Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63958

⸱

31 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diagnostic Radiology, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Department of Oncology, MRC Oxford Institute for Radiation Oncology, University of Oxford, 3Department of Surgery, School of Clinical Medicine, HKU-SZH & LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 4Department of Biomedical Engineering, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Diagnostic and Interventional Radiology, Kwong Wah Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia ortotopowych ksenoprzeszczepów raka wątrobowokomórkowego z podwiązaniem tętnicy wątrobowej i bez niej oraz wykonywania nieinwazyjnego obrazowania hipoksji guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu [18F]Fluoromisonidazolu ([18F]FMISO) i [18F]Fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG).

Streszczenie

Przedkliniczne modele eksperymentalne raka wątrobowokomórkowego (HCC), które opisują chorobę człowieka, stanowią ważne narzędzie do badania nowotworzenia i oceny nowych podejść terapeutycznych. Nieinwazyjne obrazowanie całego ciała za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) zapewnia krytyczny wgląd w charakterystykę in vivo tkanek na poziomie molekularnym w czasie rzeczywistym. Przedstawiamy tutaj protokół tworzenia ortotopowego ksenoprzeszczepu HCC z podwiązaniem tętnic wątrobowych (HAL) i bez niego w celu wywołania niedotlenienia guza oraz oceny ich metabolizmu guza in vivo za pomocą obrazowania [18F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO) i [18F]fluorodeoksyglukozy ([18F]fdg) PET/rezonansu magnetycznego (MR). Niedotlenienie guza można było łatwo uwidocznić za pomocą markera hipoksji [18F] FMISO i stwierdzono, że wychwyt [18F] FMISO był wyższy u myszy HCC, które przeszły HAL niż w grupie bez HAL, podczas gdy [18F] FDG nie mógł odróżnić niedotlenienia guza między dwiema grupami. Guzy HAL wykazywały również wyższy poziom ekspresji czynnika indukowanego hipoksją (HIF)-1α w odpowiedzi na niedotlenienie. Kwantyfikacja guzów HAL wykazała 2,3-krotny wzrost wychwytu FMISO [18F] w oparciu o podejście wychwytu wartości standaryzowanej (SUV).

Wprowadzenie

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest szóstym najczęściej diagnozowanym nowotworem i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka na świecie, z ponad 900 000 nowych przypadków i 800 000 zgonów w 2020 roku1. Głównym czynnikiem ryzyka jest marskość wątroby, która występuje w wyniku infekcji wirusowych (wirusy zapalenia wątroby typu B i C), nadużywania alkoholu, cukrzycy i niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby2. Leczenie HCC jest dość złożone i dostępnych jest kilka opcji leczenia, w tym resekcja chirurgiczna, ablacja termiczna lub chemiczna, przeszczep, chemoembolizacja przeztętnicza, radioterapia i chemioterapia, w zależności od stopnia zaawansowania choroby2,3. HCC jest nowotworem opornym na chemioterapię, z nawrotem choroby u nawet 70% pacjentów po terapii z zamiarem wyleczenia2.

Pomimo wysokiego stopnia niejednorodności guza, HCC wiąże się z dwoma powszechnymi wynikami: (i) HCC jest bardzo niedotlenione, oraz (ii) niedotlenienie guza wiąże się z większą agresywnością guza i niepowodzeniem leczenia. Niekontrolowana proliferacja komórek HCC powoduje wysokie tempo zużycia tlenu, które poprzedza unaczynienie, tworząc w ten sposób niedotlenione mikrośrodowisko. Niski poziom tlenu w obrębie guza wyzwala następnie szereg reakcji biologicznych, które wpływają na agresywność guza i odpowiedź na leczenie. Czynniki indukowane hipoksją (HIF) są często uznawane za podstawowe regulatory transkrypcji w odpowiedzi na niedotlenienie2,3. W związku z tym zdolność do wykrywania niedotlenienia jest kluczowa dla wizualizacji tkanek nowotworowych i identyfikacji miejsc niedostępnych, które wymagają inwazyjnych zabiegów. Pomaga również lepiej zrozumieć zmiany molekularne, które prowadzą do agresywności guza i poprawić wyniki leczenia pacjentów.

Obrazowanie molekularne za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) jest powszechnie stosowane w diagnostyce i ocenie stopnia zaawansowania wielu nowotworów, w tym HCC. W szczególności łączne zastosowanie dwuznacznikowego obrazowania PET z udziałem [18F]fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG) i [11C] octanu może znacznie zwiększyć ogólną czułość w diagnostyce HCC4,5. Z drugiej strony obrazowanie hipoksji można uzyskać za pomocą powszechnie stosowanego markera hipoksji [18F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO). W praktyce klinicznej nieinwazyjna ocena niedotlenienia jest ważna dla rozróżnienia różnych typów nowotworów i regionów do planowania radioterapii6.

Obrazowanie przedkliniczne stało się niezastąpionym narzędziem do nieinwazyjnej i długotrwałej oceny modeli mysich dla różnych chorób. Solidny i wysoce powtarzalny model HCC stanowi ważną platformę dla badań przedklinicznych i translacyjnych nad patofizjologią HCC u ludzi oraz oceny nowych terapii. Wraz z obrazowaniem PET, zachowania in vivo mogą zostać wyjaśnione, aby dostarczyć ważnych informacji na poziomie molekularnym dla dowolnego punktu czasowego. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania ortotopowych ksenoprzeszczepów HCC do podwiązania tętnic wątrobowych (HAL) i analizy ich metabolizmu guza in vivo przy użyciu [18F] FMISO i [18F] FDG PET/MR. Włączenie HAL tworzy odpowiedni model transgenicznych lub chemicznie indukowanych ksenoprzeszczepów myszy HCC do badania niedotlenienia guza in vivo, ponieważ HAL może skutecznie blokować dopływ krwi tętniczej w celu wywołania niedotlenienia wewnątrznowotworowego7,8. Ponadto, w przeciwieństwie do barwienia immunohistochemicznego ex vivo przy użyciu pimonidazolu, zmiany w metabolizmie guza w wyniku niedotlenienia można łatwo zobrazować i dokładnie określić ilościowo nieinwazyjnie za pomocą obrazowania PET, umożliwiając podłużną ocenę odpowiedzi na leczenie lub ocenę pojawienia się oporności3,7,8. Przedstawiona tutaj metoda pozwala na stworzenie solidnego modelu hipoksyjnego HCC wraz z nieinwazyjnym monitorowaniem niedotlenienia guza za pomocą obrazowania PET/MR w celu zbadania biologii HCC in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt w Nauczaniu i Badaniach (CULATR) w Centrum Badań Medycyny Porównawczej (CCMR) na Uniwersytecie w Hongkongu, programem akredytowanym przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Zwierzętami wykorzystanymi w badaniu były samice myszy BALB/cAnN-nu (Nude) w wieku 6-8 tygodni, o wadze 20 g ± 2 g. Żywność i wodę dostarczano ad libitum.

1. Podskórne wstrzyknięcie linii komórkowych ludzkiego raka wątrobowokomórkowego

UWAGA: MHCC97 to ludzka linia komórkowa HCC, która jest używana do generowania podskórnego modelu ksenoprzeszczepu HCC. MHCC97L komórki są pozyskiwane z Instytutu Raka Wątroby, Szpitala Zhongshan Uniwersytetu Fudan w Szanghaju, Chińska Republika Ludowa9 i uwierzytelniane przez profilowanie krótkich powtórzeń tandemowych (STR).

  1. Hodować MHCC97L komórki i utrzymywać w pożywkach hodowlanych uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz 1% penicyliną i streptomycyną w kolbie do hodowli komórek T-75 w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO2 (patrz tabela materiałów). Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni i zbieraj komórki przy zbiegu 80%-90%.
    UWAGA: Początkowy numer komórki to 1,5 x 106 komórek, a komórki są używane w ciągu 6-8 przejść.
  2. Przechowywać pożywkę hodowlaną i kwas trypsyna-etylenodiaminotetraoctowy (trypsyna-EDTA) w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu użycia. Przed użyciem należy wstępnie podgrzać pożywkę hodowlaną do temperatury 37 °C, a trypsynę-EDTA do temperatury pokojowej. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o wszystkich odczynnikach i materiałach eksploatacyjnych używanych w tym rozdziale.
  3. Usuń pożywkę hodowlaną. Przepłukać warstwę komórkową 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS, patrz Tabela materiałów).
  4. Dodać 5 ml trypsyny-EDTA do kolby hodowlanej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C. Sprawdzić komórki pod mikroskopem odwróconym przy 20-krotnym powiększeniu (patrz Tabela materiałów), aż warstwa komórkowa zostanie rozproszona i całkowicie oderwana od kolby. Upewnij się, że komórki nie pozostają w trypsyno-EDTA na dłużej niż 15 minut.
  5. Dodać 5 ml pożywki do kolby hodowlanej. Odessać komórki, delikatnie pipetując. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i wirować z masą 1,107 x g przez 5 minut (patrz tabela materiałów).
  6. Usunąć sklarowany osad i delikatnie zawiesić osad komórkowy z 1 ml PBS. Dokładnie odpipetować pipetę, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Oznaczyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów) i przygotować zawiesinę komórek do stężenia 5 x 106 komórek/ml w PBS.
  7. Pobrać 200 μl zawiesiny komórek za pomocą igły 25 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Każda strzykawka zawiera 1 x 106 MHCC97L komórek (w 200 μl). Trzymać strzykawkę na wilgotnym lodzie.
  8. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p.) mieszaniny ketaminy (87,5 mg/kg) i ksylazyny (12,5 mg/kg). Zapewnij odpowiednie znieczulenie za pomocą odruchu szczypania palców u stóp. Pamiętaj, aby nałożyć na mysz lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu i potencjalnemu tworzeniu się owrzodzeń rogówki. Umieść mysz w pozycji leżącej na sterylnej podkładce (patrz Tabela materiałów).
  9. Wysterylizuj obszar grzbietowy w pobliżu dolnej strony (po lewej lub prawej stronie) myszy za pomocą 70% etanolu (patrz Tabela materiałów). Podnieś skórę za pomocą kleszczyków i delikatnie włóż igłę pod skórę.
  10. Przesunąć igłę o 4-5 mm wzdłuż płaszczyzny podskórnej od miejsca wkłucia, aby uniknąć przypadkowego wycieku zawiesiny komórek z miejsca wstrzyknięcia po wyjęciu igły. Upewnij się, że wkłucie igły nie znajduje się zbyt głęboko pod skórą, co może spowodować przypadkowe uszkodzenie narządów.
  11. Zwolnić kleszcze i ostrożnie, powoli opróżnić zawartość strzykawki, uważając, aby nie przebić się na przeciwną stronę. Wyciągnąć igłę, aby sprawdzić, czy nie ma obrzęku po wstrzyknięciu. Umieść mysz z powrotem w klatce, siedząc na wstępnie podgrzanej poduszce grzewczej, aby pomóc w powrocie do zdrowia po znieczuleniu i odzyskaniu mobilności. Kontynuuj monitorowanie myszy, aż mysz całkowicie się obudzi i utrzyma pozycję leżącą mostka.
  12. Monitoruj wzrost guza i samopoczucie myszy co tydzień. Zmierz objętość guza (V) za pomocą suwmiarki (patrz Tabela materiałów). Oblicz i zapisz objętość guza za pomocą następującego wzoru10:
    V = (W2× L)/2
    gdzie W to szerokość, a L to długość guza.
  13. Między 4-6 tygodniami po wstrzyknięciu należy sprawdzić, czy uzyskano znaczny rozmiar guza podskórnego, między 800-1000 mm3. Upewnij się, że całkowite obciążenie guzem nie przekracza 10% masy ciała.

2. Ortotopowa implantacja wątroby i podwiązanie tętnicy wątrobowej

  1. W zdezynfekowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj następujące odczynniki i narzędzia chirurgiczne: 10 ml pożywki hodowlanej w naczyniu, 10% roztwór jodu powidonu, 70% etanol, autoklawowane narzędzia chirurgiczne, tj. ostre nożyczki, nożyczki sprężynowe, kleszcze (zakrzywione cienkie i proste), uchwyt igły, ostrze skalpela, szew nylonowy 6-0 i 5-0, poduszka grzewcza.
  2. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie i obchodzić się z nimi tylko na sterylnym stole. Zapewnij myszom odpowiednią i niezbędną opiekę przed, śród- i pooperacyjną podczas zabiegów chirurgicznych (patrz kroki poniżej).
    1. W celu złagodzenia bólu przedoperacyjnego należy wstrzyknąć myszowi podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg) co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego. W celu opieki pooperacyjnej i leczenia należy wstrzyknąć myszowi podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg) przez 3 dni w sposób ciągły, raz na 8-12 godzin. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o wszystkich odczynnikach i materiałach eksploatacyjnych używanych w tym rozdziale.
  3. Poddaj eutanazji podskórną mysz z guzem za pomocą wstrzyknięcia dożylnego pentobarbitalu (330 mg / kg). Wykonaj nacięcie na skórze w miejscu guza za pomocą ostrza skalpela. Wyciąć podskórny blok guza i natychmiast przenieść go do pożywki hodowlanej. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe.
  4. Pokrój blok nowotworowy na 1 mm3 małe kostki guza za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych. Trzymaj wszystkie kostki nowotworowe w pożywce hodowlanej. Unikaj używania obszaru rdzenia podskórnego bloku guza.
  5. Znieczulenie myszy, która będzie przechodzić późniejszą operację implantacji guza ortotopowego, za pomocą wstrzyknięcia dożylnie mieszaniny ketaminy (87,5 mg / kg) i ksylazyny (12,5 mg / kg). Upewnij się, że upłynęło co najmniej 30 minut od podania buprenorfiny przed znieczuleniem myszy. Pamiętaj, aby nałożyć lubrykant do oczu na mysz, aby uniknąć wysuszenia i potencjalnego powstania owrzodzeń rogówki.
  6. Umieść mysz w pozycji leżącej na sterylnej podkładce, która znajduje się na wstępnie podgrzanej poduszce grzewczej. Monitoruj i rejestruj stan fizjologiczny myszy co 15 minut, aż do zakończenia zabiegu chirurgicznego.
  7. Wyprostuj kończyny myszy. Zabezpiecz je taśmą, aby zmaksymalizować odsłonięcie brzusznej części brzucha i klatki piersiowej. Wysterylizuj całą skórę brzucha myszy 10% roztworem jodu powidonu, a następnie 70% etanolem. Oceń głębokość znieczulenia myszy, sprawdzając, czy nie ma reakcji na szczypanie palców u nóg - odruch wycofania pedału.
  8. Wykonaj laparotomię, wykonując około 10 mm nacięcie w linii środkowej, aby uzyskać dostęp do otrzewnej za pomocą ostrych nożyczek. Zacisnąć i pociągnąć wyrostek mieczykowaty w kierunku głowy za pomocą kleszczy i zastosować retraktory podżebrowe, aby otworzyć pole operacyjne. Upewnij się, że wykonane jest odpowiednie nacięcie, aby umożliwić dobry chirurgiczny widok miejsca operacji.
  9. Cofnij środkowe i lewe płaty do góry za pomocą mokrego wacika z gazy. Przenieś jelita na zewnątrz brzucha na lewą stronę myszy i przykryj je mokrym wacikiem z gazy. Wykonaj podwiązanie tętnicy wątrobowej (HAL) na wspólnej tętnicy wątrobowej (CHA), która zaczyna się od głowy trzustki do korzenia w szypułce wątroby, pod lampą powiększającą w celu zoptymalizowania wizualizacji.
  10. Cofnij środkowy i lewy płat do tyłu/w dół za pomocą mokrego wacika z gazy, aby odsłonić lewy płat. Wykonać nacięcie o długości i głębokości około 2 mm na powierzchni lewego płata za pomocą sterylnego ostrza skalpela.
    UWAGA: Możliwe jest również użycie środkowego płata wątroby do implantacji guza, aby zminimalizować przypadkowe rozdarcia lub skaleczenia przez uraz sąsiednich narządów jamy brzusznej.
  11. Natychmiast wprowadź fragment guza do nacięcia wątroby za pomocą sterylnych kleszczy. Zakop guz tak, aby bezpiecznie przylegał do wątroby. Nałożyć szew ósemkowy z nylonowym szwem 6-0 w miejscu nacięcia, aby zapewnić prawidłowe zagnieżdżenie fragmentu guza do wątroby i hemostazę. Wykonaj tę operację tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Po zakończeniu zamknij nacięcie brzucha przerwanymi szwami 5-0.
  12. Umieść mysz z powrotem w klatce, siedząc na wstępnie podgrzanej poduszce grzewczej, aby pomóc w powrocie do zdrowia po znieczuleniu i odzyskaniu odruchu prostowania. Kontynuuj monitorowanie i rejestrowanie stanu fizjologicznego myszy co 15 minut, aż mysz całkowicie się obudzi i utrzyma pozycję leżącą mostka.
  13. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie myszy przejdą ortotopową implantację guza. Zapewnij opiekę pooperacyjną wszystkim myszom, stale monitorując ich stan fizjologiczny codziennie przez kolejne 3 dni po operacji chirurgicznej. Podawać buprenorfinę (0,1 mg/kg) co 8-12 godzin.

3. Konfiguracja kalibracji PET/MR i przepływu pracy

UWAGA: Obrazowanie jest wykonywane przy użyciu przedklinicznego systemu PET/MR 3T (patrz Tabela Materiałów).

  1. Użyj 5% izofluranu (1 l/min medyczneO2) do znieczulenia myszy w komorze indukcyjnej. Przy każdym skanowaniu ostrożnie umieść znieczuloną mysz na stole obrazowym z ciągłym ogrzewaniem; najpierw skanuj za pomocą MR (scout view) jako anatomicznego odniesienia dla statycznych skanów [18F]FMISO lub [18F]fdg PET, a następnie anatomicznego referencyjnego obrazowania MR.
  2. Utwórz sekwencyjny przepływ pracy obrazowania PET/MR w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów), aby uwzględnić statyczny skan PET, obrazowanie MR metodą T1 (korekcja tłumienia) i T2 (odniesienie anatomiczne) oraz rekonstrukcję PET na 1 dzień przed zaplanowaną sesją obrazowania.
  3. Aby uzyskać PET, wybierz dyskryminację na poziomie 400-600 keV, izotop badania F-18, tryb koincydencji 1-5 i 20-minutowe skany.
  4. Aby uzyskać MR T1 całego ciała, użyj echo gradientowe 3D z TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, polem widzenia (FOV) = 90 mm x 60 mm, liczbą wzbudzeń (NEX) = 3, 28 warstw o grubości 0,9 mm i rozmiarem woksela = 0,375 mm3 x 0,375 mm3 x 0,9 mm3.
  5. Aby uzyskać MR T2-zależne od całego ciała, użyj echa szybkoobrotowego 2D z TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 warstw o grubości 0,9 mm, rozmiar woksela = 0,265 mm3 x 0,268 mm3 x 0,9 mm3.
  6. Aby zrekonstruować PET, wybierz algorytm Tera-Tomo (TT3D), iteracje = 8, podzbiory = 6, tryb koincydencji 1-3 oraz z poprawkami zaniku, czasu martwego, losowego, tłumienia i rozproszenia, aby utworzyć obrazy o ogólnym rozmiarze woksela 0,3 mm3.
  7. Wykonaj test aktywności PET przed rozpoczęciem eksperymentu, aby sprawdzić dokładność oceny ilościowej PET11.
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml 5-8 MBq [18F]FMISO rozcieńczonym w wodzie lub soli fizjologicznej zgodnie z zaleceniami producenta. Użyć kalibratora dawki, aby zarejestrować aktywność strzykawki (patrz Tabela materiałów). Zanotuj czas pomiaru.
    2. Narysuj objętość zainteresowania (VOI) na zrekonstruowanym obrazie, aby pokryć całą strzykawkę. Porównaj aktywność odzyskaną z obrazu z wartością uzyskaną z kalibratora dawki. Kontynuuj badania obrazowe, gdy odzyskana aktywność jest dokładna w granicach ±5%.

4. [18F]FMISO i [18F]FDG wtrysk

  1. Dawkę kliniczną [18F]FMISO należy uzyskać od dostawcy na 30 minut przed rozpoczęciem badań obrazowych. Podczas pracy z materiałami radioaktywnymi należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), takie jak fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary, plakietka filmowa i dozymetry pierścieniowe. Często zmieniaj rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego substancjami radioaktywnymi.
  2. Umieścić radioaktywne roztwory podstawowe w pojemniku do przechowywania ołowiu za osłoną stołową z blokiem L. Dozować podwielokrotność [18F]FMISO i rozcieńczyć wysterylizowanym roztworem soli fizjologicznej. Upewnij się, że całkowite stężenie aktywności wynosi 18-20 MBq w 100 μl.
  3. Sporządzić [18F]FMISO za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą (patrz tabela materiałów). Zapisać radioaktywność i czas pokazany na kalibratorze dawki.
  4. Zapisać masę ciała myszy przed wstrzyknięciem radioznacznika. Użyj 5% izoffluranu (1 l/min medyczneO2) do znieczulenia myszy, a następnie ostrożnie wstrzyknij przygotowany [18F]FMISO przez żyłę ogonową. Zapisać czas wstrzykiwania i aktywność pozostałości strzykawki w celu uwzględnienia korekcji próchnicy. Umieść mysz z powrotem w klatce na 180 minut, aby umożliwić [18F]absorpcję FMISO przed skanowaniem PET. Pozwól myszy na regenerację przez 1 dzień po [18F]FMISO PET.
    UWAGA: Pomimo bardzo różnych profili farmakokinetycznych in vivo dla [18F]FMISO i [18F]FDG, oba radioznaczniki są znakowane radioizotopem F-18, który jest radionuklidem PET o okresie półtrwania 109,77 min (< 2 h). Ponieważ sygnał PET pochodzi z F-18, połowa początkowej wstrzykniętej radioaktywności będzie tracona co 2 godziny. W takim przypadku sygnał szczątkowy 24 godziny po wstrzyknięciu nie może być już wykryty przez skaner PET. Ponadto 1-dniowa przerwa między wstrzyknięciami [18F]FMISO (dzień 1) i [18F]FDG (dzień 3) pozwoli na całkowite zanik [18F]FMISO, gdy [18F]FDG PET zostanie wykonany, a zatem nie będzie nakładania się sygnału [18F]FMISO w skanie [18F]FDG PET.
  5. Powtórzyć kroki 4.1.-4.4. dla wstrzyknięcia [18F]FDG w dniu 3, z wyjątkiem sytuacji, gdy całkowite stężenie aktywności wynoszące 6-8 MBq w 100 μl jest wstrzykiwane z 60-minutowym wychwytem przed rozpoczęciem skanowania PET.
  6. Oblicz wstrzykniętą aktywność [18F]FMISO lub [18F]FDG, korzystając z następującego wzoru11:
    Aktywność po wstrzyknięciu (MBq) = Aktywność w strzykawce przed wstrzyknięciem - Aktywność w strzykawce po wstrzyknięciu

5. Akwizycja PET/MR

  1. Włącz nagrzewnicę powietrza, aby ogrzać stół do obrazowania myszy przed zaplanowanym skanowaniem PET. Użyj 5% izofluranu (1 l/min medyczny O2) do znieczulenia myszy w komorze indukcyjnej.
  2. Po prawidłowym znieczuleniu i sprawdzeniu za pomocą reakcji szczypania palca, ostrożnie i natychmiast przenieś mysz do stołu grzewczego i utrzymuj znieczulenie na poziomie 2%-2,5% izofluranu. Umieść głowę myszy leżącą na pasku gryzowym i nałóż smar do oczu na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia i potencjalnego powstania owrzodzeń rogówki. Przykryj stół do obrazowania plastikowym prześcieradłem, aby utrzymać temperaturę otoczenia łóżka.
  3. Monitoruj i rejestruj częstość oddechów i temperaturę ciała myszy za pomocą odpowiednio wewnętrznej podkładki oddechowej i sondy termicznej. Upewnij się, że temperatura ciała myszy jest utrzymywana na poziomie 37 °C, podczas gdy częstość oddechów jest utrzymywana w zakresie 40-50 oddechów na minutę (bpm), dostosowując poziom izofluranu.
  4. Wykonaj widok zwiadowczy, aby zlokalizować pozycję myszy wewnątrz skanera. Dostosuj pozycję łoża myszy tak, aby pokryło całe ciało myszy, z obszarem tułowia znajdującym się w środkowym polu widzenia MR.
  5. Aby rozpocząć skanowanie PET, wybierz Akwizycja PET w oknie listy badań, a następnie wybierz Zakres skanowania przy poprzedniej akwizycji, aby użyć wstępnie określonej pozycji łóżka myszy w widoku zwiadowcy. Kliknij Przygotuj > OK, aby automatycznie przesunąć łóżko myszy z MR do PET i rozpocząć akwizycję.
  6. W Edytorze Radiofarmaceutyków należy wybrać odpowiedni radionuklid, a następnie wprowadzić szczegółowe informacje na temat dawki i czasu wstrzyknięcia przed i po wstrzyknięciu [18F]FMISO lub [18F]FDG, zgodnie z pomiarem w kroku 4.3 i kroku 4.4. Wprowadź wagę myszy w menu Informacje o temacie.
  7. Kontynuuj akwizycję MR po zakończeniu skanowania PET. Aby to zrobić, wybierz opcję Przygotuj do przeniesienia myszy na MR z PET. Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
  8. Po zakończeniu wszystkich skanów wybierz opcję Strona główna, aby przesunąć stół obrazowania z powrotem do pozycji domyślnej.
  9. Wyłącz znieczulenie i przepłucz stół obrazowy medycznym O2. Sprawdź odruch wycofania pedału myszy. Przenieś mysz z łóżka do obrazowania z powrotem do czystej klatki umieszczonej na poduszce grzewczej, aby pomóc w powrocie do zdrowia po znieczuleniu i odzyskaniu odruchu prostowania.
  10. W obszarze Raw Scanning (Skanowanie RAW) wybierz opcję PET Acquisition (Akwizycja PET), aby załadować pozyskane surowe dane PET do rekonstrukcji PET. Wybierz MM, który ma być używany jako mapa materiałowa. Kontynuuj rekonstrukcję PET przy użyciu parametru opisanego w kroku 3.6.
  11. Ściśle przestrzegaj lokalnych i instytucjonalnych wytycznych podczas obchodzenia się z myszami po badaniach obrazowania PET. Wszystkie zużyte materiały eksploatacyjne, np. strzykawki, igły, rękawiczki, chusteczki i odpady biologiczne, np. ściółkę w klatkach i kał, które miały bezpośredni kontakt z myszą, należy traktować jako odpady radioaktywne i obchodzić się z nimi ostrożnie zgodnie z lokalnymi przepisami.

6. Analiza obrazu PET

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) i wybierz opcję Załaduj dane DICOM, aby otworzyć obrazy PET i MR.
  2. Przeciągnij odpowiednie obrazy PET i MR do okna wyświetlacza oprogramowania i wybierz opcję Automatyczna rejestracja, aby przeprowadzić automatyczną korejestrację wynikowych obrazów PET i MR.
    1. W menu Registration Setup (Ustawienia rejestracji) wybierz opcję Rigid transformation (Transformacja sztywna). Użyj Shift i Obrót w menu Sztywny/Niesubtelny.
    2. W menu Global Role Selection (Globalny wybór roli) kliknij MM jako Reference (Odniesienie) i Static PET Scan (Statyczne skanowanie PET) jako opcję Reslice.
    3. Sprawdź współzarejestrowane obrazy PET/MR, aby upewnić się, że są prawidłowo wyrównane. W razie potrzeby użyj rejestracji ręcznej, aby ręcznie dostosować obrazy.
    4. Zlokalizuj guz ortotopowy w wątrobie za pomocą obrazu MR. Użyj interpolowanego zwrotu z inwestycji w elipsę, aby narysować VOI na guzie, używając obrazu MR jako odniesienia. Przenieś utworzony guz VOI z MR na obraz PET. Wybierz narzędzie Pędzel i narzędzie Gumka, aby dokładnie zdefiniować obramowanie VOI slajd po slajdzie. Należy upewnić się, że na obrazie PET nie dochodzi do rozlania się wychwytu radioaktywności z wątroby.
    5. Użyj Ellipsoid VOI, aby utworzyć 3 mm3 VOI na wątrobie jako narządzie referencyjnym. Upewnij się, że unikasz obszarów widocznych struktur wątrobowych, naczyniowych i żółciowych, korzystając z obrazu MR jako przewodnika.
    6. Wybierz opcję Pokaż tabelę ROI, aby zmienić nazwy wszystkich narysowanych VOI. Zapisz wszystkie niezbędne dane, np. radioaktywność (kBq/ml) i objętość guza (mm3), w arkuszu kalkulacyjnym. Zapisz kopię rysunków VOI i zarchiwizuj zarówno surowe, jak i zrekonstruowane dane obrazowania na zewnętrznym dysku twardym po zakończeniu.
    7. Oblicz znormalizowaną wartość absorpcji (SUV) dla wszystkich VOI, korzystając z następującego równania11:
      SUV = CPET(t)/(ID/BW)
      gdzie CPET(t) jest zmierzoną aktywnością w VOI, ID jest dawką wstrzykniętą mierzoną w kBq, a BW jest masą ciała myszy w kg, przy założeniu gęstości tkanki 1 g/ml.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uzyskać odpowiedni blok nowotworowy do kolejnej implantacji ortotopowej, w pierwszej kolejności wygenerowano stabilne klony poprzez podskórny wtrysk 200 μL zawiesiny komórkowej w DPBS (zawierającej komórki MHCC97L) w dolny bok myszy nago (Rysunek 1A). Monitorowano wzrost guza i gdy jego objętość osiągnęła 800-1000 mm3 (około 4 tygodnie po wstrzyknięciu), myszy uśmiercono, a otrzymany blok nowotworowy pocięto na fragmenty o wielkości około 1 mm3 do późniejszej implan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisaliśmy procedury wykonywania HAL na ortotopowych ksenoprzeszczepach HCC wątroby przy użyciu guzów podskórnych, wraz z metodami nieinwazyjnego monitorowania niedotlenienia guza w ortotopowych ksenoprzeszczepach przy użyciu [18F] FMISO i [18F] FDG PET/MR. Interesujemy się obrazowaniem metabolicznym różnych modeli nowotworów i chorób w celu wczesnej diagnozy i oceny odpowiedzi na leczenie 11,13,14,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie Funduszu Powierniczego Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) dla eksperymentów z obrazowaniem małych zwierząt. Dziękujemy również za wsparcie Centrum Obrazowania Molekularnego i Cyklotronu Medycznego (MIMCC) na Uniwersytecie w Hongkongu za udostępnienie [18F]FMISO i [18F]FDG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sterylna sól fizjologicznaBBraunN/A0,9% chlorek sodu wlew dożylny, 500 ml
10 # Ostrze skalpelaRWD Life Science Co., ltdS31010-01Narzędzie do chirurgii zwierząt
10% roztwór jodu powidonuBanitore6.425.678Do dezynfekcji
igła 25G ze strzykawką 1 mlBD PrecisionGlideN/AStrzykawka 1 ml z igłą 25G do wstrzykiwań zawiesin komórkowych
Strzykawka 5 mlTerumoSS05LStrzykawka 5 ml Luer Lock
70% etanoluMerck1.07017Do dezynfekcji
Automatyczny licznik komórekInvitrogenAMQAF2000Do automatycznego liczenia komórek
BuprenorfinaHealthDirectN/AWstrzyknięcie podskórne (0,05-0,2 mg/kg/12 godzin) dla przeciwbólowe po zabiegu chirurgicznym
Naczynie do hodowli komórkowych (średnica 60 mm)Thermo Scientific150462Do przetwarzania tkanek nowotworowych
WirówkaSigma3-16KL, rotor o stałym kącie nachylenia 12311Do zbierania zawiesin komórkowych
Wirówka Rurka stożkowaEppendorfEP0030122151Do zbierania zawiesin komórkowych
Pożywki hodowlane (Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średnie)Gibco10566024wysoka glukoza, GlutaMAX™ Suplement
Suwmiarka cyfrowaRS Pro841-2518Do podskórnego pomiaru wielkości guza
Inkubator CO2 inkubatorTechcomp LimitedNU5841Do hodowli komórkowych
Kalibrator dawkiBiodex  Nie dotyczyAtomlab 500
DPBS (Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Gibco14287072Do płukania komórek i iniekcji
Smar do oczuAlcon Duratears  Nie dotyczySterylna maść nawilżająca do oczu, 3,5 g
Surowica bydlęca płodu (FBS)GibcoA4766801Stosowany do szerokiego zakresu typów komórek, szczególnie wrażliwych linii komórkowych
Kleszcze (zakrzywione, cienkie i proste,)RWD Life Science Co., LtdF12012-10 & F12011-13Narzędzie do chirurgii zwierząt
Poduszka grzewczaALA Scientific InstrumentsN/APoduszka grzewcza dla myszy podczas operacji
Strzykawka insulinowaTerumo10ME29131 mL strzykawka insulinowa z igłą do wstrzykiwań radioznacznikowych
Oprogramowanie InterViewFusion Mediso Wersja 3.03Oprogramowanie do przetwarzania końcowego i analizy obrazu
Mikroskop odwróconyYu Lung Scientific Co., LtdBM-209GDo wizualizacji morfologii komórek
IsofluraneChanelle Pharma  N/AIso-Vet, wziewny środek znieczulający, 250 ml
KetamineAlfasan International B.V.HK-37715Ketamina 10% roztwór do wstrzykiwań, 10 ml 
Tlen medycznyLinde HKO101-HRsprężony gaz, czystość 99,5%
nanoScan Skaner PET/MRMediso  Nie dotyczy3 Tesla MR
Uchwyt igłyRWD Life Science Co., LtdF31026-12Narzędzie do chirurgii zwierząt
Oprogramowanie Nucline nanoScanMedisoWersja 3.0Oprogramowanie operacyjne skanera
Szew nylonowy (6/0 i 5/0)Healthy Medical Company Ltd000524 & 000526Narzędzie do chirurgii zwierząt
Penicylina - StreptomycynaGibco15140122Pożywki hodowlane o końcowym stężeniu 50 do 100 j.m./ml penicyliny i 50 do 100 &mikro; g/ml streptomycyny.
PentabarbitalAlfaMedic13003Wstrzyknięcie dootrzewnowe (330 mg / kg) w celu wywołania ustania oddychania myszy
Ostre nożyczkiRWD Life Science Co., LtdS14014-10Narzędzie do chirurgii zwierząt
Nożyczki sprężynoweRWD Life Science Co., LtdS11005-09Narzędzie do chirurgii zwierząt
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061Do liczenia komórek
Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, 0,25%), czerwień fenolowa.Gibco25200072Do trawienia komórkowego
KsylazynaAlfasan International B.V.HK-56179Ksylazyna 2% roztwór do wstrzykiwań, 30 ml

Bibliografia

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
  3. Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
  4. Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
  5. Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
  6. Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
  7. Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
  8. Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934(2019).
  9. Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
  10. Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
  11. Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460(2021).
  12. Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
  13. Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
  14. Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
  15. Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
  16. Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
  17. Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hipoksja nowotworupodwiązanie tętnicy wątrobowejobrazowanie PET z użyciem FMISOobrazowanie PET z użyciem FDGmetabolizm nowotworuczynnik indukowany hipoksjąprzedkliniczny model raka
Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.