Obecny protokół został zatwierdzony przez lokalną komisję etyki ds. eksperymentów na zwierzętach oraz przez Instytucjonalny Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt (APAFIS#30483-2021031811339219 v1, Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Paryskiego Saclay, Francja). Zwierzęta były leczone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opracowanymi przez Narodowy Instytut Zdrowia oraz z Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi opracowanymi przez National Society for Medical Research.
UWAGA: Zabiegi chirurgiczne były wykonywane w ścisłej sterylności przy użyciu tych samych technik, które stosuje się wobec człowieka. Zabiegi eksperymentalne obejmowały duże białe prosięta (45-60 kg) i były wykonywane w znieczuleniu ogólnym.
1. Protokół kondycjonowania i znieczulenia zwierząt
- Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się przez 7 dni, z kongenerami i wzbogacić środowisko, aby zapewnić dobrostan zwierząt.
- Nie karmić zwierząt na 12 godzin przed ich włączeniem do protokołu doświadczalnego.
- Na 30 minut przed zabiegiem należy wykonać premedykację z domięśniowym wstrzyknięciem równomolowej mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (10 mg/kg) w mięśnie szyi.
- Po podaniu zwierzęciu sedacji należy wprowadzić cewnik do żyły usznej i wywołać znieczulenie ogólne za pomocą dożylnego bolusa propofolu (2 mg/kg) w połączeniu z podaniem atrakurium (2 mg/kg).
- Zaintubuj zwierzę za pomocą sondy ustno-tchawiczej o średnicy 7,5 mm.
- Monitoruj zwierzę za pomocą ciągłego EKG, wydechowego CO2 i oksymetrii.
- Utrzymuj znieczulenie ogólne za pomocą wziewnego izofluranu (2%) zmieszanego z 40% suplementem tlenu.
2. Hemodydynamika i echokardiograficzna ocena serca in situ
UWAGA: Ocena hemodynamiczna jest wykonywana za pomocą cewnika Swan Ganz, podczas gdy podstawowa ocena funkcjonalna serca jest wykonywana za pomocą echokardiografii przezklatkowej.
- Wprowadzić przezskórnie osłonkę francuską 8 (Fr) do pnia żylnego ramienno-głowowego za pomocą techniki Seldingera8.
- Po odpowietrzeniu cewnika i ustawieniu ciśnienia 0 należy wprowadzić cewnik Swan Ganz do osłonki 8 Fr, aż na ekranie monitorowania zostanie zaobserwowany profil ciśnienia płucnego.
- Uzyskaj ciśnienie niedrożności tętnicy płucnej, wciskając cewnik Sawn-Ganz w krążenie płucne, gdy balon jest napompowany.
- Ocenić pojemność minutową serca metodą termorozcieńczania przez infuzję 10 ml zimnego (4 °C) roztworu soli fizjologicznej w linii proksymalnej cewnika Swan Ganz. Powtórz pomiar trzy razy.
- Oceń frakcję wyrzutową lewej komory (LVEF) za pomocą dwupłatowej techniki Simpsona9.
- Zbadaj zastawkę aortalną i korzeń aorty, aby zidentyfikować wszelkie zaburzenia strukturalne lub niedomykalność zastawki aortalnej powyżej stopnia 2, które mogą zagrozić perfuzji ex situ serca przez aortę wstępującą (Rysunek 1).
3. Opis i przygotowanie maszyny do normotermicznej perfuzji ex situ (NESP)
UWAGA: Zmodyfikowany moduł NESP jest używany do alternatywnego wykonywania perfuzji Langendorffa i perfuzji w trybie pracy. Krótko mówiąc, podłącz linię aorty obwodu do komory podatności za pomocą złącza Y. Dodaj dotleniacz pediatryczny i zbiornik do kardiotomii (wysokość 70-80 cm nad łącznikiem aorty modułu), aby zapewnić obciążenie następcze lewej komory około 70 mmHg w trybie pracy. Podłącz kolejny zbiornik do kardiodomii (7-10 cm wysokości powyżej łącznika aorty modułu) do głównego przewodu doprowadzającego za pomocą łącznika Y, aby zapewnić napięcie wstępne lewego przedsionka około 10 mmHg w trybie pracy (Rysunek 2). Przepływ wieńcowy ocenia się za pomocą czujnika przepływu podłączonego do kaniuli płucnej. Pompa odśrodkowa, natleniacz membranowy i maszyna grzewczo-chłodząca są podłączone do obwodu (Rysunek 2). Opisy rozwiązań znajdują się w Tabeli 1.
- Zalać obwód perfuzyjny roztworem zalewowym (Tabela 1).
- Ustaw wydajność pompy na 1500 ml/min.
- Dodaj krew pobraną od świni dawcy (1200-1500 ml) w obwodzie.
- Ustawić mieszalnik gazów tak, aby osiągnął ciśnienie parcjalne tlenu >250 mmHg.
- Podłącz roztwór do konserwacji i roztwór adrenaliny (Tabela 1) do obwodu i ustaw początkową moc wyjściową odpowiednio na 5 ml/h i 0,1 ml/h.
- Ustaw temperaturę perfuzatu w temperaturze pokojowej (RT) przed umieszczeniem serca w module perfuzyjnym.
- W trybie pracy podłączyć strzykawkę z dobutaminą o stężeniu 2,5 mg/ml (wydajność między 0,04-0,12 mg/h).
4. Pobieranie serca i oprzyrządowanie do normotermicznej perfuzji serca ex situ
- Zaopatrzenie serca
- Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i kontynuuj utrzymywanie znieczulenia ogólnego.
- Wykonaj sternotomię pośrodkową i otwórz osierdzie.
- Zawieś osierdzia za pomocą czterech szwów podtrzymujących.
- Umieść szwy polipropylenowe 4-0 na prawym przedsionku i na aorcie wstępującej, aby zabezpieczyć kaniulacje z opaskami uciskowymi.
- Po infuzji heparyny (300 j.m./kg) i dokładnym rozwarstwieniu korzenia aorty należy wprowadzić dwustopniową kaniulę żylną do prawego przedsionka w celu pobrania krwi i jednokanałową kaniulę w aorcie wstępującej w celu infuzji kardioplegii.
- Odizoluj żyłę główną górną i dolną za pomocą opasek uciskowych Silastic.
- Podłącz kaniulę żylną do worka do pobierania krwi zawierającego 10 000 j.m. niefrakcjonowanej heparyny.
- Umieść ciało prosiąt w pozycji Trendelenburga, aby poprawić drenaż krwi do worka zbiorczego.
- Po zakończeniu pobierania krwi zacisnąć krzyżowo aortę wstępującą, wprowadzić kardioplegię Del Nido do korzenia aorty (Tabela 1) i sprawdzić, czy aorta wstępująca jest pod ciśnieniem (brak niedomykalności zastawki aortalnej).
- Odciąż prawy i lewy przedsionek, otwierając odpowiednio żyłę główną dolną i prawą żyłę płucną, podczas gdy żyła główna górna jest zaciskana opaską uciskową.
- Po zakończeniu infuzji kardioplegii należy podwiązać lewą żyłę hemiazygos za pomocą dwóch szwów z polipropylenu 4-0.
- Przystąp do pobierania serca, zachowując 2 cm pnia płucnego wraz z lewą tylną ścianą przedsionka.
- Sprawdź, czy nie ma opatentowanego otworu owalnego, sprawdzając przegrodę przedsionkową i zamknij ją, jeśli to konieczne, za pomocą szwów polipropylenowych 4-0.
- Oprzyrządowanie serca przed NESP
- Umieścić serce w roztworze soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C i oddzielić aortę wstępującą od pnia płucnego. Sprawdź, czy zastawka aortalna i ujścia naczyń wieńcowych nie są uszkodzone.
- Wprowadzić cztery zastawione szwy (polipropylen 4-0) 5 mm poniżej dystalnego odcinka aorty wstępującej i wprowadzić kaniulę infuzyjną do aorty. Dokręć zacisk węża wokół aorty, aby zabezpieczyć kaniulę.
- Wprowadzić kaniulę drenażową do pnia płucnego i zabezpieczyć szokiem biegowym z polipropylenu 3-0.
- Zamknij żyłę główną dolną i górną za pomocą szwów polipropylenowych 5-0.
- Zamknij tylną ścianę lewego przedsionka za pomocą polipropylenowego szwu biegowego 4-0.
- Włóż kaniulę lewego otworu wentylacyjnego przez tylną ścianę lewej ściany przedsionka i zaczep opaskę uciskową wokół.
- Włóż kaniulę wstępnie załadowaną do uszka lewego przedsionka i załóż wokół niego opaskę uciskową.
5. Podłączenie do urządzenia NESP i reanimacja serca
UWAGA: Przed wykonaniem oprzyrządowania serca upewnij się, że materiały niezbędne do resuscytacji są dostępne obok obwodu perfuzji, zwłaszcza defibrylator z wewnętrznymi sondami i zewnętrzny rozrusznik serca z elektrodami nasierdziowymi. Upewnij się, że przewód ciśnieniowy jest podłączony do przewodu aortalnego, a czujnik wyjściowy jest umieszczony na przewodzie przepływu wieńcowego. Przewód obciążenia wtórnego musi być zaciśnięty, podobnie jak przewód napięcia wstępnego obwodu trybu pracy.
- Zmniejsz przepływ pompy do 200 ml/min.
- Podłącz serce do łącznika aorty po odpowietrzeniu łącznika. Upewnij się, że serce jest odpowiednio połączone z modułem perfuzyjnym, tak aby dolne ściany komory oraz lewy i prawy przedsionek znajdowały się przed operatorem. Unikaj skręcania aorty wstępującej, aby zapobiec niedomykalności aorty.
- Dostosuj ciśnienie w aorcie do 30 mmHg przy RT.
- Podczas resuscytacji wykonuj płynny masaż serca, aż do przywrócenia rytmu zatokowego.
- Powoli zwiększaj przepływ pompy w ciągu 15-25 minut, stopniowo co 50 ml/min, aby osiągnąć ciśnienie w aortze 65 mmHg. W tym samym czasie należy stopniowo zwiększać temperaturę perfuzatu o 2-4 °C, aż do osiągnięcia 37 °C.
- Gdy ciśnienie w aorcie osiągnie 65 mmHg, a temperatura perfuzatu 37 °C, w razie potrzeby przeprowadź wstrząs elektryczny o natężeniu 5 J i powtarzaj, aż zostanie przywrócony rytm zatokowy.
- Zamocuj elektrodę nasierdziową na tylnej ścianie prawej komory i podłącz do zewnętrznego rozrusznika serca. Stymuluj tempo pracy serca przy 80 uderzeniach na minutę, aby przesterować spontaniczny rytm.
- Podłącz kaniulę płucną do przewodu przepływu wieńcowego.
- Wykonać próbki krwi tętniczej i żylnej do analiz gazowych i biochemicznych perfuzatu. Zapisz początkowe stężenie mleczanu i skoryguj zaburzenia biochemiczne, aby osiągnąć następujące cele: glukoza >1 g/L, K+ 3,5-5,5 mmol/L, Ca2+ 1,0-1,20 mmol/L, pH 7,35-7,45, Na+ 135-145 mmol/L i HCO3-20-24 mmol/L.
- Dostosuj przepływ pompy, aby osiągnąć średnie ciśnienie w aorcie 65-75 mmHg i przepływ wieńcowy 650-850 ml / min.
- Wykonuj gazometrię krwi tętniczo-żylnej co 15 minut, aby upewnić się, że ekstrakcja mleczanu w mięśniu sercowym jest skuteczna. Jeśli mleczan żylny jest wyższy niż mleczan tętniczy, zwiększ średnie ciśnienie w asocie do 80 mmHg, zmniejszając roztwór podtrzymujący i sprawdź stężenie mleczanu 15 minut później. Jeśli klirens mleczanu tętniczo-żylnego jest nadal upośledzony, zwiększ przepływ wieńcowy do >850 ml i sprawdź stężenie mleczanu 15 minut później.
6. Procedura trybu pracy
UWAGA: Efektywny klirens mleczanu tętniczo-żylnego jest zwykle osiągany w ciągu 30 minut po rozpoczęciu perfuzji Langendorffa. Tryb pracy można następnie zainicjować, podłączając kaniulę napięcia wstępnego do zbiornika napięcia wstępnego (linia ta była wcześniej zaciśnięta w trybie Langendorffa). Podobnie, linia obciążenia następczego jest połączona z linią aorty (Rysunek 2). Ustaw czujnik przepływu na linii obciążenia następczego, aby zmierzyć rzut serca.
- Otwórz przewód napięcia wstępnego i wyreguluj przepływ pompy, aby zapewnić stabilne napełnianie zbiornika obciążenia wstępnego. W tym okresie lewy przedsionek i lewa komora są stopniowo wypełniane krwią.
- Otwórz linię obciążenia następczego aorty i zaciśnij główną linię obwodu używanego do perfuzji Langendorffa. Zbiornik obciążenia wtórnego jest stopniowo napełniany. Zapewnić opróżnienie zbiornika za pomocą przewodu przelewowego, który doprowadza perfuzat z powrotem do głównego zbiornika obwodu.
- Rozpocząć infuzję dobutaminy w dawce 0,04 mg/min.
- Wykonaj analizę próbki gazometrii krwi tętniczej i żylnej, aby upewnić się, że ekstrakcja mleczanu w mięśniu sercowym jest nadal skuteczna.
- Gdy rzut serca jest stabilny, wykonaj inwazyjną ocenę hemodynamiczną wraz z pomiarami ultrasonograficznymi nasierdzia.
7. Ocena pętli ciśnienie-objętość (PV) metodą konduktancji
UWAGA: Wszystkie kroki kalibracji muszą być wykonywane w trybie pracy.
- Wprowadzenie cewnika PV do lewej komory
- Oczyść cewnik konduktancyjny warkocza 7 Fr roztworem soli fizjologicznej i podłącz go do interfejsu sprzętowego.
- Delikatnie wepchnij cewnik do osłonki wprowadzającej 8 Fr wcześniej wprowadzonej przez lewy dach przedsionka, aby wyrównać go z zastawką mitralną.
- Gdy tylko cewnik przejdzie przez zastawkę mitralną, dostosuj odpowiednią pozycję, biorąc pod uwagę optymalne sygnały ciśnienia i objętości. Jeśli jest zbyt duży hałas, delikatnie przesuń cewnik konduktowający, aby poprawić jakość pętli.
- Kalibracja cewnika pętli PV
- Kalibracja ciśnienia
- Gdy cewnik konduktancyjny zostanie odpowiednio umieszczony w lewej komorze, otwórz interfejs kalibracji w oprogramowaniu i skalibruj wartość ciśnienia za pomocą oprogramowania do akwizycji do pomiarów przewodności.
- Rozpocznij nagrywanie, wybierz ciśnienie 0 mmHg i 100 mmHg na interfejsie sterowania i nagrywaj przez 5 sekund każdy.
- Następnie zatrzymaj nagrywanie i otwórz interfejs kalibracji ciśnienia. Dopasuj odpowiedni sygnał do poziomu ciśnienia.
- Po kalibracji sprawdź, czy sygnał jest zgodny z wartościami uzyskanymi przez inwazyjne monitorowanie ciśnienia krwi.
- Kalibracja objętości
- Kalibracja przewodności
- Otwórz interfejs sterowania w oprogramowaniu do pomiarów przewodności.
- Rozpocznij nagrywanie, jedna po drugiej, wybierz głośność sugerowaną przez interfejs kalibracji.
- Pozwól interfejsowi nagrywać przez 5 sekund, a następnie zatrzymaj nagrywanie.
- Użyj uzyskanego śledzenia danych i otwórz interfejs kalibracji objętości.
- Dopasuj odpowiednią ścieżkę do poziomu ciśnienia.
- Równoległa kalibracja głośności
- Otaczająca tkanka serca przewodzi elektryczność i przyczynia się do ogólnego sygnału głośności. Usuń tę równoległą objętość, aby uzyskać dokładny pomiar objętości (kalibracja po przetwarzaniu).
- Aby ocenić równoległą objętość w tym układzie (ściana mięśnia sercowego), wstrzyknij jednorazowo 10 ml hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej (4%) do lewej linii przedsionka.
- Nie powtarzaj operacji, aby uniknąć hipernatremii.
- Kalibracja współczynnika korekcji pola
- Wprowadź wartość objętości wyrzutowej uzyskaną z pomiarów ultradźwiękowych.
UWAGA: Współczynnik alfa zostanie obliczony z uwzględnieniem stosunku objętości wyrzutowej uzyskanej w wyniku pomiarów ultrasonograficznych lub cewnikowania konduktowanego.
- Gromadzenie danych z zakresu fotowoltaiki
- Zatrzymaj stymulację nasierdziową serca, aby uniknąć zakłóceń sygnału przewodnictwa. Rejestruj dane w stanie ustalonym, gdy sygnał jest ustabilizowany (Rysunek 3)
- Wybierz serię 10 kolejnych pętli i otwórz oprogramowanie do analizy. Oprogramowanie automatycznie zapewni pracę z udarem, pracę z udarem przed rekrutacją, maksymalną wartość dP/dt, minimalną wartość dP/dt i indeks tau.
- Aby uzyskać zależność ciśnienie końcowoskurczowe od objętości i zależność ciśnienie-ciśnienie końcoworozkurczowe od objętości, należy nagrać sygnał podczas okluzji obciążenia wstępnego. Stopniowo zaciskaj linię perfuzji przedsionków, aż redukcja obciążenia wstępnego będzie skuteczna (Rysunek 4). Następnie powoli zwolnij zacisk.
8. Echokardiografia nasierdziowa serca w stanie sprawnym
- Akwizycja pętli ultradźwiękowych
- Umieść trzy elektrody nasierdziowe EKG podłączone do aparatu do echokardiogramu.
- Nałóż sterylną serwetkę wokół serca i użyj sondy przezprzełykowej.
- Przyłóż sondę do górnej ściany lewego przedsionka i ręcznie obracaj przetwornik, aż uzyskasz widok z czterech komór (Rysunek 5).
- Uruchom oprogramowanie do akwizycji echokardiograficznej do oceny wydolności mięśnia sercowego w trybie X-plan.
- Następnie uruchom silnik sondy ultradźwiękowej, aby uzyskać widoki trzy- i dwukomorowe. Analiza tych widoków pozwala na pomiar frakcji wyrzutowej lewej komory oraz globalnego odkształcenia podłużnego9.
- Ocena wskaźnika pracy mięśnia sercowego (MWI)
- Przystąp do akwizycji widoków cztero-, trzy- i dwukomorowych i zapisz jednoczesne ciśnienie tętnicze (Rysunek 6).
- Oceń globalne odkształcenie podłużne za pomocą tych widoków i otwartego oprogramowania MWI. Użyj inwazyjnego ciśnienia krwi wykrytego przez czujnik zewnętrzny w obwodzie perfuzji podczas akwizycji pętli.
- Ręcznie powiadom oprogramowanie o dokładnym czasie otwarcia i zamknięcia zastawki aortalnej i mitralnej.
UWAGA: Oprogramowanie MWI automatycznie zapewni globalne MWI, konstruktywną pracę, zmarnowaną pracę i efektywną pracę.