Artykuł metodologiczny

Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

DOI:

10.3791/63962

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Inflammation Core Facility, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inaktywacja laserowa wspomagana chromeforem za pośrednictwemAlPcS 2a jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennych uszkodzeń pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV) w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki wewnątrzkomórkowe (IV) powstają poprzez endocytozę pęcherzyków do cytoplazmy. Tworzenie kroplówek bierze udział w aktywacji różnych szlaków sygnałowych poprzez przepuszczalność błon dożylnych oraz tworzenie endosomów i lizosomów. Metoda zwana inaktywacją laserową wspomaganą chromoforem (CALI) jest stosowana do badania tworzenia się kroplówek i materiałów kontrolujących regulację dożylną. CALI to oparta na obrazowaniu metodologia fotodynamiczna do badania szlaku sygnałowego indukowanego przez przepuszczalność błony. Metoda ta pozwala na czasoprzestrzenną manipulację wybranymi organellami w komórce. Metoda CALI została zastosowana do obserwacji i monitorowania określonych cząsteczek poprzez przenikanie endosomów i lizosomów. Wiadomo, że pęknięcie błony IV selektywnie rekrutuje białka wiążące glikany, takie jak galektyna-3. W tym przypadku protokół opisuje indukcję pęknięcia dożylnego przez AlPcS2a i zastosowanie galektyny-3 jako markera do znakowania uszkodzonych lizosomów, co jest przydatne w badaniu dalszych skutków pęknięcia błony dożylnej i ich dalszych skutków w różnych sytuacjach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy, rodzaj pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV), powstają w wyniku endocytozy, a następnie dojrzewają do lizosomów. W tworzeniu kroplówek biorą udział różne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe; dodatkowo różne bodźce wewnętrzne i zewnętrzne mogą uszkadzać kroplówki (np. patogeny mogą uciekać z ograniczonej błony podczas infekcji i wchodzić do cytoplazmy1). Zwykle towarzyszy temu pęknięcie pęcherzyków endocytotycznych2. W związku z tym techniki celowania i uszkadzania kroplówek mogą być stosowane w powiązanych badaniach3.

Terapia fotodynamiczna (PDT) to terapia zależna od światła, mająca na celu zwalczanie chorób poprzez zabijanie nowotworów lub patogenów4. W PDT docelowe komórki są znakowane nietoksycznymi chromoforami, zwanymi fotouczulaczami, które mogą być lokalnie aktywowane przez oświetlenie świetlne5,6. Fotouczulacze pochłaniają energię ze światła i przekształcają się w wzbudzony stan singletowy, prowadząc do długotrwałego wzbudzonego stanu trypletowego. Fotosensybilizatory stanu trypletowego mogą ulegać transferowi elektronów lub energii i tworzyć reaktywne formy tlenu (ROS) w obecności tlenu, a także mogą przestrzennie niszczyć znakowane komórki w obszarze oświetlenia7. Konsekwencje różnią się w zależności od mocy światła8. Kontrolując stężenie fotouczulaczy i intensywność oświetlenia świetlnego, docelowe biomolekuły mogą być selektywnie inaktywowane bez lizy komórek, określanej jako inaktywacja światła wspomagana chromoforem (CALI)9. Dzięki znaczącemu rozwojowi fotouczulaczy, które mogą selektywnie znakować różne cele subkomórkowe, CALI stał się cennym narzędziem do kontrolowania inaktywacji biomolekuł za pośrednictwem światła dla małych biomolekuł, takich jak nukleotydy i białka, a także organelli, takich jak mitochondria i endolizosomy3,10,11,12,13.

W porównaniu do CALI, metody chemiczne lub fizyczne są również używane do uszkadzania błon, takie jak toksyna bakteryjna14,15 i Leu-Leu-OMe16 leczenie uszkodzeń lizosomalnych. Jednak metody te wykazują masowe upośledzenie kroplówek w komórkach. W CAIN stosuje się wytrzymałe fotouczulacze (tj. Al(III) chlorek ftalocyjaniny, kwas disulfonowy (AlPcS2a)); AlPcS2a, celujący w lizosomy poprzez endocytozę, służy do rozbijania endosomów lub lizosomów w kontrolowanym regionie17. AlPcS2a to nieprzepuszczalny dla błony komórkowej chromofor na bazie ftalocyjaniny, który wiąże się z lipidem na błonie plazmatycznej i jest internalizowany przez endocytozę i ostatecznie gromadzi się w lizosomie przez szlak endocytarny18. Pochłania światło w zakresie widma bliskiej podczerwieni i generuje tlen singletowy, główny ROS generowany przez wzbudzony AlPcS2a18. Szybki rozpad tlenu singletowego ogranicza jego dyfuzję i odległość reakcji w maleńkim obszarze komórek (około 10-20 nm)19. Dostosowując czas trwania inkubacji AlPcS2a i oświetlenia światłem, dozwolona jest czasoprzestrzenna kontrola uszkodzeń IV w obszarze subkomórkowym. CALI staje się zatem potężnym narzędziem do badania konsekwencji uszkodzenia kroplówek oraz tworzenia i regulacji kroplówek.

W tym badaniu omówiono specyficzny protokół CALI wykorzystujący AlPcS2a jako fotosensybilizator. Protokół ten może być stosowany do różnych typów kroplówek, w tym endosomów i lizosomów, i stosowany do badania dalszych odpowiedzi po pęknięciu błony. Komórki HeLa wykazujące ekspresję galektyny-316,20 ujawnione po pęknięciu lizosomu są używane do zademonstrowania tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zapasów AlPcS2a

  1. Rozpuścić 10 mg AlPcS2a w 400 μl 0,1 M NaOH. Aby poprawić rozpuszczalność, podgrzać roztwór w temperaturze 50 °C i odwirować.
  2. Wymieszać roztwór z 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie przefiltruj roztwór filtrem 0,22 μm, aby usunąć nierozpuszczalne osady.
  3. Zmierzyć stężenie roztworu za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Współczynnik ekstynkcji AlPcS2a przy 672 nm wynosi 4 x 104 cm-1 M-1. Rozcieńczyć roztwór AlPcS2a PBS, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 mM. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Transfekcja

UWAGA: Gal3-GFP jest stosowany jako wskaźnik do obrazowania pękania lizosomów na żywych komórkach.

  1. Utrzymuj hodowlę komórek HeLa w DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Po umyciu komórek PBS, trypsynizuj komórki, a następnie ponownie zawieś komórki w DMEM uzupełnionym 10% FBS.
    UWAGA: Metoda ma zastosowanie do większości przyłączonych linii komórkowych, w tym linii komórkowych HeLa i A549. Zasadniczo, mimo że nie testuje się komórek zawiesinowych, można z nimi przeprowadzić testy CALI.
  2. Rozcieńczyć 300 ng plazmidu Gal3-GFP w 25 μl zredukowanej pożywki surowicy, a następnie dodać 0,6 μl odczynnika P3000. Delikatnie wymieszaj. Rozcieńczyć 0,45 μl odczynnika Lipofectamine 3000 w 25 μl zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj.
  3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać rozcieńczone DNA i rozcieńczoną Lipofectaminę 3000, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wymieszaj mieszaninę DNA-lipofekctaminy, 3 x 105 zawieszonych komórek HeLa i 200 μl DMEM + 10% FBS, a następnie umieść komórki w centralnym obszarze szkła szklanego naczynia guzikowego o średnicy 35 mm.

3. Barwienie AlPcS2a

  1. Aby umożliwić przyłączenie komórek, należy inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze zawierającym 5% CO2 przez co najmniej 4 godziny.
  2. Rozcieńczyć AlPcS2a w DMEM uzupełnionym 10% FBS, aby uzyskać roztwór 1 μM AlPcS2a. Podgrzej pożywkę zawierającą AlPcS2a w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą AlPcS2a.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO2 przez noc (16-18 godzin).
  4. Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć zewnątrzkomórkowy AlPcS2a. Zastąp pożywkę świeżą pożywką, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, aby umożliwić nagromadzenie się resztkowego barwnika wzdłuż szlaku endocytarnego w lizosomy.
    UWAGA: Aby wybarwić endosomy, inkubować komórki w 1 μM AlPcS2a w DMEM zawierającym 10% FBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie umyj komórki dwukrotnie PBS i inkubuj je we wstępnie podgrzanym podłożu przed obrazowaniem .

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schematyczny rysunek przedstawiający selektywne uszkodzenia dożylne za pomocą AlPcS2a. Rysunek przedstawia schematy selektywnych uszkodzeń dożylnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Barwienie lizosomalne za pomocą AlPcS2a. Lizosomy znakowane przez noc 1 μM AlPcS2a w komórkach HeLa są dodatnio barwione zielonym barwnikiem fluorescencyjnym 50 nM. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Próbkowanie i oświetlenie światłem

UWAGA: Uszkodzenie dożylne w subkomórkowym regionie pojedynczej komórki lub wszystkich komórek znakowanych AlPcS2a w naczyniu hodowlanym może być przeprowadzone. Masowe oświetlenie całej płytki hodowlanej pozwala na ilościowe badanie tego uszkodzenia, w tym badania biochemiczne.

  1. Manipuluj pojedynczymi komórkami, uszkadzając lizosomy w pojedynczej komórce, jak opisano poniżej.
    1. Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu konfokalnego. Użyj laserów 488 nm i 561 nm do ekscytujących GFP i AlPcS2a.
    2. Zakreśl obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 5 x 5μm2 na pęcherzykach znakowanych AlPcS2a, które są wybrane do uszkodzenia.
    3. Oświetlacz impulsowo ROI za pomocą lasera 633 nm o mocy 0,21 mW przez 70 powtórzeń. Monitoruj tworzenie się Gal3 puncta jako wskaźnika przepuszczalności błony lizosomalnej
      4. .
  2. Umieńć wszystkie znakowane komórki w naczyniu hodowlanym, jak opisano poniżej.
    1. Umieść naczynie hodowlane na platformie. Oświetl antenę kolimowanym światłem LED o długości fali 660 nm (światło bliskiej podczerwieni jest idealną bazą na widmie wzbudzenia AlPcS2a).
    2. Umieścić naczynie hodowlane pod mikroskopem i monitorować wskaźniki przepuszczalności błony, jak wspomniano w kroku 4.1.3.
  3. Oceń uszkodzenie kroplówek za pomocą następujących wskaźników.
    1. Zawartość endosomu lub lizosomu jest najbardziej glikozylowana, która jest poddawana działaniu cytozolu po pęknięciu dożylnym. Szybko oznacz je za pomocą galektyn wiążących glikany cytozolowe, w tym galektyny-1, galektyny-3, galektyny-8 i galektyny-916,20.
    2. Rozmiar rany można określić poprzez uwolnienie barwnika nieprzepuszczalnego dla błony, zgodnie z opisem w21.
    3. Różnica między endosomami a lizosomami polega na ich wartości pH światła. Pęknięcie lizosomalne zaburza pH światła, które można zmierzyć za pomocą barwnika wrażliwego na pH, takiego jak FITC-dextran3.

figure-protocol-3
Rysunek 3. CALI za pośrednictwem AlPcS2a indukuje lokalną rekrutację TagRFP-galektyny-3 (Gal3) do lizosomów w obszarze oświetlenia. Lizosomy w komórkach HeLa z ekspresją TagRFP-galektyny 3 barwiono przez noc 1 μM AlPcS2a, a następnie skupiano oświetlenie światłem bliskiej podczerwieni (633 nm) w obrębie żółtego kwadratu. Sygnał AlPcS2a w żółtym kwadracie ulega fotowybielaniu, czemu towarzyszy tworzenie się TagRFP-galektyna-3 puncta. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano schematyczny rysunek przedstawiający uszkodzenia IV wywołane przez AlPcS2a, w tym endosom i lizosom, (Rysunek 1).

Dostępne na rynku markery mogą być używane do określania warunków barwienia AlPcS2a. Na przykład kolokalizacja AlPcS2a puncta i zielony barwnik fluorescencyjny 22 (Rysunek 2).

Galektyna-3 znakowana fluoroforem może być stosowana jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AlPcS2a wiąże się z błoną plazmatyczną, a następnie jest internalizowany przez endocytozę i ostatecznie gromadzi się w lizosomach. AlPcS2a może być zatem zlokalizowany w przedziałach subkomórkowych poprzez dostosowanie czasu inkubacji. Ograniczeniem tej metodologii jest to, że tylko subpopulacja kroplówek może być znakowana przez AlPcS2a poprzez endocytozę, ponieważ istnieje wiele innych błonowych źródeł IV, takich jak ER i aparat Golgiego. Ponadto selektywne znakowanie AlPcS2a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS za wsparcie badań. Główny obiekt jest finansowany przez Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Autorzy dziękują Common Equipment Core Facility Instytutu Nauk Biomedycznych (IBMS), Academia Sinica (AS) za pomoc w pozyskiwaniu obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynnik
Al(III) Kwas disulfonowy chlorku ftalocyjaniny (AlPcS2a)Frontier ScientificP40632
Naczyniehodowlane ibidi812128-200
Pożywkahodowlana DMEM uzupełniona 10% FBS i 100 U/ml penicyliny G i 100 mg/ml Streptomycyny
DMEMGibco11965092
FBSThermo Fisher ScientificA4736301
zestaw plazmidu Gal3-GFPaddgene
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
LysoTracker Green DND-26Thermo Fisher ScientificL7526zielony barwnik fluorescencyjny
Płyta wielościennaperkinelmerPK-6005550
NaOHThermo Fisher ScientificQ15895
OptiMEMThermo Fisher Scientific 31985070
Penicylina-streptomycynaGibco15140163
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco21600-069137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Linia komórkowa
Linia komórkowa HeLaATCCCCL-2Metody mają zastosowanie do większości dołączonych linii komórkowych. Warunki muszą być ustalane indywidualnie.
Udogodnienia
0.22 µ m FiltrMerckSLGV013SL
Kolimowane światło LED  (660 nm)ThorlabsM660L3-C1 i DC2100Światło bliskie podczerwieni jest idealną bazą na widmie wzbudzenia AlPcS2a.
Mikroskopia konfokalnaCarl ZeissLSM 780Do długotrwałego obrazowania wymagany jest system inkubacji.
Spektrofotometry NanoDrop 2000/2000cThermo Fisher Scientific
Czerwone światło LEDTholabsM660L4-C1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
  2. Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042(2020).
  3. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  4. Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
  5. Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
  6. De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
  7. Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
  8. Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
  9. Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
  10. Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
  11. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  12. Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
  13. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  14. Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
  15. Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
  16. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
  17. Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
  18. Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
  19. Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
  20. Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
  21. Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
  22. Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
  23. Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
  24. Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
  25. Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
  26. Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).
  27. Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laserowa inaktywacja wspomagana chromoforempermeabilizacja b ony lizosomalnejszlak endocytozymarker galektyny 3mikroskopia konfokalnahodowla kom rek HeLabarwnik AlPcS2atworzenie endosom wmetoda fotodynamiczna

Powiązane artykuły