Artykuł metodologiczny

Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych

DOI:

10.3791/64014

⸱

4 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie mikrodysekcji laserowej i mikroprzepływowego RT-qPCR zapewnia anatomiczną i biotechniczną specyfikę pomiaru transkryptomu w pojedynczych neuronach i gleju. Zastosowanie kreatywnych metod z systemowym podejściem biologicznym do chorób psychicznych może prowadzić do przełomów w zrozumieniu i leczeniu, takich jak hipoteza neurozapalenia i nagrody w uzależnieniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące wskaźniki zachowań uzależniających zmotywowały zarówno badaczy zdrowia psychicznego, jak i klinicystów do zrozumienia antynagrody i powrotu do zdrowia. To odejście od nagrody i rozpoczęcia wymaga nowych perspektyw, paradygmatów i hipotez, a także rozszerzenia metod stosowanych do badania uzależnienia. Tutaj podajemy przykład: podejście biologii systemowej do badania antynagrody, które łączy mikrodysekcję wychwytywania laserowego (LCM) i wysokoprzepustowe ilościowe reakcje łańcuchowe polimerazy z odwrotną transkrypcją mikroprzepływową (RT-qPCR). Zmierzono dynamikę sieci ekspresji genów i zidentyfikowano kluczowy czynnik powodujący rozregulowanie nerwowo-trzewne w odstawieniu alkoholu i opioidów, zapalenie nerwów. To połączenie technologii zapewnia anatomiczną i fenotypową specyficzność w rozdzielczości pojedynczej komórki z wysoką przepustowością czułości i specyficznymi pomiarami ekspresji genów, co daje zarówno zestawy danych generujące hipotezy, jak i możliwości mechanistyczne, które generują możliwości dla nowatorskich spostrzeżeń i terapii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzależnienie pozostaje rosnącym wyzwaniem w krajach rozwiniętych1,2. Pomimo znacznych postępów naukowych i klinicznych, wskaźniki uzależnień nadal rosną, podczas gdy skuteczność uznanych metod leczenia pozostaje w najlepszym razie stabilna3,4,5. Jednak postępy w biotechnologii i podejściach naukowych doprowadziły do powstania nowych metod i hipotez w celu dalszego zbadania patofizjologii uzależnienia od substancji6,7,8. Rzeczywiście, ostatnie odkrycia sugerują, że nowatorskie koncepcje i paradygmaty leczenia mogą prowadzić do przełomów o społecznych, ekonomicznych i politycznych konsekwencjach9,10,11,12.

Badaliśmy antynagrodę w odstawieniu uzależnienia od alkoholu i opioidów13,14,15,16. Metody są kluczowe dla tego paradygmatu17,18. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) może wybrać pojedyncze komórki o wysokiej swoistości anatomicznej. Ta funkcja jest integralną częścią hipotezy neurozapalenia przeciw nagrodzie, ponieważ zarówno glej, jak i neurony mogą być zbierane i analizowane z tego samego podjądra neuronalnego u tego samego zwierzęcia13,14,15,16,19. Istotną część transkryptomu wybranych komórek można następnie zmierzyć za pomocą wysokoprzepustowej mikroprzepływowej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), dostarczając wielowymiarowych zestawów danych do analizy obliczeniowej dającej wgląd w sieci funkcjonalne20,21.

Pomiar podzbioru transkryptomu w neuronach i gleju w określonym jądrze mózgu generuje zestaw danych, który jest solidny zarówno pod względem liczby próbek, jak i mierzonych genów, a także jest czuły i specyficzny. Narzędzia te są optymalne dla systemowego podejścia neurologicznego do chorób psychicznych, ponieważ glej, głównie astrocyty i mikroglej, wykazały centralną rolę w chorobach neurologicznych i psychiatrycznych w ciągu ostatniej dekady22,23. Nasze podejście może mierzyć ekspresyjną odpowiedź gleju i neuronów jednocześnie w licznych receptorach i ligandach zaangażowanych w lokalną sygnalizację parakrynną. Rzeczywiście, sygnalizację można wywnioskować z tych zestawów danych przy użyciu różnych metod ilościowych, takich jak logika rozmyta24. Co więcej, identyfikacja subfenotypów komórkowych w neuronach lub gleju i ich funkcji może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób komórki mózgowe w określonych jądrach organizują się, reagują i rozregulowują na poziomie pojedynczej komórki. Dynamikę tego układu funkcjonalnego można również modelować za pomocą eksperymentów szeregów czasowych16. Wreszcie, modele zwierzęce mogą być zaburzone anatomicznie lub farmakologicznie, aby nadać mechanistyczny warunek podejściu tego systemu.

Reprezentatywny eksperyment:
Poniżej przedstawiamy przykład zastosowania tych metod. W tym badaniu badano ekspresję genów neuronalnych i mikrogleju szczurów w jądrze pojedynczym (NTS) w odpowiedzi na uzależnienie od alkoholu i późniejsze odstawienie16. Kohorty szczurów składały się z 1) kontrolnej, 2) zależnej od etanolu (EtOH), 3) 8-godzinnego odstawienia (Wd), 4) 32-godzinnego odstawienia i 5) 176-godzinnego Wd (Rysunek 1A). Po szybkiej dekapitacji pnie mózgu oddzielono od przodomózgowia i poddano kriosekcji, a plastry wybarwiono pod kątem neuronów dodatnich pod względem hydroksylazy tyrozynowej (TH +) i mikrogleju (Ryc. 1B). LCM wykorzystano do zbierania zarówno neuronów TH+, jak i TH- oraz mikrogleju. Wszystkie komórki pochodziły z NTS i były analizowane jako próbki z puli 10 komórek. Cztery mikroprzepływowe matryce dynamiczne RT-qPCR o wymiarach 96 x 96 przeprowadzono na platformie RT-qPCR mierzącej 65 genów (Rysunek 1B-C). Dane znormalizowano przy użyciu metody -ΔΔCt i przeanalizowano za pomocą R, a selekcję pojedynczych komórek zwalidowano za pomocą markerów molekularnych (Rysunek 1D-E). Walidacja techniczna została następnie zweryfikowana za pomocą replik technicznych analizowanych w ramach pojedynczej partii i między partiami (Rysunek 2 i Rysunek 3). Neurony TH+ i TH- zorganizowane w różne subfenotypy z podobnymi klastrami genów zapalnych, ale różniącymi się klastrami receptora (R) kwasu γ-aminomasłowego (GABA) (R) (Rysunek 4 i Rysunek 5). Subfenotypy, które miały podwyższoną ekspresję klastrów genów zapalnych, były nadreprezentowane po 32 godzinach Wd, podczas gdy ekspresja receptora GABA (GABAR) pozostawała niska po długotrwałym odstawieniu alkoholu (176 godzin Wd). Praca ta przyczynia się do hipotezy antynagrody uzależnienia od alkoholu i opioidów, która zakłada, że przechwytujące sprzężenie zwrotne z wnętrzności podczas odstawienia przyczynia się do rozregulowania trzewno-emocjonalnych jąder neuronalnych (tj. NTS i ciała migdałowatego), co skutkuje poważniejszymi następstwami autonomicznymi i emocjonalnymi, które przyczyniają się do uzależnienia od substancji (Ryc. 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Thomasa Jeffersona. Protokół został zatwierdzony przez IACUC Uniwersytetu Thomasa Jeffersona.

1. Model zwierzęcy

  1. Domowy samiec Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) trojaczki szczurów domowych indywidualnie z wolnym dostępem do karmy etanolowej (2 szczury) lub mieszanki kontrolnej (1 szczur).
    UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie wykorzystano protokół Liebera-DeCarliego do zbadania neurobiologii odstawienia alkoholu25,26. Trojaczki szczurów składają się z kohorty trzech szczurów, które są karmione tą samą liczbą kalorii, ale kończą w różnych ramionach badania po złożeniu w ofierze. Trzy ramiona tego badania to: 1) Kontrola, 2) Zależne od etanolu (EtOH) i 3) Wycofanie (Wd) (Rysunek 1A). W tym badaniu występuje łącznie pięć warunków, ponieważ istnieją trzy punkty czasowe odstawienia alkoholu (Rysunek 1A).
    1. Co drugi dzień mierz mieszaninę etanolu i karmowy spożywaną przez szczura Wd i zastąp spożytą ilość taką samą ilością mieszanki etanolu do karmnika dla szczurów EtOH. Dodać równoważną ilość kaloryczną mieszanki kontrolnej do karmnika szczura kontrolnego.
      UWAGA: Średnie dzienne spożycie etanolu wynosi około 12-16 g/kg po 3 tygodniach26.
    2. Po ustabilizowaniu długotrwałego spożycia etanolu i uzależnieniu (>5 tygodnia), wywołaj ostre odstawienie alkoholu u szczura Wd poprzez opróżnienie pojemnika na karmę i napełnienie go mieszaniną kontrolną. Wykonaj to w taki sposób, aby wszystkie trzy szczury zostały złożone w ofierze w tym samym okołodobowym punkcie czasowym21.
    3. We wcześniej wybranym punkcie czasowym poświęć wszystkie trzy szczury w trójce w tym samym punkcie czasowym (Kontrola, EtOH i Wd).

2. Pobieranie próbek

  1. Zbierz mózg w tym samym okołodobowym punkcie czasowym dla każdego trojaczka szczura w odpowiednim punkcie czasowym Wd (8 godzin, 32 godziny, 176 godzin).
    1. Przygotować kąpiel metanolową i suchy lód w celu szybkiego schłodzenia świeżej tkanki w celu zachowania integralności RNA. Odłóż na bok.
    2. Umieść szczura w butli z izofluranem (5% tlenu) na ~30 s lub do momentu utraty przytomności, na co wskazuje zmniejszona częstość oddechów i brak aktywności motorycznej. Włóż głowę szczura do odpowiednio naostrzonej gilotyny, aby szybko odciąć głowę.
    3. Otwórz czaszkę zwierzęcia, aby wyciąć mózg za pomocą kleszczy. Usuń móżdżek ze świeżego mózgu za pomocą ręcznej maszynki do golenia, krojąc go grubo, i wyrzuć go. Przez poprzeczne nacięcie odetnij pień mózgu od przodomózgowia.
      UWAGA: Ręczna maszynka do golenia może być dalej używana do półcięcia przodomózgowia lub pnia mózgu na lewą i prawą półkulę zgodnie z projektem eksperymentalnym. Na przykład, aby zweryfikować wyniki z jednej półkuli za pomocą różnych metod, zbadaj dywergencję od lewej do prawej lub zwiększ liczbę próby.
    4. Dodaj medium o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) na głębokość około 3-4 cm w formie do zatapiania tkanek, aby próbka tkanki mogła być całkowicie zanurzona. Umieść tkankę, przodomózgowie i/lub pień mózgu w formie do osadzania tkanek i dodaj więcej OCT, aby w pełni pokryć próbkę tkanki.
    5. Dodaj plastikową formę do zatapiania tkanek zawierającą próbkę tkanki (przodomózgowie szczura) do kąpieli chłodzącej z suchego lodu i metanolu, aby natychmiast zamrozić próbkę tkanki. Pozostawić próbkę tkanki w formie do zatapiania na pozostanie w kąpieli chłodzącej do czasu zakończenia pobierania tkanki, ale nie dłużej niż 15 minut
      UWAGA: Uważaj, aby metanol nie rozlał się do pojemnika na chusteczki higieniczne.
    6. Szybkie przechowywanie próbek tkanek w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Mikroprzepływowy RT-qPCR mierzy ekspresję genów poprzez amplifikację i pomiar transkryptów mRNA. Transkrypty te są stosunkowo niestabilne, dlatego w tym procesie podejmuje się wiele kroków, aby utrzymać próbkę tak zimną, jak to możliwe, aby zapobiec degradacji mRNA.

3. Kriosekcja

UWAGA: Jądro neuronalne szczura ma około 10 μm. Tak więc 10 μm jest optymalną grubością plastra dla tego modelu zwierzęcego. Grubość plastra jest dostosowywana zgodnie z modelem zwierzęcym do badania.

  1. Z zamrażarki o temperaturze -80 °C wyjąć formę do zatapiania tkanek, która zawiera zamrożony pień mózgu i rozmrażać próbkę w temperaturze -20 °C w kriostacie przez 5-10 minut. Zamrażanie i rozmrażanie należy wykonać do temperatury -20 °C tylko raz w celu zachowania mRNA.
  2. Za pomocą ręcznej maszynki do golenia odetnij pionowo rogi plastikowej formy do zatapiania. Usuń pień mózgu osadzony w OCT z plastikowej formy do osadzania tkanek. Na uchwycie kriostatu ustawionego na -20 °C użyj płynnego O.C.T. o temperaturze pokojowej jako kleju do zamontowania pnia mózgu w kierunku rostralnym do ogonowego w celu kriosekcji koronalnej.
  3. Wyciąć kriosekcje koronalne o wielkości 10 μm w kierunku rostralnym do ogonowym od pnia mózgu szczura, aż do osiągnięcia odcinków zawierających obszar zainteresowania (NTS). Wysokość i szerokość tych kriosekcji wynosi ~200 mm w oparciu o wymiary plastikowej formy do zatapiania.
  4. Zbierz kriosekcje 10 μm tkanki pnia mózgu, która zawiera NTS lub inny obszar zainteresowania oparty na badaniu, poprzez rozmrażanie na zwykłych szkiełkach o temperaturze pokojowej. Szybko umieść te szkiełka z sekcjami w metalowej misce chłodzącej, która znajduje się na wierzchu suchego lodu. Tak szybko, jak to możliwe, umieść szklane szkiełka zawierające kriosekcje w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
    UWAGA: Na jednym szkiełku podstawowym można umieścić wiele kriosekcji 10 μm, ponieważ szerokość i wysokość wynosi ~200 mm. W ten sposób ten sam szkiełko może zawierać kriosekcje, które są barwione pod kątem różnych typów komórek.
    1. Gdy na prowadnicy znajduje się kilka sekcji, upewnij się, że są one oddzielone od siebie 100 mm pustej przestrzeni. Aby utworzyć granicę między kriosekcjami, użyj pisaka hydrofobowego. Pozwala to na barwienie różnych roztworów przeciwciał dla różnych typów komórek na tym samym szkiełku podstawowym. Zachowaj 20 mm wolnej przestrzeni na kriosekcję od krawędzi szkiełka podstawowego.

4. Barwienie immunofluorescencyjne pojedynczych komórek

  1. Użyj protokołu szybkiego barwienia immunofluorescencyjnego na kriosekcjach mózgu, aby oznaczyć pożądane typy komórek mózgowych (neurony, mikroglej, astrocyty itp.) do pobrania za pomocą LCM.
    UWAGA: Protokół barwienia immunohistochemicznego zastosowany w tych eksperymentach został zaprojektowany tak, aby był szybki, aby zapobiec nadmiernej degradacji mRNA podczas tego procesu.
    1. Z zamrażarki o temperaturze -80 °C wyjąć szkiełka podstawowe zawierające kriosekcje pnia mózgu szczura zawierające NTS o grubości 10 μm. Zanurz szkiełka na 30 s w kąpieli z 75% etanolem, aby utrwalić kriosekcję tkanki. Usuń nadmiar płynu.
    2. Do utrwalonej kriosekcji tkanki pnia mózgu należy zastosować 2% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) przez 30 sekund w celu zablokowania nieukierunkowanego wiązania przeciwciał. Następnie umyj PBS.
    3. Nałożyć wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwotnego, aby pokryć kriosekcję tkanki (teraz utrwaloną i zablokowaną). Inkubować wycinek tkanki w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez 2 minuty. Raz umyj chusteczkę 2% roztworem BSA. Roztwór przeciwciała pierwszorzędowego zawiera 96% roztworu BSA-PBS do blokowania, 3% przeciwciała pierwszorzędowego i 1% inhibitora RNazy. Przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczono w stosunku 1:25.
      UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie przeciwciała pierwszorzędowe składają się z przeciwciała anty-NeuN i przeciwciała anty-Cd11β. Neurony zostały dalej podzielone na podgrupy TH+ i TH-, więc pierwotne roztwory przeciwciał do barwienia neuronów zawierały 93% roztworu BSA PBS, 3% przeciwciała anty-NeuN, 3% przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej i 1% RNazy Out.
    4. Nałożyć wystarczającą ilość roztworu przeciwciał drugorzędowych (1:200), aby pokryć tkankę pnia mózgu. Pozwól, aby drugorzędowy roztwór przeciwciała obkąpał tkankę. Po 3 minutach przemyć chusteczkę raz 2% roztworem BSA.
      UWAGA: Roztwór zawierający przeciwciało drugorzędowe składał się ze 196,5 μl 2% BSA, 1 μl koziego znacznika fluorescencyjnego anty-mysiego 555 nm dla typu komórki, 1 μl osła anty-królika Alexa 488 nm do barwienia TH, 2,5 μl inhibitora RNazy i 1,3 μl DAPI (1:10000).

5. Standardowe serie odwadniania tkanek etanolem i ksylenem

  1. Umieścić szkiełka, na których spoczywa wybarwiona kriosekcja tkanka, w kąpieli 75% etanolowej na 30 s, następnie w kąpieli 95% etanolowej na 30 s, w kąpieli 100% etanolowej na 30 s, a na końcu w 100% etanolowej na 30 s (w drugim pojemniku).
  2. Po zakończeniu serii odwadniania etanolu należy zalać dwie świeże kąpiele ze 100% ksylenem. Następnie umieść szkiełka w pierwszej kąpieli ksylenowej na 1 minutę. Szybko wyjmij szkiełka i umieść je w drugiej świeżej kąpieli ksylenowej na 4 minuty.
  3. Wyjmij szkiełka zawierające poplamione i odwodnione kriosekcje tkankowe z ksylenu i umieść w ciemnym, ale przewiewnym pojemniku na 5 minut do wyschnięcia na powietrzu. Po wysuszeniu na powietrzu umieścić szkiełka podstawowe w eksykatorze na 5 minut w celu ostatecznego wysuszenia.

6. Wybierz pojedyncze komórki za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM)

  1. Włóż szklane szkiełko zawierające barwione, utrwalone i odwodnione kriosekcje tkankowe do uchwytu na próbkę mikroskopu LCM. Użyj anatomicznych punktów orientacyjnych, aby zlokalizować obszar zainteresowania, z którego będzie miało miejsce pobieranie komórek (NTS w tym reprezentatywnym przykładzie).
  2. Włącz fluorescencję mikroskopu i znajdź interesujące Cię barwione typy komórek. Upewnij się, że jądro żądanej komórki znajduje się w obszarze zainteresowania i jest odizolowane od jąder innych komórek na odległość >3 mm. Zidentyfikuj i oznacz jedną komórkę (jeśli eksperyment jest prawdziwy pojedynczy komórka) lub wiele komórek (jeśli eksperyment wymaga zbiorczych próbek pojedynczych komórek [tj. skali pojedynczej komórki], jak pokazano w tym reprezentatywnym eksperymencie) do zebrania za pomocą oprogramowania LCM.
    UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie wykorzystano próbki składające się z 10-komórkowych pul. Ma to na celu zmniejszenie zmienności ekspresji genów między próbkami i zwiększenie liczby analizowanych pojedynczych komórek, chociaż nadal pozostaje to eksperymentem na skalę pojedynczej komórki. Prawdziwe eksperymenty z pojedynczymi komórkami można przeprowadzić za pomocą tej metody20,27. Dodatkowo można również wybrać większe skrawki tkanki21.
  3. Po wybraniu żądanych komórek za pomocą ramienia robota LCM umieść nasadkę LCM na obszarze zainteresowania na zaznaczonej kriosekcji tkankowej.
  4. Skalibruj intensywność i celowanie lasera na podczerwień (IR) za pomocą zdjęć testowych.
    UWAGA: Odbywa się to dla każdej próbki. Kalibrację należy przeprowadzić na części nasadki, która nie znajduje się bezpośrednio nad tkanką, aby nie pomylić się z wyborem tkanki nieeksperymentalnej.
    1. Aby skalibrować intensywność, dostosuj czas trwania, siłę i rozmiar wtrysku lasera IR tak, aby śrut topił klej nasadki tylko na tyle, aby wybrać pojedyncze jądro komórkowe, a także był wystarczająco silny, aby stopić nasadkę do kriosekcji na szkiełku. Wartości te będą różne dla każdego limitu.
    2. Skalibruj celowanie, lokalizując celownik lasera dokładnie w miejscu, w którym laser stopił nasadkę.
  5. Zbierz komórki zidentyfikowane przez wystrzelenie lasera podczerwonego LCM, aby stopić nasadkę na kriowyciętej tkance nad tymi komórkami. Upewnij się, że tylko wybrane komórki zostały podniesione z wycinka tkanki, używając ramienia robota do zlokalizowania nasadki w obszarze kontroli jakości (QC) mikroskopu LCM. Aby usunąć nadmiar komórek z czapeczki, użyj lasera ultrafioletowego (UV), aby usunąć materiał genetyczny dodatkowych komórek.
  6. Rejestruj specyficzność anatomiczną za pomocą kamery programowej LCM. Zrób zdjęcie kriowyciętej tkanki, z której usunięto komórkę (komórki).
  7. Użyj atlasu anatomicznego (w tym przykładzie atlasu przodomózgowia szczura), aby określić odległość tego wycinka tkanki od bregmy i zapisz tę informację jako odległość Z28. Określ położenie na płaszczyźnie X i/lub Y na podstawie zdjęcia, aby w pełni zlokalizować wybraną komórkę.
  8. Rękami w rękawiczkach zdejmij nasadkę LCM z obszaru kontroli jakości. Następnie przymocuj urządzenie do ekstrakcji próbki do nasadki LCM. Za pomocą pipety nałóż 5,5 μl buforu do lizy na wybrane komórki. Jest to teraz określane jako sample.
    UWAGA: Roztwór buforowy do lizy składa się z 5 μl buforu do reprodukcji wraz z 0,5 μl wzmacniacza lizy.
  9. Zamontuj probówkę mikrowirówkową o pojemności 0,5 ml na urządzeniu do ekstrakcji próbki, które jest przymocowane do nasadki LCM. Umieścić ten układ na płycie grzejnej o temperaturze 75 °C, tak aby próbka i bufor do lizy znajdowały się bliżej płytki. Pozwól próbce podgrzewać się przez 15 minut.
  10. Użyj wirówki wolnoobrotowej o stężeniu 0,01-0,02 g, aby odwirować próbkę i bufor do lizy na dno probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu mikroprzepływowego qPCR.

7. Uruchom chip qPCR na mikroprzepływowym RT-qPCR na platformie

  1. Aby zmierzyć ekspresję genów w próbkach pojedynczych komórek, należy przeprowadzić wstępną amplifikację mRNA, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Protokół nie obejmuje ekstrakcji mRNA, ponieważ próbki są pojedynczymi komórkami zawierającymi bardzo małą ilość RNA (10 pg), która zostanie utracona na etapie izolacji mRNA. Pojedyncze komórki są poddawane lizie i bezpośrednio poddawane odwrotnej transkrypcji w celu zminimalizowania strat próbki.
    1. Utwórz pulę starterów, dodając startery genu qPCR mRNA (do przodu i do tyłu) dla każdego testowanego genu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że końcowe stężenie każdego startera wynosi 500 nM. Startery w tym przykładowym eksperymencie są wymienione w tabeli uzupełniającej 116.
    2. Odpipetować 1 μl 5x cDNA reaction mix do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR.
    3. Pozostaw próbki jednokomórkowe do rozmrożenia na krótko (2-3 min), wyjmując je z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawiając w temperaturze pokojowej. Użyj wirówki wolnoobrotowej o sile 0,01-0,02 x g, aby odwirowywać próbki przez 20-30 s. Odpipetować 5,5 μl każdej próbki jednokomórkowej do innego dołka na 96-dołkowej płytce PCR.
      UWAGA: Numer i rodzaj próbki, którą należy umieścić w każdym dołku, określa się przed rozpoczęciem tego etapu.
    4. 96-dołkowa płytka do PCR zawiera teraz mieszaninę reakcyjną cDNA i próbkę pojedynczej komórki dodaną do każdej studzienki. Umieść tę płytkę w termocyklerze na 1,5 minuty w temperaturze 65 °C, aby aktywować mieszaninę reakcyjną cDNA. Odwirować zawartość za pomocą szybkiego wirowania przy 1 300 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i umieścić płytkę PCR na mokrym lodzie.
    5. Do każdego dołka na płytce PCR odpipetuj 0,12 μl białka T4 Gene 32, 0,73 μl buforu zawiesiny DNA i 0,15 μl 10-krotnej mieszanki głównej syntezy cDNA. Przeprowadź płytkę PCR przez następujący protokół w termocyklerze: 25 °C przez 5 minut, 50 °C przez 30 minut, 55 °C przez 25 minut, 60 °C przez 5 minut, 70 °C przez 10 minut i końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Białko genu T4 32 (jednoniciowe białko wiążące DNA (ssDNA)) jest wymagane do replikacji i naprawy bakteriofagów T4. Białko genu T4 32 zostało użyte na etapie odwrotnej transkrypcji protokołu w celu poprawy wydajności i efektywności odwrotnej transkrypcji oraz zwiększenia wydajności produktu PCR.
    6. Do każdego dołka na płytce PCR odpipetować 7,5 μl głównej mieszanki polimerazy Taq. Następnie w każdym dołku odpipetować 1,5 μl puli startera utworzonej w kroku 7.1.1. Przeprowadź płytkę PCR przez następujący liniowy etap wstępnej amplifikacji w termocyklerze: 95 °C przez 10 minut; 22 cykle: 96 °C przez 5 s i 60 °C przez 4 min.
    7. Do każdej studzienki na płytce PCR odpipetować 1,2 μl egzonukleazy I, 4,2 μl buforu zawiesiny DNA i 0,6 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego egzonukleazy I. Przeprowadź płytkę PCR przez następujący protokół w termocyklerze: 37 °C przez 30 min, 80 °C przez 15 min.
      UWAGA: Egzonukleaza katalizuje usuwanie nukleotydów z liniowego jednoniciowego DNA w kierunku od 3 'do 5'. Używamy egzonukleazy do oczyszczania próbki w celu usunięcia niewbudowanych starterów i wszelkich jednoniciowych cDNA, które mogą być obecne po wstępnej amplifikacji.
    8. Do każdego dołka na płytce PCR odpipetować 54 μl buforu TE. Użyć wirówki wysokoobrotowej o sile 1 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby odwirować zawartość płytki PCR.
    9. Jeśli planowane jest kontynuowanie kolejnej fazy protokołu, należy schłodzić płytkę PCR w temperaturze 4 °C. Jeżeli między zakończeniem fazy wstępnego amplifikacji a rozpoczęciem mikroprzepływowego qPCR upłynęło więcej niż 12 godzin, przykryć płytkę qPCR i umieścić ją w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj płytkę próbną (nową 96-dołkową płytkę do PCR) dla chipa qPCR, jak opisano poniżej.
    1. Jeśli płytkę PCR z pre-amplifikacją z kroku 7.1 umieszczono w zamrażarce o temperaturze -20 °C, należy ją wyjąć i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    2. Do nowej 96-dołkowej płytki PCR odpipetować do każdej studzienki 4,55 μl PCR supermix low rox i 0,45 μl 20x barwnika wiążącego DNA. Następnie odpipetować 3 μl wstępnie amplifikowanej próbki z płytki PCR wykonanej w kroku 7.1. Użyć wirowania z dużą prędkością przy 1 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby odwirować płytkę do PCR i umieścić płytkę z próbką PCR na lodzie.
  3. Wykonaj płytkę testową (nową 96-dołkową płytkę do PCR) dla chipa qPCR, jak opisano poniżej.
    1. Do nowej 96-dołkowej płytki PCR odpipetować do każdej studzienki 1,25 μl buforu zawiesiny DNA i 3,75 μl odczynnika ładującego 2x test. Następnie odpipetować odpowiedni starter qPCR w 2,5 μl startera 10 μM. Użyć wirówki wysokoobrotowej o sile 1 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby odwirować płytkę do PCR i umieścić ją na lodzie.
  4. Przygotuj chip qPCR do załadowania do mikroprzepływowej platformy RT-qPCR zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Chip qPCR to platforma qPCR w czasie rzeczywistym, która działa na zasadach mikroprzepływowych. Chip qPCR jest zasadniczo matrycą 96 kanałów próbek i 96 kanałów starterowych RNA qPCR (tj. testów), które przecinają się w 9,216 (96 x 96) komorach. Próbka i specyficzny test są łączone w każdej komorze matrycy, w której zachodzi reakcja qPCR w czasie rzeczywistym. Odczyt jest generowany jako wartości cyklu progowego (Ct) i wykresy amplifikacji dla zastosowanych starterów.
    1. Wstrzyknąć płyn z przewodu kontrolnego do chipa qPCR w celu zalania. Włóż chip qPCR do mieszalnika mikroprzepływowego. Wybierz skrypt prime (136x) i uruchom ten program.
    2. Gdy program zakończy się po ~45 minutach, usuń zagruntowany chip qPCR. Do zagruntowanego chipa qPCR należy odpipetować 6 μl reakcji z płytki próbki PCR do odpowiedniego dołka na próbkę w chipie qPCR.
    3. Do zagruntowanego chipa qPCR odpipetować 6 μl reakcji z płytki testowej PCR do odpowiedniego dołka testowego w chipie qPCR.
      UWAGA: Na dnie próbki mogą tworzyć się pęcherzyki powietrza i studzienki testowe w chipie qPCR, co może uniemożliwić przedostawanie się roztworów do przewodów mikroprzepływowych. Ostra igła może być użyta do przebicia lub usunięcia tych pęcherzyków powietrza przed włożeniem chipa qPCR do urządzenia do mieszania mikroprzepływowego.
    4. Włóż chip qPCR do mieszalnika mikroprzepływowego. Wybierz skrypt load mix (136x) i uruchom ten program.
  5. Załaduj chip qPCR do mikroprzepływowej platformy RT-qPCR.
    1. Włącz platformę mikroprzepływową RT-qPCR i rozgrzej żarówkę (~20 min). Wyjmij chip qPCR z urządzenia do mieszania mikroprzepływowego. Odklej naklejkę ochronną od spodu chipa qPCR.
    2. Otwórz mikroprzepływową platformę RT-qPCR i załaduj chip qPCR do mikroprzepływowej platformy RT-qPCR. Uruchom szybki protokół 96 x 96 PCR (30 cykli) na mikroprzepływowej platformie RT-qPCR.
    3. Uruchom oprogramowanie do zbierania danych - kliknij Rozpocznij nowy przebieg.
    4. Sprawdź kod kreskowy chipa i typ chipa - kliknij Dalej. Kliknij plik Chip Run i przeglądaj lokalizację pliku w celu uzyskania magazynu zbierania danych.
    5. Kliknij na Application Type (Typ aplikacji) i wybierz Gene Expression (Ekspresja genów); wybierz ROX dla pasywnego odniesienia, wybierz Single Probe (Pojedyncza sonda) i wybierz EvaGreen (EvaGreen) jako typ sondy.
    6. Kliknij, aby wybrać program cykli termicznych i wybierz plik Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl.

8. Analiza danych

  1. Prześlij dane z przebiegu chipa qPCR do oprogramowania analitycznego w celu kontroli jakości, jak opisano poniżej.
    1. Pobierz oprogramowanie do analizy danych. Można go znaleźć na następującej stronie internetowej: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Uruchom oprogramowanie do analizy eksperymentu mikroprzepływowego RT-qPCR.
    2. W oprogramowaniu otwórz Chip Run. Następnie otwórz plik ChipRun.bml utworzony przez eksperyment. Pojawi się okno ze szczegółami eksperymentu, w tym pasywnym odniesieniem, sondą i programem termicznym PCR.
      UWAGA: Kontrolę jakości (QC) i analizę danych można przeprowadzić na komputerze podłączonym do platformy mikroprzepływowej RT-qPCR lub poprzez przeniesienie pliku .bml na inny komputer za pomocą pendrive'a lub w inny sposób.
  2. Zdefiniuj przykładową konfigurację zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Ten krok tworzy oznaczony szablon próbek i testów (startery qPCR) do procedur kontroli jakości (QC) i analizy danych.
    1. Wybierz Chip Explorer > Sample Plate Setup (Ustawienia płytki próbki) i utwórz nową płytkę próbki. Należy wybrać odpowiedni typ pojemnika i format pojemnika (SBS96 dla płytki 96-dołkowej użytej w tym reprezentatywnym doświadczeniu).
    2. Wklej przykładowe etykiety do arkusza kalkulacyjnego oprogramowania zgodnie z projektem eksperymentalnym i wybierz opcję Mapa z menu Zadanie. Wybierz SBS96-Left.dsp. Przykładowa konfiguracja jest teraz mapowana. Wybierz opcję Widok szczegółowy > Analizuj, aby zaktualizować te zmiany w pliku.
      UWAGA: Wszelkie zmiany wprowadzone w tym oprogramowaniu nie zostaną zapisane, dopóki nie zostanie kliknięty przycisk >Analizuj.
  3. Zdefiniuj próbki kontrolne w oprogramowaniu. Wybierz komórki dla próbek kontrolnych, klikając lewym przyciskiem myszy i przytrzymując podczas przeciągania przez komórki do wyboru. Poszczególne komórki można zaznaczyć, naciskając i przytrzymując Ctrl oraz klikając poszczególne komórki. W przypadku próbek wzorcowych RNA (seria rozcieńczeń) należy wprowadzić nazwę próbki i użyte stężenie RNA. Kliknij Analizuj, aby zapisać.
  4. Zdefiniuj konfigurację detektora podobną do kroku 8.2 powyżej, ale z nazwami testów RT-qPCR, tj. nazwami oznaczanych genów. Wybierz opcję Detector Plate Setup (Konfiguracja płytki detektora) i utwórz nową płytkę testową. Wybierz odpowiedni typ i format pojemnika (SBS96 dla płytki 96-dołkowej). Wklej nazwy testów zgodnie z projektem eksperymentalnym i kliknij Analizuj, aby zapisać.
  5. Rozpocznij proces kontroli jakości użytkownika (QC) zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie zastosowano metodę progowania czasu cyklu (Ct). Oznacza to, że próbki, które nie osiągnęły sygnału progowego zdefiniowanego przez oprogramowanie (Auto Global) lub ręcznie (Użytkownik globalny), zostaną uznane za nieudane reakcje i nie zostaną uwzględnione w zbiorze danych.
    1. Wybierz pozycję Widok analizy > ramkę zadań. W okienku ustawień analizy zmień ustawienia na Automatycznie globalne (automatycznie oblicza próg, który jest stosowany do całego chipa) lub Globalny użytkownika. Ustaw korekcję linii bazowej na pochodną liniową. Jeśli używany jest User Global, próg niepowodzenia należy określić ręcznie, tak jak w reprezentatywnym eksperymencie.
    2. W tym reprezentatywnym eksperymencie zastosowano regułę kontroli jakości w następujący sposób: jeśli pojedynczy test lub próbka miała wskaźnik niepowodzeń wynoszący 70% lub więcej, to cały wiersz lub kolumna w zestawie danych została odrzucona.
    3. Ręcznie przejrzyj każdą reakcję w chipie 96 x 96. Wizualizuj krzywe amplifikacji i krzywe topnienia, aby ocenić, czy każda reakcja przebiegała zgodnie z oczekiwanym wzorcem qPCR. Jeśli krzywa wzmocnienia lub topnienia nie zgadza się z tym, czego się oczekuje, ta reakcja zakończy się niepowodzeniem.
  6. Po kontroli jakości wyeksportuj dane, wybierając pozycję Plik > Eksportuj i zapisz zestaw danych jako plik .csv.
  7. Wyczyść zestaw danych, ponieważ wyeksportowany plik .csv ma zarówno macierz Pass-Fail, jak i macierz z nieprzetworzonymi wartościami Ct. Użyj macierzy Pass-Fail, aby zastąpić wszystkie komórki, które uległy awarii, w zestawie danych wartością NA.
  8. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania R typu open source, a następnie pobierz aplikację R-Studio. Przekaż znormalizowany zestaw danych do R. Przeanalizuj dane zgodnie z danymi dla badania.
  9. Znormalizuj zestaw danych za pomocą metody -ΔΔCt, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Mediana centrowania lub normalizacja genów porządkowych może być użyta w wierszu próbki w celu wygenerowania wartości -ΔCt. W reprezentatywnym eksperymencie zastosowano centrowanie mediany i zwalidowano je za pomocą normalizacji genów porządkowych. Można to zrobić w formacie .csv lub poprzez wgranie do oprogramowania do analizy danych.
    1. W przypadku centrowania mediany należy obliczyć medianę wartości Ct obliczoną na podstawie wszystkich wartości Ct dla pojedynczej próbki (pula 10-komórkowa). Następnie odejmij wszystkie poszczególne wartości Ct od tej wartości mediany. Daje to wartość -ΔCt.
    2. W celu normalizacji genów porządkowych należy obliczyć średnią ekspresję genów porządkowych (Actb, Gapdh i Ldha w reprezentatywnym eksperymencie) dla każdej próbki i użyć tej wartości jako tej, od której należy odjąć poszczególne wartości Ct.
    3. Aby wygenerować wartość -ΔΔCt, należy wziąć medianę każdej kolumny testu, która zawiera teraz wartość -ΔCt. Odejmij medianę testu od każdej wartości -ΔCt, aby uzyskać wartość -ΔΔCt.
  10. Oblicz wskaźniki Z dla każdej wartości -ΔΔCt za pomocą funkcji skali w R. Użyj funkcji mapy cieplnej R lub oddzielnego oprogramowania, aby wygenerować mapę cieplną.
  11. Użyj funkcji korelacji Pearsona, aby obliczyć korelacje Pearsona między każdym genem. Użyj funkcji melt w języku R, aby uporządkować zestaw danych pod kątem innych funkcji. Wyeksportuj te dane i prześlij je do oprogramowania sieci korelacji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja kolekcji pojedynczych komórek jest przeprowadzana wizualnie podczas procedur LCM. Jądra komórkowe są oceniane na stacji kontroli jakości. Typ komórki można określić na podstawie emisji znakowanego fluoroforu dla tego typu komórki i jej ogólnej morfologii. Jeśli na czapce wybrano niepożądane komórki, ich materiał genetyczny może zostać zniszczony za pomocą lasera UV w stacji kontroli jakości. Konieczna jest również dalsza walidacja za pomocą analizy molekularnej. W tym reprezentatywnym przykładzie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu pozostają chorobą trudną do leczenia. Nasza grupa podeszła do tego zaburzenia, badając procesy antynagradzania z perspektywy neuronauki systemowej. Zmierzyliśmy zmiany ekspresji genów w pojedynczych neuronach NTS i mikrogleju w szeregu czasowymodstawienia alkoholu 16. NTS został wybrany ze względu na jego znaczącą rolę w dysregulacji autonomicznej, która występuje w alkoholowym zespole abstynencyjnym. Łączymy LCM z jednokomórkowym mikroprzepływowym RT-qPCR,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tutaj praca została sfinansowana przez NIH HLB U01 HL133360 przyznany JS i RV, NIDA R21 DA036372 przyznany JS i EVB, T32 AA-007463 przyznany Janowi Hoekowi na rzecz SJO'S, oraz National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20X Barwnik wiążący DNAFluidigm100-7609NA
2x Test GE Ładowanie odczynnikaFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamiczna tablica IFC do ekspresji genów (określana jako chip qPCR w tekście)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β PrzeciwciałoGenway BiotechCCEC48Microglea Stain
Przeciwciało anty-NeuN, klon A60EMD MilliporeMAB377Barwnik neuronalny
Przeciwciało przeciwko hydroksylazie tyrozynyAbcamab112Barwnik dla neuronów TH +
System mikrodysekcji ArcturusXT Laser CaptureArcturusNA NA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platforma
Antygen surowicy bydlęcejSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific  LCM0211NA
CellDirect Jednoetapowy zestaw qRT-PCRThermoFisher Scientific11753500Składniki roztworu buforowego do lizy
KomórkiBezpośrednie ponowne zawieszenie i Zestaw do lizyThermoFisher Scientific 11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Bufor
zawiesinowy zawiesiny DNATEKnovaT0221
Przeciwciało wtórne ReadyProbe przeciwko oślicym, przeciwciało wtórne przeciwko królikowi IgG (H+L) ReadyProbe ReadyProbe, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry
Egzonukleaza przeciwciała INowy Englnad BioLabs, Inc.M0293SUrządzenie
ekstrakcji próbek NA ExtracSureThermoFisher ScientificLCM0208NA
Szkiełka mikroskopowe FisherbrandTM Superfrost PlusThermoFisher Scientific22-037-246Szkiełka podstawowe
Rurka reakcyjna cienkościenna GeneAmpThermoFisher ScientificN8010611
Kozia anty-mysia IgG (H+L), rekombinowane przeciwciało wtórne Superclona, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Kontroler
przeciwciał IFCFluidigmNA
NA RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix z Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNAThermoFisher Scientific11754250zawiera VILO i SuperScript
T4 Gen 32 BiałkoNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate 96-dołkowa płytka do PCR z półspódniczką, 0,2 mlUSA Scientific1402-9700NA
do barwienia jądra do zwykłe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mechanizmy antynagrodowelaserowa mikrodysekcja wychwytuj camikrofluidyczny RT qPCRsieci ekspresji gen wneuroinflamacjapodtypy neuronalnenormalizacja gen w gospodarzysie korelacji gen w

Powiązane artykuły