Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego u swobodnie poruszających się myszy

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63972

⸱

2 czerwca 2022

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metabolity mikrobiologiczne pochodzące z jelit mają wieloaspektowe działanie, prowadząc do skomplikowanych zachowań u zwierząt. Naszym celem jest opracowanie metody krok po kroku, która pozwoli określić wpływ metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego na mózg poprzez dostarczanie domózgowo-komorowe za pomocą kaniuli prowadzącej.

Streszczenie

Wpływ mikrobioty jelitowej i jej metabolitów na fizjologię i zachowanie gospodarza był intensywnie badany w ciągu tej dekady. Liczne badania wykazały, że metabolity pochodzące z mikrobioty jelitowej modulują funkcje fizjologiczne mózgu, w których pośredniczy mózg, poprzez skomplikowane szlaki jelitowo-mózgowe w organizmie gospodarza. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) są głównymi metabolitami pochodzącymi z bakterii, wytwarzanymi podczas fermentacji błonnika pokarmowego przez mikrobiom jelitowy. Wydzielane SCFA z jelit mogą działać w wielu miejscach na obrzeżach, wpływając na odpowiedzi immunologiczne, endokrynologiczne i nerwowe ze względu na rozległą dystrybucję receptorów SCFA. W związku z tym trudno jest rozróżnić ośrodkowe i obwodowe działanie SCFA poprzez doustne i dootrzewnowe podawanie SCFA. W artykule przedstawiono metodę opartą na wideo do badania funkcjonalnej roli SCFA w mózgu za pomocą kaniuli prowadzącej u swobodnie poruszających się myszy. Ilość i rodzaj SCFA w mózgu można regulować, kontrolując objętość i szybkość infuzji. Metoda ta może dostarczyć naukowcom sposobu na docenienie roli metabolitów pochodzących z jelit w mózgu.

Wprowadzenie

Ludzki przewód pokarmowy jest siedliskiem różnych mikroorganizmów wpływających na gospodarza1,2,3. Te bakterie jelitowe mogą wydzielać metabolity pochodzące z jelit podczas wykorzystywania składników diety spożywanych przez gospodarza4,5. Co ciekawe, metabolity jelitowe, które nie są metabolizowane na peryferiach, mogą być transportowane do innych narządów przez circulation6. Warto zauważyć, że te wydzielane metabolity mogą służyć jako mediatory dla osi jelitowo-mózgowej, zdefiniowanej jako dwukierunkowa komunikacja między ośrodkowym układem nerwowym a jelitami7. Wcześniejsze badania wykazały, że metabolity pochodzące z jelit mogą modulować złożone zachowanie i emocje u zwierząt8,9,10,11.

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) są głównymi metabolitami wytwarzanymi przez mikrobiotę jelitową podczas fermentacji błonnika pokarmowego i niestrawnych węglowodanów6. Octan, propionian i maślan są najliczniejszymi SCFA w klasie gut12. SCFA służą jako źródło energii dla komórek w przewodzie pokarmowym. Niezmetabolizowane SCFA w jelitach mogą być transportowane do mózgu przez żyłę wrotną, modulując w ten sposób mózg i zachowanie6,12. Wcześniejsze badania sugerowały, że SCFA mogą odgrywać kluczową rolę w zaburzeniach neuropsychiatrycznych6,12. Na przykład dootrzewnowe wstrzyknięcie maślanu myszom BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), zwierzęcemu modelowi zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD), uratowało ich deficyty społeczne13. Szczury leczone antybiotykami otrzymujące mikrobiotę od osób z depresją wykazywały wzrost zachowań podobnych do lęku i SCFA w kale14. Klinicznie zaobserwowano zmiany w poziomach SCFA w kale u osób z ASD w porównaniu z typowo rozwijającymi się grupą kontrolną15,16. Osoby z depresją mają niższy poziom SCFA w kale niż osoby zdrowe17,18. Badania te sugerowały, że SCFA mogą zmieniać zachowanie zwierząt i ludzi różnymi drogami.

Metabolity mikrobiologiczne wywierają różnorodny wpływ na wiele miejsc w ciele, wpływając na fizjologię i zachowanie gospodarza4,19, w tym na przewód pokarmowy, nerw błędny i nerw współczulny. Trudno jest określić dokładną rolę metabolitów pochodzących z jelit w mózgu podczas podawania metabolitów drogami obwodowymi. W artykule przedstawiono protokół oparty na wideo do badania wpływu metabolitów pochodzących z jelit na mózg swobodnie poruszającej się myszy (Rysunek 1). Wykazaliśmy, że SCFA mogą być ostro podawane przez kaniulę prowadzącą podczas testów behawioralnych. Rodzaj, objętość i szybkość infuzji metabolitów mogą być modyfikowane w zależności od celu. Miejsce kaniulizacji można dostosować, aby zbadać wpływ metabolitów jelitowych na określony obszar mózgu. Naszym celem jest dostarczenie naukowcom metody badania potencjalnego wpływu metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit na mózg i zachowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne i opieka nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Narodowy Uniwersytet Cheng Kung (NCKU) Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Przygotowanie do zwierzęcia doświadczalnego

  1. Zdobądź 6-8-tygodniowe samce myszy C57BL/6JNarl typu dzikiego od sprzedawcy.
  2. Umieść myszy w standardowej klatce dla myszy ze standardową karmą dla myszy i wysterylizowaną wodą ad libitum.
    UWAGA: Warunki przetrzymywania w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych NCKU to temperatura 22 ± 1 °C, wilgotność 55% ± 10% oraz cykl jasny/ciemny 13 h/11 h.

2. Chirurgia stereotaktyczna

  1. Przygotuj i wysterylizuj instrument stereotaktyczny, narzędzia chirurgiczne i powiązane przedmioty.
    UWAGA: Wszystkie przedmioty, które będą miały bezpośredni kontakt z miejscem operacji, powinny być wysterylizowane, aby uniknąć infekcji.
  2. Znieczulij mysz, umieszczając ją w klatce z pleksiglasu z 1%-5% izofluranem w tlenie.
    UWAGA: Uważnie obserwuj mysz, aby upewnić się, że częstość oddechów jest utrzymywana na poziomie około jednego oddechu na sekundę.
  3. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej. Ogolić miejsce operowane (głowę myszy) za pomocą trymera dla zwierząt. Umieść mysz na ramie stereotaktycznej, mocując siekacze myszy na drążku siekacza w stereotaktycznym uchwycie siekacza. Zakryj nos maską na nos
    4. .
  4. Znieczulij mysz 1%-2,5% izofluranem w tlenie podczas operacji stereotaktycznej. Oceń nocycepcję myszy za pomocą odruchu szczypania palca u nogi i upewnij się, że jest to stała częstość oddechów przed nacięciem pola operacyjnego.
  5. Umieść poduszkę grzewczą (37.0 °C) pod myszą na ramie stereotaktycznej, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji. Alternatywnie można utrzymać temperaturę rdzenia za pomocą doodbytniczej sondy termicznej łączącej zaprogramowany podgrzewacz z poduszką grzewczą.
  6. Usuń przycięte futro na głowie za pomocą taśmy klejącej. Wstrzyknąć myszy przeciwbólowy ketoprofen (5 mg/kg) podskórnie w celu złagodzenia bólu. Nałóż maść na oczy, aby uniknąć suchości oczu.
  7. Włóż spiczastą wkładkę douszną do kanału słuchowego, aby zamocować głowę.
  8. Wyśrodkuj głowę, regulując skalę paska nausznika.
  9. Dokręć nos clamp na uchwycie siekacza, aby uniknąć ruchu pionowego. Delikatnie dociśnij głowę, aby sprawdzić, czy głowa jest zamocowana i uniknąć poluzowania głowy podczas kolejnej operacji.
  10. Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi peelingami chlorheksydyny za pomocą bawełnianego wacika. Rozpocznij każde szorowanie od środka w kierunku zewnętrznej strony (od najbardziej zdezynfekowanego obszaru środkowego do najmniej zdezynfekowanego obszaru).
    UWAGA: Stosowanie fartuchów od środka na zewnątrz może pomóc naukowcom zminimalizować infekcje i zanieczyszczenia sierści. Zewnętrzna część znajduje się w pobliżu nieogolonej głowy, która nadal ma dużą ilość sierści i nie jest łatwa do dokładnej dezynfekcji.
  11. Naciąć skórę głowy w sposób przedni/tylny (<1 cm) za pomocą ostrza chirurgicznego. Otwórz nacięcie i przetrzyj czaszkę bawełnianym wacikiem trzymanym przez kleszcze do mikroanalizacji.
    UWAGA: Kleszcze do mikropreparacji, ostrze chirurgiczne i waciki bawełniane należy wysterylizować w autoklawie przed operacją. Podczas procesu chirurgicznego należy sterylizować cały sprzęt chirurgiczny za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C) przez co najmniej 5 sekund przed i po każdym zwierzęciu. Przygotuj wysterylizowaną zlewkę do trzymania ostrza chirurgicznego i kleszczy podczas procesu chirurgicznego i między zwierzętami.
  12. Zidentyfikuj Bregmę i Lambdę na czaszce. Użyj Bregmy jako odniesienia, aby zlokalizować interesujący Cię region.
    1. Opcjonalnie: Zamontuj wiertło stereotaktyczne na uchwycie wiertła stereotaktycznego i użyj końcówki wiertła, aby wskazać Bregmę jako odniesienie. Sterylizuj wiertło stereotaktyczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C) przez co najmniej 5 sekund.
  13. Skalibruj i wyrównaj płaską płaszczyznę poziomą czaszki w płaszczyźnie lewej/prawej i przedniej/tylnej za pomocą Bregma/Lambda.
    UWAGA: Jeśli nie znajduje się w prawidłowej płaszczyźnie poziomej, ponownie zamontuj mysz na instrumencie stereotaktycznym.

3. Komercyjna implantacja kaniuli prowadzącej dostosowana do potrzeb

klienta
  1. Zidentyfikuj i oznacz położenie prawej komory bocznej na podstawie współrzędnych stereotaktycznych: Odległość do Bregmy, przednia/tylna (A/P): 0,26 mm, przyśrodkowa/boczna (M/L): -1,0 mm, grzbietowa/brzuszna (D/V): -2,0 mm20,
    UWAGA: Współrzędne można modyfikować w zależności od obszaru zainteresowania. Współrzędne komory bocznej oparto na dorosłych myszach C57BL/6J o wadze 26-30 g. Jeśli używane są młodsze myszy, zapoznaj się z dyskusją.
  2. Wywierć otwór (średnica = 1,5 mm) przez czaszkę w oznaczonym miejscu za pomocą wiertła stereotaktycznego do wszczepienia komercyjnej kaniuli prowadzącej.
  3. Wywierć jeszcze dwa do czterech otworów (średnica = 1,5 mm) w czaszce za pomocą wiertła stereotaktycznego do montażu ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Sterylizuj wiertło stereotaktyczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C) przez co najmniej 5 sekund przed i po każdym zwierzęciu.
  4. Wytrzyj skrawki kości i zatamuj krwawienie bawełnianym wacikiem.
  5. Przetrzyj czaszkę lidokainą (1 mg/kg) za pomocą bawełnianego wacika, aby uzyskać działanie znieczulające miejscowo, przeciwświądowe i przeciwbólowe. Jeśli krwawienie nie ustanie po wierceniu, delikatnie umieść bawełniany wacik na otworze do hemostazy.
  6. Zamontuj dwie do czterech ze stali nierdzewnej na otworach, aby zapewnić kotwy do akrylu dentystycznego.
  7. Umieść komercyjną kaniulę prowadzącą na stereotaktycznym uchwycie kaniuli i zdezynfekuj za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C).
    UWAGA: Komercyjna kaniula prowadząca, komercyjny manekin i komercyjny wtryskiwacz (Rysunek 2A) zostały dostosowane zgodnie ze specyfikacjami przedstawionymi w Tabeli materiałów.
  8. Przesuń stereotaktyczny uchwyt kaniuli do otworu wywierconego na komorę boczną i powoli włóż komercyjną kaniulę prowadzącą do otworu, aż do żądanej głębokości (2.5 mm).
    UWAGA: Współrzędną grzbietową/brzuszną można zdefiniować, ustawiając końcówkę komercyjnej kaniuli prowadzącej jako odniesienie, gdy końcówka jest ledwo włożona do otworu.
  9. Nałożyć 10 μl kleju cyjanoakrylanu n-butylu (klej tkankowy), aby zamocować komercyjną kaniulę prowadzącą w wywierconym otworze i odczekać 3-4 minuty. Delikatnie zwolnij komercyjną kaniulę prowadzącą z uchwytu kaniuli stereotaktycznej i odsuń uchwyt.
  10. Nałóż akryl dentystyczny na naciętą skórę głowy, aby zamocować komercyjną kaniulę prowadzącą i odczekaj co najmniej 5 minut. Wszczep komercyjny manekin do komercyjnej kaniuli prowadzącej, aby uniknąć zatkania kaniuli przez krew lub płyn ustrojowy (Rysunek 2B).
  11. Zwolnij pasek douszny z kanału słuchowego i wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej.
  12. Umieść mysz w nowej klatce z poduszką grzewczą pod spodem w celu odzyskania sprawności po znieczuleniu i obserwuj, aż mysz całkowicie się obudzi.
    UWAGA: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Zwierzę, które przeszło operację, nie powinno wracać do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  13. Umieść mysz z powrotem w pomieszczeniu jednoosobowym lub grupowym, w zależności od instytucjonalnego protokołu IACUC i projektu eksperymentalnego. W przypadku trzymania grupowego upewnij się, że mniej myszy jest trzymanych w klatce, aby zminimalizować niepożądane obrażenia lub odłączenie kaniuli.
  14. Podawać ibuprofen (0,2 mg/ml) w wodzie do picia przez co najmniej 3 dni w celu opieki pooperacyjnej i monitorować dwa razy dziennie pod kątem objawów bólu i niepokoju przez co najmniej 3 dni.
    1. Podczas pielęgnacji pooperacyjnej należy nałożyć maść z roksytromycyną na skórę, aby zapobiec stanom zapalnym i infekcjom u myszy.
    2. Monitoruj stan zwierzęcia i w odpowiednim czasie wstrzyknij dootrzewnowo 5% glukozy i/lub 0,9% chlorku sodu, aby zapewnić wystarczającą ilość energii.
    3. Jeśli stan bólu, niepokoju lub infekcji stale się pogarsza, poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 .
  15. Poczekaj 1 tydzień po operacji, aby mysz była gotowa do domózgowo-komorowego dostarczania SCFA i testów behawioralnych.

4. Przygotowanie SCFA

  1. Rozpuścić octan sodu, maślan sodu i propionian sodu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) (patrz tabela materiałów).
  2. Upewnij się, że chemikalia są całkowicie rozpuszczone, a następnie dostosuj pH do 7,4 i przefiltruj mieszaninę SCFA przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji.

5. Konfiguracja systemu infuzyjnego do domózgowo-komorowego dostarczania SCFA podczas testów behawioralnych

  1. Zamontuj kamerę sufitową, aby zarejestrować zachowanie. Podłącz kamerę do komputera, aby sterować oprogramowaniem do nagrywania wideo ( Rysunek 3).
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 μl wodą destylowaną.
    UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza w strzykawce o pojemności mikrolitrów.
  3. Podłączyć pompę do mikroiniekcji ze sterownikiem mikroiniekcji.
  4. Zamontować strzykawkę o pojemności mikrolitrów na pompie do mikroiniekcji. Aby zainstalować strzykawkę, naciśnij przycisk, aby poluzować zacisk i zainstalować strzykawkę w odpowiedniej pozycji. Zamknij zacisk i dokręć mocującą tłok na pompie mikrowtryskowej (Rysunek 4A).
  5. Włóż komercyjny wtryskiwacz do rurki polietylenowej (Rysunek 2A).
  6. Zawieś rurkę polietylenową na kamerze sufitowej nad areną testową.
  7. Napełnij rurkę polietylenową wodą destylowaną za pomocą strzykawki insulinowej. Podłącz strzykawkę o pojemności mikrolitrów do wiszącej rurki polietylenowej.
    UWAGA: Upewnij się, że rurka polietylenowa jest wystarczająco długa, aby mysz mogła swobodnie poruszać się po arenie testowej.

6. Ustawienia systemowe kontrolera mikroiniekcji

  1. Włącz kontroler mikroiniekcji i naciśnij Wyświetl wszystkie kanały, aby uzyskać dostęp do ekranu poleceń (Rysunek 4C). Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw docelowy wolumin na 9,800 nL z szybkością dostarczania na 100 nL/s. Wlej 9 800 nl wody destylowanej z rurki polietylenowej podłączonej do strzykawki mikrolitrowej (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu zaparzania i naciśnij URUCHOM) (patrz czerwone kwadraty na ekranie poleceń Rysunek 4C).
  2. Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw docelowy wolumin na 3,000 nL z szybkością dostarczania na 100 nL/s. Wycofaj 3 000 nL oleju mineralnego (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu wypłaty i naciśnij RUN) (patrz czerwone kwadraty na ekranie poleceń Rysunek 4C).
    UWAGA: Na rurze polietylenowej należy przestrzegać wyraźnej separacji faz olej-woda.
  3. Zdemontuj rurkę polietylenową z mikrolitrowej igły strzykawki. Wypluj 3,000 nL wody destylowanej z mikrolitrowej igły strzykawki (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu zaparzania i naciśnij URUCHOM).
  4. Włóż strzykawkę o pojemności mikrolitrów z powrotem do rurki polietylenowej. Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw docelowy wolumin na 9 500 nL z szybkością dostarczania na 100 nL/s. Wycofaj 9,500 nL SCFA (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu wypłaty i naciśnij RUN). Oznacz fazę olej-SCFA, aby sprawdzić, czy SCFA są pomyślnie podawane.
  5. Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw żądany docelowy wolumin z szybkością dostarczania na 7 nL/s. Naciśnij przycisk Kierunek, aby przejść do trybu zaparzania (patrz czerwone kwadraty na ekranie poleceń Rysunek 4C).
    UWAGA: Określ objętość na podstawie czasu infuzji. Na przykład, jeśli czas infuzji wynosi 3 minuty przy szybkości podawania 7 nL/s, objętość docelowa = 1,260 nL.
  6. Naciśnij RUN, aby wlać mikrolitrową strzykawkę do przodu, aż płyn wypłynie z przodu komercyjnego wtryskiwacza przed włożeniem wtryskiwacza do kaniuli w celu wstrzyknięcia SCFA.

7. Infuzja SCFA do komory bocznej przez komercyjną kaniulę prowadzącą u swobodnie poruszającej się myszy

  1. Znieczulij mysz, umieszczając ją w klatce z pleksiglasu z 1%-5% izofluranem w tlenie.
    UWAGA: Uważnie obserwuj mysz, aby upewnić się, że częstość oddechów jest utrzymywana na poziomie około jednego oddechu na sekundę.
  2. Chrap mysz i włóż komercyjny wtryskiwacz do komercyjnej kaniuli prowadzącej (Rysunek 4B).
    UWAGA: Jeśli komercyjna kaniula prowadnica zostanie zatkana przez krew lub płyn ustrojowy, delikatnie odblokuj ją pęsetą.
  3. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu przez 15 minut w klatce przed testami behawioralnymi.
  4. W podstawowym teście lokomocji umieść mysz w nowej klatce i pozwól jej swobodnie eksplorować przez 35 minut. Zainfujaj SCFA, używając szybkości dostarczania 7 nL/s dla docelowej objętości 2,100 nL w ciągu pierwszych 5 minut (naciśnij Direction, aby przejść do trybu zaparzania i naciśnij RUN).
    UWAGA: Lokomocja w nowej klatce może być analizowana za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo zachowań zwierząt21,22.
  5. Znieczulij mysz (powtarzając krok 7.1) i wyjmij komercyjny wstrzykiwacz z komercyjnej kaniuli prowadzącej.
    UWAGA: Mysz może być wielokrotnie wstrzykiwana z różnymi kontrolami/metabolitami po zapewnieniu odpowiedniego czasu na wypłukanie poprzedniego wstrzyknięcia. Tak długo, jak kaniula jest zamocowana na głowie myszy, mysz może być wielokrotnie testowana z różnymi metabolitami.

8. Przywrócenie systemu mikroiniekcji

  1. Zdemontuj rurkę polietylenową ze strzykawki o pojemności mikrolitrów.
  2. Wstrzyknąć powietrze do rurki za pomocą strzykawki insulinowej, aby wyrzucić wodę destylowaną z rurki polietylenowej. Opróżnij strzykawkę z mikrolitrem.
  3. Naciśnij Reset Pos na ekranie konfiguracji, aby otworzyć ekran definicji zatrzymania strzykawki (Rysunek 4C).
  4. Naciskaj przycisk wycofywania, aż rozlegnie się sygnał dźwiękowy, aby zresetować pompę mikrowtrysku do pozycji całkowitego wycofania ( Rysunek 4C).
  5. Wróć do ekranu poleceń i wyłącz kontroler mikroiniekcji, jeśli na tym ekranie pojawi się znak **OSIĄGNIĘTO KONIEC** (Rysunek 4C).

9. Opcjonalnie: Walidacja iniekcji domózgowo-komorowej za pomocą znacznika neuronalnego

  1. Wlej 2 100 nl znacznika neuronalnego z szybkością dostarczania 7 nL/s, aby zweryfikować miejsce infuzji.
    UWAGA: Pozostaw wtryskiwacz w kaniuli prowadzącej na 5 minut, aby zapobiec przepływowi wstecznemu.
  2. Znieczulić mysz przez przedawkowanie izofluranu (5%) 30 minut po infuzji znacznika neuronalnego.
  3. Sprawdź częstość oddechów i odruch szczypania ogona/łapy u znieczulonej myszy.
    UWAGA: Myszy muszą nie odpowiadać przed następnym krokiem.
  4. Wykonaj 4-5 cm nacięcie przez skórę, mięśnie i ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej.
  5. Ostrożnie odsuń wątrobę od przepony.
  6. Naciąć przysłonę, aby odsłonić serce myszy.
  7. Przeprowadź perfuzję myszy przez serce za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i lodowatego 4% paraformaldehydu w PBS.
  8. Odetnij głowę myszy i ostrożnie przeprowadź sekcję mózgu za pomocą kleszczy do mikropreparacji i nożyczek do mikropreparacji, aby usunąć cały mózg23. Umieść próbki mózgu w lodowatym 4% paraformaldehydzie w PBS na 3-4 dni i umyj je 3 x 5 minut PBS.
  9. Pokrój mózg na dwie części w uchwycie na plasterki mózgu myszy w ósmym cięciu uchwytu na plasterki mózgu myszy (1 mm / sekcja) od przodu do tyłu. Umieść mózg w formie do zatapiania i osadź próbki mózgu w agarozie o niskiej temperaturze topnienia (4% w PBS).
  10. Przyklej mózg osadzony w agarozie do etapu wibratomu za pomocą superglue. Podziel mózg koronalnie na wycinki mózgu o grubości 50 μm za pomocą wibratomu.
  11. Inkubować wycinki mózgu w przeciwciałie skierowanym do znacznika neuronalnego rozcieńczonego w buforze blokującym (rozcieńczenie 1:1,000) przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Bufor blokujący zawierał 10% surowicy końskiej, 0,1% Triton X-100 i 0,02% azydku sodu.
  12. Umyj plastry 3 x 5 min za pomocą PBST (PBS z 0,1% trytonem X-100).
  13. Inkubować wycinki mózgu w przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym rozcieńczonym w buforze blokującym (rozcieńczenie 1:500) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  14. Umyj plastry 3 x 5 min za pomocą PBS.
  15. Zamontuj wycinki mózgu na szkiełku za pomocą podłoża mocującego zawierającego 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI).
  16. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym mikroskopu.
  17. Nałóż lakier do paznokci na krawędź prowadnicy, aby uniknąć wycieku medium mocującego.
  18. Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, zobrazować sygnał fluorescencyjny w miejscu infuzji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

10. Opcjonalnie: Infuzja metabolitów przez dostosowaną do potrzeb kaniulę prowadzącą ze stali nierdzewnej w komorze bocznej u myszy

  1. Postępuj zgodnie z sekcjami protokołu 1-8 i zastąp komercyjną kaniulę prowadzącą kaniulą prowadzącą ze stali nierdzewnej, aby wstrzykiwać chemikalia przez wstrzykiwacz ze stali nierdzewnej w myszy.
    UWAGA: Plusy i minusy różnych kaniul komercyjnych i ze stali nierdzewnej zostały omówione w sekcji dyskusji.
  2. Protokół chirurgiczny należy wykonać w taki sam sposób, jak opisano w sekcjach 2 i 3 protokołu, z wyjątkiem tego, że należy pamiętać o wymianie komercyjnej kaniuli prowadzącej na kaniulę prowadzącą ze stali nierdzewnej (Rysunek 5B).
    UWAGA: Kaniula prowadząca ze stali nierdzewnej, atrapa ze stali nierdzewnej i wtryskiwacz ze stali nierdzewnej (Rysunek 5A) zostały dostosowane do specyfikacji przedstawionych w tabeli materiałów. Włóż niestandardową kaniulę prowadzącą ze stali nierdzewnej do otworu na żądaną głębokość (2.0 mm).
  3. Infuzję SCFA za pomocą kaniuli prowadzącej ze stali nierdzewnej za pomocą systemu mikroiniekcji składającego się z kontrolera mikroiniekcji i pompy do mikroiniekcji (Rysunek 4B) (tak samo jak w sekcjach protokołu 4-7). W przypadku manekina kaniuli prowadzącej ze stali nierdzewnej należy delikatnie zegnąć jedną stronę wtryskiwacza ze stali nierdzewnej, aż końcówka drugiej strony będzie o 1 mm dłuższa niż kaniula prowadząca ze stali nierdzewnej.
  4. Wlej 2,100 nL znacznika neuronalnego przez kaniulę prowadzącą ze stali nierdzewnej do komory bocznej u myszy (tak samo jak w sekcji 9 protokołu).
  5. Pobieraj próbkę przez 30 minut po infuzji znacznika neuronalnego (tak samo jak w sekcji 9 protokołu).
  6. Wykonaj akwizycję obrazu w wycinkach mózgu z nasyconym znacznikiem neuronowym (tak samo jak w sekcji 9 protokołu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy podano SCFAs 1 tydzień po rekonwalescencji po implantacji kaniuli prowadzącej, aby ocenić aktywność lokomotoryczną w nowej klatce. Myszy umieszczono w nowej klatce i w ciągu pierwszych 5 min podano do mózgu 2 100 nL SCFAs lub ACSF (szybkość podawania 7 nL/s) poprzez komercyjną kaniulę prowadzącą implantowaną w bocznym komorze mózgu. Aktywność lokomotoryczną w nowej klatce rejestrowano przez kolejne 30 min po infuzji. Nie zaobserwowano różnic w aktywności lokomotorycznej w nowej klatce pomiędzy infuzją SCFAs a ACSF ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metabolity pochodzenia jelitowego są związane z chorobami o podłożu mózgu bez bardziej precyzyjnego mechanizmu, częściowo ze względu na ich liczne miejsca wiązania w organizmie 6,12,24. Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że SCFA mogą służyć jako ligandy dla receptorów sprzężonych z białkiem G, regulatorów epigenetycznych i źródeł produkcji energii w wielu miejscach w organizmie 6,12

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Podziękowania

Dziękujemy pracownikom Centrum Zwierząt Laboratoryjnych na Narodowym Uniwersytecie Cheng Kung (NCKU) za opiekę nad zwierzętami. Praca ta została wsparta stypendium z Funduszu Edukacyjnego im. prof. Kun-Yen Huang Fundacji Medycznej CHENG-HSING dla C.-W.L.; fundusze z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) na Tajwanie: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) do T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) do W.-L.W.; oraz Projekt Kiełki Szkolnictwa Wyższego, Ministerstwa Edukacji Narodowej do Centrali Kształcenia Uczelni NCKUK do W.-L.W.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< mocny>Materiał< / mocny>
Advil Liqui-Gels Solubilizowany ibuprofen A2: D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 osł anty-królikThermoFisher ScientificA-21206
Antyfluorescencyjne złoto (poliklonalne królika)MilliporeAB153-I
Butelkowy filtr próżniowy, 500 mL, 0,22 μ m, PES, SterylneNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0,14 g/L
Peeling chlorheksydynowy 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Roztwór chlorheksydynyPhoenixNDC 57319-599-09
Manekin handlowyRWD Life Science62004Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Komercyjna kaniula prowadzącaRWD Life Science62104Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm 
Komercyjny wtryskiwaczRWD Life Science62204Single_OD 0,21 mm-33G/ Pasuje do M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0,61 g/L
Akryl dentystycznyHYGENICn/a
mocująceRWD Life Science62521
Fluoroshield medium montażowe z DAPIAbcam AB104139
Surowica dla koniThermoFisher Scientific16050130
Strzykawki insulinoweBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 ml
Izofluran Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0,19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidokaina AstraZenecan/a
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0,19 g/L
Szkiełka nakrywkowe do mikroskopuMARIENFELD101242
Szkiełka mikroskopoweThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Lampa do oleju mineralnego, biała NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7,46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0,18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1,76 g/L
klej cyjanoakrylowy n-butylu (klej tkankowy)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Rurka polietylenowaRWD Life Science62329OD 1,50, ID 0,50 mm i OD 1,09, ID 0,38 mm
Puralube Vet (oko) MaśćDechra 
Octan sodu SCFA Sigma-AldrichS2889: 13,5 mM
Azydek sodu Sigma-AldrichS2002
Maślan sodu Sigma-AldrichB5887SCFA: 8 mM
Propionian sodu Sigma-AldrichP1880SCFA: 5,18 mM
Kaniula prowadząca ze stali nierdzewnejChun Ta przedsiębiorstwo ze stali nierdzewnej CO., LTD.nie dotyczyśrednicy zewnętrznej 0,63 mm; Lokalny sprzedawca
Wtryskiwacz ze stali nierdzewnejChun Ta przedsiębiorstwo ze stali nierdzewnej CO., LTD.n/aOD 0,3 mm; manekin wykonany jest z wtryskiwacza; lokalny sprzedawca
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Uchwyt kaniuliRWD Life ScienceB485-68217
Kamera sufitowaFOSCAMR2
Cyfrowe instrumenty stereotaktyczneStoelting51730D
Mikroskop preparacyjnyINNOVIEWSEM-HT/TW
Sterylizator szklanych koralikówRWD Life ScienceRS1501
Poduszka grzewczaStoelting53800M
Mikroskop Leica LeicaDM2500
Mikro kleszcze preparacyjneROBOZRS-5136Ząbkowany, Lekka krzywa; Ekstra delikatny; 0.5mm Szerokość końcówki; Długość 4" 
Nożyczki do mikro preparacjiROBOZRS-59184,5-calowy kątowy
ostry kontroler mikroiniekcjiWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TKontroler SMARTouch Pompa
strzykawkowa do mikroiniekcjiWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3   
Strzykawka mikrolitrowaHamilton8001410 & L
Światłowód Zimne światło z podwójnym stopniem światłowodowymLGY-150Lokalny sprzedawca
Podkaszarka dla zwierzątWAHL09962-2018
Parownik do IsofluraneStepAS-01Lokalny sprzedawca
Vibratome LeicaVT1000S
Software
Film o zachowaniu zwierząt oprogramowanie śledząceNoldusEthoVisionWersja: 15.0.1416
Oprogramowanie Leica Application Suite XWersja LeicaLASX: 3.7.2.22383
12920060

Bibliografia

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25(2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22(2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939(2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428(2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252(2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023(2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941(2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157(2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879(2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540(2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3(2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28(2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157(2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrobiota jelitowakrótkołańcuchowe kwasy tłuszczowekaniula prowadzącachirurgia stereotaktycznaoś jelitowo-mózgowatesty behawioralnemikroskopia fluorescencyjna
Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego u swobodnie poruszających się myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.