Artykuł metodologiczny

Szybkie cięcie kości skroniowej człowieka w celu oceny patologii ucha środkowego związanej z COVID-19

DOI:

10.3791/64012

⸱

18 maja 2022

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje technikę szybkiego cięcia kości skroniowej człowieka, która wykorzystuje mikropiłę z podwójnymi diamentowymi ostrzami do generowania cienkich plasterków do szybkiego odwapnienia i analizy immunohistochemii kości skroniowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza histopatologiczna przekrojów kości skroniowej człowieka jest podstawową techniką do badania patologii ucha wewnętrznego i środkowego. Wycinki kości skroniowej są przygotowywane przez pośmiertne pobranie kości skroniowej, utrwalenie, odwapnienie, osadzenie i barwienie. Ze względu na gęstość kości skroniowej odwapnienie jest procesem czasochłonnym i wymagającym dużych zasobów; Kompletne przygotowanie tkanek może zająć średnio 9-10 miesięcy. Spowalnia to badania otopatologiczne i utrudnia badania, w których liczy się czas, takie jak te związane z pandemią COVID-19. W artykule opisano technikę szybkiego przygotowania i odwapnienia skroniowych odcinków kości w celu przyspieszenia przetwarzania tkanek.

Kości skroniowe zostały pobrane pośmiertnie przy użyciu standardowych technik i utrwalone w 10% formalinie. Precyzyjna mikropiła z podwójnymi diamentowymi ostrzami została użyta do pocięcia każdej sekcji na trzy grube sekcje. Grube skrawki kości skroniowej były następnie odkamieniane w roztworze odwapniającym przez 7-10 dni, a następnie zanurzone w parafinie, pocięte na cienkie (10 μm) odcinki za pomocą kriotomii i zamontowane na nienaładowanych szkiełkach. Próbki tkanek zostały następnie odparafinowane i ponownie uwodnione w celu barwienia przeciwciałami (ACE2, TMPRSS2, furyna) i zobrazowane. Technika ta skróciła czas od pobrania do analizy tkanek z 9-10 miesięcy do 10-14 dni. Szybkie cięcie kości skroniowej może przyspieszyć badania otopatologiczne i zmniejszyć zasoby niezbędne do przygotowania tkanek, a jednocześnie ułatwić badania, w których liczy się czas, takie jak te związane z COVID-19.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania kości skroniowej człowieka stanowią nieocenione źródło do badania patologii i patofizjologii ucha wewnętrznego i środkowego. Przed XIX wiekiem niewiele było wiadomo o chorobach otologicznych1,2,3. Aby lepiej zrozumieć chorobę otologiczną i "chirurgię słuchu ratującą z rąk znachorów", Joseph Toynbee (1815-1866) opracował metody badania przekrojów histologicznych ludzkiej kości skroniowej3. Praca ta była kontynuowana przez Adama Politzera (1835-1920) w Wiedniu i innych w całej Europie przez pozostałą część XIX wieku, który wykorzystał skrawki kości skroniowej do opisania histopatologii wielu powszechnych schorzeń dotykających ucho2,3,4.

Pierwsze laboratorium ludzkiej kości skroniowej w Stanach Zjednoczonych zostało otwarte w 1927 roku w Johns Hopkins Hospital, gdzie Stacy Guild (1890-1966) opracowała metody przekroju kości skroniowej5,6. Metody opracowane przez Gildię składały się z 9-10-miesięcznego procesu, który obejmował pośmiertne zbiory, utrwalanie, odwapnianie w kwasie azotowym, odwadnianie w etanolu, osadzanie celoidyny, cięcie, barwienie i montaż. Modyfikacje tej techniki zostały później wprowadzone przez Harolda Schuknechta (1917-1996)7; Podstawowe składowe tego procesu pozostają jednak zasadniczo niezmienione.

Znaczne zasoby niezbędne do utrzymania laboratorium kości skroniowej stanowiły wyzwanie dla badań nad kością skroniową i prawdopodobnie przyczyniły się do spadku jej popularności w ciągu ostatnich 30 lat4,8. Znaczna część zasobów laboratoryjnych kości skroniowej musi być poświęcona 9-10 miesięcznemu procesowi przygotowania kości skroniowej. Jednym z najbardziej czasochłonnych etapów przygotowań jest odwapnienie kości skroniowej, która jest najgęstszą kością w ludzkim ciele. Odwapnienie jest zwykle wykonywane w kwasie azotowym lub kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i trwa od tygodni do miesięcy, wymagając częstej wymiany roztworów7,9. Co więcej, wrażliwe na czas badania ludzkiego ucha, takie jak te związane z pandemią COVID-19, mogą być utrudnione przez ten powolny proces przygotowania. W artykule opisano technikę szybkiego cięcia kości skroniowej, która wykorzystuje mikropiłę diamentową do generowania grubych sekcji, które pozwalają na szybkie odwapnienie i analizę tkanek w ciągu 10-14 dni od pobrania kości skroniowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został opracowany za zgodą IRB (IRB00250002) i zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą korzystania z tkanek ludzkich i materiału zakaźnego. Każdy dawca kości skroniowej wyraził pisemną zgodę przed śmiercią lub zgodę uzyskano pośmiertnie od rodziny dawcy. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole.

1. Pobieranie kości skroniowych

  1. Uzyskaj zgodę lokalnej instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB), dokonaj przeglądu polityki uczelni dotyczącej wykorzystania materiału ludzkiego i zakaźnego oraz uzyskaj zgodę na dawstwo tkanek przed zastosowaniem tego protokołu.
  2. Przed rozpoczęciem pracy z tkankami pobranymi od dawców kości skroniowej zakażonych COVID-19 należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). Upewnij się, że środki ochrony osobistej składają się z respiratora N-95 i osłony twarzy (lub alternatywnie systemu oczyszczania powietrza pod nadciśnieniem), fartucha i dwóch par rękawiczek. Zapoznaj się z technikami prawidłowego zakładania i zdejmowania środków ochrony osobistej przed rozpoczęciem tego protokołu10.
  3. Skroniową tkankę kostną należy pobrać w ciągu 12-24 godzin od śmierci dawcy. Jeśli ciało nie jest przechowywane w lodówce, upewnij się, że zbiory nastąpią w ciągu 8 godzin od śmierci.
    1. Pobranie kości skroniowych podczas autopsji przy użyciu metody czterech nacięć i bloku metodą osteotome7.
      1. Po kraniotomii należy usunąć mózg i ostro podzielić nerwy czaszkowe do wewnętrznego kanału słuchowego.
      2. Wykonaj pierwsze nacięcie kostne z osteotomem równolegle i tylko przyśrodkowo do płaskonabłonkowej części kości skroniowej.
      3. Wykonaj drugie nacięcie kości równolegle do pierwszego na przyśrodkowej granicy kości skroniowej.
      4. Następnie wykonaj trzecie nacięcie 3-4 cm do przodu i równolegle do grzbietu skalistego.
      5. Wykonaj czwarte nacięcie mniej więcej równolegle do trzeciego, 2 cm za grzbietem skalistym.
        UWAGA: Upewnij się, że wszystkie nacięcia przechodzą przez podstawę czaszki.
      6. Następnie usuń kość skroniową za pomocą ostrej sekcji, aby uwolnić przyczep tkanek miękkich wzdłuż dolnej krawędzi próbki. Jeśli balsamowanie ma być wykonane po pobraniu kości skroniowej, należy związać kikut tętnicy szyjnej.

2. Utrwalanie tkanek, odwapnianie i sekcje

  1. Natychmiast umieść tkankę w 200-300 ml 10% buforowanej formaliny (formaldehydu), tak aby tkanka była całkowicie zanurzona. Pozostaw tkankę w formaldehydzie na minimum 72 godziny w temperaturze pokojowej, codziennie zmieniając roztwory. Chusteczkę należy przechowywać w hermetycznym pojemniku i wymieniać roztwór pod wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się wirusa.
    UWAGA: Po upływie 72-godzinnego okresu utrwalania próbki nie muszą być już uważane za zakaźne.
  2. Użyj precyzyjnej mikropiły z podwójnymi ostrzami diamentowymi, aby pociąć każdą próbkę na trzy "grube" sekcje, aby umożliwić szybsze odwapnienie tkanek. Ustaw podwójne tarcze diamentowe na odległość 5 mm, tak aby środkowa część kości skroniowej miała grubość 5 mm. Upewnij się, że skrawki tkanki na obu końcach mają grubość 3-5 mm.
  3. Umieść grube skrawki w 200-300 ml 23% w/w roztworu odwapniającego z kwasem mrówkowym na 7-10 dni w temperaturze pokojowej, aż tkanka będzie wystarczająco miękka, aby można było ją zatopić w parafinie. Zmieniaj rozwiązania codziennie. Sprawdź, czy tkanki są odpowiednio odwapnione, dotykając próbki, która powinna być miękka.
    UWAGA: Odwapnienie można również zweryfikować za pomocą promieniowania rentgenowskiego.
  4. Opłucz próbki pod bieżącą wodą z kranu przez 24 godziny, umieszczając je w dużej zlewce pod bieżącą wodą.
  5. Odwodnić tkankę w serii alkoholi o rosnącym stężeniu7. Zanurz tkankę w 100-200 ml 70% etanolu na 1,5 godziny, a następnie trzy przepłucz w 95% i 100% etanolu odpowiednio przez 1,5 godziny każde. Następnie umyj chusteczkę 3 x 1,5 h w ksylenie.
  6. Zanurz grube skrawki w parafinie, z czterema zabiegami po 45 minut każdy.
  7. Użyj kriotomu, aby wyciąć cienkie (10 μm) odcinki. Ustaw tkankę tak, aby tkanka została przecięta w płaszczyźnie osiowej. W razie potrzeby wytnij grubsze (20 μm) odcinki
    8. .

3. Immunohistochemia i obrazowanie

  1. Jeśli pożądane jest tradycyjne barwienie hematoksyliną i eozyną (nie opisane tutaj), wykonaj barwienie przed zamontowaniem sekcji na szkiełkach szkiełkowych7.
  2. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych.
  3. Piecz szkiełka na gorącej płycie w temperaturze 60 °C przez 20 minut.
  4. Umieść szkiełka w uchwycie i zanurz je w komercyjnym roztworze do obróbki wstępnej zawierającym rozpuszczalnik organiczny (w tym przypadku dietanoloaminę) i etanol w celu odparafinowania, ponownego nawodnienia i zdemaskowania tkanki.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny do osiągnięcia zadowalających wyników immunohistochemii dla tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
  5. Szkiełka podgrzewamy w szybkowarze pod wysokim ciśnieniem przez 20 min.
  6. Umieść szkiełka w nawilżonej komorze i zablokuj tkankę dostępnym w handlu roztworem blokującym.
  7. Zbadaj skrawki tkanki pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko enzymowi konwertującemu angiotensynę 2 (ACE2; 1:50), transbłonowej proteazie seryny 2 (TMPRSS2, 1:1,000) i proteazie furyny (1:250).
    UWAGA: Przeciwciała ACE2, TMPRSS2 i furyny są stosowane, ponieważ uważa się, że białka te odgrywają rolę w zakaźności SARS-CoV-211,12, a ten protokół miał na celu zbadanie możliwych mechanizmów, za pomocą których SARS-CoV-2 może zainfekować ucho środkowe13.
  8. Leczyć drugorzędowym przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z HRP (ACE2, furyna; rozcieńczenie 1:100) lub przeciwciałem drugorzędowym anty-kozie (TMPRSS2, rozcieńczenie 1:100).
  9. Przeciwbarwić szkiełka 70% hematoksyliną w wodzie.
  10. Rejestruj obrazy pod mikroskopem świetlnym za pomocą zamontowanej kamery cyfrowej. Uzyskaj obrazy błony śluzowej ucha środkowego i trąbki Eustachiusza odpowiednio w powiększeniu 20x i 10x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie hematoksyliną i eozyną błony śluzowej ucha środkowego i trąbki Eustachiusza wykazało zachowanie błony śluzowej ucha środkowego i tkanki podśluzówkowej ucha środkowego po przetworzeniu (Rysunek 1). Obrazy immunohistochemiczne wykazały ekspresję białek ACE2, TMPRSS2 i furyny w błonie śluzowej ucha środkowego i trąbce Eustachiusza (Ryc. 1). Obecność tych białek w uchu środkowym stanowi możliwą drogę, za pomocą której SARS-CoV-2 może zainfekować nabłonek oddechowy w uchu środ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad kością skroniową człowieka mają kluczowe znaczenie dla badania patologii ucha wewnętrznego i środkowego, ale pozostają przedsięwzięciem wymagającym dużej ilości czasu i zasobów. W artykule opisano technikę, która wykorzystuje mikropiłę diamentową do generowania grubych skrawków kości skroniowej, które można szybko odwapnić przed dalszym cięciem, dzięki czemu czas od pobrania tkanki do badania można skrócić z 9-10 miesięcy do 10-14 dni. Technika ta może zmniejszyć zasoby wymagane do przetwarzania kości skronio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mohamedowi Leharowi za pomoc w tym projekcie. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-ACE-2 (rozcieńczenie 1:50)Novus BiologicalsSN0754
(rozcieńczenie 1:250)PrzeciwciałoEPR 14674
(rozcieńczenie 1:1 000)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 Ręczny mikroskop systemowyOlympus Life Science Solutions
Hybrydowa płytka CBN/diamentowa BladePace TechnologiesWB-007GP
Collin Mallet - 8'Surgical MartSM1517
DS-Fi3 Kamera mikroskopowaNikon
Podwójny endogenny blok enzymatyczny (komercyjne rozwiązanie blokujące)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10%Sigma-AldrichHT501128
Formical-4 Decalcifier (roztwór odwapniający kwas mrówkowy)StatLab1214-1 GAL
Hematoxylin StainSigma-AldrichH9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Drugorzędowe przeciwciało (rozcieńczenie 1:100)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP Zestaw do wykrywania igG przeciwko kozom, peroksydaza (1:100 rozcieńczenie)Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte OsteotomeSurgical MartSM1553
Metalograficzny PICO 155P Precyzyjna piłaPace TechnologiePICO 155P
Microsaw NIS Elements Wersja oprogramowania 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683parafina
Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe z białym matowym końcemWalter Products1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat MicrotomeNew Life Scientific Inc.A78900104kriotom
Triology Roztwór do obróbki wstępnej (komercyjny roztwór do obróbki wstępnej)Sigma-Aldrich920P-05
KsylenSigma-Aldrich920P-05
Przeciwciało antyfurynowe anty-TMPRSS2 Abcam '

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113(2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Patologia COVID 19szybka dekalcyfikacjabadania z zakresu otopatologiiimmunohistochemiaprecyzyjna mikropi azatapianie tkanekbarwienie hematoksylin i eosinbia ko ACE2

Powiązane artykuły