czasu drukowania.
  3. Przygotowanie zawiesiny mikrogelu GelMA do drukowania
    1. Przygotować 1% (m/m) roztwór GelMA w zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle (DMEM), odważając liofilizowaną GelMA do probówki, dodając DMEM i podgrzewając w kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C do pełnego nawodnienia.
    2. Odparować aceton z odwodnionych mikrogeli i odważyć powstały proszek do probówki. Dodać aceton i przenieść do środowiska sterylnego.
    3. Aby utworzyć zawiesinę mikrogelu, odparować aceton i dodać DMEM, 1% (m/m) roztwór GelMA w DMEM oraz 2,5% (m/m) roztwór inicjatora fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP), aby uzyskać końcową frakcję upakowania 30%. Pozostawić do pełnego nawodnienia przez co najmniej 12 h w temperaturze pokojowej. Przechowywać w lodówce do 7 dni. Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Objętości tych odczynników opierają się na suchej masie mikrogeli i mogą być obliczone za pomocą równań w Tabeli 1.

Równanie
x = masa suchych mikrogeli (mg)
Objętość 1% m/m GelMA w DMEM, a (µL)a = 21,93x
Objętość DMEM, b (µL)b = 8,773x
Objętość 2,5% (m/m) roztworu LAP, c (µL)c = 0,6267x
Całkowita objętość otrzymanej zawiesiny mikrożeli (µL)a + b + c

Tabela 1: Równania służące do obliczania objętości odczynników wymaganych do hydratacji zawiesin mikrogelu GelMA.Skróty: GelMA = metakrylan żelatyny; LAP = fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilfosfinian litu.

Układ z zlewką zawierającą GelMA w oleju z lodem, ilustrujący proces polimeryzacji do badań naukowych.
Rycina 2: Schemat metody emulsji w oleju stosowanej do syntezy mikrogelu. Układ z podwójną zlewką przedstawia zlewkę zawierającą mieszaną (wskazane strzałką) emulsję umieszczoną wewnątrz większej zlewki w celu umożliwienia chłodzenia. Skrót: GelMA = żelatyna metakrylowa Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Drukowanie biotuszu kostnego do zawiesin komórkowych

UWAGA: Mikrożele na bazie żelatyny wspierają adhezję wielu różnych typów komórek, co sprawia, że podejście to jest odpowiednie dla pojedynczych i wielu komórek w obrębie macierzy mikrożelu. Niniejszy protokół opisuje procedurę wykorzystania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs), ponieważ jest to popularny i stabilny typ komórek stosowany w inżynierii tkanki układu mięśniowo-szkieletowego.

  1. Hodować ADSCs w DMEM z niską zawartością glukozy, uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do uzyskania konfluencji.
  2. Odłączyć ADSCs z kolby do hodowli tkankowej poprzez usunięcie medium, przemycie sterylnym PBS i inkubację w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z 0,25% trypsyny przez 3 min.
  3. Zgranulować komórki poprzez wirowanie przy 150 × g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Policzyć komórki i obliczyć ilość 5 × 105 komórek na każdy 1 mL mikrogeli GelMA. Przenieść wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do oddzielnej probówki i zgranulować jak opisano wyżej.
  5. Ostrożnie usunąć jak największą ilość supernatantu za pomocą pipety, pozostawiając jedynie pellet komórkowy. Dodać wymaganą objętość zawiesiny mikrogelu do pelletu i delikatnie aspirować, aby zapewnić równomierny rozkład komórek.
    UWAGA: Jeśli w zawiesinie znajdują się nadmiarowe pęcherzyki powietrza, delikatnie wirować w celu ich usunięcia i pipetować w górę i w dół, aby ponownie rozłożyć komórki.
  6. Napełnić reaktor zawiesiną mikrogelu z komórkami za pomocą pipety.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wydrukowano w technologii 3D reaktory o wymiarach 10 mm x 10 mm x 3 mm i pojemności 100 µL.
  7. Nanieść bioatrament kostny za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 23 G.
    UWAGA: Można to wykonać za pomocą drukarki 3D, albo poprzez dostosowanie systemu ekstruzji umożliwiającego drukowanie bezpośrednio ze strzykawki 1 mL, albo poprzez bezpośrednie załadowanie bioatramentu kostnego do wkładu ekstruzyjnego drukarki (Rycina 3).
  8. Usieciować konstrukt z mikrogelu GelMA zawierający komórki i bioatrament kostny za pomocą lampy do sieciowania UV (405 nm) przez 90 s. Natychmiast przenieść do płytki wielodołkowej o odpowiedniej wielkości i przykryć kompletnym DMEM.
    ​UWAGA: Wspomniane reaktory wydrukowane w 3D mieszczą się w 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowej.
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wymienić medium hodowlane po 24 h, a następnie co 48-72 h w zależności od potrzeb.

Schemat procesu mikrożeli GelMA, formulacja tuszu kostnego, mieszanina komórek do badań z zakresu bioinżynierii.
Rysunek 3: Schematyczna reprezentacja procedury COBICS pokazująca hydratację mikrożeli, inkorporację komórek oraz późniejszy druk tuszu kostnego w zawiesinie mikrożeli obciążonej komórkami. Skróty: COBICS = ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions; GelMA = gelatin methacrylate. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Ocena żywotności i proliferacji komórek

  1. Aby ocenić cytotoksyczność tuszu kostnego, należy utrzymać konstrukty COBICS z komórkami w pełnej pożywce hodowlanej. Przeprowadzić test Live Dead po 24 h, 72 h i 120 h (lub w innych odpowiednich punktach czasowych).
  2. W każdym punkcie czasowym konstrukty należy przemyć PBS, a następnie dodać roztwór DMEM bez fenolu zawierający 4 mM kalceiny i 2 mM bromku etydyny. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Przemyć PBS i przenieść do szalki z szklanym dnem w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego przy widmach Ex/Em 494/517 nm i 528/617 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

COBICS umożliwia drukowanie złożonych, biologicznie istotnych konstruktów bez konieczności stosowania materiałów wspierających poświęcalnych lub agresywnych etapów postprocessingu (np. napromieniowania i spiekania w wysokiej temperaturze), które stanowią dwa z największych wyzwań w addytywnym wytwarzaniu konstruktów naśladujących kość. Aby zademonstrować tworzenie złożonych struktur kostnych za pomocą COBICS oraz współdrukowanie komórek w zawiesinach mikrogelu, wykonano reprezentatywne obrazy kompozytów kostkopodobnych s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika druku 3D COBICS została opracowana, aby umożliwić wytwarzanie zmineralizowanych struktur przypominających kości poprzez wytłaczanie do sieciowalnej zawiesiny mikrożelu zawierającej żywe komórki. Technika ta została zastosowana do degradowalnej zawiesiny mikrożelu, a komórki wykazują dobrą żywotność, zdolność do rozprzestrzeniania się i różnicowania osteogennego w systemie11. Kluczowym wyznacznikiem sukcesu konstruktów tworzonych tą techniką jest prawidłowa synteza tuszu kostnego na bazie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Narodowej Radzie Zdrowia i Badań Medycznych (Grant nr. GNT1111694 i GNT1141602) oraz Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr FT180100417, FL150100060 i CE14100036). Autorzy pragną podziękować Zakładowi Obrazowania Biomedycznego na Uniwersytecie Nowej Południowej Walii. Rysunki zostały utworzone za pomocą programów Biorender.com, Adobe Photoshop i Adobe Illustrator i zostały wyeksportowane w ramach płatnej subskrypcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wytłaczarka do drukarki 3DHyrel3DEMO-25
50 ml probówki wirówkoweFalconBDAA352070
Absolutny etanol 100% denaturowanyChem-Supply
AcetonChem-Supply154871
tygiel z tlenku glinuCoors
Fosforan amonu dwuzasadowy (NaHPO4)SigmaA5764
Autodesk Fusion 360Autodesk
Szafa bezpieczeństwa biologicznego poziom 2
Węglan wapniaSigma239216
Wodorofosforan wapnia (CaHPO4)SigmaC7263
Kolby do hodowli komórkowychCorningużywane różne objętości
Celulozowe probówki do dializy, odcięcie 14 kDaSigmaD9777
Eppendorf5430R
WirówkaSigma3-16KL
Końcówka dozująca, 23 GNordson7018302
DMEM, niska glukoza, pirogronianThermo FIsher11885084
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermo FIsher
Piec elewatorowyDrukarka wielogłowicowa Labec
Engine HRHyrel3D
Płodowa surowica bydlęcaBovogen
Żelatyna typu A, ze skóry świńskiejSigmaG2500
Końcówki ze stali nierdzewnej ogólnego przeznaczeniaNordson EF
GlycerolSigmaG9012
Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowejATCCPCS-500-011
LSM 800 Mikroskop konfokalnyZEISS
(Alpha 1-4 LDplus)Christ101541
Magnetyczna płyta grzejna i mieszadło
Bezwodnik metakrylowySigma276685
Mini 2 Biurkowa drukarka 3DLulzBot
Parafilm folia uszczelniającaParafilmPM996
Penicylina-StreptomycynaThermo FIsher15140122
Planetarny młyn
Planetarny
Monooleinian polioksyetylenoorbitanu Tween-80SigmaP6224
Skanowanie mikroskop elektronowyFEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM
Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadańKimtech18813156
Standardowe sito testowe
Olej słonecznikowyCommunity Co
Trypsin-EDTA 0,25% czerwieni fenolowejThermo FIsher25200056
ZEN Microscope SoftwareZEISS
Zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków InvitrogenL3224
DMEM, niski poziom glukozy, bez czerwieni fenolowej Thermo Fisher11054020
Wirówka 14190144 Liofilizator kulowysłoik do młyna kulowegoze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
  2. Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757(2020).
  3. Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041(2016).
  4. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  5. Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660(2019).
  6. Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986(2021).
  7. Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
  8. Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209(2019).
  9. Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014(2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520(2019).
  11. Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216(2021).
  12. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).
  13. Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490(2014).
  14. Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ceramiczny biodruktusz z fosforanu wapniamikropelety GelMAregeneracja ko cimezenchymalne kom rki macierzystesieciowanie UVzawiesina mikropelet w

Powiązane artykuły