Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Podsumowanie

Inaktywacja laserowa wspomagana chromeforem za pośrednictwem_{AlPcS 2a} jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennych uszkodzeń pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV) w żywych komórkach.

Streszczenie

Pęcherzyki wewnątrzkomórkowe (IV) powstają poprzez endocytozę pęcherzyków do cytoplazmy. Tworzenie kroplówek bierze udział w aktywacji różnych szlaków sygnałowych poprzez przepuszczalność błon dożylnych oraz tworzenie endosomów i lizosomów. Metoda zwana inaktywacją laserową wspomaganą chromoforem (CALI) jest stosowana do badania tworzenia się kroplówek i materiałów kontrolujących regulację dożylną. CALI to oparta na obrazowaniu metodologia fotodynamiczna do badania szlaku sygnałowego indukowanego przez przepuszczalność błony. Metoda ta pozwala na czasoprzestrzenną manipulację wybranymi organellami w komórce. Metoda CALI została zastosowana do obserwacji i monitorowania określonych cząsteczek poprzez przenikanie endosomów i lizosomów. Wiadomo, że pęknięcie błony IV selektywnie rekrutuje białka wiążące glikany, takie jak galektyna-3. W tym przypadku protokół opisuje indukcję pęknięcia dożylnego przez AlPcS_2a i zastosowanie galektyny-3 jako markera do znakowania uszkodzonych lizosomów, co jest przydatne w badaniu dalszych skutków pęknięcia błony dożylnej i ich dalszych skutków w różnych sytuacjach.

Wprowadzenie

Endosomy, rodzaj pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV), powstają w wyniku endocytozy, a następnie dojrzewają do lizosomów. W tworzeniu kroplówek biorą udział różne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe; dodatkowo różne bodźce wewnętrzne i zewnętrzne mogą uszkadzać kroplówki (np. patogeny mogą uciekać z ograniczonej błony podczas infekcji i wchodzić do cytoplazmy¹). Zwykle towarzyszy temu pęknięcie pęcherzyków endocytotycznych². W związku z tym techniki celowania i uszkadzania kroplówek mogą być stosowane w powiązanych badaniach³.

Terapia fotodynamiczna (PDT) to terapia zależna od światła, mająca na celu zwalczanie chorób poprzez zabijanie nowotworów lub patogenów⁴. W PDT docelowe komórki są znakowane nietoksycznymi chromoforami, zwanymi fotouczulaczami, które mogą być lokalnie aktywowane przez oświetlenie świetlne5^,6. Fotouczulacze pochłaniają energię ze światła i przekształcają się w wzbudzony stan singletowy, prowadząc do długotrwałego wzbudzonego stanu trypletowego. Fotosensybilizatory stanu trypletowego mogą ulegać transferowi elektronów lub energii i tworzyć reaktywne formy tlenu (ROS) w obecności tlenu, a także mogą przestrzennie niszczyć znakowane komórki w obszarze oświetlenia⁷. Konsekwencje różnią się w zależności od mocy światła⁸. Kontrolując stężenie fotouczulaczy i intensywność oświetlenia świetlnego, docelowe biomolekuły mogą być selektywnie inaktywowane bez lizy komórek, określanej jako inaktywacja światła wspomagana chromoforem (CALI)⁹. Dzięki znaczącemu rozwojowi fotouczulaczy, które mogą selektywnie znakować różne cele subkomórkowe, CALI stał się cennym narzędziem do kontrolowania inaktywacji biomolekuł za pośrednictwem światła dla małych biomolekuł, takich jak nukleotydy i białka, a także organelli, takich jak mitochondria i endolizosomy3^,10,11,12,13.

W porównaniu do CALI, metody chemiczne lub fizyczne są również używane do uszkadzania błon, takie jak toksyna bakteryjna^14,15 i Leu-Leu-OMe¹⁶ leczenie uszkodzeń lizosomalnych. Jednak metody te wykazują masowe upośledzenie kroplówek w komórkach. W CAIN stosuje się wytrzymałe fotouczulacze (tj. Al(III) chlorek ftalocyjaniny, kwas disulfonowy (AlPcS_2a)); AlPcS_2a, celujący w lizosomy poprzez endocytozę, służy do rozbijania endosomów lub lizosomów w kontrolowanym regionie¹⁷. AlPcS_2a to nieprzepuszczalny dla błony komórkowej chromofor na bazie ftalocyjaniny, który wiąże się z lipidem na błonie plazmatycznej i jest internalizowany przez endocytozę i ostatecznie gromadzi się w lizosomie przez szlak endocytarny¹⁸. Pochłania światło w zakresie widma bliskiej podczerwieni i generuje tlen singletowy, główny ROS generowany przez wzbudzony AlPcS_2a¹⁸. Szybki rozpad tlenu singletowego ogranicza jego dyfuzję i odległość reakcji w maleńkim obszarze komórek (około 10-20 nm)¹⁹. Dostosowując czas trwania inkubacji AlPcS_2a i oświetlenia światłem, dozwolona jest czasoprzestrzenna kontrola uszkodzeń IV w obszarze subkomórkowym. CALI staje się zatem potężnym narzędziem do badania konsekwencji uszkodzenia kroplówek oraz tworzenia i regulacji kroplówek.

W tym badaniu omówiono specyficzny protokół CALI wykorzystujący AlPcS_2a jako fotosensybilizator. Protokół ten może być stosowany do różnych typów kroplówek, w tym endosomów i lizosomów, i stosowany do badania dalszych odpowiedzi po pęknięciu błony. Komórki HeLa wykazujące ekspresję galektyny-3^16,20 ujawnione po pęknięciu lizosomu są używane do zademonstrowania tego protokołu.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu zapasowego AlPcS_2a

1. Rozpuścić 10 mg AlPcS_2a w 400 µL 0,1 M NaOH. Aby zwiększyć rozpuszczalność, podgrzać roztwór do 50 °C i wymieszać na wortexie.
2. Wymieszać roztwór z 4 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Następnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 µm w celu usunięcia nierozpuszczalnych osadów.
3. Zmierzyć stężenie roztworu za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Współczynnik ekstynkcji AlPcS_2a przy 672 nm wynosi 4 x 10⁴ cm^-1 M^-1. Rozcieńczyć roztwór AlPcS_2a za pomocą PBS do uzyskania stężenia 1 mM. Przygotować aliquoty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Transfekcja

UWAGA: Gal3-GFP jest stosowane jako wskaźnik do obrazowania żywych komórek w celu wykrycia pękania lizosomów.

1. Hodować kulturę komórek HeLa w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płatkowej surowicy bydlęcej (FBS). Po przemyciu komórek roztworem PBS, poddać je trypsynizacji, a następnie resuspender w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS.
   UWAGA: Metoda ta jest możliwa do zastosowania w przypadku większości linii komórek przylegających, w tym linii HeLa i A549. W zasadzie, mimo braku testów na komórkach w zawiesinie, testy CALI można by przeprowadzić również z ich wykorzystaniem.
2. Rozpuścić 300 ng plazmidu Gal3-GFP w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, a następnie dodać 0,6 µL odczynnika P3000. Delikatnie wymieszać. Rozpuścić 0,45 µL odczynnika Lipofectamine 3000 w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Delikatnie wymieszać.
3. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Połączyć rozcieńczone DNA oraz rozcieńczoną Lipofectamine 3000, a następnie inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
4. Wymieszać mieszaninę DNA-Lipofectamine, 3 x 10⁵ zawiesionych komórek HeLa oraz 200 µL DMEM+10% FBS, a następnie wysiać komórki na centralnym szklanym obszarze szalki szklanej o średnicy 35 mm.

3. Barwienie AlPcS2a

1. Aby umożliwić adhezję komórek, inkubuj je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO₂ przez co najmniej 4 h.
2. Rozcieńcz AlPcS_2a w medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS, aby przygotować roztwór AlPcS_2a o stężeniu 1 µM. Podgrzej medium zawierające AlPcS_2a w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wymień medium hodowlane na medium zawierające AlPcS_2a.
3. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO₂ przez noc (16-18 h).
4. Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć pozakomórkowy AlPcS2a. Wymień medium na świeże, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 4 h, aby pozostały barwnik wzdłuż szlaku endocytozy mógł zgromadzić się w lizosomach.
   ​UWAGA: Aby zabarwić endosomy, inkubuj komórki w 1 µM AlPcS_2a w DMEM zawierającym 10% FBS przez 15 min w temperaturze 37 °C. Następnie przemyj komórki dwukrotnie PBS i inkubuj je w uprzednio ogrzanym medium przed obrazowaniem.

Rycina 1. Schemat przedstawiający selektwne uszkadzanie IV przy użyciu AlPcS_2a. Rycina przedstawia schemat selektywnego uszkadzania IV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Barwienie lizosomów za pomocą AlPcS2a. Lizosomy znakowane przez noc 1 µM AlPcS_2a w komórkach HeLa wykazują pozytywne barwienie zielonym barwnikiem fluorescencyjnym o stężeniu 50 nM. Pasek skali: 10 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Obrazowanie próbki i oświetlenie

UWAGA: Można przeprowadzić uszkodzenie IV w obrębie regionu podkomórkowego pojedynczej komórki lub we wszystkich komórkach znakowanych AlPcS_2a w naczyniu hodowlanym. Masowe naświetlanie całego naczynia hodowlanego umożliwia ilościowe badanie tego uszkodzenia, w tym badania biochemiczne.

1. Manipuluj pojedynczymi komórkami poprzez uszkadzanie lizosomów w obrębie jednej komórki, zgodnie z poniższym opisem.
   1. Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu konfokalnego. Do wzbudzenia GFP i AlPcS2a użyj odpowiednio laserów 488 nm i 561 nm.
   2. Zaznacz obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 5 x 5 µm² na pęcherzykach znakowanych AlPcS_2a, które mają zostać uszkodzone.
   3. Naświetlaj impulsowo ROI laserem 633 nm o mocy 0,21 mW przez 70 powtórzeń. Monitoruj powstawanie punktów Gal3 jako wskaźnika permeabilizacji błony lizosomalnej.
2. Uszkodź wszystkie znakowane komórki w naczyniu hodowlanym zgodnie z poniższym opisem.
   1. Umieść naczynie hodowlane na platformie. Naświetl naczynie kolimowanym światłem LED 660 nm (światło bliskiej podczerwieni jest idealne, biorąc pod uwagę widmo wzbudzenia AlPcS2a).
   2. Umieść naczynie hodowlane pod mikroskopem i monitoruj wskaźniki permeabilizacji błony, o których wspomniano w kroku 4.1.3.
3. Oceń uszkodzenie IV za pomocą następujących wskaźników.
   1. Zawartość endosomów lub lizosomów jest silnie glikozylowana i zostaje odsłonięta w cytozolu po pęknięciu IV. Szybko znakuj te struktury za pomocą cytozolowych galektyn wiążących glikany, w tym galektynę-1, galektynę-3, galektynę-8 i galektynę-9^16,20.
   2. Wielkość rany można określić poprzez uwalnianie barwnika nieprzenikającego przez błonę, zgodnie z opisem w²¹.
   3. Różnicą między endosomami a lizosomami jest wartość pH w ich świetle. Pęknięcie lizosomów zaburza pH światła, co można zmierzyć za pomocą barwnika czułego na pH, takiego jak FITC-dekstran³.

Rysunek 3. CALI pośredniczone przez AlPcS_2a indukuje lokalną rekrutację TagRFP-galektyny-3 (Gal3) do lizosomów w obszarze naświetlania. Lizosomy w komórkach HeLa wykazujących ekspresję TagRFP-galektyny-3 barwiono przez noc za pomocą 1 µM AlPcS_2a, po czym zastosowano naświetlanie skupionym światłem bliskiej podczerwieni (633 nm) w obrębie żółtego kwadratu. Sygnał AlPcS_2a wewnątrz żółtego kwadratu uległ fotobleachingowi, co towarzyszyło formowaniu się punktowych struktur (puncta) TagRFP-galektyny-3. Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Pokazano schematyczny rysunek przedstawiający uszkodzenia IV wywołane przez AlPcS_2a, w tym endosom i lizosom, (Rysunek 1).

Dostępne na rynku markery mogą być używane do określania warunków barwienia AlPcS_2a. Na przykład kolokalizacja AlPcS_2a puncta i zielony barwnik fluorescencyjny ²² (Rysunek 2).

Galektyna-3 znakowana fluoroforem może być stosowana jak...

Dyskusja

AlPcS_2a wiąże się z błoną plazmatyczną, a następnie jest internalizowany przez endocytozę i ostatecznie gromadzi się w lizosomach. AlPcS_2a może być zatem zlokalizowany w przedziałach subkomórkowych poprzez dostosowanie czasu inkubacji. Ograniczeniem tej metodologii jest to, że tylko subpopulacja kroplówek może być znakowana przez AlPcS_2a poprzez endocytozę, ponieważ istnieje wiele innych błonowych źródeł IV, takich jak ER i aparat Golgiego. Ponadto selektywne znakowanie AlPcS_2a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynnik
Al(III) Kwas disulfonowy chlorku ftalocyjaniny (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Naczynie	hodowlane ibidi	812128-200
Pożywka			hodowlana DMEM uzupełniona 10% FBS i 100 U/ml penicyliny G i 100 mg/ml Streptomycyny
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
zestaw plazmidu Gal3-GFP	addgene
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	zielony barwnik fluorescencyjny
Płyta wielościenna	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific 31985070
Penicylina-streptomycyna	Gibco	15140163
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Linia komórkowa
Linia komórkowa HeLa	ATCC	CCL-2	Metody mają zastosowanie do większości dołączonych linii komórkowych. Warunki muszą być ustalane indywidualnie.
Udogodnienia
0.22 µ m Filtr	Merck	SLGV013SL
Kolimowane światło LED  (660 nm)	Thorlabs	M660L3-C1 i DC2100	Światło bliskie podczerwieni jest idealną bazą na widmie wzbudzenia AlPcS2a.
Mikroskopia konfokalna	Carl Zeiss	LSM 780	Do długotrwałego obrazowania wymagany jest system inkubacji.
Spektrofotometry NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific
Czerwone światło LED	Tholabs	M660L4-C1