Ten artykuł opisuje technikę szybkiego cięcia kości skroniowej człowieka, która wykorzystuje mikropiłę z podwójnymi diamentowymi ostrzami do generowania cienkich plasterków do szybkiego odwapnienia i analizy immunohistochemii kości skroniowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybkie cięcie kości skroniowej człowieka w celu oceny patologii ucha środkowego związanej z COVID-19
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza histopatologiczna przekrojów kości skroniowej człowieka jest podstawową techniką do badania patologii ucha wewnętrznego i środkowego. Wycinki kości skroniowej są przygotowywane przez pośmiertne pobranie kości skroniowej, utrwalenie, odwapnienie, osadzenie i barwienie. Ze względu na gęstość kości skroniowej odwapnienie jest procesem czasochłonnym i wymagającym dużych zasobów; Kompletne przygotowanie tkanek może zająć średnio 9-10 miesięcy. Spowalnia to badania otopatologiczne i utrudnia badania, w których liczy się czas, takie jak te związane z pandemią COVID-19. W artykule opisano technikę szybkiego przygotowania i odwapnienia skroniowych odcinków kości w celu przyspieszenia przetwarzania tkanek.
Kości skroniowe zostały pobrane pośmiertnie przy użyciu standardowych technik i utrwalone w 10% formalinie. Precyzyjna mikropiła z podwójnymi diamentowymi ostrzami została użyta do pocięcia każdej sekcji na trzy grube sekcje. Grube skrawki kości skroniowej były następnie odkamieniane w roztworze odwapniającym przez 7-10 dni, a następnie zanurzone w parafinie, pocięte na cienkie (10 μm) odcinki za pomocą kriotomii i zamontowane na nienaładowanych szkiełkach. Próbki tkanek zostały następnie odparafinowane i ponownie uwodnione w celu barwienia przeciwciałami (ACE2, TMPRSS2, furyna) i zobrazowane. Technika ta skróciła czas od pobrania do analizy tkanek z 9-10 miesięcy do 10-14 dni. Szybkie cięcie kości skroniowej może przyspieszyć badania otopatologiczne i zmniejszyć zasoby niezbędne do przygotowania tkanek, a jednocześnie ułatwić badania, w których liczy się czas, takie jak te związane z COVID-19.
Wprowadzenie
Badania kości skroniowej człowieka stanowią nieocenione źródło do badania patologii i patofizjologii ucha wewnętrznego i środkowego. Przed XIX wiekiem niewiele było wiadomo o chorobach otologicznych1,2,3. Aby lepiej zrozumieć chorobę otologiczną i "chirurgię słuchu ratującą z rąk znachorów", Joseph Toynbee (1815-1866) opracował metody badania przekrojów histologicznych ludzkiej kości skroniowej3. Praca ta była kontynuowana przez Adama Politzera (1835-1920) w Wiedniu i innych w całej Europie przez pozostałą część XIX wieku, który wykorzystał skrawki koś....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół został opracowany za zgodą IRB (IRB00250002) i zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą korzystania z tkanek ludzkich i materiału zakaźnego. Każdy dawca kości skroniowej wyraził pisemną zgodę przed śmiercią lub zgodę uzyskano pośmiertnie od rodziny dawcy. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole.
1. Pobieranie kości skroniowych
- Uzyskaj zgodę lokalnej instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB), dokonaj przeglądu polityki uczelni dotyczącej wykorzystania materiału ludzkiego ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Barwienie hematoksyliną i eozyną błony śluzowej ucha środkowego oraz trąbki słuchowej wykazało zachowanie struktury błony śluzowej ucha środkowego oraz tkanki podśluzowej ucha środkowego po obróbce (Rycina 1). Obrazy immunohistochemiczne wykazały ekspresję białek ACE2, TMPRSS2 i furyny w obrębie błony śluzowej ucha środkowego oraz trąbki słuchowej (Rycina 1). Obecność tych białek w uchu środkowym wskazuje na możliwą drogę, poprzez którą SARS-CoV-2 może infekować.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badania nad kością skroniową człowieka mają kluczowe znaczenie dla badania patologii ucha wewnętrznego i środkowego, ale pozostają przedsięwzięciem wymagającym dużej ilości czasu i zasobów. W artykule opisano technikę, która wykorzystuje mikropiłę diamentową do generowania grubych skrawków kości skroniowej, które można szybko odwapnić przed dalszym cięciem, dzięki czemu czas od pobrania tkanki do badania można skrócić z 9-10 miesięcy do 10-14 dni. Technika ta może zmniejszyć zasoby wymagane do przetwarzania kości skronio.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Mohamedowi Leharowi za pomoc w tym projekcie. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało anty-ACE-2 (rozcieńczenie 1:50) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| (rozcieńczenie 1:250) | Przeciwciało | EPR 14674 | |
| (rozcieńczenie 1:1 000) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Ręczny mikroskop systemowy | Olympus Life Science Solutions | ||
| Hybrydowa płytka CBN/diamentowa Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8 | 'Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Kamera mikroskopowa | Nikon | ||
| Podwójny endogenny blok enzymatyczny (komercyjne rozwiązanie blokujące) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (roztwór odwapniający kwas mrówkowy) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Drugorzędowe przeciwciało (rozcieńczenie 1:100) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Zestaw do wykrywania igG przeciwko kozom, peroksydaza (1:100 rozcieńczenie) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metalograficzny PICO 155P Precyzyjna piła | Pace Technologie | PICO 155P | |
| Microsaw NIS Elements Wersja oprogramowania 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafina |
| Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe z białym matowym końcem | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | kriotom |
| Triology Roztwór do obróbki wstępnej (komercyjny roztwór do obróbki wstępnej) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Ksylen | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
Bibliografia
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
