Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka nanomatrycy janus base warstwa po warstwie w celu wspomagania regeneracji chrząstki

DOI:

10.3791/63984

⸱

6 lipca 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kolejno składanie rusztowania nano-matrycy podstawy Janusa (JBNm) warstwa po warstwie poprzez dodawanie nanorurek o zasadzie Janusa (JBNts), matriliny-3 i transformującego czynnika wzrostu beta-1 (TGF-β1). JBNm został wyprodukowany i scharakteryzowany; Dodatkowo wykazywał doskonałą bioaktywność, wspierając funkcje komórek, takie jak adhezja, proliferacja i różnicowanie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne rusztowania z biomateriałów zostały opracowane w celu kierowania adhezją i proliferacją komórek w nadziei na promowanie określonych funkcji do zastosowań in vitro i in vivo. Dodawanie czynników wzrostu do tych rusztowań biomateriałowych odbywa się na ogół w celu zapewnienia optymalnego środowiska hodowli komórek, pośredniczącego w różnicowaniu komórek i ich późniejszych funkcjach. Jednak czynniki wzrostu w konwencjonalnym rusztowaniu biomateriałowym są zazwyczaj zaprojektowane tak, aby były uwalniane po implantacji, co może skutkować niezamierzonymi skutkami ubocznymi dla otaczających tkanek lub komórek. W tym przypadku inspirowana DNA nanomatryca zasady Janusa (JBNm) z powodzeniem osiągnęła wysoce zlokalizowane mikrośrodowisko ze strukturą warstwa po warstwie dla samowystarczalnych konstruktów tkanki chrzęstnej. JBNm są samoorganizujące się z nanorurek podstawy Janusa (JBNts), matriliny-3 i transformującego czynnika wzrostu beta-1 (TGF-β1) poprzez powinowactwo biologiczne. JBNm został zmontowany w stosunku TGF-β1:matrilin-3:JBNt wynoszącym 1:4:10, ponieważ był to określony stosunek, w którym może nastąpić prawidłowy montaż w strukturze warstwa po warstwie. Najpierw roztwór TGF-β1 dodano do roztworu matryliny-3. Następnie mieszaninę tę odpipetowano kilka razy, aby zapewnić wystarczającą jednorodność przed dodaniem roztworu JBNt. W ten sposób uformowano warstwę po warstwie JBNm, po kilkukrotnym ponownym pipetowaniu. Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu scharakteryzowania struktury JBNm warstwa po warstwie, samych JBNts, samej matriliny-3 i TGF-β1. Powstawanie JBNm badano za pomocą widm absorpcyjnych UV-Vis, a strukturę JBNm obserwowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Ponieważ innowacyjne rusztowanie JBNm warstwa po warstwie jest formowane w skali molekularnej, można było zaobserwować JBNm znakowany barwnikiem fluorescencyjnym. TGF-β1 jest zamknięty w wewnętrznej warstwie wstrzykiwanego JBNm, co może zapobiegać uwalnianiu czynników wzrostu do otaczających obszarów, promować miejscową chondrogenezę i promować mikrośrodowisko antyprzerostowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rusztowania w inżynierii tkankowej odgrywają istotną rolę w dostarczaniu strukturalnego wsparcia dla przyłączania się komórek i późniejszego rozwoju tkanek1. Zazwyczaj konwencjonalne konstrukty tkankowe bez rusztowania opierają się na środowisku hodowli komórkowej i dodanych czynnikach wzrostu, które pośredniczą w różnicowaniu komórek. Co więcej, to dodawanie bioaktywnych cząsteczek do rusztowań jest często preferowanym podejściem do kierowania różnicowaniem i funkcją komórek2,3. Niektóre rusztowania mogą niezależnie naśladować biochemiczne mikrośrodowisko rodzimych tkanek, podczas gdy ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza JBNts

  1. Przygotowanie monomeru JBNt z wykorzystaniem wcześniej opublikowanych metod, obejmujących syntezę różnych związków12.
  2. Oczyść surowy monomer JBNt po jego zsyntetyzowaniu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy użyciu kolumny z odwróconymi fazami. Użyj rozpuszczalnika A: 100% wody, rozpuszczalnika B: 100% acetonitrylu i rozpuszczalnika C: roztworu wodnego HCl o pH = 1. Stosować natężenie przepływu 3 ml/min. Zebrać największy pik uzyskany w HPLC po 7,2 min.

2. Produkcja dla JBNt/Matn1/TGF-β1 (Wideo 1)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, JBNty zostały pomyślnie zsyntetyzowane i scharakteryzowane za pomocą absorpcji UV-Vis i TEM. JBNm to stałe rusztowanie do wstrzykiwań, które poddawane jest szybkiemu procesowi biomimetycznemu. Po dodaniu JBNt do mieszaniny roztworu TGF-β1/matryliny-3 w środowisku fizjologicznym, uformowano solidne rusztowanie o białej siatce, wskazujące na pomyślne złożenie JBNm, jak widać na Rysunek 1. Wykazano to w metodach charakteryzacji.

W warunkach fizjol.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania jest opracowanie biomimetycznej platformy rusztowania, JBNm, w celu przezwyciężenia ograniczeń konwencjonalnych konstruktów tkankowych, które opierają się na środowiskach hodowli komórkowych w celu pośredniczenia w różnicowaniu komórek. JBNm jest rusztowaniem strukturalnym warstwa po warstwie dla samowystarczalnej konstrukcji tkanki chrzęstnej. Innowacyjny projekt opiera się na nowatorskich nanomateriałach inspirowanych DNA, JBNt. JBNm, składający się z JBNts30, TGF-β1 i matrili.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Yupeng Chen jest współzałożycielem firm Eascra Biotech, Inc. i NanoDe Therapeutics, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty NIH 7R01AR072027 i 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 oraz University of Connecticut. Prace te są również częściowo wspierane przez S10OD016435 grantów NIH.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 % Normal Goat SerumThermo Fisher50062ZŚrodek stosowany do blokowania niespecyficznych działań wiążących przeciwciała podczas barwienia.
Płytka 24-dołkowaCorning07-200-740Płytka 24-dołkowa używana do porównawczej hodowli komórek.
384-dołkowa nieobrobiona płytkaThermo Fisher262260384-dołkowa płytka używana do pomiarów absorpcji.
Szkło nakrywkowe 8-dołkoweThermo Fisher155409PK8-dołkowe szkło nakrywcowe stosowane do porównawczych hodowli komórkowych.
96-dołkowa płaskapłytka Corning07-200-9196-dołkowa płytka używana do porównawczej hodowli komórkowej.
Płytka 96-dołkowa niepoddana działaniumetody Thermo Fisher26089596-dołkowa płytka używana do porównawczej hodowli komórkowej i analizy.
Agaroza GelSigma-AldrichA9539Hydrożel stosowany do hodowli komórkowych.
Agaroza GelSigma AldrichA9539Hydrożel stosowany jako środowisko do hodowli komórkowych.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) i A30007 (555)Barwnik fluorescencyjny używany do znakowania białek.
Przeciwciało Anti-Collagen XThermo Fisher41-9771-82Przeciwciało stosowane do barwienia kolagenu-X.
Maszyna do PCR Bio-RadBio-Radużywany do wykonywania PCR na próbkach.
C28 / I2 Komórki liniiużywane do analizy zdolności proliferacyjnych różnych próbek.
Zestaw do liczenia komórek 8Milipore Sigma96992Test proliferacji komórek.
Oprogramowanie Cell ProfilerBroad Institutesłużące do analizy obrazów komórek.
Sprzęt do mikrotomukriostatu używany do produkcji cienkich segmentów próbek do stosowania w barwieniu i mikroskopii.
DAPIInvitrogenD1306Niebieski barwnik fluorescencyjny, który wiąże się z regionami DNA adeniny-tyminy.
Kuwety jednorazoweFISHER Scientific14-955-128Pojemnik służący do spektrofotometrii.
DMEM Cell Culture MediumThermo Fisher10566032Media stosowane do wspomagania wzrostu komórek.
Płodowa surowica bydlęcaGIBCOA4766801Serum stosowane w pożywce do hodowli komórkowych w celu wspomagania wzrostu komórek.
Fluoromount-G Medium montażoweThermo Fisher00-4958-02Roztwór stosowany do montażu szkiełek do barwienia immunologicznego.
Związek formaldehydustosowany do utrwalania próbek przed mikrotomowaniem.
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowejPrzeciwciało wtórne Thermo FisherA16110stosowane do barwienia białek.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzysteLONZAPT-2501Komórki służące do analizy zdolności różnicowania różnych próbek.
Ludzka mezenchymalna pożywka chondrogenna łodygiLONZAPT-3003Pożywka komórkowa stosowana do promowania różnicowania chondrogennego.
ImageJNational Institutes of HealthOprogramowanie do analizy obrazu używane w połączeniu z mikroskopią.
itaq Uniwersalny SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit używany do PCR.
Nanorurki na zasadzie Janusa (JBNts)Nanorurki wykonane z syntetycznych zasad nukleotydowych, które działają jako rusztowanie komórkowe.
LaB6 20-120 kV Transmisyjny mikroskop elektronicznyTecnaiSprzęt używany do wykonywania transmisyjnej mikroskopii elektronowej na próbce.
MATLABMathWorksOprogramowanie statystyczne służące do modelowania i analizy danych.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Białko strukturalne stosowane jako miejsca adhezji chondrocytów.
Spektrofotometr NanoDropThermo FisherSprzęt służący do pomiaru wartości absorpcji próbki.
Mikroskop spektralny konfokalny Nikon A1R Mikroskop konfokalnyNikonA1R HD25służy do analizy próbek.
Numer 1,5 Komorowe szkło nakrywkoweThermo Fisher152250Środowisko do sterylnej hodowli komórek i obrazowania.
Optymalna temperatura cięcia Związek odczynnikowyZwiązek używany do osadzania komórek przed mikrotomowaniem.
ParaformaldehydThermo ScientificAAJ19943K2Związek stosowany do utrwalania komórek.
PDC-32G Plasma CleanerHarrick PlasmaCleaner służy do przygotowania siatek przed transmisyjną mikroskopią elektronową.
penicylina-streptomycynaGIBCO15-140-148Antybiotyk stosowany w celu zniechęcenia wzrostu bakterii podczas hodowli komórkowej.
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanemThermo Fisher10010023Używany do przemywania pożywki komórkowej i działa jako bufor podczas eksperymentów.
Rodamino-falloidynaInvitrogenR415F-aktyna czerwony barwnik fluorescencyjny.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Zestaw służy do filtrowania i homogenizacji próbek podczas ekstrakcji RNA.
sacharozyRoztwór stosowany do przetwarzania próbek przed mikrotomizacją.
Zestaw do testu ELISA dla ludzi TGF beta-1 ZestawoznaczaniaTGF-249-4 Zestaw testowy BMS249-4służący do oznaczania obecności TGF-β 1 w próbce.
TGF-β 1PEPROTECH100-21CCzynnik wzrostu stosowany do stymulacji różnicowania i proliferacji chondrogennej.
Triton-XInvitrogenHFH10Związek stosowany do lizy komórek, które nie są utrwalone podczas procesu barwienia.
Odczynnik TRIzolThermo Fisher15596026Odczynnik służący do izolacji RNA.
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalSprzęt służący do pomiaru wartości potencjału zeta próbki.
Sprzęt komórkowej chondrocytów Roztwór do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rusztowanie warstwa po warstwieenkapsulacja czynnik w wzrostubia ko matrylina 3TGF beta1nanorurki Janusadhezja kom rektransmisyjna mikroskopia elektronowamikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły