Ten protokół opisuje izolację preadipocytów myszy z podskórnego tłuszczu, ich różnicowanie na dojrzałe adipocyty oraz indukcję insulinooporności. Działanie insuliny ocenia się na podstawie fosforylacji/aktywacji członków szlaku sygnałowego insuliny przez western blot. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie insulinooporności/wrażliwości w adipocytach pierwotnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zróżnicowane adipocyty myszy w hodowli pierwotnej: model insulinooporności
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Insulinooporność to zmniejszony wpływ insuliny na jej komórki docelowe, zwykle wynikający ze zmniejszonej sygnalizacji receptora insuliny. Insulinooporność przyczynia się do rozwoju cukrzycy typu 2 (T2D) i innych chorób związanych z otyłością, które występują na całym świecie. Dlatego zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw insulinooporności ma ogromne znaczenie. Do badania insulinooporności wykorzystano kilka modeli zarówno in vivo, jak i in vitro; Pierwotne adipocyty stanowią atrakcyjną opcję do badania mechanizmów insulinooporności i identyfikacji cząsteczek, które przeciwdziałają temu schorzeniu, a także celów molekularnych leków uczulających na insulinę. W tym miejscu ustaliliśmy model insulinooporności przy użyciu pierwotnych adipocytów w hodowli leczonej czynnikiem martwicy nowotworu-α (TNF-α).
Komórki prekursorowe adipocytów (APC), wyizolowane z trawionej kolagenazą podskórnej tkanki tłuszczowej myszy za pomocą technologii magnetycznej separacji komórek, różnicują się w pierwotne adipocyty. Insulinooporność jest następnie indukowana przez leczenie TNF-α, cytokiną prozapalną, która zmniejsza fosforylację/aktywację tyrozyny członków kaskady sygnalizacji insuliny. Zmniejszona fosforylacja receptora insuliny (IR), substratu receptora insuliny (IRS-1) i kinazy białkowej B (AKT) jest oznaczana ilościowo za pomocą western blot. Metoda ta stanowi doskonałe narzędzie do badania mechanizmów pośredniczących w insulinooporności w tkance tłuszczowej.
Wprowadzenie
Insulina jest hormonem anabolicznym wytwarzanym przez komórki β wysp trzustkowych i kluczowym regulatorem metabolizmu glukozy i lipidów. Wśród wielu swoich funkcji, insulina reguluje wychwyt glukozy, syntezę glikogenu, glukoneogenezę, syntezę białek, lipogenezę i lipolizę1. Początkowym sygnałem molekularnym po interakcji insuliny z jej receptorem (IR) jest aktywacja wewnętrznej aktywności kinazy białkowej tyrozyny IR2, co skutkuje jej autofosforylacją3 i późniejszą aktywacją rodziny białek znanych jako substraty receptora insuliny (IRS), które wiążą się z białkami adaptorowymi, prowadząc do aktywacji kaskady kinaz białkowych4. Insulina aktywuje dwa główne szlaki sygnałowe: kinazę 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)-kinazę białkową B (AKT) i kinazę białkową aktywowaną mitogenem Ras (MAPK). Pierwszy z nich stanowi główny punkt rozgałęzienia lub węzeł4,5 do aktywacji licznych efektorów biorących udział w różnych funkcjach fizjologicznych, w tym regulacji homeostazy paliwa, podczas gdy drugi reguluje wzrost i różnicowanie komórek4,6. Działanie insuliny ostatecznie zależy od typu komórki i kontekstu fizjologicznego7.
Jedną z głównych tkanek metabolicznych reagujących na insulinę jest tkanka tłuszczowa. Biała tkanka tłuszczowa jest najliczniejszym rodzajem tłuszczu u ludzi i gryzoni, rozmieszczonym w podskórnej tkance tłuszczowej (między skórą a mięśniami) i tłuszczu trzewnym (wokół narządów w jamie brzusznej). Ze względu na ich dużą objętość, adipocyty lub komórki tłuszczowe są najliczniejszym typem komórek w tkance tłuszczowej. Te komórki tłuszczowe mogą być brązowo-beżowe (termogeniczne), różowe (w gruczole sutkowym) i białe8,9. Białe adipocyty utrzymują główne rezerwy energii w organizmie w postaci trójglicerydów, co jest procesem insulinozależnym. Insulina wspomaga transport glukozy i lipogenezę, jednocześnie hamując lipolizę lub rozpad lipidów7,10. Ułatwia również różnicowanie preadipocytów w adipocyty — dojrzałe komórki magazynujące tłuszcz11.
Insulinooporność występuje, gdy normalny poziom insuliny wywołuje osłabioną odpowiedź biologiczną, co prowadzi do kompensacyjnej hiperinsulinemii12. Insulinooporność to stan związany z nadwagą i otyłością5, który w połączeniu prowadzi do cukrzycy typu 2 (T2D) i innych chorób metabolicznych13. Hiperinsulinemia kompensuje insulinooporność w tkankach obwodowych w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy we krwi14. Jednak ostateczna utrata lub wyczerpanie komórek β, wraz z zaostrzeniem insulinooporności, prowadzi do podwyższonego poziomu glukozy we krwi zgodnego z T2D5. Dlatego insulinooporność i hiperinsulinemia mogą przyczyniać się do rozwoju chorób metabolicznych wynikających z otyłości15. Ponadto otyłość może powodować przewlekłe miejscowe stany zapalne o niskim stopniu nasilenia, sprzyjające insulinooporności w tkance tłuszczowej15,16,17. Ponadto zmiany w tkance tłuszczowej wynikające z otyłości, takie jak zwłóknienie, zapalenie oraz zmniejszona angiogeneza i adipogeneza, prowadzą do obniżenia poziomu adiponektyny w surowicy (uwrażliwiającego na insulinę) i zwiększonego wydzielania czynników, takich jak inhibitor aktywatora plazminogenu 1 (PAI-1), wolne kwasy tłuszczowe i egzosomy do krwiobiegu, zaostrzając insulinooporność17.
Wiele aspektów leżących u podstaw insulinooporności pozostaje nieznanych. Opracowano modele in vitro i in vivo w celu zbadania mechanizmów pośredniczących w insulinooporności w głównych tkankach docelowych, w tym w tkance tłuszczowej. Zaletą modeli in vitro jest to, że naukowcy mają większą kontrolę nad warunkami środowiskowymi i mogą ocenić insulinooporność w określonych typach komórek. W szczególności komórki prekursorowe adipocytów (APC) mają indywidualny fenotyp tkanki dawcy, który może lepiej odzwierciedlać fizjologię niż linie komórkowe adipocytów. Głównym czynnikiem wywołującym insulinooporność in vitro jest czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α). TNF-α jest cytokiną prozapalną wydzielaną przez adipocyty i makrofagi w tkance tłuszczowej18. Chociaż jest to wymagane do prawidłowej przebudowy i ekspansji tkanki tłuszczowej19, długotrwała ekspozycja na TNF-α indukuje insulinooporność w tkance tłuszczowej in vivo i w adipocytach in vitro20. Przewlekłe leczenie TNF-α kilku typów komórek prowadzi do zwiększonej fosforylacji seryny zarówno IR, jak i IRS-1, co sprzyja zmniejszonej fosforylacji tyrozyny21. Zwiększona fosforylacja IRS-1 na resztach seryny hamuje aktywność kinazy tyrozynowej IR i może być jednym z kluczowych mechanizmów, za pomocą których przewlekłe leczenie TNF-α upośledza działanie insuliny22,23. TNF-α aktywuje szlaki obejmujące inhibitor kinazy serynowo-treoninowej czynnika jądrowego kinazy β czynnika jądrowego (IKKβ) i kinazy końcowej c-Jun N (JNK)24. JNK indukuje złożony prozapalny program transkrypcyjny, ale także bezpośrednio fosforyluje IRS-16.
Zrozumienie patogenezy insulinooporności staje się coraz ważniejsze dla ukierunkowania rozwoju przyszłych terapii przeciwko T2D. APC okazały się doskonałym modelem do badania biologii komórek tłuszczowych, w tym wrażliwości i oporności na insulinę, oraz do identyfikacji wewnętrznych właściwości adipocytów niezależnie od środowiska ogólnoustrojowego. APC można łatwo pozyskać z różnych magazynów tłuszczowych i w odpowiednich warunkach różnicować w dojrzałe adipocyty. Dzięki tej metodzie można ocenić bezpośredni wpływ na insulinooporność/wrażliwość w adipocytach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na gryzoniach zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Instytutu Neurobiologii UNAM, numer protokołu 075.
1. Izolacja komórek prekursorowych adipocytów myszy
- Eutanazja 8-10-tygodniowego samca myszy C57BL/6 (np. przez wdychanie CO2 i późniejsze zwichnięcie szyjki macicy) (cztery zwierzęta na izolację). Zdezynfekuj myszy, nacierając je 70% etanolem i uzyskaj tkankę tłuszczową natychmiast po uśmierceniu.
UWAGA: Po eutanazji gryzoni należy natychmiast odizolować tkankę tłuszczową i wykonać wszystkie czynności w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Myszy są trzymane w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. - Wypreparuj pachwinową podskórną tkankę tłuszczową z każdej myszy. Usuń tylko tkankę tłuszczową, unikając usuwania mięśni, skóry lub jakiejkolwiek innej tkanki, i zbierz ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml roztworu kolagenazy typu 1 (1,5 mg / ml) na lodzie. Rozpuść kolagenazę typu 1 w zmodyfikowanej pożywce Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) firmy Dulbecco i przefiltruj przez filtry strzykawkowe 0,2 μm.
- Pociąć tkankę tłuszczową na małe kawałki sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi i trawić próbki przez inkubację z roztworem kolagenazy typu 1 w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej (150 obr./min) przez 30 minut (umieścić probówkę zawierającą tłuszcz i kolagenazę w pozycji poziomej, aby uzyskać większą powierzchnię wstrząsania). Sprawdzaj trawienie co 10 minut, aby upewnić się, że działa (widoczna jest degradacja tkanek) i aby zapobiec nadmiernemu trawieniu (patrz rysunek uzupełniający S1).
- Przefiltrować za pomocą strzykawki siatkowej o wielkości 200 μm (uprzednio sterylizowanej w autoklawie) w celu wyeliminowania tkanki, która nie została strawiona kolagenazą. Przełóż filtr przez krawędź rurki, aby spuścić jak najwięcej komórek do roztworu. Dodać 15 ml zimnego DMEM-1% BSA w celu zatrzymania trawienia i odwirować w temperaturze 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Odessać górną warstwę zawierającą dojrzałe adipocyty i większość warstwy płynu; unikać dotykania lub naruszania osadu. Dodać 20 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (PBS)-2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i ponownie zawiesić osad. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Usuń supernatant, odsysając najpierw górną warstwę, aby wyeliminować pozostałe adipocyty i tłuszcz. Zawiesić osad w 1 ml buforu lizującego chlorku amonu i potasu (ACK) (w celu lizy czerwonych krwinek) i inkubować na lodzie przez 5 minut. Dodać 10 ml PBS-2% FBS, wymieszać i odwirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl roztworu anty-Fc (oczyszczony szczurzy anty-mysz CD16 / CD32 rozcieńczony w PBS-2% FBS [1:150]) w celu zmniejszenia wiązania za pośrednictwem receptora Fc przez interesujące nas przeciwciała. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 5 ml, która mieści się we wstępnie schłodzonych stojakach magnetycznego separatora komórek i odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant, dodać 200 μl mieszaniny przeciwciała monoklonalnego CD31(PECAM-1) (390)-biotyny (1:100) i przeciwciała monoklonalnego CD45 (30-F11)-biotyny (1:100), dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 15 minut (przygotować rozcieńczenia przeciwciał w roztworze anty-Fc; patrz tabela 1). Dodać 400 μl PBS-2% FBS i wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: CD31 i CD45 są markerami odpowiednio komórek śródbłonka i komórek krwiotwórczych. - Odessać supernatant i inkubować w 100 μl mikrogranulek antybiotyny (1:5) przez 15 minut na lodzie (przygotować rozcieńczenia przeciwciał w roztworze anty-Fc, patrz tabela 1). Dodać 400 μl PBS-2% FBS i wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 350 μl PBS-2% FBS. Usunąć agregaty komórkowe lub duże cząstki z zawiesin jednokomórkowych za pomocą filtra do separacji wstępnej (70 μm). Najpierw aktywuj filtr 100 μL PBS-2% FBS, przepuść zawiesinę komórek przez filtr (zebrać do czystej probówki), a na koniec umyj filtr 100 μL PBS-2% FBS.
- Przeprowadzić separację magnetyczną komórek przy użyciu strategii separacji ujemnej za pomocą magnetycznego separatora komórek.
- Umieścić próbkę w pozycji A stojaka chłodzącego (upewnić się, że stojak jest wstępnie schłodzony), a dwie puste probówki w pozycji B i C, aby odzyskać odpowiednio nieoznakowane i oznakowane komórki.
- Załaduj bufor myjący i bufor do pracy do odpowiednich butelek przed włączeniem urządzenia. Zaprogramuj sprzęt do wykonywania separacji magnetycznej komórek za pomocą protokołu DEPLETE.
UWAGA: Ten protokół służy do zubożenia w trybie standardowym w celu usunięcia komórek o normalnej ekspresji antygenu (w tym przypadku komórek znakowanych anty-CD31 i anty-CD45), jeśli odzyskiwanie jest najwyższym priorytetem. - W sekcji separacji wybierz liczbę próbek do rozdzielenia i wybierz protokół DEPLETE. Naciśnij Uruchom i rozpocznij separację. Pod koniec programu odzyskać nieznakowane komórki i odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 500 μl podłoża wzrostowego (Tabela 1).
- Zasiaj APC w jednym dołku 12-dołkowej płytki uprzednio pokrytej 2,5% macierzyą błony podstawnej (uzyskuje się około 50 000-75 000 komórek). Dodaj 400 μl 2,5% matrycy membrany podstawnej, aby pokryć całą powierzchnię każdej studzienki. Natychmiast po usunięciu nadmiaru roztworu i pozostawieniu tylko niewielkiej warstwy, pozostaw płytkę do wyschnięcia (bez pokrywki) wewnątrz okapu z przepływem laminarnym na co najmniej 1 godzinę. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
- Przy 80% konfluencji całkowicie usuń podłoże i przemyj 350 μl PBS-2% FBS. Zebrać komórki z 350 μl 0,05% trypsyny-EDTA przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 2 ml pożywki wzrostowej i zebrać komórki w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie odwirować przy 400 × g przez 5 minut.
- Przenieś APC na płytki 12-dołkowe (10 000-20 000 komórek na studzienkę) uprzednio pokryte 2,5% matrycą membrany podstawnej. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 48 godzin, aż komórki osiągną 80% konfluencji.
UWAGA: Transportery opancerzone można przejechać raz. Następnie tracą zdolność do namnażania się i różnicowania. Zobacz przebieg procesu izolacji APC na rysunku uzupełniającym S2.
2. Różnicowanie adipocytów i indukcja insulinooporności
UWAGA: Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wykonuj kroki obejmujące zmianę pożywki i leczenie TNF-α i insuliną w sterylnym kapturze.
- Przy 80% zbiegu rozpocznij proces różnicowania; odessać dowolną pożywkę wzrostową i zastąpić ją 500 μl pożywki różnicującej (Tabela 1) zawierającej 3,3 nM białka morfogenetycznego kości (BMP4) w każdym dołku.
- Po 48 godzinach zastąpić pożywkę pożywką różnicującą (500 μl na studzienkę) i koktajlem różnicującym (tabela 1).
- Usunąć pożywkę 72 godziny później i dodać 100 nM insuliny do 500 μl świeżej pożywki różnicującej.
UWAGA: Komórki zaczynają wykazywać okrągły wygląd z małymi kropelkami lipidów w środku. - Odessać wszelkie pożywki różnicujące i zastąpić je 500 μl prostego podłoża - 2% FBS (Tabela 1) 48 godzin później. Indukuj insulinooporność za pomocą 4 ng/ml TNF-α. Obejmują studzienki kontrolne bez obróbki TNF-α.
- Po 24 godzinach inkubacji dodać 4 ng/ml TNF-α w prostym podłożu 0% FBS (Tabela 1). Utrzymuj studzienki kontrolne bez obróbki TNF-α.
- Aktywuj szlak sygnalizacji insuliny 24 godziny później, dodając 100 nM insuliny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Usunąć podłoże i przemyć 500 μl PBS. Uwzględnij studzienki kontrolne bez leczenia insuliną.
3. Ocena szlaku sygnalizacji insuliny przez western blot
- Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe białek
- Przemyć każdą studzienkę komórek 500 μl PBS i trzymać na lodzie w celu lizy komórek w 50 μl buforu RIPA (Tabela 1) zawierającego 1% koktajl inhibitorów proteazy dodany tuż przed izolacją próbki. Zeskrob całą powierzchnię studzienki końcówką i przenieś lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml (trzymaj na lodzie).
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w obracającym się wytrząsarce, mieszać przez wirowanie i odwirowywać w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odzyskać supernatant (przechowywać na lodzie).
- Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda (nie rozcieńczać próbki w celu określenia ilościowego).
- Pobrać niezbędną objętość odpowiadającą 40–60 μg i poddać denaturacji 6x buforem Laemmli (tabela 1) przez inkubację w temperaturze 97 °C przez 15 minut, wytrząsając przy prędkości 550 obr./min. Zamrażać do czasu użycia.
- Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS
- Wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) z 7,5% żelem poliakrylamidowym o grubości 1,5 mm. Włóż żel do zbiornika i napełnij go działającym buforem (Tabela 1).
- Dodać 3 μl wstępnie wybarwionego wzorca białkowego do pierwszego dołka żelu i załadować każdą próbkę do kolejnych dołków.
- Uruchom żel pod napięciem 80 V przez około 15 minut, aby upewnić się, że próbka dostanie się do matrycy żelu koncentratora poliakryloamidu. Następnie zwiększaj napięcie do 90 V przez 2,5 godziny lub do momentu, gdy na dolnej krawędzi żelu będzie widoczny marker masy cząsteczkowej 37 kDa.
- Przenieść białka z żelu na membranę nitrocelulozową w komorze półsuchej na 35 minut przy napięciu 25 V. Wcześniej zanurzyć żel, membranę i filtry w buforze transferowym (Tabela 1) na kilka minut.
- Plama zachodnia
- Po przeniesieniu przepłukać membranę solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) zawierającą 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (Tabela 1) przez 3 minuty z wytrząsaniem przy 30 obr./min.
- Zawiesić membranę roztworem blokującym (tabela 1) w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę przy stałych obrotach.
- Przeciąć błonę na trzy części zgodnie ze znacznikiem masy cząsteczkowej w celu inkubacji przez noc z różnymi pierwszorzędowymi przeciwciałami (rozcieńczonymi w roztworze blokującym) w temperaturze 4 °C przy stałej rotacji: przeciwciało Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1,000), oczekiwane pasmo przy 180 kDa; Przeciwciało przeciwko receptorowi fosfoinsuliny β (Tyr1150/1151) (1:1000), oczekiwane pasmo 95 kDa; Przeciwciało Phospho-Akt (Ser473) (1:1,000), oczekiwane pasmo przy 60 kDa.
- Umyj membrany 5x po 5 min każdą TBS-T 0,1%.
- Inkubować błony z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą (rozcieńczonym w roztworze blokującym) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w stałej rotacji: affiniPure donkey anty-rabbit IgG (H + L) (1:5,000).
- Umyj membrany 5x po 5 min każdą TBS-T 0,1%.
- Wykryj białka za pomocą systemu detekcji chemiluminescencji. Podłoże należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.
- Umieść blot w plastikowej torbie i dodaj 200 μl podłoża chemiluminescencyjnego, aby całkowicie pokryć membranę. Odcedź nadmiar podłoża i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza.
- Naświetlaj każdą plamę przez 30-60 s w wysokowydajnym systemie obrazowania kompatybilnym z chemiluminescencją.
- Usuń błony (kroki 10-13 sekcji western blot), aby przerwać interakcje przeciwciało-antygen, a tym samym umożliwić ponowne osuszenie błon nitrocelulozowych. Odzyskaj membrany i myj 3x po 5 minut za pomocą TBS-T 1% przy 50 obr./min.
- Inkubować przez 7 minut z 10 ml 0,2 M NaOH przy 50 obr./min.
- Myć 3x po 5 min wodą z kranu o prędkości 50 obr./min.
- Prać przez 10 minut z TBS-T 1% przy 50 obr./min.
- Powtórzyć kroki 2-9 sekcji western blot, aby inkubować błonę z tubuliną anty-beta (55 kDa) jako kontrolę obciążenia przy użyciu rozcieńczenia 1:1 000.
- Wykonaj analizę densytometryczną25 dla każdego białka za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W ciągu ostatnich kilku lat wzrost częstotliwości występowania otyłości i cukrzycy typu 2 (T2D) doprowadził do intensywnych poszukiwań mechanizmów pośredniczących w insulinooporności w tkance tłuszczowej. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi, komórki APC można różnicować w dojrzałe adipocyty w celu oceny insulinooporności i wrażliwości na insulinę. Po osiągnięciu przez komórki APC stanu konfluencji, proces ich różnicowania w dojrzałe adipocyty oraz indukowana przez TNF-α insulinooporność trwają 10 dni (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono metodę badania insulinooporności, która wykorzystuje pierwotne adipocyty w hodowli leczonej TNF-α. Model ten ma tę zaletę, że pierwotne adipocyty mogą być hodowane w określonych warunkach przez długi czas przy ścisłej kontroli komórkowych czynników środowiskowych26. Czas trwania testu wynosi 15-20 dni, chociaż mogą wystąpić różnice w procentowym odsetku zróżnicowanych adipocytów między eksperymentami. Adipocyty pierwotne mają przewagę nad liniami komórkowymi, ponieważ nie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Danielowi Mondragónowi, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martínowi Garcíi-Servínowi, Alejandrze Castilla i Maríi Antoniecie Carbajo za ich pomoc techniczną, oraz Jessice Gonzalez Norris za krytyczną redakcję rękopisu. Protokół ten został poparty przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (do Y.M.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1. Izolacja mysich komórek prekursorowych adipocytów | |||
| ACK bufor lizujący | LONZA | 10-548E | |
| Mikrogranulki antybiotynowe | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| Separator AutoMACS Pro | Miltenyi Matryca | ||
| membrany podstawnej (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Czynnik wzrostu |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Przeciwciało monoklonalne (30-F11) - Biotyna | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Kolagenaza, typ 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| deksametazon | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM o niskiej zawartości glukozy | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Czynnik wzrostu |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Mieszanka ITS | Sigma | I3146 | |
| 2-fosforan kwasu L-askorbinowego | Sigma | A8960 | |
| LIF | Milipor | ESG1107 | Czynnik wzrostu |
| Kwas linolowy-albumina | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 podłoże | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Czynnik wzrostu |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Filtry wstępnej separacji (70 &mikro; m) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Oczyszczony szczurzy środek przeciw myszom CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Różnicowanie adipocytów i indukcja insulinooporności | |||
| 3-Izobutylo-1-metyloksantyna [IBMX] | Sigma | I5879 | Koktajl różnicujący |
| BMP4 | R& D Systems | 5020-BP-010 | Koktajl różnicujący |
| Deksametazon | Sigma | D1756 | Koktajl różnicujący |
| Insulina | Sigma | I9278 | |
| Rozyglitazon | Kajman | 71742 | Koktajl różnicujący |
| TNFα | R& Systemy D | 210-TA-005 | |
| 3. Ocena szlaku sygnalizacji insuliny za pomocą western blot | |||
| Przeciwciało anty-beta tubuliny | Abcam | ab6046 | |
| Błękit bromofenolowy | BioRad | 161-0404 | Bufor Laemmli |
| EDTA | Sigma | E5134 | Bufor RIPA |
| EGTA | Sigma | E4378 | Bufor RIPA |
| System | FluorChem EProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Bufor Laemmli |
| Glycine | Sigma | G7126 | Bufor do pracy i transferu |
| Igepal | Sigma | I3021 | Bufor |
| RIPA 2-merkaptoetanol | Sigma | M3148 | Bufor Laemmli |
| Metanol | JT Baker | 907007 | Bufor transferowy |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | Bufor RIPA |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | Bufor RIPA |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | Bufor RIPA |
| Membrana nitrocelulozowa | BioRad | 1620112 | |
| Odtłuszczone mleko w proszku | BioRad | 1706404 | Roztwór blokujący |
| Białko barwione standardowo | BioRad | 1610395 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroksydaza AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Fosfo-receptor insulinowy i beta; | Sygnalizacja komórkowa | 3024 | |
| Przeciwciało Phospho-Akt (Ser473) | Sygnalizacja komórkowa | 9271 | |
| Przeciwciało Phospho-IRS1 (Tyr608) | Milipora | 9432 | |
| Sacharoza | JT Baker | 407205 | Bufor RIPA |
| SDS | BioRad | 1610302 | Bufor do biegania i laemmli |
| SuperSignal West Pico PLUS Podłoże chemiluminescencyjne | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Bufor do pracy, transferu i laemmli |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | Bufor RIPA - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
Bibliografia
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
