Artykuł metodologiczny

Model bólu pleców myszy wywołany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63997

⸱

1 września 2023

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology & Critical Care Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Metody prostej, szybkiej indukcji modelu bólu pleców u myszy są tutaj dostępne za pomocą iniekcji aktywatora plazminogenu w moczu do wnętrza więzadła.

Streszczenie

Model utrzymującego się bólu dolnej części pleców może być wywołany u myszy za pomocą prostej metodologii opisanej poniżej. Przedstawiono tutaj metody krok po kroku do prostej, szybkiej indukcji modelu utrzymującego się bólu pleców u myszy przy użyciu wstrzyknięcia aktywatora plazminogenu typu urokinazy (urokinazy), proteazy serynowej obecnej u ludzi i innych zwierząt. Metodologia indukcji utrzymującego się bólu dolnej części pleców u myszy polega na prostym wstrzyknięciu urokinazy wzdłuż obszaru przyczepu więzadła kręgosłupa lędźwiowego. Czynnik zapalny urokinazy aktywuje plazminogen do plazminy. Zazwyczaj model można wywołać w ciągu 10 minut, a nadwrażliwość utrzymuje się przez co najmniej 8 tygodni.

Nadwrażliwość, zaburzenia chodu i inne standardowe środki podobne do lęku i depresji mogą być testowane w modelu utrzymującym się. Ból pleców jest najbardziej rozpowszechnionym rodzajem bólu. Aby zwiększyć świadomość na temat bólu pleców, Międzynarodowe Stowarzyszenie Badań nad Bólem (IASP) ogłosiło rok 2021 "Światowym Rokiem Bólu Pleców", a rok 2022 "Światowym Rokiem Przekładania Wiedzy o Bólu na Praktykę". Jednym z ograniczeń zaawansowania terapeutycznego terapii bólu jest brak odpowiednich modeli do badania bólu uporczywego i przewlekłego. Cechy tego modelu są odpowiednie do testowania potencjalnych terapii mających na celu zmniejszenie bólu pleców i jego cech pomocniczych, przyczyniając się do ustanowienia przez IASP roku 2022 Światowym Rokiem Przekładania Wiedzy o Bólu na Praktykę.

Wprowadzenie

Ból krzyża jest jedną z najczęstszych przyczyn niepełnosprawności, na którą cierpi 1 na 5 osób na całym świecie1. Pomimo tych wysiłków, niewiele wiarygodnych modeli zwierzęcych bólu pleców jest powszechnie stosowanych w badaniach na zwierzętach w dziedzinie bólu, zwłaszcza u myszy. Poprzednie modele wykorzystywały prawie wyłącznie szczury do indukcji przewlekłego bólu pleców (CBP), takiego jak te wywołane wstrzyknięciem aktywatora plazminogenu w moczu (uPA) do stawu międzywyrostkowego lędźwiowego2,3, wstrzyknięcie czynnika wzrostu nerwów (NGF) do mięśni tułowia4, lub jodooctan sodu (MIA)5 lub interleukina-1beta6 wstrzyknięcie w krążek międzykręgowy. Oczywiście szczury są preferowane w tych modelach, głównie ze względu na ich większy rozmiar i łatwość dostępu do wstrzykiwania środków zapalnych.

Dla jasności, istnieją mysie modele bólu pleców, takie jak mysi model zwyrodnienia krążka międzykręgowego SPARC-null, używany od wielu lat7, ale są one bardziej kosztowne i czasochłonne niż modele oparte na iniekcjach. Niedawne badanie na myszach ustaliło model bólu dolnej części pleców, łącząc wstrzyknięcie NGF do mięśni dolnej części pleców z pionowym przewlekłym stresem ograniczającym8. W poniższym protokole dostosowaliśmy model CBP indukowany przez uPA od szczurów dla myszy2. Nadwrażliwość pojawia się w ciągu 1 tygodnia i utrzymuje się do 6-8 tygodni. Ponadto ustaliliśmy, że myszy rozwijają zachowania podobne do lęku i depresji. Biorąc pod uwagę rozpowszechnienie bólu pleców i powszechniejsze wykorzystanie myszy w badaniach molekularnych nad bólem, ten trwały model jest łatwo dostępny do wykorzystania w opracowywaniu nowych strategii leczenia bólu pleców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane procedury z udziałem zwierząt są zgodne z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Badania zostały zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC #23-201364-HSC) Centrum Nauk Zdrowotnych Uniwersytetu Nowomeksykańskiego. Wszystkie badania są zgodne z polityką objętą zapewnieniem zgodności OLAW (A3002-01) w zakresie wykorzystania zwierząt w badaniach, zgodnie z opisem w Części III. II. Zapewnienia i Certyfikacje. Zwierzęta są przetrzymywane w obiekcie Animal Resources Center (ARC), nad którym opiekę sprawuje personel laboratorium oraz pracownicy Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR). Metoda eutanazji (iniekcja 100 µL pentobarbitalu w stężeniu 59 mg/mL) jest szybka i niezawodna, co umożliwia przeprowadzenie sekcji oraz pobranie różnych tkanek do dalszych badań.

1. Zwierzęta

  1. Utrzymuj dorosłe (ok. 3-4 tygodniowe) samce i samice myszy BALB/c (20-25 g) w odwróconym 12 h:12 h cyklu światło:ciemność, tak aby ich czas aktywności w ciemności przypadał na godziny pracy laboratoryjnej.
    UWAGA: Pozwoli to na ocenę wszystkich parametrów podczas naturalnego czasu aktywności zwierząt, ponieważ gryzonie są naturalnie zwierzętami nocnymi. Ogranicza to wpływ zmian w zegarze okołodobowym, dzięki czemu zwierzęta mogą być badane w czasie ich aktywności, który obecnie przypada na dzień.
  2. Monitoruj zwierzęta dwa razy dziennie.
  3. Karm myszy standardową paszą dla myszy hodowlanych, która ma niższą zawartość białka sojowego w porównaniu do standardowej paszy dla gryzoni (znanej z wpływu na nadwrażliwość), jeżeli oceniane są efekty leków w zachowaniach związanych z bólem.
  4. Waż zwierzęta raz w tygodniu, aby upewnić się, że przybierają na wadze w sposób prawidłowy.
    ​UWAGA: W trakcie 8-10 tygodniowych badań nie odnotowano różnic w masie ciała między grupami, co umożliwiło przeprowadzenie badania metodą ślepej próby.

2. Indukcja modelu

  1. Przeprowadź indukcję modelu na ciepłej, sterylnej, płaskiej powierzchni wyposażonej w środek do mocowania stabilizatorów, aby utrzymać mysz w miejscu (Rycina 1A). Przeprowadź operację za pomocą mikroskopu sekcyjnego na sterylnej powierzchni.
    UWAGA: Jeśli nie jest dostępny system wychwytywania anestetyku, należy użyć wyciągu chemicznego.
  2. Jeśli używana jest płyta bazowa zalecana w Tabeli Materiałów, w jako stabilizatorów należy zastosować chirurgiczną nić jedwabną lub zwykłą włóczkę z gumkami recepterkami zawiązanymi na końcach sznurków, zaczepionymi o prążkowane krawędzie płyty.
  3. Umieść stanowisko regeneracyjne z mata grzewczą na powierzchni sąsiadującej z zestawem chirurgicznym, aby móc przenieść myszy na stanowisko natychmiast po iniekcji (Rycina 1B).
    UWAGA: Umieść pustą klatkę na macie grzewczej co najmniej 10 min przed iniekcją, aby klatka nagrzała się do komfortowej temperatury (37 °C). Umieść klatkę częściowo poza matą, aby budząca się mysz mogła wybrać preferowaną temperaturę regeneracji.
  4. Przygotuj urokinazę, rozcieńczając ją w sterylnej wodzie. Oczyść strzykawkę Hamiltona alkoholem i przepłucz w sterylnej wodzie. Nabierz roztwór wcześniej, aby mysz znajdowała się pod narkozą jak najkrócej. Do modelu użyj 5 µL aktywatora plazminogenu z moczu o stężeniu 2 mg/mL; w grupach pozorowanych (sham) użyj 5 µL sterylnej soli fizjologicznej.
  5. Ustaw stację anestezji izofluranem na poziomie 4% lub mniej dla tej krótkiej procedury. Umieść mysz w komorze indukcyjnej; zazwyczaj szybkie tempo oddychania myszy spowolni w ciągu 1-2 min, a ruchy przejdą z górnej części klatki piersiowej na dolną.
  6. Zastosuj przepływ tlenu 1,5 L/min i kanister z węglem aktywnym F lub pracuj pod biologicznym przepływem laminarnym lub wyciągiem nad głową, aby neutralizować izofluran i uniknąć ekspozycji chirurga. Jeśli nie są one dostępne, wykonaj procedurę w dygestorium chemicznym.
  7. Szybko przenieś mysz i przepływ anestetyku do obszaru chirurgicznego na matę grzewczą o temperaturze 37°C, umieszczając nos myszy w lejku nosowym w celu utrzymania poziomu anestezji (Rycina 1C,D). Sprawdź, czy mysz nie wykazuje odruchu na uciśnięcie palca u nogi, a następnie unieruchom mysz na płycie bazowej.
    UWAGA: Jeśli występuje jakikolwiek ruch, ponownie umieść mysz w komorze indukcyjnej i powtórz tę czynność.
  8. Oczyść obszar skóry na grzbiecie gazikiem nasączonym alkoholem. Dostosuj oświetlenie LED tak, aby uzyskać wyraźny widok na grzbiet znieczulonej myszy.
    UWAGA: W razie potrzeby użyj elektrycznej golarki, aby usunąć sierść z grzbietu myszy, tak aby uzyskać niezakłócony widok na wyrostki kolczyste kręgosłupa pod skórą. Jeśli myszy eksperymentalne są golone, należy również ogolić grzbiety myszy naiwnych i pozorowanych w celu zaślepienia badania.
  9. Wykonaj iniekcję u myszy w pełnej anestezji i unieruchomieniu (brak odruchu prostowania i wycofywania palca u nogi po uciśnięciu). Użyj dwóch palców, aby delikatnie wyczuć miejsce, w którym dół klatki piersiowej myszy styka się z kręgosłupem (Rycina 2A). Poniżej tego punktu znajdują się odcinki lędźwiowe kręgosłupa; celuj iniekcją w obszar L2-L3.
  10. Umieść końcówkę strzykawki Hamiltona obok kręgosłupa (Rycina 2B,C). Skieruj strzykawkę pod kątem ~45° w więzadło nadkolczyste bezpośrednio przy kości.
    UWAGA: W zależności od twardości skóry myszy, czasami lepiej może działać poleganie na grawitacji zamiast aktywnego nacisku i kąta 90°.
  11. Wprowadź końcówkę igły delikatnie, ale stanowczo w więzadło nadkolczyste (Rycina 3B,C).
    UWAGA: Celem nie jest przebicie jamy brzusznej, lecz iniekcja w więzadło.
  12. Powoli opróżnij zawartość igły. Jeśli w którymkolwiek momencie na końcówce pojawi się ciecz, oznacza to, że igła nie przeszła przez skórę. Kontynuuj, aż do momentu wstrzyknięcia wszystkich 5 µL.
  13. Przytrzymaj igłę w miejscu przez ~5 s, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętego płynu. W badaniach pilotażowych końcowych lub ostrych zaleca się użycie niebieskiego barwnika.
    UWAGA: Jeśli zabieg został wykonany prawidłowo, ciecz powinna rozprzestrzenić się w więzadle, jak pokazano na (Rycina 3A).
  14. Usuń igłę delikatnie i powoli. Upewnij się, że nie występuje krwawienie ani wydzielina.
  15. Umieść mysz w stanowisku regeneracyjnym z przykryciem klatki, aż się obudzi i odzyska sprawność ruchową, zanim przeniesiesz ją z powrotem do klatki domowej.
    UWAGA: Zakładając, że procedura została wykonana szybko, mysz powinna się obudzić w ciągu nie więcej niż jednej minuty.
  16. Obserwuj myszy przez 1 h po operacji, aby profilaktycznie upewnić się, że wszystkie normalne funkcje motoryczne są zachowane.
    UWAGA: Jeśli procedura została wykonana prawidłowo, nie powinny wystąpić żadne powikłania.
  17. Codziennie sprawdzaj stan myszy przez tydzień po operacji, w tym oceniaj masę ciała i sprawdzaj miejsce iniekcji, aby upewnić się, że nie wystąpiła infekcja ani powikłania. Nie używaj myszy do dalszych eksperymentów, jeśli nastąpi zmiana w zachowaniu, taka jak utrata wagi lub letarg.

Konfiguracja laboratoryjna do badań na zwierzętach; stanowisko do anestezji, klatki dla myszy i aparatura badawcza.
Rysunek 1: Konfiguracja do indukcji CBP za pomocą urokinazy. (A) Płyta bazowa Fine Science Tools zalecana do operacji na myszach. Na prążkowanych krawędziach można zamocować sznurki służące do unieruchomienia myszy. (B) Stanowisko rekonwalescencji. Zaleca się użycie pustej klatki mieszkalnej, umieszczonej połową na podkładce grzewczej, a połową poza nią. Na dnie kładzie się czystą tkaninę, aby zapewnić myszy wygodne miejsce do odpoczynku. (C) Zalecana konfiguracja aparatu do anestezji. Korzystając z dwukanałowego systemu podawania, należy podłączyć jeden wąż do komory indukcyjnej, a drugi do stanowiska operacyjnego. (D) Widok unieruchomień myszy. Dwa sznurki są zawiązane na prążkowanych krawędziach płyty bazowej, a następnie delikatnie przeciągnięte odpowiednio przez szyję i tylną część ciała myszy. Należy upewnić się, że mysz nie jest unieruchomiona zbyt ciasno, aby mogła normalnie oddychać. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przygotowanie do operacji zwierzęcia, zbliżenie, technika przygotowania pola sterylnego, gryzoń, badania eksperymentalne.
Rysunek 2: Indukcja CBP poprzez wstrzyknięcie urokinazy. (A) Widok miejsca podania zastrzyku. Jak pokazano, należy wyczuć palcami dół klatki piersiowej myszy, aby wyznaczyć punkt odniesienia dla poziomu L4-L5. (B) Widok procesu wstrzykiwania, pokazujący kąt prawidłowego podania zastrzyku. (C) Preferowany jest kąt 45°, ale należy go dostosować w razie potrzeby, aby upewnić się, że igła trafi w odpowiednie miejsce. W razie potrzeby należy ogolić miejsce wstrzyknięcia w celu lepszej wizualizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat anatomii kręgosłupa, wstrzyknięcia kręgowe, więzadła międzykolczyste i międzypoprzeczne, model gryzoni.
Figura 3: Schemat miejsca wstrzyknięcia. (A) Fotografia lokalizacji miejsca wstrzyknięcia. Atrament został tutaj użyty do wskazania miejsca, w którym ciecz będzie dostawać się do więzadła międzykolczystego pomiędzy kręgami L2 i L3. (B) Schemat przedstawiający prawidłowe ułożenie igły i lokalizację miejsca wstrzyknięcia, ukazany z widoku bocznego. (C) Schemat przedstawiający widok z góry na kręgi oraz miejsca wstrzyknięcia do więzadeł międzykolczystych. Wstrzyknięcia będą zazwyczaj wykonywane w więzadła międzykolczyste obok kręgosłupa, jednak igłę można wprowadzić również w przestrzeń między poprzecznymi wyrostkami kręgów. W badaniach pilotażowych zaleca się użycie niebieskiego barwnika, jak pokazano na (A). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Testy behawioralne

  1. Badanie progu odpowiedzi odruchowej mechanicznej metodą von Freya
    UWAGA: Mechaniczny próg wycofania jest minimalną siłą potrzebną do wywołania odpowiedzi w 50% przypadków przy użyciu serii 8 monofilamentów von Freya o stopniowanej średnicy z przyrostami ok. 0,2 g, co zapewnia logarytmiczne zmiany siły mechanicznej (Tabela materiałów).
    1. Przeprowadzić stymulację mechaniczną za pomocą włókien von Freya przykładanych do tylnej łapy, która jest obszarem unerwienia nerwów lędźwiowo-krzyżowych. Wyznaczyć bazowe wartości wycofania łapy przed operacją. Po operacji wyznaczać próg mechaniczny raz w tygodniu podczas eksperymentu chronicznego.
    2. Przenieść zwierzęta z pomieszczenia bytowego i poddać je aklimatyzacji w pomieszczeniu testowym przez 30 min w ich domowych klatkach przed badaniem. Następnie przenieść zwierzęta do indywidualnych ograniczników w małych przezroczystych boksach na stole testowym z ekranem na górze na 15-20 min, w zależności od ich poziomu aktywności.
      UWAGA: Badanie można rozpocząć po tym, jak myszy przyjmą pozycję spoczynkową i przestaną obracać się oraz poruszać w komorze. Aklimatyzacja w boksie ograniczającym minimalizuje efekty wywołane stresem. Jeśli myszy były utrzymywane w odwróconym cyklu świetlnym, badania należy przeprowadzać w warunkach czerwonego światła.
    3. Przeprowadzić badanie z użyciem stopniowanej serii włókien von Freya zgodnie z opisem poniżej oraz w pracy Chaplan i wsp.9.
      1. Sondować poduszkę stopy w tym samym miejscu u każdego zwierzęcia, używając filnamentu von Freya 3,61, który po zgięciu wywołuje siłę 0,4 g (Tabela materiałów). Następnie zastosować stymulację filamentem von Freya 4,08, który wywołuje siłę 1,0 g.
        UWAGA: Żadne z tych włókien nie wywołuje odpowiedzi u naiwnych, zaaklimatyzowanych zwierząt.
      2. Przyłożyć każdy filament 5x w odstępach >5 s prostopadle do poduszki stopy, uważając, aby nie dotknąć fałdy, szczeliny lub włosa. Za odpowiedź pozytywną uznaje się wycofanie stopy w trzech z pięciu bodźców. Stosować kolejny, słabszy filament z serii, aż zwierzę przestanie reagować na stymulację mechaniczną; w tym momencie należy użyć kolejnego, silniejszego filamentu. Jeśli wywoła on reakcję, ponownie użyć słabszego filamentu, aż wykonano cztery próby po zmianie odpowiedzi na mechaniczną stymulację poduszki stopy.
      3. Wykorzystać wynikowy wzorzec odpowiedzi do obliczenia mechanicznego progu wycofania, czyli minimalnej siły potrzebnej do wywołania odpowiedzi w 50% przypadków, stosując algorytm dopasowania krzywej9. Zmniejszenie siły wymaganej do wywołania reakcji wycofania stopy w porównaniu z myszami naiwnymi lub własną wartością bazową zwierzęcia wskazuje na zwiększoną wrażliwość zwierzęcia.
  2. Badanie progu odpowiedzi odruchowej termicznej
    UWAGA: Progi odpowiedzi na ciepło i zimno są ustalane odpowiednio za pomocą testów Hargreavesa oraz testu zimnej płyty.
    1. Test Hargreavesa
      1. Umieścić myszy w boksach na szklanej powierzchni ogrzewanej od dołu emiteryem podczerwieni. Odnotować latencję wycofania stopy jako czas w sekundach od zastosowania bodźca światła podczerwonego (50 °C) przez aparat na tylną łapę myszy do momentu wycofania z powodu stymulacji.
    2. Test zimnej płyty
      1. Umieścić myszy na aparacie z zimną płytą schłodzonej do -9 °C. Odnotować latencję wycofania stopy jako czas w sekundach od umieszczenia myszy na aparacie do momentu, gdy mysz zacznie podnosić łapę.
      2. Alternatywnie, umieścić sondę chłodzącą schłodzoną do -9 °C pod tylną łapą myszy, podczas gdy mysz znajduje się w klatce na drucianej siatce. Odnotować latencję wycofania jako czas w sekundach od umieszczenia aparatu pod tylną łapą do momentu, gdy mysz zacznie podnosić łapę, lizać ją lub potrząsać nią. Aby uniknąć wywołania odpowiedzi nocyceptywnej, należy zaaklimatyzować mysz do dotyku sondy w temperaturze pokojowej.
  3. Behawioralne testy zależne od funkcji poznawczych i emocjonalnych
    UWAGA: Długotrwała nadwrażliwość u zwierząt powoduje dysfunkcje emocjonalne i poznawcze. Są one zazwyczaj mierzone tylko raz, w 6. tygodniu po indukowaniu modelu bólu, aby uniknąć efektu wprawy.
    1. Testy lękowe
      UWAGA: Lęk i depresję można również wiarygodnie testować w celu oceny skuteczności modelu. Najlepiej poczekać co najmniej 4-6 tygodni po wstrzyknięciu indukcyjnym, aby pozwolić na rozwój chorób współistniejących. Preferencja ciemnej zamiast jasnej komory jest miarą lęku związanego z nocycepcją. W testach labiryntu zero lub plus myszy z modelem bólu spędzają mniej czasu w otwartych kwadrantach niż naiwne zwierzęta kontrolne, co jest objawem zachowania lękowego10,11.
      1. Test preferencji miejsca jasnego/ciemnego: umieścić każde zwierzę w pudełku do testu preferencji miejsca z przejściem między dwiema komorami (10 x 10 x 10 cm3). Jedna komora aparatu jest jasno oświetlona, podczas gdy druga pozostaje ciemna. Podczas każdego 10-minutowego testu monitorować komputerowo lokalizację zwierzęcia, aby wyznaczyć czas przebywania w jasnej i ciemnej części oraz liczbę przejść.
        UWAGA: Alternatywnie można zamontować kamerę wideo nad komorą testową i ręcznie rejestrować czas spędzony w każdej komorze.
      2. Podwyższony labirynt plus lub zero: umieścić gryzonie modelowe lub zwierzęta naiwne w labiryncie i użyć stopera do oceny czasu spędzonego w zamkniętych częściach labiryntu. Wyznaczyć czas spędzony w dwóch ściankowych obszarach „bezpiecznych” i dwóch otwartych obszarach „niebezpiecznych”. Zwierzęta z bólem preferują zamknięte obszary bezpieczne.
        UWAGA: Zachowanie lękowe można testować w labiryncie zero lub plus (10 min). Labirynt zero jest ścieżką kolistą, w przeciwieństwie do labiryntu plus, który ma kształt znaku plus. Oba posiadają dwa otwarte i dwa zamknięte kwadranty, co pozwala na ciągłe zachowanie eksploracyjne. Oba są podniesione na wysokość 1 m nad ziemią i składają się z kolistego lub w kształcie plusa przejścia podzielonego na cztery kwadranty o tej samej wielkości.
    2. Test depresyjny z rozpryskiem sacharozy
      UWAGA: Test z rozpryskiem sacharozy jest stosowany do oceny zachowania przypominającego depresję. Test ten pozwala na pomiar braku normalnego zachowania pielęgnacyjnego jako objawu depresji wynikającej z przewlekłego bólu.
      1. Ocenić częstotliwość, czas trwania i latencję pielęgnacji przez 10 min po spryskaniu grzbietowej strony futra 10-30% roztworem sacharozy (~250 µL w pobliżu nasady ogona). Zaślepieni obserwatorzy powinni policzyć liczbę manewów pielęgnacyjnych na podstawie nagrań wideo12.
        UWAGA: Doniesiono, że wskaźnik ten jest zmieniony w gryzoniach modelach zaburzeń nastroju, takich jak przewlekły łagodny stres, i ulega poprawie po przewlekłym leczeniu przeciwdepresyjnym13.
    3. Test nowego obiektu
      UWAGA: Dysfunkcję poznawczą można zmierzyć za pomocą testu nowego obiektu.
      1. Aklimatyzować myszy indywidualnie w przezroczystej plastikowej klatce z otwartą górą (56 x 30 x 20 cm) przez 1 h. Wstawić dwie identyczne figurki zabawek w przeciwległych narożnikach klatki na 5 min.
      2. W dniu badania ponownie aklimatyzować zwierzęta w przezroczystej klatce przez 1 h, a następnie umieścić dwie identyczne figurki w tych samych pozycjach w klatce na 5 min przed powrotem do domowej klatki.
      3. Zastąpić jedną z oryginalnych figurek wyraźnie innym nowym obiektem, zwrócić myszy do klatki testowej 4 h później i zarejestrować czas spędzony na badaniu obiektów.
      4. Obliczyć raportowany wskaźnik rozpoznawania (RI) jako procent czasu spędzonego na badaniu nowego obiektu w stosunku do całkowitego czasu badania obiektów14.
    4. Ocena funkcji motorycznych
      UWAGA: Test mobilności i zaburzeń chodu za pomocą plam atramentowych15 ocenia funkcję motoryczną w modelu bólu pleców.
      1. Skonstruować tunel z papierowego rulonu po ręcznikach, przeciętego wzdłuż jednej krawędzi. Rozłożyć tunel na czystym arkuszu papieru do drukarki.
      2. Trzymać myszy delikatnie owinięte w ręcznik, aż się uspokoją. Przyłożyć łapy do poduszki stemplującej nasączonej nietoksycznym atramentem indyjskim, aby pokryć je atramentem, lub pomalować spody stóp myszy za pomocą patyczka higienicznego. Wypuścić myszy przy wejściu do tunelu i pozwolić im przebiec przez tunel, chwytając je na końcu.
      3. Ocenić odciski łap na podstawie trzech parametrów: długości kroku (odległość pionowa od końca jednego odcisku do następnego), szerokości kroku (odległość pozioma między odciskami) oraz rozstawu palców (odległość między palcami po przeciwnych stronach łapy).
        UWAGA: Do zachęcenia myszy do przejścia przez tunel można użyć dopuszczalnych smakołyków. Jeśli odciski łap są rozmazane lub nieczytelne, eksperyment należy powtórzyć.

Analiza wrażliwości na ból za pomocą testów von Frey, Hargreaves i sondy zimna; statystyczne wykresy słupkowe.
Rycina 4: Nadwrażliwość mechaniczna i termiczna po indukcji CBP. Ból jest mierzalny tydzień po indukcji modelu i utrzymuje się przez 8 tygodni. (A) test von Frey. Badanie progu mechanicznego przeprowadzono za pomocą włókien von Frey przykładanych do poduszki stopy przez siatkowy blat stołu metodą up-down, jak pokazano tutaj, w ciągu 4 tygodni. Próg dla naiwnych samców (zielony) znajduje się pod niebieską linią dla naiwnych myszy samic. Myszy CBP (n = 4 samce, 4 samice) wykazały znacząco zwiększoną wrażliwość mechaniczną w porównaniu z naiwnymi kontrolami (n = 2 samce, 2 samice). Dane te poddano analizie dwuczynnikowej ANOVA (test wielokrotnych porównań Dunnetta): n = 4 na grupę. W analizach post-hoc korekta Bonferroniego dla wszystkich wartości P w porównaniach tydzień po tygodniu CBP względem grupy naiwnej dała 11 wartości < 0,0011. **** p < 0,0001. (B) test Hargreaves. Próg cieplny badano na poduszce stopy za pomocą testu Hargreaves (50 °C). Myszy CBP (n = 12 samców, 12 samic) wykazały znacząco zwiększoną wrażliwość na ciepło w porównaniu z naiwnymi kontrolami (n = 6 samców, 6 samic). W celu sprawdzenia istotności przeprowadzono obustronny test t Manna-Whitneya (p < 0,0001). (C) Wrażliwość na zimno. Test sondy zimnej przeprowadzono, umieszczając myszy na aparacie z płytką chłodzącą schłodzoną do -9 °C. Latencję wycofania zapisano jako czas w sekundach od momentu umieszczenia myszy na aparacie do chwili, gdy mysz zaczęła podnosić stopę, lizać ją lub potrząsać nią. Na przedstawionych danych sonda zimna schłodzona do -9 °C została umieszczona pod tylną łapą myszy, podczas gdy mysz znajdowała się w klatce na drucianej siatce. Wszystkie myszy badano w okresie od 1 do 3 tygodni po wstrzyknięciu. Myszy CBP (n = 4 samce, 6 samice) wykazały znacząco zwiększoną wrażliwość na zimno w porównaniu z naiwnymi kontrolami (n = 2 samce, 4 samice). W celu sprawdzenia istotności przeprowadzono obustronny test t Manna-Whitneya (p = 0,0002). Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Testy behawioralne związane z nocycepcją i analiza danych
Miary wywołane
Nadwrażliwość w obrębie poduszeczki stopy rozwija się w ciągu jednego dnia od wstrzyknięcia urokinazy. W ciągu 1 tygodnia próg wycofania znacząco spada i utrzymuje się do momentu eutanazji; wykazano to do 4. tygodnia po operacji (Rysunek 4A). Latencję wycofania łapy analizuje się metodą von Freya (up-down)9 oraz testem Hargreavesa. W przedstawionym przykł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten model przewlekłego bólu pleców jest łatwy do wywołania, a nadwrażliwość stwierdzona w ciągu 1 tygodnia może trwać do (a nawet dłużej) 8 tygodni. Pozwala to na dokładne badanie stanu bólu przewlekłego, w przeciwieństwie do innych ostrych modeli, które trwają tylko tydzień lub dwa. Podczas gdy pokazujemy model u myszy, model CBP indukowany przez uPA można również ustalić u szczurów2. Zaletą modelu jest to, że wydłużony przebieg czasowy prowokuje rozwój zachowań podobnych do lękowych i depresyjny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych. KNW potwierdza bezpłatne konsultacje z NeuroChronix, Bessor Pharma i USA Elixeria BioPharm, Inc.

Podziękowania

Grant został dostarczony przez NIH HEAL UG3 NS123958. Obiekty mieszkalne zostały skontrolowane i akredytowane przez AAALAC. Zwierzęta były trzymane w obiekcie socjalnym Centrum Zasobów Zwierzęcych (ARC) utrzymywanym przez personel laboratorium oraz personel Wydziału Laboratoriów i Zasobów Zwierzęcych (DLAR). Procedury testów behawioralnych są standardowymi metodami w tej dziedzinie, zatwierdzonymi przez Amerykańskie Towarzystwo Bólu i Międzynarodowe Stowarzyszenie Badań nad Bólem. Metoda eutanazji jest zgodna z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Animals and Consumables
70% etanoluLokalne źródło
BALB/c myszyEnvigo20-25 g
WacikiFisher Scientific19-090-702
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher Scientific19-062-616
Inhalator izofluranu znieczulenieMedVetRXISO-250
Taśma etykietowaFisher Scientific NGFP7002
Rękawice nitryloweFisher Scientific
Zbiornik tlenuŹródło
Obłożenie chirurgiczne, Steri-Drape Arkusz narzędziowy, Profilaktyka chłonnaVWR76246-788pocięta na kawałki 15 x 15 cm
Rurka Tygon z 3 mm średnica wewnętrznaGrainger22XH87
Equipment
#11 ostrza skalpela ze stali węglowejVWR21909-612
Komora indukcyjna anestezjologii Firma Summit Medical EquipmentAS-01-0530-LG
AutoklawLokalna jednostka
Biologia Dumont #kleszcze Fine Science Tools11252-30
Sterylizator z kulkami szklanymi Germinator 500VWR102095-946
IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Miernik analgezji na gorąco / na zimnoIITCPE34
Bawełna Integra Miltex & Szczypce opatrunkowe Safco Dental Supply66-317
OPTIKA CL31 dwuramienny oświetlacz LED Nowojorska firmamikroskopowa OPCL-31
System testowy podeszwy z emiterem podczerwieni, tj. Aparat HargreavesaUgo Basile37370-001 i 37370-002
Rękojeść skalpela nr 3VWR25607-947
Podkładka grzewcza dla małych zwierząt Valley Vet Supply47375
Nożyczki sprężynowe Student Vannas, proste ostrze Fine Science Tools91500-09
Przenośna stacja anestezjologiczna do badań na zwierzętach " PAM"Patterson ScientificAS-01-0007
Von Frey FilamentsUgo Basile37450-275
lokalne5

Bibliografia

  1. O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
  2. Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine. Cureus. 10 (3), 2371(2018).
  3. Shuang, F., et al. Establishment of a rat model of lumbar facet joint osteoarthritis using intraarticular injection of urinary plasminogen activator. Scientific Reports. 5 (1), 9828(2015).
  4. Reed, N. R., et al. Somatosensory behavioral alterations in a NGF-induced persistent low back pain model. Behavioural Brain Research. 418, 113617(2022).
  5. Suh, H. R., Cho, H. -Y., Han, H. C. Development of a novel model of intervertebral disc degeneration by the intradiscal application of monosodium iodoacetate (MIA) in rat. The Spine Journal. 22 (1), 183-192 (2022).
  6. Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model. The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).
  7. Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse. Spine. 36 (2), 95-102 (2011).
  8. La Porta, C., Tappe-Theodor, A. Differential impact of psychological and psychophysical stress on low back pain in mice. Pain. 161 (7), 1442-1458 (2020).
  9. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  10. Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104(2006).
  11. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
  12. David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
  13. Yalcin, I., et al. A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain. Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).
  14. Madathil, S. K., et al. Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice. PloS One. 8 (6), e67204(2013).
  15. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027(2019).
  16. Hassan, S., et al. Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review. Pain. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wstrzykni cie urokinazymodel przewlek ego b luwstrzykni cie w odcinku l d wiowym kr gos upanadwra liwo mechanicznatest Von Freytest Hargreavesatest zimnej p ytyocena l kuanaliza funkcji motorycznych

Powiązane artykuły