Trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą CUBIC

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę oczyszczania tkanek i barwienie immunofluorescencyjne w całości do trójwymiarowego (3D) obrazowania nerek. Technika ta może zaoferować makroskopowe perspektywy w patologii nerek, prowadząc do nowych odkryć biologicznych.

Streszczenie

Chociaż konwencjonalna patologia dostarczyła wielu informacji na temat mikrostruktury nerek, trudno było poznać dokładną strukturę naczyń krwionośnych, kanalików proksymalnych, przewodów zbiorczych, kłębuszków nerkowych i nerwów współczulnych w nerkach z powodu braku trójwymiarowych (3D) informacji. Oczyszczanie optyczne jest dobrą strategią pokonania tej dużej przeszkody. Wiele komórek w całym narządzie można analizować w rozdzielczości pojedynczej komórki, łącząc oczyszczanie tkanek i technikę obrazowania 3D. Jednak metody znakowania komórek do obrazowania całego narządu pozostają słabo rozwinięte. W szczególności barwienie całych narządów jest trudne ze względu na trudności w penetracji przeciwciał. W niniejszym protokole opracowano barwienie nerek myszy w całości do obrazowania 3D za pomocą metody oczyszczania tkanek CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Protokół umożliwił wizualizację odnerwienia współczulnego nerek po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym i powiększeniu kłębuszków nerkowych we wczesnym stadium cukrzycowej choroby nerek z kompleksowego punktu widzenia. W związku z tym technika ta może prowadzić do nowych odkryć w badaniach nad nerkami, zapewniając perspektywę makroskopową.

Wprowadzenie

Nerka składa się z różnych populacji komórek. Chociaż konwencjonalna patologia dostarcza nam wielu informacji na temat mikrośrodowiska nerek, obrazowanie trójwymiarowe (3D) jest potrzebne, aby dokładnie zrozumieć przesłuchy międzykomórkowe podczas progresji choroby nerek. W przeszłości konieczne było wykonanie ogromnej liczby seryjnych cięć i rekonstrukcji obrazu dla obrazowania 3D całego narządu¹. Metoda ta wymagała jednak zbyt dużego wysiłku i wiązała się z problemami pod względem odtwarzalności.

Oczyszczanie optyczne jest dobrą strategią na pokonanie tej przeszkody^2,3. Zmętnienie tkanek wynika głównie z rozpraszania i absorpcji światła, ponieważ każdy narząd składa się z różnych substancji, w tym wody, białka i lipidów. Tak więc podstawową strategią oczyszczania tkanek jest zastąpienie wody i lipidów w tkankach odczynnikami dopasowującymi współczynnik załamania światła (RI), które mają takie same właściwości optyczne jak białka⁴. Aby zaobserwować przezroczystą próbkę, przydatna jest mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkusza świetlnego⁵. Arkusze świetlne oświetlają przezroczystą próbkę z boku, a sygnały wzbudzenia są odbierane przez soczewkę obiektywu umieszczoną w pozycji pionowej⁶. Mikroskopia ta uzyskuje informacje o przekroju poprzecznym w jednym przemiataniu, co różni się od konfokalnej lub wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej. Dzięki temu może szybko pozyskiwać obrazy z-stack przy niskim poziomie fotowybielania.

Clear, Unstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) to jedna z metod oczyszczania tkanek, która umożliwia obrazowanie całego narządu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego^2,7,8. Barwienie immunofluorescencyjne CUBIC i całe mocowanie jest zoptymalizowane w niniejszym badaniu w celu wizualizacji struktur 3D nerek myszy^9,10,11. Korzystając z tej metody barwienia całościowego, wizualizuje się zmiany w nerkowych nerkach współczulnych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym^9,10 i kłębuszkowe powiększenie we wczesnym stadium cukrzycowej choroby nerek¹¹, a także naczynia krwionośne, kanaliki proksymalne i przewody zbiorcze w całej nerce⁹.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Tokijskiego. Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL / 6NJcl w wieku 8 tygodni. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie zwierząt i fiksacja nerek

1. Wykonaj utrwalenie perfuzji, wykonując poniższe czynności.
   1. Znieczulić mysz poprzez inhalację izofluranu (3%, 2,0 l/min) i dootrzewnowe podanie chlorowodorku medetomidyny (0,3 mg/kg), winianu butorfanolu (5 mg/kg) i midazolamu (4 mg/kg) (patrz tabela materiałów).
   2. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z 20 ml PBS (pH 7,4) i 30 ml 4% PFA w buforze fosforanowym (PB) przez lewą komorę serca¹².
2. Wykonaj utrwalanie przez zanurzenie zaraz po fiksacji perfuzyjnej i pobraniu próbek nerki⁹.
   1. Zanurz nerkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C na dodatkowe 16 godzin, a następnie myj ją PBS przez 2 godziny (trzy razy)⁹ (Rysunek 1).
      UWAGA: Formaldehyd i paraformaldehyd są toksycznymi substancjami drażniącymi. Z odczynnikami należy obchodzić się pod wyciągiem z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

2. Odbarwianie i delipidacja

1. Przygotuj CUBIC-L do odbarwiania i delipidacji składającego się z 10% wagowych Triton X-100 i 10% wagowych N-butylodietanoloaminy (patrz Tabela Materiałów), zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami^4,8,9.
2. Wykonaj odbarwianie i delipidację za pomocą CUBIC-L, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Zanurz utrwaloną nerkę w 7 ml 50% (v/v) CUBIC-L (mieszanina wody i CUBIC-L 1:1) w probówce o okrągłym dnie 14 ml (patrz Tabela materiałów) z delikatnym potrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 6 godzin (Rysunek 2A). Następnie zanurzyć go w 7 ml CUBIC-L w 14 ml probówce z okrągłym dnem, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 5 dni.
   2. Podczas tego procesu codziennie odświeżaj CUBIC-L. Po procesie odbarwiania i delipidacji płucz nerkę PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (trzy razy)⁹ (Rysunek 1). Użyj łyżki dozującej do przenoszenia próbki (Rysunek 2B).

3. Barwienie immunofluorescencyjne w całości

1. Przygotuj do barwienia.
   1. Przygotować bufor barwiący dla przeciwciał pierwszorzędowych, mieszając 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% kazeiny w PBS i 0,05% azydku sodu⁹.
   2. Przygotować bufor barwiący dla przeciwciał drugorzędowych, mieszając 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% kazeiny w PBS i 0,05% azydku sodu⁹.
2. Wykonaj barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi.
   1. Wybarwić immunologicznie zdelipidowaną nerkę przeciwciałami pierwszorzędowymi (1:100 lub 1:200, patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 7 dni.
      UWAGA: Ilość buforu barwiącego potrzebna na jedną nerkę wynosi 500-600 μL (Rysunek 2C).
   2. Płucz nerkę 0,5% (v/v) Triton X-100 w PBS (PBST) w temperaturze pokojowej przez 1 dzień⁹ (Rysunek 1).
3. Wykonaj barwienie przeciwciałami wtórnymi.
   1. Wybarwić immunologicznie nerkę przeciwciałami drugorzędowymi (1:100 lub 1:200, patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 7 dni. Myj nerkę PBST w temperaturze pokojowej przez 1 dzień⁹ (Rysunek 1).
   2. Po utrwaleniu⁹, zanurz nerkę w 1% formaldehydzie w PB (mieszanina 1:36 37% formaldehydu i PB) na 3 godziny i przemyj ją PBS w temperaturze pokojowej przez 6 godzin (Rysunek 1).

4. Dopasowanie współczynnika załamania światła (RI)

1. Przygotuj CUBIC-R+.
   1. Przygotować CUBIC-R, mieszając 45% wag. 2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolonu/antypiryny i 30% wag. nikotynamidu (patrz tabela materiałów).
   2. Przygotuj CUBIC-R+ do dopasowania indeksu załamania światła (RI), dodając 0,5 v% N-butylodietanoloaminy do CUBIC-R zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami^4,8,9.
2. Wykonaj dopasowywanie wystąpień zarezerwowanych.
   1. Zanurz nerkę w 7 ml 50% (v/v) CUBIC-R+ (mieszanina wody i CUBIC-R+ w stosunku 1:1) w probówce o okrągłym dnie o pojemności 14 ml, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 dzień. Następnie zanurz go w 7 ml CUBIC-R+ w 14 ml probówce z okrągłym dnem, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 2 dni⁹ (Rysunek 1).
      UWAGA: Chociaż nerka unosi się w 50% CUBIC-R+ na początku dopasowania RI, opada i staje się przezroczysta w CUBIC-R+ pod koniec procesu (Rysunek 2D).

5. Akwizycja i rekonstrukcja obrazu

1. Zanurz nerkę dopasowaną do RI w mieszaninie oleju silikonowego (RI = 1,555) i oleju mineralnego (RI = 1,467) (55:45) podczas akwizycji obrazu (RI = 1,51)⁵ (Rysunek 3).
2. Uzyskaj obrazy 3D całej nerki za pomocą specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego ⁹ (patrz Tabela materiałów). Zbierz wszystkie nieprzetworzone dane obrazu w 16-bitowym formacie TIFF. Wizualizuj i przechwytuj obrazy renderowane w 3D za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania (Imaris, patrz tabela materiałów).

Wyniki

Korzystając z tej metody barwienia, zwizualizowano nerwy współczulne [przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynowej (TH)] i tętnice [przeciwciało przeciw aktynie mięśni gładkich przeciwko α (αSMA)] w całej nerce (Rysunek 4A,B i Wideo 1)⁹. Nieprawidłowe nerwy współczulne nerek zostały również uwidocznione po uszkodzeniu niedokrwiennym/reperfuzyjnym (IRI)^9,10 (Rysunek...

Dyskusja

Obecny protokół pozwolił na obrazowanie 3D całej nerki różnych struktur, takich jak nerwy współczulne, przewody zbiorcze, tętnice, kanaliki proksymalne i kłębuszki nerkowe ^9,10,11. Ta metoda barwienia umożliwiła obserwację makroskopową i doprowadziła do nowych odkryć biologicznych, poprzez wizualizację zmian w nerkach współczulnych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym ^9,10

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
14 ml probówka PP o okrągłym dnie o wysokiej przejrzystości	Falcon	352059	Oczyszczanie tkanek, barwienie, mycie
2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolon/antypiryna	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-roztwór formaldehydu	Nacalai Tesque	16223-55	Po utrwaleniu
4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu	Nacalai Tesque	09154-85	Fiksacja nerek
Alexa Mąka 555-sprzężone przeciwciało IgG przeciwko owcom	Invitrogen	A-21436	Przeciwciało drugorzędowe (1:100)
Mąka Alexa 647-sprzężone przeciwciało IgG przeciwko królikowi osłu	Invitrogen	A-31573	Przeciwciało drugorzędowe (1:200)
Przeciwciało anty-akwaporyny 2 (AQP2)	Abcam	ab199975	Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)
Przeciwciało anty-podocyny	Sigma-Aldrich	P0372	Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)
Przeciwciało anty-sodowo-glukozowo-glukozowe 2 (SGLT2)	Abcam	ab85626	Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynowej (TH)	Abcam	ab113	Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)
Przeciwciało anty-&alfa--aktynowe mięśni gładkich (&alfa;-SMA)	Abcam	ab5694	Przeciwciało pierwszorzędowe (1:200)
Kazeina blokująca w PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Bufor barwiący
Winian butorfanolu	Meiji	005526	Znieczulenie
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	Nie dotyczy	Szczep myszy
Imaris	Bitplane	N/A	Oprogramowanie do analizy obrazowania
Mikroskop makro-zoom	OLYMPUS	MVX10	Jednostka obserwacyjna specjalnie zbudowanego mikroskopu
Chlorowodorek medetomidyny	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Środek znieczulający
Midazolam	SANDOZ	27803229	Znieczulający
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M8410	Olejek immersyjny
N-butylodietanoloamina	Tokio Przemysł chemiczny	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nikotynamid	Tokio Przemysł chemiczny	N0078	CUBIC-R +
eter mono-p-izooktylofenylowy glikolu polietylenowego / Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Olej silikonowy HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Olejek immersyjny
Azydek sodu	Wako	195-11092	Bufor do barwienia