Artykuł metodologiczny

Transmisyjna mikroskopia elektronowa: narzędzie do patologii chirurgicznej nerwiaka zarodkowego

DOI:

10.3791/63994

⸱

6 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anatomic Pathology Division of EORLA, Children's Hospital of Eastern Ontario, University of Ottawa, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Alberta, 3Department of Pediatrics, University of Alberta, Stollery Children's Hospital, 4Department of Orthopedics, Tianyou Hospital, Wuhan University of Science and Technology, 5Institute of Pathology, Medical University of Innsbruck

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe okrągłe guzy niebieskokrwinkowe u dzieci to intrygujący i wymagający zbiór nowotworów. Dlatego transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i profesjonalna wiedza na temat nowotworów dziecięcych mogą być niezwykle cenne w patologii chirurgicznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania TEM w celu rozpoznania nerwiaka zarodkowego, jednego z najczęstszych guzów litych w dzieciństwie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe okrągłe guzy niebieskokrwinkowe u dzieci (PSRBCT) to intrygujący i wymagający zbiór nowotworów. Mikroskopia świetlna małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych identyfikuje małe okrągłe komórki. Posiadają ogólnie hiperchromatyczne jądro i stosunkowo skąpą cytoplazmę zasadochłonną. Małe okrągłe guzy niebieskokrwinkowe u dzieci obejmują kilka jednostek. Zwykle obejmują między innymi guz Wilmsa, nerwiaka zarodkowego, mięsaka prążkowanokomórkowego, mięsaka Ewinga, siatkówczaka, chłoniaka i kostniakomięsaka drobnokomórkowego. Nawet przy użyciu immunohistochemii diagnostyka różnicowa tych nowotworów może być kontrowersyjna w mikroskopii świetlnej. Słabe zabarwienie lub niejednoznaczne tło może zniechęcić patologów do podjęcia właściwej decyzji diagnostycznej. Ponadto biologia molekularna może dostarczyć przytłaczającej ilości danych trudnych do ich odróżnienia, a niektóre translokacje można zaobserwować w więcej niż jednej kategorii. W związku z tym transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) może być niezwykle cenna. W tym miejscu kładziemy nacisk na nowoczesny protokół danych TEM nerwiaka zarodkowego. Komórki nowotworowe ze splątkami procesów cytoplazmatycznych zawierających ziarnistości neurowydzielnicze mogą diagnozować nerwiaka zarodkowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca patologa może być dość trudna zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i na polach badawczych. Ewolucja mikroskopii świetlnej w XVIIIi XIX wieku była niezwykła. Moc mikroskopu elektronowego zależy przede wszystkim od długości fali elektronów, która jest krótsza od światła1,2,3. Przed pojawieniem się przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych oraz ich zastosowaniem w immunohistochemii, TEM odgrywał znaczącą rolę w diagnozowaniu małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych.

Począwszy od lat 90-tych ubiegłego wieku, podejście immunohistochemiczne zastąpiło narzędzie morfologiczne w diagnostyce4. Obecnie istnieją tysiące nowych przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom grupy małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych4,6,7,8. Wydaje się, że w ostatniej dekadzie bardzo płodnego XX wieku i pierwszej dekadzie początku XXI wieku biologia molekularna, w tym fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, od sond genomowych po sekwencjonowanie nowej generacji, wyparła znaczącą rolę aplikacyjną immunohistochemii w kilku laboratoriach4. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA), kanadyjska Kanadyjska Agencja Kontroli Żywności (CFIA), Agencja Ochrony Środowiska (EPA) lub podobne organy rządowe w innych krajach nie zawsze zatwierdzają protokoły biologii molekularnej9. Wygląda na to, że jest wiele informacji dość trudnych do umieszczenia w raporcie patomorfologicznym, które można wykorzystać do celów terapeutycznych, a wybór dobrze finansowanego i działającego systemu informacji laboratoryjnej jest krytyczny10. W międzyczasie immunohistochemia ujawniła liczne pułapki, w tym guzy nabłonkowe wykazujące markery mezenchymalne i odwrotnie11. Przejście nabłonkowo-mezenchymalne pomyliło niektóre granice w grupach patologicznych12,13. W ciągu ostatnich kilku lat stało się oczywiste, że mikroskopia elektronowa rozkwitła w kilku laboratoriach na całym świecie14. W szczególności czas oczekiwania na wytworzenie próbek tkanek skrócił się z tygodni do zaledwie 3 dni lub nawet krócej przy użyciu kilku protokołów zbliżających się do barwienia przeciwciałami monoklonalnymi lub poliklonalnymi4,10.

Ponadto, zastosowanie elektronicznej kamery sprzężonej z mikroskopem elektronowym pomogło patologom uzyskać szybki obraz, który jest uniwersalny w różnych systemach operacyjnych. Wreszcie, niektóre przeciwciała, nawet po pobraniu antygenu, są trudne do ujawnienia w niektórych obszarach martwicy lub zmian związanych z autofagią/niedokrwieniem. Jednocześnie, mikroskopia elektronowa w bezpiecznych rękach może nadal dostarczać doskonałych wyników i wskazówek dotyczących prawidłowej klasyfikacji nieznanych nowotworów patologicznych15.

Dziecięca grupa małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych obejmuje kilka nowotworów, głównie nerwiaka zarodkowego, guza Wilmsa lub nerczaka, mięsaka prążkowanokomórkowego i mięsaka Ewinga. Dane z biologii molekularnej w odniesieniu do pediatrycznej grupy małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych mogą być przytłaczające ze względu na zastosowane techniki. Małe okrągłe niebieskie krwinki mogą nie różnić się zbytnio w rutynowych barwieniach (barwienie hematoksyliną i eozyną), a niektóre nowotwory mogą mieć nieprawidłowe cechy immunofenotypowe. Postępy w biologii molekularnej są ogromne od czasu odkrycia TEM. W grupie małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych niektóre nowotwory mogą być częściej spotykane niż inne, ale należy je wziąć pod uwagę. Chociaż rak brodawkowatokomórkowy nerki nie jest zasadniczo małym okrągłym guzem niebieskokomórkowym, ale składa się głównie z brodawek, może wykazywać pewne obszary okrągłych komórek, które mogą wymagać odróżnienia od innych dobrze znanych małych okrągłych guzów niebieskokrwinkowych (np. Guz Wilmsa) przy użyciu kilku technik pomocniczych16. Ostatecznie guzy podścieliskowe śródnerczycy mogą również wymagać uwzględnienia w diagnostyce różnicowej17. Guz rabdoidalny jest szczególnie złośliwym nowotworem dziecięcym, wyróżniającym się w podtypie nerkowym i pozanerkowym18.

Neuroblastoma jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych w okresie niemowlęcym i dziecięcym. Komórki nerwiaka zarodkowego to złośliwe komórki tego guza litego, które powstają podstępnie z pochodnych pierwotnego grzebienia nerwowego. Jego rozpoznanie i diagnostyka różnicowa może być trudna. Jego naturalna biologia odnotowała niezwykły postęp w ciągu ostatnich kilku dekad. Rodzina czynników transkrypcyjnych widelcowych charakteryzuje się wyraźną domeną "widełkową" (FOXO3/FKHRL1). Te czynniki transkrypcyjne działają jako wyzwalacz apoptozy (zaprogramowanej śmierci komórki) poprzez ekspresję genów niezbędnych do śmierci komórki. FOXO3/FKHRL1 jest aktywowany przez 5-aza-2-deoksycytydynę i indukuje wyciszoną kaspazę-8, a kompleks ten odgrywa kluczową rolę w nerwiaku zarodkowym. Nuclear FOXO3 przewiduje niekorzystne wyniki kliniczne i promuje angiogenezę guza w nerwiaku zarodkowym7,19. Pomimo postępów w patologii molekularnej, klasyfikacja Shimada pozostaje standardem praktyki dla każdego patologa i onkologa dziecięcego. Ma to kluczowe znaczenie w rozróżnianiu między korzystną i niekorzystną histologią20,21,22,23.

Uzasadnienie dla opracowania prostego protokołu dla mikroskopii elektronowej guzów podejrzanych o neuroblastomę jest związane z wykonalnością i solidnością badania ultrastrukturalnego próbki tkanki. Rzadko ulega zmianie w wyniku problemów powszechnie spotykanych przy użyciu immunohistochemii. Uzasadnienie i protokół były podstawą kilku podręczników i wkładów naukowych w patologię pediatryczną i mikroskopię elektronową4,24,25. Protokół ten obejmuje doświadczenie autora z trzech dekad i skupi się na kilku PSRBCT, kładąc nacisk na osobiste doświadczenia i przegląd literatury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury wykonywane w badaniach z udziałem ludzi były zgodne ze standardami etycznymi instytucjonalnego i/lub krajowego komitetu badawczego oraz z Deklaracją Helsińską z 1964 roku i jej późniejszymi poprawkami lub porównywalnymi standardami etycznymi. Badanie mikroskopią elektronową jest częścią normalnej procedury badań mikroskopowych próbek otrzymanych do celów diagnostycznych i nie wymaga zatwierdzenia przez Komisję Bioetyczną. Badanie to ma charakter retrospektywny i respektuje całkowitą anonimowość próbek.

1. Protokół TEM dla próbek tkanek FFPE (utrwalonych w formalinie i parafinie) oraz próbek tkanek utrwalonych aldehydem glutarowym

  1. Pobrać ostatnie szkiełka barwione hematoksyliną i eozyną oraz blok tkankowy FFPE.
  2. Za pomocą markera permanentnego wybierz obszar zainteresowania na szkiełku tkankowym i dopasuj go do obszaru na bloku tkankowym.
  3. Wytnij wybrany obszar nową żyletką z bloku i dokładnie pokrój go w kostkę 5 mm na bibule filtracyjnej.
  4. Umieścić bibułę filtracyjną z pobraną tkanką na oznakowanej szalce Petriego. Umieścić szalkę Petriego w piekarniku o temperaturze 60-70 °C na 15 minut, tj. do momentu, gdy parafina stopi się (wosk parafinowy składa się z mieszaniny stałych węglowodorów o prostych łańcuchach o temperaturze topnienia 48 °C-66 °C (120 do 150 °F)) i zostanie wchłonięta przez bibułę filtracyjną.
  5. Pobraną tkankę wolną od parafiny przenieść do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej 4 ml 100% toluenu (metylobenzenu) v/v [100% toluenu oznacza 100 ml toluenu]. Upewnij się, że próbki obracają się w sposób ciągły w procesie odparafinowania (prędkość obrotowa: 24 obroty/min).
  6. Wykonaj dwie zmiany toluenu, każda po 1 godzinie, i jedną zmianę po 4 ml 100% toluenu po 30 minut każda, używając kątowego urządzenia obrotowego.
  7. Przeprowadzić jedną zmianę w 4 ml 100% absolutnego etanolu (C2H5OH) przez 1 godzinę, a następnie dwie zmiany po 4 ml 100% absolutnego etanolu przez 30 minut każda. Następnie kolejna 30-minutowa zmiana w 4 ml 70% etanolu.
  8. Przeprowadzić jedną zmianę 4 ml 0,1 M buforu kakodylanu sodu, 30 min. Przenieść próbki w 4 ml 2,5% aldehydu glutarowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
  9. Wykonaj następujące kroki w automatycznym procesorze tkanek, aby ustandaryzować przetwarzanie: 0,1 M bufor kakodylanu sodu przez 5 min, 2% tetratlenek osmu przez 1 h i 50 min, dH2O przez 5 min, 50% etanol przez 15 min, 70% etanol przez 30 min, 100% etanol przez 15 min (trzy razy), 100% etanol przez 30 min (trzy razy), 100% etanol przez 45 min, aceton przez 50 min, żywica przez 1 h (dwa razy) i świeża żywica na noc. Objętość wszystkich roztworów wynosi 15 ml.
  10. Osadź świeżą żywicę bezpośrednio po wyjęciu z procesora tkanek.
    1. Umieść kapsułki polietylenowe w uchwycie z ponumerowanymi paskami papieru. Wrzuć świeżą żywicę do kapsułek, przenieś próbkę do odpowiednich bloków i przechowuj bloki przez noc w piekarniku o temperaturze 60 °C (140 °F).
  11. Półcienkie (500 nm) skrawki zabarwić 1% błękitem toluidynowym na płycie grzejnej, minimalne ustawienie grzania na 30 s, spłukać w dH2O, a następnie umieścić szkiełko nakrywkowe.
  12. W tym przypadku mikrotom Ultracut (UCM) służy do cięcia półcienkich odcinków.
    1. Weź blok osadzony w żywicy i zainstaluj go w uchwycie bloku UCM. Następnie zainstaluj uchwyt bloku na stoliku UCM i dokręć go.
    2. Odetnij nadmiar żywicy wokół próbki za pomocą żyletki pokrytej pojedynczą krawędzią za pomocą okularów. Wytnij powierzchnię bloku w kształcie trapezu.
    3. Zdejmij uchwyt bloku ze sceny i zainstaluj go mocno w ramieniu UCM. Następnie zainstaluj uchwyt ostrza na stoliku UCM. Na koniec dokręć szklany nóż na uchwycie ostrza.
    4. Za pomocą okularów i światła dostarczanego przez UCM przesuń krawędź szklanego noża powoli, jak najbliżej, do powierzchni bloku żywicy, który chcesz przeciąć. Dokręć uchwyt ostrza na miejscu na scenie.
    5. Ustaw grubość cięcia UCM na 500 nm i przytnij blok żywicy do 75% pełnej powierzchni.
    6. Zmień nóż do szkła na nowy. Dodaj sterylną wodę do zbiornika szklanego noża.
    7. Oznacz szkiełko mikroskopowe numerem sprawy i umieść cztery oddzielne krople sterylnej wody na szkiełku podstawowym.
    8. Wciąż przy ustawieniu 500 nm wytnij cztery sekcje z bloku. Za pomocą cienkich kleszczy przenoś po 1 sekcji na raz w jednej z kropli wody na szkiełku podstawowym. Każda kropla na slajdzie będzie zawierała jedną sekcję. Wysuszyć szkiełko na gorącej płycie przy najniższym ustawieniu grzania, aż wyschnie (30 s).
  13. Barwienie metodą błękitu toluidynowego. Spłucz w wodzie i umieść szkiełko nakrywkowe. Zbadaj skrawki błękitu toluidynowego pod mikroskopem świetlnym. Jeśli pożądane struktury tkankowe są widoczne, wytnij ultracienkie odcinki. Jeśli pożądane struktury tkankowe nie są widoczne, wytnij głębsze odcinki i zabarw je, wykonując te same czynności, aż pożądane struktury zostaną odsłonięte i pokazane na szkiełku z toluidyną.
  14. Po zidentyfikowaniu pożądanego obszaru do mikroskopii elektronowej na podstawie skrawków błękitu toluidynowego, należy wyciąć ultracienkie skrawki na miedzianych siatkach. Pociąć ultracienkie plasterki za pomocą ultramikrotomu (próbki przeznaczone do oglądania w TEM muszą być pocięte na bardzo cienkie plasterki (80 nm)).
    1. Weź blok osadzony w żywicy i zainstaluj go w uchwycie bloku UCM. Następnie zainstaluj uchwyt bloku na stoliku UCM i dokręć go.
    2. Za pomocą okularów przetnij żywicę wokół żądanego obszaru do mikroskopii elektronowej za pomocą żyletki z pojedynczą krawędzią. Wytnij powierzchnię bloku w kształcie trapezu, nie większym niż 1 mm kwadratowy. Jeśli pożądany obszar do mikroskopii elektronowej jest trudny do zobaczenia ze względu na odblaski światła, użyj odrobiny chloroformu, aby podkreślić struktury w bloku żywicy.
    3. Zdejmij uchwyt bloku ze sceny i zainstaluj go mocno w ramieniu UCM. Następnie zainstaluj uchwyt ostrza na stoliku UCM. Na koniec dokręć nóż diamentowy na uchwycie ostrza.
    4. Korzystając z okularów i światła dostarczanego przez UCM, przesuń krawędź noża diamentowego powoli, jak najbliżej, do powierzchni bloku żywicy, który chcesz przeciąć. Dokręć uchwyt ostrza na miejscu na scenie.
    5. Dostosuj różne kąty noża diamentowego za pomocą UCM. Upewnij się, że krawędź noża diamentowego jest jak najbardziej idealnie wyrównana z powierzchnią bloku, który chcesz ciąć. Napełnij zbiornik noża diamentowego sterylną wodą.
    6. Ustaw UCM na grubość 80 nm i prędkość 1 mm/s. W tym przypadku funkcja automatyzacji jest wykorzystywana do ultracienkiego cięcia. Ustaw okno cięcia na UCM (górna i dolna część powierzchni bloku).
    7. Naciśnij przycisk Start UCM, aby rozpocząć tworzenie sekcji. Sekcje będą unosić się na sterylnym zbiorniku noża diamentowego.
    8. Po wycięciu wystarczającej liczby odcinków użyj oparów chloroformu, aby wyprostować sekcje. Zanurz bawełniany wacik w chloroformie i przełóż go nad sekcjami, nie dotykając ich.
  15. Zanurz miedzianą siatkę w 100% alkoholu, a następnie sterylnej wodzie za pomocą drobnych kleszczyków. Wyczyść każdą siatkę przed użyciem. Wybierz sekcje na kilku siatkach.
  16. Pozostaw siatki z sekcjami na oznaczonej bibule filtracyjnej. Umieść tę bibułę filtracyjną na szalce Petriego i wstaw do piekarnika o temperaturze 60 °C na 30 minut, aby sekcje wyschły na rusztach.
  17. Następnie wykonaj barwienie kontrastowe.
    1. Zabarwić siatki octanem uranylu lub innym przyjaznym dla środowiska alternatywnym substytutem przez 1 minutę. Następnie opłucz je w sterylnej wodzie do wstrzykiwań (40 zanurzeń w czterech różnych pojemnikach z wodą na każde płukanie po octanie uranylu i cytrynianu ołowiu). Krok cytrynianu ołowiu wynosi również 1 minutę.
  18. Włóż siatkę do TEM, umożliwiając emitację wiązki elektronów o wysokim napięciu przez katodę i tworzenie jej przez soczewki magnetyczne. Wiązka, która została częściowo przepuszczona przez cienką (półprzezroczystą elektronów) próbkę, tworzy informacje TEM na ekranie (patrz poniżej).

2. Protokół TEM do skanowania i fotografowania próbek

  1. Po zabarwieniu skrawków na siatkach przesiewaj je mikroskopem elektronowym. W mikroskopie elektronowym włącz napięcie ACC do wcześniej ustalonego ustawienia (200-300 kV), które zależy od użytego mikroskopu elektronowego.
  2. Na komputerze włącz oprogramowanie aparatu cyfrowego i wprowadź numer sprawy. Jest to ważne, ponieważ mikrofotografie są zapisywane w odpowiednich aktach sprawy.
  3. Załaduj siatkę do mikroskopu elektronowego, wyciągnij próbkę pistoletu do połowy i przestaw przełącznik na POWIETRZE, aby umożliwić wypełnienie próżni z komory pistoletu do próbek powietrzem otoczenia (pomieszczenia).
  4. Gdy będzie pełen powietrza, wyciągnij próbkę pistoletu. Umieść próbkę pistoletu na zaprojektowanym uchwycie. Następnie otwórz uchwyt siatki na końcówce pistoletu.
  5. Umieść siatkę na miejscu. Zamknij uchwyt siatki i upewnij się, że siatka jest zabezpieczona.
  6. Umieść próbkę pistoletu z powrotem w komorze na próbkę w połowie i przestaw przełącznik na EVAC, aby wytworzyć próżnię w komorze na próbkę.
  7. Wskaźnik zielonego światła włączy się, gdy w komorze na próbkę zostanie osiągnięte podciśnienie. Następnie ostrożnie wepchnij próbkę pistoletu do kolumny mikroskopu elektronowego i upewnij się, że nie pozwól, aby poruszała się zbyt szybko. W przeciwnym razie uszkodziłoby to przedmiot na końcówce próbki pistoletu.
  8. Gdy siatka jest już dobrze umieszczona w kolumnie mikroskopu elektronowego, włącz żarnik do pośredniego (wcześniej ustalonego) ustawienia nasycenia.
  9. Włącz aparat za pomocą przełącznika ON/OFF. Na komputerze kliknij Live Image (Obraz na żywo) w oprogramowaniu do obrazowania.
  10. W mikroskopie elektronowym naciśnij przycisk Niskie powiększenie i otwórz aperturę obiektywu. Pozwala to na wybór żądanego obszaru ekranu. Następnie umieść żądany obszar sekcji na środku ekranu komputera, używając dwóch kontrolerów po obu stronach kolumny mikroskopu elektronowego.
  11. W mikroskopie elektronowym naciśnij przycisk Zoom i zamknij aperturę obiektywu, aby uzyskać lepszy kontrast.
  12. Projekcję sekcji należy rozpocząć od wykonania mikrofotografii w powiększeniu 2 500x. Następnie wyreguluj ostrość za pomocą przycisku woblera i przycisku jasności na mikroskopie elektronowym, aby zapewnić jakość mikrofotografii.
  13. Kliknij na Final Image (Obraz końcowy) na komputerze, aby zrobić mikrofotografię. Jeśli kolory nie są równe, wykonaj korekcję tła w oprogramowaniu aparatu. Dostosuj również kontrast na końcowym obrazie za pomocą oprogramowania przed zapisaniem mikrofotografii.
  14. Podczas zapisywania mikrofotografii należy dwukrotnie sprawdzić numer koperty i powiększenie, aby zapewnić prawidłową identyfikację wykonanych mikrofotografii.
    UWAGA: W niektórych przypadkach użytkownik może również wprowadzić dodatkowe podpisy, a także inicjały technika mikroskopii elektronowej.
  15. Przeprowadzić proces mikrofotografii na całej powierzchni sekcji, która ma być przesiewana. Po wystarczającym powiększeniu 2,500x, mikrofotografie są zapisywane, aby pokryć obszar zainteresowania, przechwytywać mikrofotografie w powiększeniu 4,000x i 8,000x i zapisywać je na komputerze z odpowiednią identyfikacją numeru sprawy.
  16. Zrób zbliżenie na sekcję, aby uzyskać szczegółowe informacje ultrastrukturalne, jeśli podane są bardzo szczegółowe instrukcje dotyczące przesiewania. Następnie zapisz pomiary określonych szczegółów ultrastrukturalnych w komputerze, biorąc pod uwagę większe powiększenia, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  17. Po zakończeniu badania przesiewowego próbki wyłącz kolejno filament, kamerę, wysokie napięcie i oprogramowanie aparatu. Następnie usuń siatkę z kolumny mikroskopu elektronowego, wpuszczając powietrze do komory próbki pistoletu.
  18. Spiłuj siatkę w żelatynowej kapsułce i przechowuj kapsułkę w odpowiednio oznakowanym pudełku wraz z blokami żywicy z tego samego etui. Umieść próbkę pistoletu z powrotem w komorze pistoletu i przechowuj ją w chłodnym i suchym miejscu, aby zachować użyty materiał.
  19. Przenieś cyfrowe mikrofotografie na popularne platformy współpracy (np. SharePoint) lub serwery wewnętrzne, aby umożliwić patologowi ich przeglądanie.
  20. Wprowadź jednostki robocze do Laboratoryjnego Systemu Informacyjnego (LIS).
  21. Jeśli wymagane są bardziej szczegółowe mikrofotografie, wyciągnij siatkę pola i wykorzystaj ją ponownie do dodatkowych badań przesiewowych lub konkretnych pytań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyczne cechy TEM neuroblastoma są wyświetlane tutaj. Tutaj zilustrujemy charakterystyczne cechy TEM nerwiaka zarodkowego.

Neuroblastoma jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych w okresie niemowlęcym i dziecięcym. Komórki nerwiaka zarodkowego to złośliwe komórki tego guza litego, które powstają podstępnie z pochodnych pierwotnego grzebienia nerwowego. Ta histogeneza wyjaśnia niektóre cechy biochemiczne i morfologiczne tego niebieskiego guza. Jednak deterministyczne cechy cyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym przeglądzie narracyjnym wraz z powiązanym protokołem podkreśliliśmy charakterystyczne cechy ultrastrukturalne nerwiaka zarodkowego. Na koniec sugerujemy, że mikroskopia elektronowa jest daleka od "martwej" lub starożytnej techniki, postulując odkrycie nowej roli w połączeniu z technologiami omicznymi pojedynczych komórek. Niniejszy wkład ma na celu podkreślenie niedawnej roli mikroskopii elektronowej w patologii dziecięcej 4,27. Krytyczne kroki, modyfikacje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszy autor otrzymuje tantiemy od następujących wydawców: Springer (https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-662-59169-7; ISBN: 978-3-662-59169-7) i Nova (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; ISBN: 978-1-53619-816-4). Wszystkie tantiemy trafiają do organizacji charytatywnych zajmujących się pediatrią.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wiedzę i hojne wsparcie dr Richarda Vrienda, byłego pracownika Alberta Health Services w Szpitalu Uniwersytetu Alberta, oraz Stevena Joya (1972-2019), również byłego pracownika Alberta Health Services w Szpitalu Uniwersytetu Alberta. Naszą pracę poświęcamy pamięci pana Joya, starszego eksperta w dziedzinie technologii ultrastrukturalnych, który zmarł tragicznie i przedwcześnie kilka lat temu. Pan Joy był filarem większości badań mikroskopii elektronowej w Albercie w Kanadzie. Nasze myśli i modlitwy za niego i jego rodzinę. Jesteśmy również wdzięczni Pani Lesley Burnet za jej pomoc i rady. Badania dr C. Sergiego zostały sfinansowane dzięki hojności Szpitala Dziecięcego Wschodniego Ontario w Ottawie w Ontario oraz Fundacji Szpitala Dziecięcego Stollery oraz osób wspierających Szpital dla Kobiet w Lois Hole za pośrednictwem Instytutu Badań nad Zdrowiem Kobiet i Dzieci (WCHRI, Grant ID #: 2096), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hubei dla Uniwersytetu Technologicznego w Hubei (grant 100 talentów na program rekrutacyjny ekspertów zagranicznych Razem Finansowanie: Cyfrowa diagnostyka PCR i NGS w leczeniu zakażeń i onkologii, 2017-2022), Österreichische Krebshilfe Tyrol (Krebsgesellschaft Tirol, Austriacki Instytut Badań nad Rakiem w Tyrolu, 2007 i 2009 - "DMBTI i raki żółciowokomórkowe" oraz "Hsp70 i HSPBP1 w rakach trzustki"), Austriacki Fundusz Badawczy (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, FWF, Grant ID L313-B13), Kanadyjska Fundacja na rzecz Zdrowia Kobiet ("Early Fetal Heart-RES0000928"), Towarzystwo Badań nad Rakiem (ekspresja genów czynnika von Willebranda w komórkach nowotworowych), Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (Kwasy tłuszczowe omega-3 w leczeniu choroby wątroby związanej z niewydolnością jelit: badanie translacyjne, 2011-2014, CIHR 232514) oraz Saudyjskie Biuro Kultury, Ottawa, Kanada. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aceton, odczynnik ACSMikroskopia elektronowa Odczynnik Sciences10014ustalony przez Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne (odczynnik ACS).
Zautomatyzowany procesor tkanekMikroskopia elektronowa SciencesL12600LYNX II Automatyczny procesor tkanek do histologii i mikroskopii.
Oprogramowanie aparatu cyfrowegoGatanL12600Mikrograf
cyfrowy Żywica SpurraMikroskopia elektronowa Sciences14300Żywica do zatapiania. Zapewnia doskonałą penetrację w celu osadzania tkanek i szybkiej infiltracji. Bloki mają doskonałe właściwości przycinania i cięcia, podczas gdy cienkie sekcje ujawniają twarde właściwości pod wiązką elektronów.
Alkohol etylowyMikroskopia elektronowa Sciences15058100% alkohol etylowy z sitem molekularnym, 50% i 70%.
Aldehyd glutarowy, 25% wodny roztwór klasy EM w fiolce surowicyMikroskopia elektronowa Sciences162142,5% aldehyd gluterynowy w buforze kakodylowym 0,1 M, pH 7,2-7,4 wykonany z 25% aldehydu gluterowego, podstawowy utrwalacz dla próbek tkanek TEM.
Tetratlenek osmuMikroskopia elektronowa Nauki19110Drugi utrwalacz podczas przetwarzania tkanek TEM stosowany jako OsO4 w wodzie destylowanej
Kapsułki polietylenoweMikroskopia elektronowa Sciences70021Kapsułki do zatapiania z płaskim dnem, rozmiar 00
ScyntylatorMikroskopia elektronowa Sciences82010Phillip Quad Detector
Jednokrawędziowa żyletkaMikroskopia elektronowa Sciences71952-10Ostrze do czyszczenia Rm., 10/Disp.
Bufor kakodylanu soduMikroskopia elektronowa Sciences11655Bufor kakodylanu sodu, 0,4 M, pH 7,2, przygotowany z odczynnika CACS Sodium Cacodylate Trihydrate
Tannic Acid, A.C.S.,Grade Electron Microscopy Sciences21700zgodnie z ustaleniami American Chemical Society (odczynnik ACS).
Transmisyjny mikroskop elektronowy (1)HitachiHitachi 7100Używamy go w ustawieniu HV 75
Transmisyjny mikroskop elektronowy (2)JEOLJEM-1010Używamy go w ustawieniu HV 38
Odczynnik do mikroskopii elektronowejtoluenu22030zgodnie z ustaleniami Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego (odczynnik ACS)
Ultracut mikrotomLeica11865766Ultramikrotom
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Nauki22400Bez urany, substytut octanu uranylu
EM Sciences

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nitta, R., Imasaki, T., Nitta, E. Recent progress in structural biology: lessons from our research history. Microscopy (Oxford). 67 (4), 187-195 (2018).
  2. Moser, T. H., et al. The role of electron irradiation history in liquid cell transmission electron microscopy. Science Advances. 4 (4), (2018).
  3. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  4. Sergi, C. M. Pathology of Childhood and Adolescence. An Illustrated Guide. 1st edn. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2020).
  5. Sergi, C., Dhiman, A., Gray, J. A. Fine needle aspiration cytology for neck masses in childhood. An illustrative approach. Diagnostics (Basel). 8 (2), 28(2018).
  6. Sergi, C., Kulkarni, K., Stobart, K., Lees, G., Noga, M. Clear cell variant of embryonal rhabdomyosarcoma: report of an unusual retroperitoneal tumor--case report and literature review). European Journal of Pediatric Surgery. 22 (4), 324-328 (2012).
  7. Hagenbuchner, J., et al. Nuclear FOXO3 predicts adverse clinical outcome and promotes tumor angiogenesis in neuroblastoma. Oncotarget. 7 (47), 77591-77606 (2016).
  8. Xu, X., Sergi, C. Pediatric adrenal cortical carcinomas: Histopathological criteria and clinical trials. A systematic review. Contemporary Clinical Trials. 50, 37-44 (2016).
  9. Khan, A., Feulefack, J., Sergi, C. M. Pre-conceptional and prenatal exposure to pesticides and pediatric neuroblastoma. A meta-analysis of nine studies. Environmental Toxicology and Pharmacology. 90, 103790(2022).
  10. Sergi, C. M. Implementing epic beaker laboratory information system for diagnostics in anatomic pathology. Risk Management and Healthcare Policy. 15, 323-330 (2022).
  11. D'Cruze, L., et al. The role of immunohistochemistry in the analysis of the spectrum of small round cell tumours at a tertiary care centre. Journal of Clinical Diagnostic Research. 7 (7), 1377-1382 (2013).
  12. Garcia, E., et al. Epithelial-mesenchymal transition, regulated by beta-catenin and Twist, leads to esophageal wall remodeling in pediatric eosinophilic esophagitis. PLoS One. 17 (3), 0264622(2022).
  13. Al-Bahrani, R., Nagamori, S., Leng, R., Petryk, A., Sergi, C. Differential expression of sonic hedgehog protein in human hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma. Pathol and Oncology Research. 21 (4), 901-908 (2015).
  14. Taweevisit, M., Thorner, P. S. Electron microscopy can still have a role in the diagnosis of selected inborn errors of metabolism. Pediatric and Developmental Pathology. 22 (1), 22-29 (2019).
  15. Ghadially, F. N. Diagnostic Electron Microscopy of Tumours. , Butterworths. (1980).
  16. Geiger, K., et al. FOXO3/FKHRL1 is activated by 5-aza-2-deoxycytidine and induces silenced caspase-8 in neuroblastoma. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2226-2234 (2012).
  17. Shimada, H. Transmission and scanning electron microscopic studies on the tumors of neuroblastoma group. Acta Pathologica Japonica. 32 (3), 415-426 (1982).
  18. Samardzija, G., et al. Aggressive human neuroblastomas show a massive increase in the numbers of autophagic vacuoles and damaged mitochondria. Ultrastructural Pathology. 40 (5), 240-248 (2016).
  19. Suganuma, R., et al. Peripheral neuroblastic tumors with genotype-phenotype discordance: a report from the Children's Oncology Group and the International Neuroblastoma Pathology Committee. Pediatric Blood and Cancer. 60 (3), 363-370 (2013).
  20. Joshi, V. V. Peripheral neuroblastic tumors: pathologic classification based on recommendations of international neuroblastoma pathology committee (Modification of shimada classification). Pediatric and Developmental Pathology. 3 (2), 184-199 (2000).
  21. Schultz, T. D., Sergi, C., Grundy, P., Metcalfe, P. D. Papillary renal cell carcinoma: report of a rare entity in childhood with review of the clinical management. Journal of Pediatric Surgery. 46 (6), 31-34 (2011).
  22. Brisigotti, M., Cozzutto, C., Fabbretti, G., Sergi, C., Callea, F. Metanephric adenoma. Histology and Histopathology. 7 (4), 689-692 (1992).
  23. McKillop, S. J., et al. Adenovirus necrotizing hepatitis complicating atypical teratoid rhabdoid tumor. Pediatric International. 57 (5), 974-977 (2015).
  24. Kim, N. R., Ha, S. Y., Cho, H. Y. Utility of transmission electron microscopy in small round cell tumors. Journal of Pathology and Translational Medicine. 49 (2), 93-101 (2015).
  25. Iida, M., Tsujimoto, S., Nakayama, H., Yagishita, S. Ultrastructural study of neuronal and related tumors in the ventricles. Brain Tumor Pathology. 25 (1), 19-23 (2008).
  26. Erlandson, R. A., Nesland, J. M. Tumors of the endocrine/neuroendocrine system: an overview. Ultrastructural Pathology. 18 (1-2), 149-170 (1994).
  27. Sergi, C. Microscopy Science: Last Approaches on Educational Programs and Applied Research.Microscopy. Torres-Hergueta, E., Méndez-Vilas, A. , Formatex Research Center S.L. 101-112 (2018).
  28. Song, D., et al. FOXO3 promoted mitophagy via nuclear retention induced by manganese chloride in SH-SY5Y cells. Metallomics. 9 (9), 1251-1259 (2017).
  29. Chiu, B., Jantuan, E., Shen, F., Chiu, B., Sergi, C. Autophagy-inflammasome interplay in heart failure: A systematic review on basics, pathways, and therapeutic perspectives. Annals of Clinical and Laboratory Science. 47 (3), 243-252 (2017).
  30. Radogna, F., et al. Cell type-dependent ROS and mitophagy response leads to apoptosis or necroptosis in neuroblastoma. Oncogene. 35 (29), 3839-3853 (2016).
  31. Franchi, A., et al. Immunohistochemical and ultrastructural investigation of neural differentiation in Ewing sarcoma/PNET of bone and soft tissues. Ultrastructural Pathology. 25 (3), 219-225 (2001).
  32. Llombart-Bosch, A., et al. Soft tissue Ewing sarcoma--peripheral primitive neuroectodermal tumor with atypical clear cell pattern shows a new type of EWS-FEV fusion transcript. Diagnostic Molecular Pathology. 9 (3), 137-144 (2000).
  33. Parham, D. M., et al. Neuroectodermal differentiation in Ewing's sarcoma family of tumors does not predict tumor behavior. Human Pathology. 30 (8), 911-918 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Diagnostyka neuroblastomaguzy wieku dzieci cegoma e okr g e niebieskie kom rkiimmunohistochemiadiagnostyka r nicowa guz wziarna neurosekrecyjnemikroskopia wietlnabiologia molekularna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły