Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

DOI:

10.3791/63999

⸱

10 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Applied Physiology, College of Health Sciences, University of Delaware, 2Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 3University of Delaware Flow Cytometry Core, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę preparacji mysich magazynów tłuszczu oraz izolacji i trawienia odpowiednich tętnic w celu uwolnienia, a następnie zidentyfikowania populacji komórek śródbłonka. Świeżo wyizolowane komórki wykorzystywane w dalszych zastosowaniach przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych wyściełające ścianę układu naczyniowego odgrywają ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych, w tym w regulacji napięcia naczyniowego, funkcjach barierowych i angiogenezie. Dysfunkcja komórek śródbłonka jest charakterystycznym predyktorem i głównym czynnikiem powodującym postęp poważnych chorób sercowo-naczyniowych, jednak mechanizmy leżące u jej podstaw pozostają słabo poznane. Możliwość izolowania i wykonywania analiz na komórkach śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych w ich natywnej postaci da wgląd w procesy chorób sercowo-naczyniowych. W protokole przedstawiono procedurę preparacji podskórnej i krezkowej tkanki tłuszczowej myszy, a następnie izolacji ich odpowiednich naczyń tętniczych. Wyizolowane tętnice są następnie trawione przy użyciu specyficznego koktajlu enzymów trawiennych skoncentrowanych na uwalnianiu funkcjonalnie zdolnych do życia komórek śródbłonka. Strawioną tkankę ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej przy użyciu komórek CD31 + / CD45 - jako markerów do pozytywnej identyfikacji komórek śródbłonka. Komórki mogą być sortowane w celu natychmiastowego przeprowadzenia dalszych testów funkcjonalnych lub wykorzystane do wygenerowania pierwotnych linii komórkowych. Technika izolowania i trawienia tętnic z różnych łożysk naczyniowych zapewni naukowcom możliwości oceny świeżo wyizolowanych komórek naczyniowych z tętnic będących przedmiotem zainteresowania i umożliwi im przeprowadzenie szerokiego zakresu testów funkcjonalnych na określonych typach komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka są dobrze znane ze swoich ważnych ról w różnych procesach fizjologicznych, w tym funkcji barierowych, angiogenezie i regulacji napięcia naczyniowego1,2. Chociaż dysfunkcja komórek śródbłonka jest dobrze udokumentowana w promowaniu miażdżycy, nadciśnienia, cukrzycy itp., mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji śródbłonka pozostają słabo poznane i prawdopodobnie różnią się między różnymi łożyskami naczyniowymi2,3,4. Próba rozwikłania tych patologicznych mechanizmów dysfunkcji komórek śródbłonka jest kwestionowana przez ograniczony dostęp do czystej populacji komórek śródbłonka z tkanek i/lub zmiany fenotypowe komórek śródbłonka w hodowli5,6. Dlatego możliwość izolowania i wykonywania analiz na komórkach śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych w ich natywnej postaci da wgląd w procesy chorób sercowo-naczyniowych.

Ten protokół przedstawia procedurę preparowania podskórnej i krezkowej tkanki tłuszczowej od myszy, a następnie izolacji ich odpowiednich naczyń tętniczych. Funkcjonalnie żywotne komórki śródbłonka wyściełające ściany tętnic są uwalniane za pomocą specyficznego koktajlu enzymów. Szczególną uwagę zwrócono na optymalizację warunków protokołu trawienia w celu uzyskania wystarczającej wydajności komórek śródbłonka z <1 mg tkanki wyjściowej, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonych markerów biomolekularnych do analizy. Wyizolowane komórki śródbłonka są następnie identyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność CD31 (PECAM) służy przede wszystkim do identyfikacji komórek śródbłonka. Ze względu na ekspresję CD31 w innych typach komórek, w tym w kilku komórkach pochodzenia krwiotwórczego, które również wykazują ekspresję CD45, czystość izolowanych komórek śródbłonka została dodatkowo zwiększona przez wykluczenie komórek wykazujących ekspresję zarówno CD31, jak i CD455,6,7,8. Ponadto, w zależności od pytania badawczego i dalszych zastosowań, które mają być zastosowane, naukowcy powinni rozważyć wybór obszernego panelu markerów selekcji pozytywnej i negatywnej, aby zoptymalizować czystość populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Chociaż technika preparowania i izolowania tętnic depochodnych tłuszczu była stosowana w poprzednich publikacjach9,10,11,12,13, szczegółowy protokół opisujący izolację osadzonych tętnic nie został jeszcze przedstawiony. Zademonstrowanie techniki izolacji i trawienia tętnic z różnych łożysk naczyniowych danego gatunku będącego przedmiotem zainteresowania zapewni naukowcom możliwości oceny świeżo wyizolowanych komórek naczyniowych z tętnic będących przedmiotem zainteresowania i umożliwi im przeprowadzenie szerokiego zakresu testów funkcjonalnych na określonych typach komórek. Testy mogą obejmować między innymi cytometrię przepływową do sortowania komórek i ekspresji białek błonowych5,8, elektrofizjologia aktywności kanałów jonowych9, profilowanie molekularne (proteomika/analizy genomiczne itp.)14,15, oraz generowanie pierwotnych linii komórkowych do badań przesiewowych leków in vitro16,17.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt w tych badaniach zostało zatwierdzone przez University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (#1372).

1. Sekcja i czyszczenie tkanek

UWAGA: 10- do 12-tygodniowe myszy C57BL/6J są używane w protokole wideo. Proszę zapoznać się z Rysunek 1 w celu zapoznania się ze schematem i pożądanym wynikiem rozwarstwienia tkanek i czyszczenia tętnic oraz zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać listę materiałów eksploatacyjnych i informacje o producencie.

  1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Zabezpiecz mysz za pomocą szpilek rozpoznawczych i spryskaj powierzchnię brzuszną 70% etanolem.
  3. Izolacja podskórnych tkanek tłuszczowych zlokalizowanych przy każdej kończynie tylnej
    UWAGA: Potrzebne narzędzia preparacyjne: proste nożyczki Bonn (9 cm) i, zakrzywione kleszcze Graefe.
    1. Za pomocą kleszczy unieś skórę tuż nad genitaliami i wykonaj małe (2 mm) nacięcie w skórze.
    2. Włóż końcówkę nożyczek w miejsce nacięcia i wykonaj 4-5 cm nacięcie w linii środkowej, zaczynając od początkowego nacięcia i rozcinając czaszkę do podstawy mostka. Uważaj, aby nie przeniknąć do jamy brzusznej.
    3. Wykonaj 1 cm nacięcie boczne, rozciągające się na boki od linii środkowej bezpośrednio poniżej kończyny przedniej.
    4. Wykonaj ukośne 1 cm nacięcie między tylną kończyną a genitaliami.
    5. Wykonaj małe nacięcia wzdłuż nacięć skóry w linii środkowej, aby usunąć powiązaną tkankę łączną i odsłonić podskórny magazyn tłuszczu. Przypnij skórę w dół.
    6. Zidentyfikuj podskórną tkankę tłuszczową w kształcie litery "C" i tętnicę/żyłę, która biegnie prostopadle do jamy brzusznej.
    7. Zacznij od dołu kształtu C w pobliżu narządów płciowych i delikatnie chwyć tkankę tłuszczową, aby odsłonić tkankę łączną. Wykonaj małe nacięcia w tkance łącznej, aby oddzielić tłuszcz od skóry. Unikaj naruszania odsłoniętych naczyń krwionośnych.
    8. Kontynuuj preparowanie tkanki łącznej, aż podskórna tkanka tłuszczowa będzie mogła zostać usunięta w stanie nienaruszonym. Ostrożnie oddziel odsłoniętą tętnicę od otaczającej tkanki łącznej.
    9. Przechowywać wyizolowaną podskórną tkankę tłuszczową w buforze HEPES na lodzie, aż będzie gotowa do wyizolowania interesującego łożyska naczyniowego.
    10. Powtórzyć kroki 1.3.3.-1.3.5. dla pozostałego tylnego podskórnego magazynu tkanki tłuszczowej.
  4. Izolacja krezkowego magazynu tłuszczu
    UWAGA: Potrzebne narzędzia preparacyjne: proste nożyczki Bonn (9 cm), kleszcze Graefe, para kleszczy #5, proste nożyczki do tęczówki i zakrzywione nożyczki Bonn (9 cm).
    1. Za pomocą kleszczyków Graefe unieś cienką ścianę jamy otrzewnej nad pęcherz moczowy i wykonaj małe nacięcie prostymi nożyczkami.
    2. Powoli podnieś przebitą ścianę jamy otrzewnej, ostrożnie włóż proste nożyczki tęczówki w miejsce nacięcia i wykonaj 4-5 cm nacięcie od pęcherza moczowego do mostka.
    3. Wykonaj dwa poziome nacięcia o długości 1 cm za pomocą prostych nożyczek do tęczówki, rozciągające się na boki od linii środkowej do bezpośrednio nad kończyną tylną i poniżej kończyny przedniej. Użyj kleszczy Graefe, aby odkleić mięśnie brzucha i odsłonić wnętrzności otrzewnej.
    4. Powtórz krok 1.4.3. po przeciwnej stronie.
    5. Użyj pary kleszczy #5, aby podnieść jelita z jamy trzewnej, aby odsłonić tkankę tłuszczową krezkową.
    6. Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy #5, aby oddzielić tłuszcz wzdłuż okrężnicy, zaczynając od kątnicy do miejsca, w którym okrężnica schodzi z pola widzenia.
    7. Wróć do kątnicy i użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy #5, aby oddzielić tłuszcz wzdłuż jelita cienkiego do trzustki. Usuń niewielką część trzustki, aby całkowicie odizolować tkankę tłuszczową krezkową.
      UWAGA: Usunięcie niewielkiej części trzustki wraz z tłuszczem krezkowym może pomóc w oczyszczeniu tętnic, ponieważ zapewnia stabilność podczas czyszczenia.
    8. Przechowywać wyizolowaną tkankę tłuszczową krezkową w buforze HEPES na lodzie, aż będzie gotowa do wyizolowania tętnic krezkowych.
  5. Izolacja odpowiednich tętnic z tkanki tłuszczowej podskórnej i krezkowej
    UWAGA: Potrzebne narzędzia preparacyjne: naczynie preparacyjne i stereoskop ze źródłem światła, para kleszczy #55 i para kleszczy #5.
    1. Umieść ~10 ml zimnego buforu HEPES w naczyniu preparacyjnym i przenieś tkankę tłuszczową do naczynia za pomocą kleszczy #5.
    2. Użyj stereoskopu przy powiększeniu 1x, aby wyświetlić i ustawić tkankę tłuszczową tak, aby odsłonić parę tętnica/żyła (Rysunek 2).
    3. Użyj kleszczyków #55, aby ostrożnie usunąć miąższową tkankę tłuszczową z tętnicy. Usuwaj małe kawałki tkanki tłuszczowej na raz i uważnie obserwuj pary tętnica/żyła pod stereoskopem, aby zidentyfikować i uniknąć uszkodzenia interesującego układu krwionośnego.
      nuta: Dostosuj odpowiednio powiększenie i źródło światła, aby oczyścić tętnice. Zwiększ powiększenie i natężenie światła, aby lepiej widzieć tętnice podczas usuwania tkanki tłuszczowej. Dokładne czyszczenie tętnic powinno odbywać się w powiększeniu 4x-5x. Ważne jest, aby rozróżnić tkanki łączne (kolageny), żyły i tętnice. Tkanki łączne i włókna kolagenowe mają wygląd sznurka bez gałęzi, są prążkowane i mają białawy kolor. W przeciwieństwie do włókien kolagenowych i tkanek łącznych, tętnice i żyły są przezroczyste i mają wiele rozgałęzień o określonym świetle. Małe tętnice i żyły mogą wyglądać podobnie, gdy są wolne od tkanki miąższowej. Obecność krwi w świetle może dodatkowo pomóc w identyfikacji tętnic od żył. Żyły mają cieńsze ściany naczyń krwionośnych i większe światło oraz zawierają więcej krwi w porównaniu z tętnicami o porównywalnej wielkości.
    4. Powtarzać krok 1.5.3 aż do momentu, gdy tętnice zostaną całkowicie pozbawione tkanki tłuszczowej w miąższu.
    5. Użyj kleszczyków #5, aby przenieść oczyszczone tętnice do nowej rurki ze świeżym buforem HEPES i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do trawienia.

2. Trawienie izolowanych tętnic w celu izolacji komórek śródbłonka

UWAGA: Proszę zapoznać się z Rysunek 2 dla schematu trawienia tkanek i izolacji komórek śródbłonka oraz Tabeli Materiałów, aby uzyskać pełną listę materiałów potrzebnych do protokołu.

  1. Dodać po 1 mg dypazy i elastazy do każdej probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml. Dodać 2 ml roztworu dysocjacyjnego do każdej probówki. Wirować i inkubować w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Użyj kleszczyków #5, aby przenieść oczyszczone tętnice (krok 1.5.5.) do odpowiednich probówek na próbki. Końcowe stężenie każdego enzymu wynosi 0,5 mg/ml.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem przez odwrócenie co 10-15 minut, tak aby tętnice były zawieszone w roztworze w celu utrzymania stałego i jednolitego kontaktu między enzymami a tętnicami.
  3. Zważyć 1 mg kolagenazy typu I na próbkę i dodać ją do nowych probówek.
  4. Pozwól, aby tętnice osiadły na dnie rurki. Usunąć 500 μl buforu z góry, nie naruszając tętnic i przenieść go do wyznaczonych probówek zawierających kolagenazę. Odwirować i zwrócić roztwór do odpowiednich próbek w oryginalnych probówkach na próbki. Końcowe stężenie kolagenazy typu I wynosi 0,5 mg/ml.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Upewnić się, że tętnice rozdzieliły się na części po krótkim wstrząsnięciu probówką z próbką. Jeśli tętnice nie rozdzielają się na części po zaburzeniach, inkubować w odstępach 5-minutowych, aż będzie widoczny rozpad tętnicy.
  6. Za pomocą szklanej pipety energicznie rozcieraj strawioną tkankę 10x-15x, aby mechanicznie zdysocjować komórki.
  7. Przepuścić roztwór i strawioną tkankę przez sitko do komórek o wielkości 70 μm lub sitko do rurki do cytometrii przepływowej w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.

3. Barwienie komórek śródbłonka przed cytometrią przepływową

UWAGA: Barwienie i przetwarzanie komórek śródbłonka odbywa się na lodzie w celu poprawy żywotności komórek, chyba że jest to zalecane. Probówki okrągłodenne z polistyrenu o pojemności 5 ml odwirowuje się przy 1,163 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).

  1. Odwirować zawiesiny jednokomórkowe o stężeniu 1,163 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 5% BSA przez 30 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Badacze powinni rozważyć blokowanie receptorów FC w zależności od typu komórki, celu zainteresowania i użytego przeciwciała18,19.
  3. Dodać 1 μl barwienia żywotności komórek (wzbudzenie 405 nm) (tabela materiałów) i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 1,163 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS + 1% BSA.
  5. Do próbek dodać pierwszorzędowe przeciwciała sprzężone z CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/próbkę) i CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/próbkę) i inkubować na kołysce w lodówce przez 15 minut po przykryciu próbek folią aluminiową.
    UWAGA: Aby zidentyfikować i / lub uzyskać czystą populację komórek śródbłonka, zbadaj zarówno CD31, jak i CD45 za pomocą przeciwciał pierwotnych sprzężonych z CD31 i CD45 z wyraźną fluorescencją wzbudzenia / emisji i komórek bramkowych / sortujących z profilem ekspresji CD31 + CD45. Kompensacja może być wymagana w zależności od użytych fluoroforów18,20,21.
  6. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS + 1% BSA bezpośrednio do zawiesiny komórek.
  7. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 1,163 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl 1% formaldehydu z 0,1% BSA. Przechowywać w lodówce przykrytej folią aluminiową, aż będzie gotowy do cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Wydajność komórek poprawia się poprzez zmniejszenie liczby etapów mycia i wirowania. Mogą one wymagać zmiany w zależności od podejścia do wyników. Próbkę w utrwalaczu należy przeanalizować w ciągu 24 godzin.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat przepływu pracy jest pokazany w Rysunek 1. Na schemacie wyróżnione są kroki protokołu opisane bardziej szczegółowo w tekście protokołu. Rysunek 2 pokazuje zdjęcia podskórnej tkanki tłuszczowej (Figura 2A, po lewej) po rozwarstwieniu i podskórnej arkady tętnicy (Figura 2A, po prawej) po oczyszczeniu tkanki miąższowej. Rysunek 2 pokazuje również krezkową tkankę tłuszczową (Rycina 2B, po lewej) po rozwarstwieniu i krezkowym łuku tętniczego (Rysunek 2B, po prawej) po oczyszczeniu tkanki miąższowej.

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu pomóc badaczom potencjalnie zainteresowanym a) porównywaniem różnych łożysk naczyniowych magazynu tłuszczu w podstawowych podejściach naukowych i/lub modelach chorób, b) trawieniem łożysk naczyniowych przed izolacją komórek naczyniowych interesujących do dalszego zastosowania, oraz c) wykorzystaniem cytometrii przepływowej do identyfikacji komórek naczyniowych będących przedmiotem zainteresowania (Rysunek 3) do różnych zastosowań, w tym między innymi do analiz ekspresji białek, jak to ma miejsce tutaj (Rysunek 4). Rysunek 3 przedstawia przykład naszego podejścia do identyfikacji komórek śródbłonka z trawionych tętnic myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Preparaty komórkowe uzyskane z trawionych tętnic tłuszczowych podskórnych (Rycina 3A) lub krezkowych (Figura 3B) wybarwiono CD31-PE, CD45-FITC i barwnikiem żywotności komórek przed utrwaleniem i identyfikacją żywotnych komórek śródbłonka CD31 + CD45 za pomocą cytometrii przepływowej, jak podobnie wykonano w innym miejscu8. Barwienie żywotności komórek pozwoliło na identyfikację tylko tych żywotnych komórek, które przetrwały protokół izolacji i trawienia przed utrwaleniem. Zastosowanie tej metody pozwoli naukowcom ocenić ekspresję lub funkcję żywotnych komórek naczyniowych, które są przedmiotem zainteresowania.

Aby ustalić, czy komórki śródbłonka wyizolowane z odrębnego układu naczyniowego magazynu tłuszczu wykazywały różnice w ekspresji białka błonowego, izolowane komórki zostały zbadane pod kątem translokazy kwasów tłuszczowych, CD36 (Rysunek 4), ponieważ niedawno wykazano, że to białko błonowe jest niezbędne w dystrybucji kwasów tłuszczowych do tkanek za pośrednictwem śródbłonka22. W związku z tym określenie względnych różnic ekspresji między błonowym CD36, na przykład, w różnych łożyskach naczyniowych może a) wspierać istniejące dane dotyczące zróżnicowanej preferencji wykorzystania kwasów tłuszczowych między różnymi tkankami i / lub b) ujawnić potencjalne nowe różnice w rozmieszczeniu kwasów tłuszczowych w tkankach w zdrowiu i chorobie. Z tych samych preparatów trawionych komórek naczyniowych, których przykładem jest Figura 3, komórki śródbłonka CD31 + CD45 −CD36 + zidentyfikowano w podskórnej (Figura 4A) i krezkowej ( Figura 4B), a ekspresję CD36 określono ilościowo w tej populacji w każdym łożysku naczyniowym. Rysunek 4C i Rysunek 4D pokazują, że zarówno procent komórek śródbłonka wyrażających CD36, jak i intensywność ekspresji CD36 były większe w podskórnych komórkach śródbłonka w porównaniu do obserwowanych w komórkach śródbłonka krezkowego. Te wstępne wyniki wspierają zastosowanie naszej metodologii do identyfikacji wyraźnych różnic między łożyskami naczyniowymi.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat działania do izolacji komórek śródbłonka z podskórnej i trzewnej tkanki tłuszczowej do dalszych zastosowań. (A) 10-12-tygodniowe myszy C57BL/6J zostały poddane eutanazji i wykorzystane do zademonstrowania tej procedury. (Bi) W pierwszej kolejności usuwana jest podskórna tkanka tłuszczowa. (Bii) Następnie usuwana jest tkanka tłuszczowa krezkowa (trzewna). Białe przerywane linie wskazują lokalizacje podskórnych (po lewej) i krezkowych (po prawej) magazynów tłuszczowych po rozwarstwieniu i usunięciu. Odpowiednie tętnice są izolowane do dalszych zastosowań. (C) W tym protokole izolowane tętnice są następnie trawione przy użyciu specyficznego koktajlu enzymatycznego jako pierwszy krok do uwolnienia funkcjonalnie zdolnych do życia komórek śródbłonka. (D) Izolowane komórki śródbłonka identyfikuje się przez sondowanie komórek CD31 + i CD45 - przy użyciu sprzężonych przeciwciał przed analizą cytometrii przepływowej. Komórki o profilu ekspresji CD31+/CD45− są komórkami śródbłonka będącymi przedmiotem zainteresowania do dodatkowych analiz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Izolowane podskórne i trzewne tkanki tłuszczowe oraz odpowiednie tętnice. (A) Po lewej: Wyizolowana podskórna tkanka tłuszczowa w kształcie litery "C" z kończyn tylnych. Główna gałąź podskórnej tętnicy tłuszczowej, oznaczona strzałką (1), ujawnia się po usunięciu miąższowej tkanki tłuszczowej. Po prawej: Izolowane podskórne tętnice tłuszczowe. (B) Po lewej: Tkanka tłuszczowa krezkowa (trzewna) jest izolowana z jelita. Po prawej: Odpowiedni arkada tętnicy izoluje się poprzez usunięcie tkanki miąższowej. Pomiędzy obrazami tkanki tłuszczowej (5 mm) i tętnic (1 mm) stosuje się różne skale. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Identyfikacja komórek śródbłonka po trawieniu tkanki tętniczej za pomocą cytometrii przepływowej. Reprezentatywne wykresy przedstawiające komórki uwolnione z izolowanych (A) podskórnych lub (B) krezkowych tętnic tłuszczowych. Komórki poddano działaniu sprzężonych przeciwciał, które były ukierunkowane na zewnątrzkomórkowe epitopy CD31 (PE) i CD45 (FITC) przed utrwaleniem. Cytometria przepływowa została wykorzystana do identyfikacji populacji komórek śródbłonka CD31+CD45−. Barwienie żywotności komórek wykorzystano do wybrania tylko komórek, które przetrwały protokoły izolacji i trawienia do kolejnych analiz. Ponadto, odpowiednie bramkowanie na tym etapie pozwoli na dalsze oddzielenie zamierzonej populacji komórek od komórek zanieczyszczających, jeśli znana jest wielkość typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza ekspresji błony CD36 w komórkach śródbłonka tętnicy tłuszczowej podskórnej i krezkowej za pomocą cytometrii przepływowej. Reprezentatywne wykresy populacyjne i histogramy przedstawiające ekspresję błony śródbłonkowej CD36 (APC) w (A) podskórnych lub (B) krezkowych tętnicach tłuszczowych. (C) Odsetek komórek śródbłonka (EC) wykazujących ekspresję CD36 w EC podskórnym i krezkowym (n = 5, 3 mężczyźni, 2 kobiety; *p < 0,05 po teście t-Studenta). (D) Znormalizowana ekspresja CD36 błony EC w podskórnych i krezkowych tętnicach tłuszczowych (n = 5, 3 mężczyzn, 2 kobiety; *p < 0,05 po teście t Studenta). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja śródbłonka jest prekursorem ciężkich stanów chorobowych, prawdopodobnie prowadząc do rozwoju miażdżycy, nadciśnienia tętniczego i udaru mózgu 3,23. Podczas gdy zidentyfikowane mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji śródbłonka w danym stanie patologicznym są liczne, różne łożyska naczyniowe mogą być w różny sposób dotknięte stanami patologicznymi 4,24. Ponadto różne czynniki ryzyka sercowo-naczyniowego (np. otyłość, nadciśnienie, dyslipidemia, palenie tytoniu, cukrzyca) wywołują dysfunkcję poprzez różne różne mechanizmy23,25. Dlatego tak ważne jest wyizolowanie populacji komórek śródbłonka z ustalonych zwierzęcych modeli choroby lub dostępnych tkanek ludzkich i przeprowadzenie testów na komórkach natychmiast usuniętych ze środowiska in vivo. Izolowanie komórek w ten sposób ma wyjątkową przewagę nad badaniem komórek w hodowli, ponieważ są one pozbawione zmian fenotypowych wywołanych hodowlą 5,6. Co więcej, włączenie heterogenicznej populacji komórek śródbłonka, jak zaobserwowano in vivo 26,27 (i które można dalej oddzielić za pomocą sortowania komórek wspomaganego przepływem), z żywego organizmu lepiej informuje środowisko in vivo. Wreszcie, metoda ta ma zastosowanie do badania wielu modeli zwierzęcych i potencjalnie tkanek ludzkich i może być wykorzystana do wygenerowania pierwotnych linii hodowli komórkowych, jeśli taka potrzeba jest uzasadniona.

Krytycznym krokiem w tym protokole i krokiem, który będzie wymagał największego dostosowania dla różnych łożysk naczyniowych lub typów komórek, które nie zostały tutaj przedstawione, jest trawienie tkanki naczyniowej. Ten krok musi być zoptymalizowany pod kątem zdrowia komórek bez zmniejszania ich wydajności. Specyficzne stosowane enzymy i czas trawienia mają kluczowe znaczenie dla optymalizacji zdrowia komórek i wydajności, aby móc odpowiednio przeprowadzać dalsze testy. W celu identyfikacji błonowej ekspresji CD36, wykrytej za pomocą cytometrii przepływowej w komórkach śródbłonka podskórnego i krezkowego (ryc. 4), opracowano zmodyfikowaną wersję protokołu trawienia pierwotnie zaprojektowanego dla elektrofizjologii patch-clamp28 . Obejmowało to wydłużenie czasu trawienia kolagenazy I do 30 minut w celu zwiększenia wydajności komórek, aby lepiej sprostać wymaganiom cytometrii przepływowej w porównaniu z tym, co jest wymagane w badaniach typu patch-clamp. Ponieważ modyfikacja ta może w pewnym stopniu wpływać na zdrowie komórek, w analizach cytometrii przepływowej zastosowano barwienie żywotności komórek, aby upewnić się, że zgodnie z tym protokołem oceniano tylko żywotne komórki śródbłonka (ryc. 3). Zaleca się, aby badania mające na celu wyizolowanie komórek z tkanki naczyniowej obejmowały marker żywotności komórek przed oceną pożądanego podejścia.

Opisany protokół jest wystarczający do uwolnienia żywotnych komórek śródbłonka do analizy i dalszych zastosowań z próbek tętniczych o stężeniu ≤1 mg pochodzących od myszy; Jeśli jednak interesujące nas tętnice miałyby zostać wyizolowane z różnych tkanek lub organizmów (np. ludzi), co skutkowałoby znacznie różnymi masami tętniczymi, należałoby zoptymalizować zawartość enzymu trawiącego i czas inkubacji, aby skutecznie wyizolować badaną populację komórek. W przypadku niektórych łożysk naczyniowych, które zaczynają się od jeszcze mniejszych ilości tkanki wyjściowej niż przedstawione tutaj łóżka podskórne i krezkowe (np. Tętnice wieńcowe), może być konieczne połączenie tętnic od kilku myszy na próbkę. Rzeczywiście, może to być konieczny krok dla każdego łożyska naczyniowego, biorąc pod uwagę, że podejście wynikowe wymaga stosunkowo wysokiej wydajności komórek. Głównym ograniczeniem jest to, że ze względu na charakter różnic w trawieniu próbki, wydajność komórek może czasami znacznie różnić się w różnych partiach, nawet jeśli pochodzą z tego samego łożyska naczyniowego. Może to powodować problemy podczas analizowania danych i w razie potrzeby powinno być uwzględniane za pomocą normalizacji. Na przykład ekspresja CD36 była niezwykle zmienna w surowych danych ze względu na zmiany w wydajności komórek w poszczególnych próbkach podskórnych i krezkowych tętnic tłuszczowych. W związku z tym surowe dane znormalizowano do średniej intensywności fluorescencji CD31 + CD45 - przy założeniu, że ta metoda skoryguje różnice w partiach (Rysunek 4). Oczywiście, w zależności od podejścia, mogą być wymagane bardziej wyrafinowane analizy statystyczne i metody normalizacji.

Podsumowując, w artykule przedstawiono metodę preparowania, izolowania i trawienia tętnic podskórnych i krezkowych u myszy w celu zbadania ekspresji i/lub funkcji celów śródbłonka będących przedmiotem zainteresowania. Dzięki modyfikacjom przedstawionego protokołu można badać różne łożyska naczyniowe i typy komórek (np. komórki mięśni gładkich). Protokół ten, jako podstawa dla wielu dostępnych podejść eksperymentalnych, może przyczynić się do pogłębienia wiedzy na temat biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ku pamięci Richa Westa, genialnego naukowca, kolegi i drogiego przyjaciela. Chcielibyśmy podziękować University of Delaware Flow Cytometry and BioImaging Core jako część Delaware Biotechnology Institute za ich ciągły wkład w nasze badania. Chcielibyśmy również podziękować Emmie Hudgins za staranne przejrzenie i zredagowanie manuskryptu. Nasza praca jest wspierana przez National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Projekt ten był również wspierany przez program Delaware INBRE, z grantem NIGMS (P20GM103446) z National Institutes of Health i stanu Delaware (I.S. Fancher) oraz grantem badawczym University of Delaware General University (I.S. Fancher). Odpowiedzialność za te treści ponoszą wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzia do preparowania tkanek
5 kleszczy (2)Fine Science Tools11252-00Do izolacji krezki i transferu tętnic
55 kleszczy (2)Fine Science Tools11295-51Do usuwania miąższowej tkanki tłuszczowej
Zakrzywione nożyczki BonnFine Science Tools14061-10Do izolacji Magazyn tkanki tłuszczowej krezki
Kleszcze GraefeFine Science Tools11051-10Do ogólnych etapów preparacji i izolacji podskórnego magazynu tkanki tłuszczowej
Proste nożyczki BonnFine Science Tools14060-09Do ogólnych etapów preparacji i izolacji podskórnego magazynu tkanki tłuszczowej
Stereoskop ze źródłem światłaLaxcoZ230PT40Do usuwania miąższu tkanki tłuszczowej i izolacji tętnic
Enzymy trawienne do trawienia tętnic
Collagenase Type IWothington-BioChemLS004194
Dispase (neutralna proteaza)Wothington-BioChemLS02110
ElastazaWothington-BioChemLS002292
Solutions Receptury
Bufor HEPES, pH 7,4Stężenie końcowe
Dwuwodny chlorek wapniaJ.T.Baker1332-12 mM
Dekstroza (D-glukoza) bezwodnaFisherD16-50010 mM
HEPESFisherBP310-50010 mM
Chlorek magnezuFisherM33-5001 mM
Chlorek potasuFisherP217-5005 mM
Chlorek soduOxoidLP0005145 mM
Roztwór dysocjacyjny, pH 7,30-7,40
Dekstroza (D-glukoza) bezwodnaFisherD16-50010 mM
HEPESFisherBP310-50010 mM
ChlorekmagnezuFisherM33-5002 mM
Chlorek potasuFisherP217-50056 mM
Chlorek soduOxoidLP000555 mM
L-glutaminian sodu jednowodnyTCIG018880 mM
Flow Cytometria Analizy
5 mL Polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadkąsitka komórkowegoFalcon352235
CD31-PEMiltenyi Biotec130-119-6530,75&mikro; g/próbka
CD36-APCR& D SystemsAF25192.5 i mikro; g/ próbka
CD45-FITCBioLegend1031082,5 i mikro; g / próbka
Żywy/martwy Zestaw do barwienia fioletowych martwych komórek (barwienie żywotności komórek)InvitrogenL349551µ L/próbka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411(2019).
  2. Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
  3. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  4. Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
  5. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  6. Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
  7. Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520(2017).
  8. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  9. Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
  10. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  11. Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
  12. Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
  13. Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
  14. van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
  15. Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
  16. Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
  17. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
  18. Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641(2016).
  19. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167(2013).
  20. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).
  21. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546(2010).
  22. Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
  23. Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
  24. Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
  25. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
  26. Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
  27. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).
  28. Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka t uszczowaizolacja kom rek r db onkacytometria przep ywowat uszcz podsk rnyt uszcz krezkowysekcja t tnicybarwienie ywotno ci kom rekmarkery CD31 CD45trawienie enzymatyczne

Powiązane artykuły