Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka nanomatrycy janus base warstwa po warstwie w celu wspomagania regeneracji chrząstki

DOI:

10.3791/63984

⸱

6 lipca 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kolejno składanie rusztowania nano-matrycy podstawy Janusa (JBNm) warstwa po warstwie poprzez dodawanie nanorurek o zasadzie Janusa (JBNts), matriliny-3 i transformującego czynnika wzrostu beta-1 (TGF-β1). JBNm został wyprodukowany i scharakteryzowany; Dodatkowo wykazywał doskonałą bioaktywność, wspierając funkcje komórek, takie jak adhezja, proliferacja i różnicowanie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne rusztowania z biomateriałów zostały opracowane w celu kierowania adhezją i proliferacją komórek w nadziei na promowanie określonych funkcji do zastosowań in vitro i in vivo. Dodawanie czynników wzrostu do tych rusztowań biomateriałowych odbywa się na ogół w celu zapewnienia optymalnego środowiska hodowli komórek, pośredniczącego w różnicowaniu komórek i ich późniejszych funkcjach. Jednak czynniki wzrostu w konwencjonalnym rusztowaniu biomateriałowym są zazwyczaj zaprojektowane tak, aby były uwalniane po implantacji, co może skutkować niezamierzonymi skutkami ubocznymi dla otaczających tkanek lub komórek. W tym przypadku inspirowana DNA nanomatryca zasady Janusa (JBNm) z powodzeniem osiągnęła wysoce zlokalizowane mikrośrodowisko ze strukturą warstwa po warstwie dla samowystarczalnych konstruktów tkanki chrzęstnej. JBNm są samoorganizujące się z nanorurek podstawy Janusa (JBNts), matriliny-3 i transformującego czynnika wzrostu beta-1 (TGF-β1) poprzez powinowactwo biologiczne. JBNm został zmontowany w stosunku TGF-β1:matrilin-3:JBNt wynoszącym 1:4:10, ponieważ był to określony stosunek, w którym może nastąpić prawidłowy montaż w strukturze warstwa po warstwie. Najpierw roztwór TGF-β1 dodano do roztworu matryliny-3. Następnie mieszaninę tę odpipetowano kilka razy, aby zapewnić wystarczającą jednorodność przed dodaniem roztworu JBNt. W ten sposób uformowano warstwę po warstwie JBNm, po kilkukrotnym ponownym pipetowaniu. Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu scharakteryzowania struktury JBNm warstwa po warstwie, samych JBNts, samej matriliny-3 i TGF-β1. Powstawanie JBNm badano za pomocą widm absorpcyjnych UV-Vis, a strukturę JBNm obserwowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Ponieważ innowacyjne rusztowanie JBNm warstwa po warstwie jest formowane w skali molekularnej, można było zaobserwować JBNm znakowany barwnikiem fluorescencyjnym. TGF-β1 jest zamknięty w wewnętrznej warstwie wstrzykiwanego JBNm, co może zapobiegać uwalnianiu czynników wzrostu do otaczających obszarów, promować miejscową chondrogenezę i promować mikrośrodowisko antyprzerostowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rusztowania w inżynierii tkankowej odgrywają istotną rolę w dostarczaniu strukturalnego wsparcia dla przyłączania się komórek i późniejszego rozwoju tkanek1. Zazwyczaj konwencjonalne konstrukty tkankowe bez rusztowania opierają się na środowisku hodowli komórkowej i dodanych czynnikach wzrostu, które pośredniczą w różnicowaniu komórek. Co więcej, to dodawanie bioaktywnych cząsteczek do rusztowań jest często preferowanym podejściem do kierowania różnicowaniem i funkcją komórek2,3. Niektóre rusztowania mogą niezależnie naśladować biochemiczne mikrośrodowisko rodzimych tkanek, podczas gdy inne mogą bezpośrednio wpływać na funkcje komórek poprzez czynniki wzrostu. Jednak badacze często napotykają wyzwania związane z wyborem rusztowań, które mogą pozytywnie wpływać na adhezję, wzrost i różnicowanie komórek, zapewniając jednocześnie optymalne wsparcie strukturalne i stabilność przez długi czas4,5. Bioaktywne cząsteczki są często luźno związane z rusztowaniem, co prowadzi do szybkiego uwalniania tych białek po implantacji, co skutkuje ich uwalnianiem w niepożądanych miejscach. Kulminacją tego są skutki uboczne dla tkanek lub komórek, które nie były celowo celem ataku6,7.

Rusztowania są zazwyczaj wykonane z materiałów polimerowych. Nano-matryca podstawy Janusa (JBNm) to biomimetyczna platforma rusztowania stworzona przy użyciu nowatorskiej metody warstwa po warstwie do samowystarczalnej konstrukcji tkanki chrzęstnej8. Te nowatorskie nanorurki inspirowane DNA zostały nazwane nanorurkami o zasadzie Janusa (JBNt), ponieważ prawidłowo naśladują strukturę i chemię powierzchni kolagenu znajdującego się w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Dzięki dodatkowi bioaktywnych cząsteczek, takich jak matrylina-3 i transformujący czynnik wzrostu beta-1 (TGF-β1), JBNm może stworzyć optymalne mikrośrodowisko, które może następnie stymulować pożądaną funkcjonalność komórek i tkanek9.

JBNts to nowe nanorurki pochodzące z syntetycznych wersji nukleozasady, adeniny i tyminy. Identyfikatory JBN są tworzone przez self-assembly10; Sześć syntetycznych zasad nukleotydowych łączy się, tworząc pierścień, a pierścienie te przechodzą π-π interakcje układania w stosy, tworząc nanorurkę o długości 200-300 μm11. Te nanorurki są strukturalnie podobne do białek kolagenowych; naśladując aspekt natywnego mikrośrodowiska chrząstki, wykazano, że JBNts zapewniają korzystne miejsce przyczepu dla chondrocytów i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSCs)11,12,13,14. Ponieważ nanorurki ulegają samoorganizacji i nie wymagają żadnego inicjatora (takiego jak światło UV), wykazują ekscytujący potencjał jako rusztowanie do wstrzykiwań dla trudno dostępnych obszarów defektów15.

Matrilin-3 to strukturalne białko macierzy zewnątrzkomórkowej występujące w chrząstce. Białko to odgrywa znaczącą rolę w chondrogenezie i prawidłowym funkcjonowaniu chrząstki16,17. Ostatnio został włączony do rusztowań biomateriałowych, zachęcając do chondrogenezy bez hipertrofii9,18,19. Poprzez włączenie tego białka do JBNm, komórki chrząstki są przyciągane do rusztowania, które zawiera podobne składniki do tego z ich rodzimego mikrośrodowiska. Dodatkowo wykazano, że matrylina-3 jest potrzebna do prawidłowej sygnalizacji TGF-β1 w chondrocytach20. Czynniki wzrostu działają jako cząsteczki sygnałowe, powodując specyficzny wzrost określonej komórki lub tkanki. Tak więc, aby osiągnąć optymalną regenerację chrząstki, matrylina-3 i TGF-β1 są niezbędnymi składnikami JBNm. Dodanie TGF-β1 do rusztowania warstwa po warstwie może dodatkowo wspomagać regenerację chrząstki w konstrukcie tkankowym. TGF-β1 jest czynnikiem wzrostu stosowanym w celu wspomagania procesu gojenia się wad kostno-chrzęstnych, pobudzając proliferację i różnicowanie chondrocytów i hMSC21,22. Tak więc TGF-β1 odgrywa kluczową rolę w regeneracji chrząstki JBNm (J/T/M JBNm)23, zachęcając do prawidłowego wzrostu, zwłaszcza gdy jest zlokalizowany w warstwach JBNm.

Jak wspomniano wcześniej, czynniki wzrostu są zazwyczaj montowane na zewnątrz rusztowań bez konkretnych metod ich włączania. W tym przypadku, dzięki precyzyjnie zaprojektowanej nanoarchitekturze biomateriałów, JBNm został opracowany z myślą o specyficznym ukierunkowaniu na zamierzone komórki i tkanki. JBNm składa się z TGF-β1 przylegającego do powierzchni JBNt w warstwie wewnętrznej i matryliny-3 przylegającego do powierzchni JBNt w warstwie zewnętrznej24,25. Włączenie TGF-β1 do wewnętrznej warstwy struktury warstwa po warstwie pozwala na wysoce zlokalizowane mikrośrodowisko wzdłuż włókien JBNm, tworząc homeostatyczny konstrukt tkankowy ze znacznie wolniejszym uwalnianiem białka12. Wstrzykiwalność JBNm sprawia, że jest to idealny konstrukt tkanki chrzęstnej do różnych przyszłych zastosowań biomateriałów26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza JBNts

  1. Przygotowanie monomeru JBNt z wykorzystaniem wcześniej opublikowanych metod, obejmujących syntezę różnych związków12.
  2. Oczyść surowy monomer JBNt po jego zsyntetyzowaniu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy użyciu kolumny z odwróconymi fazami. Użyj rozpuszczalnika A: 100% wody, rozpuszczalnika B: 100% acetonitrylu i rozpuszczalnika C: roztworu wodnego HCl o pH = 1. Stosować natężenie przepływu 3 ml/min. Zebrać największy pik uzyskany w HPLC po 7,2 min.

2. Produkcja dla JBNt/Matn1/TGF-β1 (Wideo 1)

UWAGA: Wideo 1 pokazuje, że JBNm jest wstrzykiwalnym ciałem stałym powstałym w środowisku fizjologicznym (roztwór wodny, brak światła UV, brak dodatków chemicznych i brak ogrzewania), które jest również inspirowane biologicznie.

  1. Dodać 8 μl 1 mg/ml TGF-β1 zawieszonego wH2Odo 32 μl 1 mg/ml matryliny-3 zawieszonego wH2O. Odpipetować, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie tych białek.
  2. Dodać 80 μl 1 mg/ml JBNts zawieszonych wH2Odo roztworu TGF-β1/matrilin-3. Kilkakrotnie pipetować, aby zapewnić prawidłowe mieszanie. Obecność białych kłaczków można zaobserwować natychmiast po dodaniu JBNts, co wskazuje na tworzenie się JBNm (Wideo 1).

3. Obserwacja próbek z absorpcją w ultrafiolecie widzialnym (UV-Vis)

UWAGA: Widma absorpcyjne UV-Vis zostały zbadane w celu scharakteryzowania montażu JBNm. Pomiar ten analizowano dla czterech kategorii: samych JBNts, samych matrilin-3, samych TGF-β1 oraz pełnego JBNm warstwa po warstwie, składającego się ze wszystkich trzech części. Wszystkie początkowe stężenia są zawieszone wH2O.

  1. W przypadku grupy JBNt dodać 5 μl 1 mg/ml JBNts do 50 μlH2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 90,9 μg/ml.
  2. W przypadku grupy matryliny-3 dodać 40 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 15 μlH2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,3 μg/ml.
  3. W przypadku grupy TGF-β1 dodać 10 μl 10 μg/ml TGF-β1 do 45 μlH2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1,8 μg/ml.
  4. Dla grupy JBNm dodać 40 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 10 μl 10 μg/mL TGF-β1. Mieszać, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie, a następnie dodać 5 μl 1 mg/ml JBNts do roztworu, kilkakrotnie pipetując w celu wymieszania próbki.
  5. Za pomocą spektrofotometru zmierz widmo absorpcyjne każdej grupy.

4. Pomiar potencjału Zeta próbek

UWAGA: Potencjał zeta został przeanalizowany, aby lepiej przewidzieć, w jaki sposób JBNm będzie oddziaływać z tkanką in vivo. Mierzono trzy grupy: samą matrilinę-3, matrylinę-3 z TGF-β1 i pełną warstwę po warstwie JBNm.

  1. W przypadku grupy matryliny-3 dodać 160 μl 10 mg/ml matryliny-3 do 640 μlH2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 800 μl.
  2. W przypadku związku matryliny-3/TGF-β1 dodać 160 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 40 μl 10 μg/ml TGF-β1. Kilkakrotnie pipetować, aby zapewnić odpowiednią jednorodność. Następnie dodaj go do 600 μlH2O, dając 800 μl roztworu.
  3. Dla grupy JBNm dodać 160 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 40 μl 10 μg/ml TGF-β1. Odpipetować kilka razy, aby wymieszać białka. Następnie dodaj 20 μl 1 mg/ml JBNts do roztworu i odpipetować, aby zapewnić jednorodność. Na koniec dodać roztwór JBNm do 580 μlH2O, aby uzyskać roztwór o objętości 800 μl.
  4. Zmierz wartości potencjału zeta dla trzech grup.

5. Przygotowanie nano-matrycy JBNt/matrilin-3 do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

UWAGA: Charakterystyka TEM jest wykonywana w celu scharakteryzowania morfologii JBNts i JBNm.

  1. Włóż dwie siatki do myjki plazmowej, aby prawidłowo oczyścić kratki przed ujemnym zabarwieniem JBNts i JBNm zgodnie z opublikowanymi protokołami i protokołami producenta12.
  2. Stwórz roztwór JBNt o stężeniu 200 μg/mL, mieszając 10 μl 1 mg/ml JBNts z 40 μl wody destylowanej.
  3. Wymieszać 30 μl 100 μg/ml matrilin-3 z 20 μl 100 μg/mL TGF-β1 i kilkakrotnie odpipetować. Dodać 10 μl 1 mg/ml JBNts do mieszaniny matrilin-3/TGF-β1 w celu przygotowania próbki JBNm. Ponownie kilkakrotnie pipetować.
  4. Dodać 3 μl roztworu JBNt (200 μg/ml) i 3 μl roztworu JBNm na oddzielnych rusztach i pozostawić na 2 minuty.
  5. Przepłukać każdą siatkę 100 μl roztworu octanu uranylu (0,5%). Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar roztworu i pozostaw kratki do wyschnięcia na powietrzu.
  6. Użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby prawidłowo obserwować i charakteryzować próbki, zgodnie z wcześniejszymi publikacjami11,12.

6. Pomiar widm absorpcyjnych białek znakowanych fluorescencyjnie

UWAGA: Struktura JBNm jest weryfikowana poprzez obserwację struktur JBNm za pomocą absorpcyjnej analizy spektralnej.

  1. Oznacz TGF-β1 za pomocą zestawu do znakowania białek zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 20 μl z 20 μg/ml oznaczonego TGF-β1 do 25 μlH2O, aby uzyskać roztwór testowy o stężeniu 8,9 μg/ml.
  2. Oznacz matrilin-3 za pomocą oddzielnego zestawu do etykietowania. Dodać 20 μl 80 μg/ml znakowanej matryliny-3 do 25 μlH2O, aby uzyskać roztwór testowy o stężeniu 36 μg/ml.
    UWAGA: Znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym TGF-β1 dało końcowe stężenie 20 μg/ml, podczas gdy znakowanie matriliny-3 dało końcowe stężenie 80 μg/ml.
  3. Zmieszaj 20 μl z 80 μg/ml znakowanego matrilin-3 z 20 μl 20 μg/ml znakowanego TGF-β1 i 5 μlH2O, otrzymując znakowany związek TGF-β1/matrilin-3. Odpipetuj mieszaninę kilka razy, aby wymieszać.
  4. Dodać 5 μl 1 mg/ml JBNts do 40 μlH2O, otrzymując roztwór o stężeniu 111 μg/ml.
  5. Dodać 20 μl z 20 μg/ml znakowanego TGF-β1 do 20 μl 80 μg/ml znakowanego matrilin-3 i kilkakrotnie pipetować. Dodać 5 μl 1 mg/ml JBNts do znakowanego roztworu TGF-β1/ matrilin-3 i kilkakrotnie pipetować, aby prawidłowo wymieszać związek.
    UWAGA: Końcowe stężenia JBNt, oznaczonego TGF-β1 i znakowanego matryliny-3 wynosiły odpowiednio 111 μg/ml, 8,9 μg/ml i 36 μg/ml.
  6. Przenieś każdą grupę próbek (tj. oznaczoną TGF-β1 (krok 6.1), oznaczoną matriliną-3 (krok 6.2), oznaczoną TGF-β1/matrilin-3 (krok 6.3), JBNts (krok 6.4), JBNm (krok 6.5)) do ich własnej studzienki na czarnej płytce 384-dołkowej.
  7. Załaduj czarną 384-dołkową płytkę do wielomodowego czytnika mikropłytek i wykonaj pomiary przy długościach fal wzbudzenia 488 nm i 555 nm zgodnie z protokołem producenta.

7. Test funkcji biologicznej in vitro

  1. Test adhezji komórek w komorach ze szkła nakrywkowego
    1. Przygotować dwie komorowe szkła nakrywkowe z pięcioma grupami próbek, ponieważ dla każdego typu komórki stosuje się jedno szkło nakrywkowe.
    2. Dodaj 1,25 μl 1 mg/ml JBNts do 198,75 μl wody destylowanej, otrzymując roztwór o stężeniu 6,25 μg/ml.
    3. Dodać 10 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 190 μl wody destylowanej, otrzymując roztwór o stężeniu 0,5 μg/ml.
    4. Dodać 2,5 μl 10 μg/ml TGF-β1 do 197,5 μg/ml wody destylowanej, co daje roztwór o stężeniu 0,125 μg/ml.
    5. W przypadku grupy JBNm dodać 10 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 2,5 μl 10 μg/mLTGF-β1 i kilkakrotnie pipetować. Dodać 1,25 μl JBNts o stężeniu 1 mg/ml do roztworu mieszaniny i odpipetować. Na koniec dodaj 186,25 μl wody destylowanej, aby uzyskać 200 μl roztworu JBNm.
      1. Dla grupy kontrolnej użyj 200 μl wody destylowanej.
    6. Dodaj każdą grupę próbek do osobnej studzienki z komorowym szkłem nakrywkowym nr 1,5. Umieść szkło nakrywkowe w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 godzinę, a następnie liofilizuj je za pomocą liofilizatora.
    7. Wysiewaj ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) i ludzkie komórki chondrocytów (10 000 komórek na studzienkę) do każdej studzienki przygotowanych komorowych szkieł nakrywkowych.
    8. Inkubować dwie szklanki nakrywkowe przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Następnie odessać pożywkę do hodowli komórkowej i dwukrotnie przepłukać PBS.
    9. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 5 minut, a następnie usuń i przepłucz próbki PBS. Przepłukać próbkę po raz drugi, aby całkowicie usunąć 4% paraformaldehydu.
    10. Inkubować komórki ze 100 μl 0,1% Triton-X przez 10 minut i przemywać PBS. Dodaj 100 μL 0,165 μM rodaminy-falloidyny do każdego dołka. Odczekaj 30 minut, a następnie ponownie umyj PBS.
    11. Dodaj 0,1 μg/ml DAPI do każdego dołka, aby zabarwić jądra. Odczekaj 5 minut i dwukrotnie przepłucz studzienki PBS.
    12. Użyj spektralnego mikroskopu konfokalnego, aby obserwować morfologię komórek i rejestrować obrazy fluorescencyjne.
    13. Ponadto przeanalizuj liczbę komórek i morfologię za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Otwórz oprogramowanie i załaduj obrazy. Dodaj podziałkę liniową i skalibruj oprogramowanie. Policz liczbę komórek w danym obszarze dla każdej próbki. Następnie użyj narzędzia pomiarowego, aby zebrać dane dotyczące morfologii komórki dla każdej próbki.
  2. Proliferacja komórek
    1. Przygotować trzy niepoddane działaniu 96-dołkowe płytki, dodając do każdej z nich pięć grup próbek.
      1. W przypadku grupy JBNt dodać 3,75 μl 1 mg/ml JBNts do 596,25 μl wody destylowanej, otrzymując 600 μl roztworu JBNt o stężeniu 6,25 μg/ml.
      2. W przypadku grupy TGF-β1 dodać 7,5 μl 10 μg/ml TGF-β1 do 592,5 μl wody destylowanej, otrzymując roztwór testowy o stężeniu 0,125 μg/ml.
      3. W przypadku grupy matryliny-3 dodać 30 μl 10 μg/ml matriliny-3 do 570 μl wody destylowanej, otrzymując roztwór testowy o stężeniu 0,5 μg/ml.
      4. W przypadku grupy JBNm zmieszać 7,5 μl z 10 μg/ml TGF-β1 z 30 μl 10 μg/ml matrilin-3 i kilkakrotnie odpipetować, a następnie dodać 3,75 μl 1 mg/ml JBNts do roztworu.
      5. Rozcieńczyć roztwór JBNm w 558,75 μl wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 6,25 μg/mL, 0,125 μg/ml i 0,5 μg/ml dla próbek JBNt, TGF-β1 i matrilin-3.
      6. Dla grupy kontrolnej użyj 600 μl wody destylowanej.
    2. Podzielić każdą grupę próbek na sześć dołków (100 μl próbki na studzienkę).
    3. Umieścić trzy płytki zawierające wszystkie próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 godzinę, a następnie liofilizować za pomocą przyrządu do liofilizacji.
    4. Wysiewaj hMSC na tych płytkach, z których każda otrzymuje 100 μl zawiesiny komórek (na studzienkę) zawierającej 5000 komórek. Inkubować trzy płytki w temperaturze 37 °C przez 1 dzień, 3 dni lub 5 dni w temperaturze 5% CO2 .
    5. Dodać 10 μl roztworu CCK-8 do każdej studzienki z komórkami i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 2 godziny.
    6. Zmierz wartości absorpcji każdej studzienki za pomocą wielomodowych czytników mikropłytek przy długości fali 450 nm.
    7. Wysiewać znany gradient hMSC na 96-dołkową płytkę i inkubować przez 4 godziny. Użyj testu CCK-8, aby zmierzyć wartości absorpcji znanej liczby komórek i wygenerować krzywą standardową.
    8. Oblicz proliferację komórek przy użyciu krzywej wzorcowej absorpcji.
  3. Test stabilności
    UWAGA: Ludzki zestaw ELISA ukierunkowany na TGF-β1 został użyty do określenia procentowego uwalniania TGF-a1 z JBNm w hydrożelu agarozowym.
    1. Przygotuj 2% agarozy, dodając 400 mg proszku agarozy do 20 ml PBS i podgrzewając go do 100 °C, aby całkowicie rozpuścić proszek agarozy.
    2. Przygotuj JBNm w schłodzonym 2% hydrożelu agarozowym.
      1. Połącz 10 μl z 10 μg/ml TGF-β1, 40 μl z 10 μg/ml matryliny-3, 5 μl z 1 mg/ml JBNts i 195 μl PBS. Wymieszaj ten roztwór z 250 μl 2% agarozy, tworząc hydrożel JBNm.
    3. Dodaj 500 μl PBS, używając go jako roztworu antyadhezyjnego i pamiętaj, aby wymieniać go co 3 dni. Zachowaj każdy uwolniony roztwór i pozostaw próbkę na 15 dni.
    4. Użyj zestawu ELISA, aby przetestować każde z przechwyconych roztworów uwalniających, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Odejmując ilość TGF-β1 uwolnionego w PBS od teoretycznej wartości obciążenia wynoszącej 100%, można określić pozostałą ilość TGF-β1.
  4. Analiza różnicowania komórek za pomocą PCR26.
    1. Przygotować siedem grup próbek, z których każda zawiera 20 μl zawiesiny komórek (4 x 104 komórek), 30 μl specyficznego roztworu (lub PBS, w zależności od grupy próbki) i 50 μl 2 % wag. agarozy.
      1. W przypadku grupy TGF-β1 dodaj 5 μl 10 μg/ml TGF-β1 do 25 μl PBS, co daje roztwór o stężeniu 1,6 μg/ml.
      2. W przypadku grupy matryliny-3 dodać 20 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 10 μl PBS, co daje roztwór o stężeniu 6,7 μg/ml.
      3. W przypadku grupy JBNt dodaj 2,5 μl 1 mg/ml JBNts do 27,5 μl PBS, co daje roztwór o stężeniu 83,3 μg/ml.
      4. W przypadku grupy J/T/M JBNm dodać 10 μl 10 μg/ml matryliny-3 do 5 μl 10 μg/ml TGF-β1 i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać roztwór. Następnie dodać 2,5 μl 1 mg/ml JBNts i ponownie odpipetować. Na koniec rozcieńczyć 2,5 μl PBS.
      5. Dla każdej grupy kontrolnej należy użyć 30 μl PBS jako próbki.
    2. Dodaj 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki, pamiętając o jej wymianie co 3 dni.
      1. W przypadku pozytywnej grupy kontrolnej należy użyć dostępnej w handlu pożywki chondrogennej hMSC zawierającej dodatek TGF-β1. Ten dodatkowy TGF-β1 jest równy ilości zarówno w grupach TGF-β1, jak i J/T/M JBNm.
      2. W przypadku jednej z ujemnych grup kontrolnych należy użyć komercyjnej pożywki chondrogenicznej hMSC, która nie zawiera TGF-β1. W przypadku drugiej grupy kontroli ujemnej należy użyć pożywki do hodowli komórek DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
      3. Dla każdej innej grupy należy użyć komercyjnej pożywki do hodowli komórek chondrogennych hMSC bez TGF-β1.
    3. Hoduj próbki przez 15 dni.
    4. Wyekstrahuj RNA próbek i wykonaj PCR, aby zbadać zróżnicowanie próbek, jak opisano wcześniej26.
  5. Barwienie immunologiczne w teście ekspresji kolagenu typu X
    1. Przygotować siedem próbek na bazie agarozy w taki sam sposób, jak w przypadku różnicowania komórek, w rozdziale dotyczącym metody PCR (krok 7.4).
    2. Hoduj próbki przez 15 dni.
    3. Utrwalić próbki 4% formaldehydem przez 1 dzień, namoczyć w 30% roztworze sacharozy przez noc, a następnie zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C z ciekłym azotem. Utrwalić próbki za pomocą odczynnika złożonego o optymalnej temperaturze skrawania (OCT), mieszaniny rozpuszczalnych w wodzie glikoli i żywic, w temperaturze -10 °C.
    4. Użyć mikrotomu kriostatu, aby uzyskać zamrożone fragmenty każdej próbki o grubości 20 μm.
    5. Wybarwić każdą sekcję przeciwciałem Anti-Collagen X o rozcieńczeniu 1:800 i fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym PBS, zgodnie z protokołami producenta.
    6. Obserwuj każdą sekcję za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając wzbudzenia 488 nm i 40-krotnego powiększenia na okularze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, JBNty zostały pomyślnie zsyntetyzowane i scharakteryzowane za pomocą absorpcji UV-Vis i TEM. JBNm to stałe rusztowanie do wstrzykiwań, które poddawane jest szybkiemu procesowi biomimetycznemu. Po dodaniu JBNt do mieszaniny roztworu TGF-β1/matryliny-3 w środowisku fizjologicznym, uformowano solidne rusztowanie o białej siatce, wskazujące na pomyślne złożenie JBNm, jak widać na Rysunek 1. Wykazano to w metodach charakteryzacji.

W warunkach fizjol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania jest opracowanie biomimetycznej platformy rusztowania, JBNm, w celu przezwyciężenia ograniczeń konwencjonalnych konstruktów tkankowych, które opierają się na środowiskach hodowli komórkowych w celu pośredniczenia w różnicowaniu komórek. JBNm jest rusztowaniem strukturalnym warstwa po warstwie dla samowystarczalnej konstrukcji tkanki chrzęstnej. Innowacyjny projekt opiera się na nowatorskich nanomateriałach inspirowanych DNA, JBNt. JBNm, składający się z JBNts30, TGF-β1 i matrili...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Yupeng Chen jest współzałożycielem firm Eascra Biotech, Inc. i NanoDe Therapeutics, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty NIH 7R01AR072027 i 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 oraz University of Connecticut. Prace te są również częściowo wspierane przez S10OD016435 grantów NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 % Normal Goat SerumThermo Fisher50062ZŚrodek stosowany do blokowania niespecyficznych działań wiążących przeciwciała podczas barwienia.
Płytka 24-dołkowaCorning07-200-740Płytka 24-dołkowa używana do porównawczej hodowli komórek.
384-dołkowa nieobrobiona płytkaThermo Fisher262260384-dołkowa płytka używana do pomiarów absorpcji.
Szkło nakrywkowe 8-dołkoweThermo Fisher155409PK8-dołkowe szkło nakrywcowe stosowane do porównawczych hodowli komórkowych.
96-dołkowa płaskapłytka Corning07-200-9196-dołkowa płytka używana do porównawczej hodowli komórkowej.
Płytka 96-dołkowa niepoddana działaniumetody Thermo Fisher26089596-dołkowa płytka używana do porównawczej hodowli komórkowej i analizy.
Agaroza GelSigma-AldrichA9539Hydrożel stosowany do hodowli komórkowych.
Agaroza GelSigma AldrichA9539Hydrożel stosowany jako środowisko do hodowli komórkowych.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) i A30007 (555)Barwnik fluorescencyjny używany do znakowania białek.
Przeciwciało Anti-Collagen XThermo Fisher41-9771-82Przeciwciało stosowane do barwienia kolagenu-X.
Maszyna do PCR Bio-RadBio-Radużywany do wykonywania PCR na próbkach.
C28 / I2 Komórki liniiużywane do analizy zdolności proliferacyjnych różnych próbek.
Zestaw do liczenia komórek 8Milipore Sigma96992Test proliferacji komórek.
Oprogramowanie Cell ProfilerBroad Institutesłużące do analizy obrazów komórek.
Sprzęt do mikrotomukriostatu używany do produkcji cienkich segmentów próbek do stosowania w barwieniu i mikroskopii.
DAPIInvitrogenD1306Niebieski barwnik fluorescencyjny, który wiąże się z regionami DNA adeniny-tyminy.
Kuwety jednorazoweFISHER Scientific14-955-128Pojemnik służący do spektrofotometrii.
DMEM Cell Culture MediumThermo Fisher10566032Media stosowane do wspomagania wzrostu komórek.
Płodowa surowica bydlęcaGIBCOA4766801Serum stosowane w pożywce do hodowli komórkowych w celu wspomagania wzrostu komórek.
Fluoromount-G Medium montażoweThermo Fisher00-4958-02Roztwór stosowany do montażu szkiełek do barwienia immunologicznego.
Związek formaldehydustosowany do utrwalania próbek przed mikrotomowaniem.
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowejPrzeciwciało wtórne Thermo FisherA16110stosowane do barwienia białek.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzysteLONZAPT-2501Komórki służące do analizy zdolności różnicowania różnych próbek.
Ludzka mezenchymalna pożywka chondrogenna łodygiLONZAPT-3003Pożywka komórkowa stosowana do promowania różnicowania chondrogennego.
ImageJNational Institutes of HealthOprogramowanie do analizy obrazu używane w połączeniu z mikroskopią.
itaq Uniwersalny SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit używany do PCR.
Nanorurki na zasadzie Janusa (JBNts)Nanorurki wykonane z syntetycznych zasad nukleotydowych, które działają jako rusztowanie komórkowe.
LaB6 20-120 kV Transmisyjny mikroskop elektronicznyTecnaiSprzęt używany do wykonywania transmisyjnej mikroskopii elektronowej na próbce.
MATLABMathWorksOprogramowanie statystyczne służące do modelowania i analizy danych.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Białko strukturalne stosowane jako miejsca adhezji chondrocytów.
Spektrofotometr NanoDropThermo FisherSprzęt służący do pomiaru wartości absorpcji próbki.
Mikroskop spektralny konfokalny Nikon A1R Mikroskop konfokalnyNikonA1R HD25służy do analizy próbek.
Numer 1,5 Komorowe szkło nakrywkoweThermo Fisher152250Środowisko do sterylnej hodowli komórek i obrazowania.
Optymalna temperatura cięcia Związek odczynnikowyZwiązek używany do osadzania komórek przed mikrotomowaniem.
ParaformaldehydThermo ScientificAAJ19943K2Związek stosowany do utrwalania komórek.
PDC-32G Plasma CleanerHarrick PlasmaCleaner służy do przygotowania siatek przed transmisyjną mikroskopią elektronową.
penicylina-streptomycynaGIBCO15-140-148Antybiotyk stosowany w celu zniechęcenia wzrostu bakterii podczas hodowli komórkowej.
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanemThermo Fisher10010023Używany do przemywania pożywki komórkowej i działa jako bufor podczas eksperymentów.
Rodamino-falloidynaInvitrogenR415F-aktyna czerwony barwnik fluorescencyjny.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Zestaw służy do filtrowania i homogenizacji próbek podczas ekstrakcji RNA.
sacharozyRoztwór stosowany do przetwarzania próbek przed mikrotomizacją.
Zestaw do testu ELISA dla ludzi TGF beta-1 ZestawoznaczaniaTGF-249-4 Zestaw testowy BMS249-4służący do oznaczania obecności TGF-β 1 w próbce.
TGF-β 1PEPROTECH100-21CCzynnik wzrostu stosowany do stymulacji różnicowania i proliferacji chondrogennej.
Triton-XInvitrogenHFH10Związek stosowany do lizy komórek, które nie są utrwalone podczas procesu barwienia.
Odczynnik TRIzolThermo Fisher15596026Odczynnik służący do izolacji RNA.
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalSprzęt służący do pomiaru wartości potencjału zeta próbki.
Sprzęt komórkowej chondrocytów Roztwór do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106(2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317(2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590(2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823(2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676(2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670(2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147(2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rusztowanie warstwa po warstwieenkapsulacja czynnik w wzrostubia ko matrylina 3TGF beta1nanorurki Janusadhezja kom rektransmisyjna mikroskopia elektronowamikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły