Przedstawiamy protokół do hodowli ex vivo ludzkiej tkanki mięśnia sercowego komorowego. Pozwala na szczegółową analizę siły skurczu i kinetyki, a także zastosowanie obciążenia wstępnego i następczego w celu dokładniejszego naśladowania środowiska fizjologicznego in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie ludzkiej tkanki mięśnia sercowego do długotrwałej hodowli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hodowla kardiomiocytów doczekała się wielu zmian, począwszy od dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek, a skończywszy na organoidach pochodzących z iPSC. W 2019 r. zademonstrowano sposób hodowli ex vivo wycinków mięśnia sercowego uzyskanych z próbek ludzkiego serca, podczas gdy zbliża się do stanu skurczu mięśnia sercowego in vivo. Próbki te pochodzą głównie z przeszczepów serca lub umieszczenia urządzeń wspomagających lewą komorę. Za pomocą wibratomu i specjalnie opracowanego systemu uprawy, plastry o grubości 300 μm są umieszczane między drutem stałym a sprężynowym, co pozwala na stabilną i powtarzalną uprawę przez kilka tygodni. Podczas uprawy plastry są stale stymulowane zgodnie z indywidualnymi ustawieniami. Skurcze mogą być wyświetlane i rejestrowane w czasie rzeczywistym, a środki farmakologiczne mogą być łatwo stosowane. Zdefiniowane przez użytkownika protokoły stymulacji mogą być zaplanowane i wykonane w celu oceny istotnych parametrów skurczu, takich jak nasilenie po pauzie, próg stymulacji, stosunek siły do częstotliwości i okres refrakcji. Ponadto system umożliwia zmienne ustawienie obciążenia wstępnego i następczego, co zapewnia bardziej fizjologiczną uprawę.
Tutaj prezentujemy przewodnik krok po kroku, jak wygenerować udaną długoterminową hodowlę wycinków mięśnia sercowego ludzkiej lewej komory, korzystając z komercyjnego rozwiązania do uprawy biomimetycznej.
Wprowadzenie
W ciągu ostatniej dekady, hodowla in vitro komórek mięśnia sercowego poczyniła ogromne postępy, począwszy od technik 2D i trójwymiarowych (3D), a skończywszy na wykorzystaniu organoidów i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych zróżnicowanych w miocyty serca1,2,3. Hodowle komórkowe ex vivo i pierwotne okazały się bardzo przydatne, zwłaszcza w badaniach genetycznych i opracowywaniu leków4,5,6. Wykorzystanie tkanek ludzkich poprawia wartość translacyjną wyników. Długoterminowa hodowla 3D tkanek mięśnia sercowego o nienaruszonej geometrii nie jest jednak dobrze ugruntowana. Nienaruszona geometria jest kluczową cechą do naśladowania warunków in vivo, ponieważ warunkiem wstępnym jest prawidłowe funkcjonowanie serca, komunikacja między różnymi komórkami, a także interakcje komórka-macierz. Hodowla tkanki mięśnia sercowego przechodziła przez różne fazy rozwoju. Wskaźnik sukcesu i stabilność hodowli tkanki mięśnia sercowego ex vivo były początkowo dość niskie, ale ostatnie podejścia przyniosły obiecujące wyniki7,8,9,10,11.
Wśród nich, Fischer i in. jako pierwsi wykazali, że żywotność i zdolność skurczowa ludzkiej tkanki mięśnia sercowego może być utrzymana w hodowli komórkowej ex vivo przez wiele tygodni7. Ich technika opierała się na cienkich wycinkach tkanek wyciętych z eksplantowanego ludzkiego mięśnia sercowego, które zostały zamontowane w nowo opracowanych komorach hodowlanych, które zapewniały określone warunki biomechaniczne i ciągłą stymulację elektryczną. Ta metoda hodowli bardzo przypomina funkcję in vivo tkanki mięśnia sercowego i została odtworzona przez kilka niezależnych grup badawczych2,12,13,14,15. Co ważne, komory zastosowane przez Fischera i wsp. umożliwiły również ciągłą rejestrację wytworzonych sił przez okres do 4 miesięcy, a tym samym otworzyły niespotykane dotąd możliwości badań fizjologicznych i farmakologicznych na nienaruszonym mięśniu sercowym człowieka7.
Podobne techniki zostały niezależnie opracowane przez inne grupy i zastosowane do mięśnia sercowego u ludzi, szczurów, świń i królików7,10,11. Pitoulis i wsp. opracowali następnie bardziej fizjologiczną metodę, która odtwarza normalną relację siła-długość podczas cyklu skurczu, ale jest mniej odpowiednia do analizy wysokoprzepustowej16. W związku z tym ogólne podejście do uprawy biomimetycznej można uznać za kolejny krok w kierunku redukcji, udoskonalenia i zastąpienia (3R) doświadczeń na zwierzętach.
Jednak wykorzystanie tego potencjału wymaga ustandaryzowanych procedur, analiz o wysokiej zawartości i wysokiego poziomu przepustowości. Przedstawiamy technikę, która łączy zautomatyzowane krojenie żywego ludzkiego mięśnia sercowego z utrzymaniem in vitro w systemie hodowli biomimetycznej, który stał się dostępny na rynku (patrz tabela materiałów). Przy proponowanym podejściu liczba pojedynczych wycinków, które można wygenerować z pojedynczej przezściennej próbki mięśnia sercowego, jest ograniczona jedynie czasem przetwarzania. Próbka o odpowiedniej wielkości i jakości (3 cm x 3 cm) często daje 20-40 wycinków tkanki, które można wygodnie pokroić za pomocą automatycznego wibratomu. Plastry te można umieszczać w komorach uprawowych należących do systemu. Komory pozwalają na stymulację elektryczną, której parametry mogą być modulowane (tj. czas trwania impulsu, polaryzacja, szybkość i prąd), a także regulację obciążenia wstępnego i następczego, za pomocą drutów sprężynowych wewnątrz komór. Skurcz każdego wycinka jest rejestrowany na podstawie ruchu małego magnesu przymocowanego do drutu sprężynowego i wyświetlany jako interpretowalny wykres. Dane mogą być rejestrowane przez cały czas i analizowane za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania. Oprócz stałego tempa wyjściowego, można wykonać zaplanowane protokoły w celu funkcjonalnej oceny okresu refrakcji, progu stymulacji, wzmocnienia po pauzie i zależności między siłą a częstotliwością.
Ta długoterminowa biomimetyczna hodowla wielu wycinków mięśnia sercowego z pojedynczego serca toruje drogę do przyszłych badań ex vivo zarówno w tkance ludzkiej, jak i zwierzęcej, a także ułatwia badania przesiewowe pod kątem terapeutycznych i kardiotoksycznych efektów leków w medycynie sercowo-naczyniowej. Został on już zastosowany w różnych podejściach eksperymentalnych2,12,13,15. W tym miejscu podajemy szczegółowy opis krok po kroku przygotowania tkanki ludzkiej i podajemy rozwiązania często spotykanych problemów związanych z uprawą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobieranie tkanek do opisanych tutaj eksperymentów zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Uniwersytetu w Monachium i Uniwersytetu Ruhry w Bochum. Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej. Pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed pobraniem tkanek.
1. Pobieranie tkanek
- Pozyskaj tkankę ludzką od pacjentów poddawanych przeszczepowi serca lub operacji kardiochirurgicznej.
- Przed pobraniem tkanki należy przygotować 2 litry roztworu kardioplegicznego (zwanego dalej buforem do krojenia (Tabela 1)).
- Po wykonaniu przezściennej biopsji lewej komory (LV) o wymiarach 4 cm x 4 cm, należy natychmiast (w ciągu 5 minut po wycięciu) umieścić tkankę w zamykanej sterylnej zlewce jednorazowego użytku z tworzywa sztucznego zawierającej około 70 ml zimnego (4 °C) buforu do krojenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Bufor do krojenia zastosowany w tym protokole pozwala na przechowywanie tkanki w chłodni (4 °C) do 36 godzin. Pozwala to na transport tkanek na zimno z klinik, które nie znajdują się w pobliżu laboratorium. Jednak czas transportu ≤ 24 godziny okazał się optymalny.
2. Przygotowanie agarozy i wibratomu
- Upewnij się, że wystarczająca ilość komór uprawowych jest przygotowana i wysterylizowana (Rysunek 1A).
- Zanurzyć komory i elektrody grafitowe w 1 l 10% roztworu izopropanolu i mieszać przez noc. Następnego dnia przenieść komory do 100% roztworu izopropanolu na 3 minuty i autoklawować elektrody grafitowe w temperaturze 120 °C przez 10 minut.
- Pozostaw komory i elektrody grafitowe do wyschnięcia na powietrzu pod okapem z przepływem laminarnym.
- Przymocuj płytkę drukowaną do każdej z komór zgodnie z dostępnymi pozycjami na kołysce. Umieść dwie elektrody grafitowe na płytce drukowanej zgodnie z instrukcjami producenta.
- Umieść pokrywkę szalki Petriego o średnicy 35 mm na górze komory, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
- Ustaw system uprawy Myodish (patrz tabela materiałów) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , podłączając system do komputera (Rysunek 1B).
- Przygotuj 4% niskotopliwą agarozę w buforze do krojenia (bez glukozy; Tabela 2). Agaroza może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 6 miesięcy.
- W dniu doświadczenia stopić podstawową objętość roztworu agarozy za pomocą łaźni wodnej o temperaturze 80 °C. W zależności od ilości topnienie trwa około 30 minut.
- Gdy agaroza stanie się płynna, wlej 8 ml płynnej agarozy do strzykawki o pojemności 10 ml z dodatkowymi 2 ml powietrza. Zamknąć strzykawkę sterylnym wieczkiem i umieścić ją do góry dnem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20 minut, aby zapobiec krzepnięciu agarozy i zrównoważyć jej temperaturę, aby zapobiec uszkodzeniu próbki przez hipertermię.
- Jeśli jest obecne, włącz urządzenie chłodzące wodę wibratomu co najmniej 30 minut przed krojeniem tkanek, aby zapewnić wystarczającą wydajność chłodzenia. Ustawić temperaturę obiegu wody na 4 °C.
UWAGA: Zastosowana tutaj taca do cięcia i płyta chłodząca zawierały wbudowany obieg wody. Jest to wysoce zalecane do chłodzenia i zmniejszania ryzyka zanieczyszczenia. Możliwe jest jednak również użycie lodu jako techniki chłodzenia. Ponadto urządzenie chłodzące wodę nie musi być w tym momencie protokołu podłączone do tacy tnącej i/lub płyty chłodzącej wibratomu. - Wyczyść tackę do krojenia wibratomu i płytkę na próbkę, spłukując wszystkie powierzchnie 100% izopropanolem przez co najmniej 3 minuty.
UWAGA: W zależności od używanego systemu wibratomu, konfiguracja wibratomu może się różnić. Zapoznaj się z instrukcją wibratomu znajdującą się w laboratorium, aby uzyskać informacje na temat metod konfiguracji i kalibracji ostrzy. - Napełnij blachę do krojenia do 90%-95% buforem do krojenia. W obecnie używanym zestawie odpowiada to około 400 ml. Podłącz rurkę urządzenia chłodzącego wodę do zaworów na tacy tnącej wibratomu i płycie chłodzącej.
- Zdezynfekować wszystkie narzędzia potrzebne do przygotowania, zanurzając je w 100% roztworze izopropanolu na 5 sekund. Wyjmij narzędzia z roztworu izopropanolu i wysusz na powietrzu pod okapem z przepływem laminarnym.
3. Przycinanie i osadzanie próbek
- Przenieść próbkę tkanki na płytkę Petriego o średnicy 100 mm wypełnioną zimnym buforem do krojenia. Przechowywać danie na płycie chłodzącej w temperaturze 4 °C (podłączonej do chłodziarki lub umieszczonej na lodzie).
- Usuń beleczki wsierdzia, przytrzymując wsierdzie pęsetą i używając nożyczek, aby odciąć około 3 mm tkanki wsierdzia. W ten sam sposób usuń nadmiar tkanki tłuszczowej pod nasierdziem, jeśli jest obecny.
- Przymocuj wyciętą próbkę tkanki stroną wsierdziową do góry do gumowej łaty o wymiarach 2 cm x 2 cm za pomocą czterech igieł o wymiarach 0,9 mm x 70 mm 20 G, które są zamocowane w pozycji kwadratowej (0,9 cm x 0,9 cm; Rysunek 1C, D). Upewnij się, że ukośna krawędź każdej końcówki igły jest skierowana do wewnątrz. Poprawia to fiksację i zapobiega uszkodzeniom mięśnia sercowego.
UWAGA: Orientacja wyżej wymienionego kwadratu powinna być prostopadła do oczekiwanego dominującego kierunku włókien mięśniowych. - Odetnij cały nadmiar tkanki na zewnątrz kwadratu z czterema igłami za pomocą skalpela. Jeżeli pozwala na to wielkość oryginalnej próbki, podczas tego przygotowania należy użyć dwóch próbek tkanek mięśnia sercowego z tej samej próbki surowej.
- Za pomocą pęsety umieść przyciętą próbkę na sterylnym kawałku tkanki, aby usunąć nadmiar buforu do krojenia pozostawiony na próbce. Aby zapobiec wysychaniu próbki, nie należy trzymać próbki na tkance dłużej niż 10 sekund.
- Umieścić próbkę (próbki) na szalce Petriego o średnicy 35 mm w taki sposób, aby ostrze nacięło prostopadle do ustawienia kardiomiocytów, a nasierdzie było skierowane w dół. Jeśli preparat obejmuje dwie próbki, upewnij się, że próbki są wyśrodkowane i nie stykają się ze sobą.
- Wyjąć strzykawkę z agarozą z łaźni wodnej i zanurzyć próbkę (próbki) w agarozie. (Rysunek 2A). Pozwól agarozie zastygnąć przez 5 minut na płycie chłodzącej. Próbka(-i) musi pozostawać w kontakcie z płytką Petriego, co zapewni, że płaszczyzna cięcia będzie równoległa do dominującego kierunku włókien mięśnia sercowego.
UWAGA: Nie należy całkowicie opróżniać strzykawki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Zwróć uwagę na ilość agarozy, która pozostaje w strzykawce podczas zanurzania próbek. W przypadku pęcherzyków powietrza w naczyniu z próbkami, należy ostrożnie wciągnąć pęcherzyki powietrza z powrotem do strzykawki.
4. Umieszczanie próbek na tacy do cięcia
- Usunąć zestaloną agarozę zawierającą próbkę (próbki) z płytki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą szpatułki lub podobnego narzędzia, wciskając ją między próbkę a bok płytki Petriego. Odetnij część agarozy za pomocą skalpela, trzymając próbki przykryte.
UWAGA: Nie usuwaj zbyt dużej ilości agarozy. Na dłuższym i krótszym boku w płaszczyźnie X/Z powinno pozostać co najmniej 5 mm agarozy.
UWAGA: Kroki 4.2-4.4 należy wykonywać w krótkich odstępach czasu (tj. maksymalnie 5 sekund). Przed rozpoczęciem miej w zasięgu ręki wszystkie wymagane narzędzia. Po umieszczeniu próbki nie jest możliwa zmiana położenia. Staraj się ograniczyć narażenie kleju na powietrze i wilgoć. Kontakt z powietrzem lub płynami spowoduje zestalenie kleju, czyniąc go bezużytecznym. - Za pomocą pipety umieść i rozprowadź 60 μl kleju w i wokół środka platformy tnącej.
- Umieść stronę nasierdziową próbki zawartej w agarozie na wierzchu klejonego obszaru za pomocą pęsety. Nie zmieniaj położenia. Strona wsierdzia próbki musi być widoczna w agarozie. Pozwól klejowi zastygnąć przez 1 minutę. Delikatnie dociśnij agarozę zawierającą próbkę od góry narzędziem (np. pęsetą), zapobiegając przecięciu lub uszkodzeniu agarozy.
- Umieść platformę próbki w wyznaczonej pozycji na tacy tnącej wibratomu, wypełnionej buforem do krojenia.
5. Uruchamianie wibratomu
- Ustaw amplitudę drgań na 1 mm, a początkową prędkość cięcia na 0,07 mm/s. Ustaw grubość plastra na 300 μm, aby ciąć plastry.
- Dopóki ostrze tnie tylko agarozę, zwiększ prędkość cięcia do maksimum, która w tym przypadku wynosi 1,50 mm/s. Gdy tylko wibratomium zacznie ciąć tkankę, natychmiast zmniejsz prędkość do 0,07 mm/s.
UWAGA: Jeśli tkanka nie jest gładko pokrojona, na przykładample, jeśli w próbce znajdują się duże obszary zwłóknienia, może to pomóc w zwiększeniu amplitudy cięcia do 1,5 mm i zmniejszeniu prędkości cięcia do 0,04 mm/s.
6. Przygotowanie podłoża i inkubatora podczas procedury krojenia
- Napełnij każdą komorę uprawową 2,4 ml kompletnego podłoża uprawowego (Tabela 3).
- Umieść komory uprawowe wypełnione podłożem na systemie uprawowym w inkubatorze ustawionym na 37 °C, 5% CO2, 21% O2 i wilgotności 80%. Równoważyć podłoże przez co najmniej 20 minut.
- Podłącz system uprawy do komputera i uruchom odpowiednie oprogramowanie.
- Ustaw prędkość kołyski na 60 obr./min i ustaw parametry stymulacji (impulsy stymulacji i częstotliwość). W przypadku wycinków ludzkiego serca ustaw standardową stymulację na impulsy dwufazowe prądem 50 mA, z których każdy składa się z prądu dodatniego 3 ms, przerwy 1 ms i impulsu prądu odwróconego 3 ms, z częstotliwością stymulacji 30 uderzeń na minutę (BPM).
UWAGA: W dobrze zachowanych tkankach typowy próg stymulacji wynosi około 15 mA. Aby zapewnić niezawodną stymulację i uwzględnić ewentualny wzrost progu stymulacji, zaleca się ustawienie prądu na wartość, która przekracza próg stymulacji od dwóch do trzech razy. - Sprawdź wskaźniki elektrod w oprogramowaniu, aby upewnić się, że elektrody komór uprawowych działają prawidłowo.
UWAGA: Działanie jest konieczne za każdym razem, gdy wskaźnik kanału w oprogramowaniu do uprawy zmieni kolor na czerwony. W tym przypadku dwubiegunowe ładunki impulsowe nie są zrównoważone.
7. Przygotowanie plastrów
UWAGA: Początkowe plastry podwsierdziowe często nie nadają się do hodowli tkanek i muszą zostać odrzucone z powodu nierównej morfologii. Po pierwszych pięciu do 10 plasterkach poprawia się tekstura i morfologia plasterka. Idealny plasterek ma co najmniej 1 cm x 1 cm, nie ma lub ma tylko ograniczone plamy zwłóknienia, nie jest rozdrobniony i ma jednorodne wyrównanie włókien (Rysunek 2B, D). Zwłóknienie śródmiąższowe, zlokalizowane między włóknami miocytów, jest często obecne w niewydolności ludzkiego mięśnia sercowego. Co zaskakujące, nie jest to negatywny predyktor sukcesu uprawy.
- Wlej odpowiednią ilość zimnego buforu do krojenia w 5 cm pokrywkę na szalkę Petriego, aby upewnić się, że plastry nie wyschną. Umieść plastry w pokrywie szalki Petriego zawierającej bufor do krojenia na zimno.
- Oddziel agarozę od tkanki za pomocą pęsety. Zapobiegaj dotykaniu tkanki. Z tkanką należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie tkanki zmniejszy wskaźnik sukcesu uprawy.
- Określ kierunek włókien mięśnia sercowego, dokładnie sprawdzając źródło światła. Ma to znaczenie przy mocowaniu plastikowych trójkątów do tkanki w kroku 7.6.
UWAGA: Kroki 7.4 i 7.5 należy wykonać w krótkich odstępach czasu, w ciągu 5 sekund. - Przymocuj dwa plastikowe trójkąty do próbki za pomocą kleju, aby zakotwiczyć tkankę w komorach hodowlanych.
- Umieść 1 μl kleju na sterylnej pokrywce szalki Petriego. Użyj haczykowatej pęsety, aby podnieść jeden z autoklawowanych plastikowych trójkątów. Szybko zanurz przednią krawędź trójkąta w kleju i wklej trójkąt na próbkę, prostopadle do wyrównania kardiomiocytów. Powtórz dla drugiego trójkąta.
- Odetnij skalpelem tkankę przekraczającą szerokość trójkąta (Rysunek 2C). Umieść plasterek z dwoma zamontowanymi trójkątami z powrotem w buforze do krojenia tacki do krojenia.
UWAGA: Powtarzaj kroki od 7.2 do 7.5, aż przygotuje się wystarczającą ilość plastrów, aby wypełnić komory uprawowe. Zalecamy przygotowanie kilku dodatkowych plastrów, aby umożliwić zastąpienie plastrów o słabym skurczu.
8. Montaż plastrów
UWAGA: Obciążenie następcze zależy od sztywności drutu sprężynowego w komorach uprawowych. Dostępne są trzy różne typy, w zależności od grubości drutu sprężynowego.
- Weź komorę uprawową wypełnioną medium z inkubatora. Wybierz jeden z przygotowanych plastrów i włóż go do komory, łącząc jeden trójkąt z każdym kołkiem.
- Dostosuj odległość między kołkami montażowymi zgodnie z wielkością próbki. Upewnij się, że próbka jest zanurzona w podłożu. Umieść komorę z powrotem w przeznaczonym do tego gnieździe systemu hodowli w inkubatorze.
UWAGA: Nie rozciągaj nadmiernie tkanki i nie zginaj nadmiernie drutu sprężynowego! - Ustaw napięcie napięcia wstępnego po umieszczeniu czaszy na kołysce.
- Zmniejsz napięcie wstępne, obracając regulacyjną w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Rób to, aż linia bazowa odpowiedniego wykresu na ekranie komputera przestanie się zmieniać.
- Ostrożnie zwiększ napięcie wstępne (tj. zwiększ napięcie), obracając regulacyjną zgodnie z ruchem wskazówek zegara. W przypadku komór o największej sztywności kontynuuj, aż odpowiednia linia bazowa na wykresie wzrośnie o 1000-1200 jednostek, co odpowiada 1 mN napięcia wstępnego.
UWAGA: Dokładna regulacja będzie zależeć od indywidualnej stałej sprężystości komory uprawowej, którą można określić przez kalibrację przed eksperymentem zgodnie z instrukcjami producenta. Oprogramowanie rejestrujące umożliwia uwzględnienie indywidualnej kalibracji komory, dzięki czemu siły będą jednolicie wyświetlane w μN. Zaleca się stosowanie stymulacji elektrycznej od początku uprawy. W związku z tym możliwe jest, że plasterek zacznie się kurczyć podczas regulacji napięcia wstępnego. W takim przypadku skoncentruj się na rozkurczowej linii podstawowej, aby ocenić obciążenie wstępne.
9. Zmiana medium
- Przygotować podłoże uprawowe zgodnie z przepisem w tabeli 3. Na krótko przed użyciem pożywki dodać 50 μl β-merkaptoetanolu (50 mM) do probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Raz na 2 dni częściowo wymieniaj podłoże uprawowe. Odświeżaj podłoże co 2 dni, jeśli pożądana jest długotrwała uprawa plastrów mięśnia sercowego.
- Świeżą pożywkę należy wstępnie ogrzać w łaźni wodnej lub inkubatorze z gorącym powietrzem w temperaturze 37 °C przez 30-45 minut. Wyjąć komorę uprawową z inkubatora i umieścić ją pod okapem o przepływie laminarnym.
UWAGA: Konieczne jest, aby komora, a także podłoże, były ciepłe w temperaturze 37 °C (> 35 °C), aby zapobiec nadmiernym przykurczom spowodowanym niską temperaturą. Mniej wyraźne uszkodzenia mogą występować jako wzrost napięcia rozkurczowego w ciągu kilku godzin po wymianie pożywki. Może się wydawać, że sytuacja się poprawia, ale powtarzający się stres może powodować narastające pogorszenie. - Wyjmij podłoże z komory uprawowej, pozostawiając w komorze około 0,8 ml. Dodaj 1,6 ml świeżej pożywki do tej samej komory. Całkowita objętość pożywki powinna wynosić około 2,4 ml na komorę.
- Załóż z powrotem pokrywę komory i ustaw komorę uprawową z powrotem w odpowiedniej pozycji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skurcze plastrów mięśnia sercowego były wyświetlane na ekranie komputera po włożeniu komory hodowlanej do odpowiedniego złącza (Rysunek 3). Skurcze plastrów ludzkiego mięśnia sercowego rozpoczynały się natychmiast po stymulacji. Plastry ulegały hiperkontrakcji przez 5-10 min. Objawiało się to wzrostem sił rozkurczowych, wywołanym tonicznym przykurczem uszkodzonych frakcji tkanki. Proces ten cofał się w różnym stopniu w ciągu 1-1,5 h. Po stabilizacji plastry tkanki LV człowieka wykazywały sił...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przeszłości badania nad układem sercowo-naczyniowym poczyniły ogromne postępy w hodowli kardiomiocytów. Jednak hodowla 3D kardiomiocytów o nienaruszonej geometrii nie jest jeszcze dobrze ugruntowana. W porównaniu z poprzednimi protokołami stosowanymi do hodowli ex vivo tkanki mięśnia sercowego, protokół, który tutaj opisaliśmy, bardziej przypomina środowisko in vivo tkanki. Co więcej, zastosowanie obciążenia wstępnego i następczego pozwala na uzyskanie bardziej biomimetycznego środowiska. Jesteśmy w s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
JH, PS, DM i KL nie mają nic do ujawnienia. AD i TS są udziałowcami firmy InVitroSys GmbH, która dostarcza system uprawy Myodish.
Podziękowania
Badania zostały sfinansowane z grantów DZHK 81Z0600207 (JH, PS i DM) oraz 81X2600253 (AD i TS).
Autorzy chcieliby podziękować Claudii Fahney, Mei-Ping Wu i Matthiasowi Semischowi za ich wsparcie w przygotowaniu zestawów, jak również za regularne utrzymanie hodowli tkanek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Agarose Niska temperatura topnienia | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (monooksym 2,3-butanodionu) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Kalcyseptyna | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glukoza*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-suplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicylina / streptomycyna x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Sprzęt laboratoryjny | |||
| Komora przepływowa | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix pompa wodna i chłodzenie + BBraun Thermomix BM | BBraun | Wykonane we własnym zakresie połączenie rozwiązania chłodzącego i grzewczego. | |
| Inkubator | Binder | CB240 | |
| System hodowli MyoDish | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | System hodowli Myodish |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Łaźnia wodna 37 stopni | Haake | SWB25 | |
| Łaźnia wodna 80 stopni | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materiały | |||
| 100 ml plastikowa zlewka jednorazowa | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Jednostka filtracyjna, igły Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| 0,9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastikowe trójkąty | Własna produkcja | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Srebrno-Niebieski | Gillette | 7393560010170 | |
| Skalpel jednorazowy | Feather | 02.001.30.020 | |
| Strzykawka 10 mL Końcówka Luer BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych 3,5 cm | Falcon | 353001 | |
| probówki 50 mL | Falcon | Numer katalogowy: 352070 |
Bibliografia
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781(2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147(2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139(2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406(2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913(2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182(2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
