Artykuł metodologiczny

Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

DOI:

10.3791/64024

⸱

20 lipca 2022

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pokazuje, że przeprowadzając mikroprzeszczepy błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis, można rejestrować spójne i niezawodne odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego i kwasu γ-aminomasłowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobudzające i hamujące receptory jonotropowe są głównymi bramami strumieni jonów, które determinują aktywność synaps podczas fizjologicznej komunikacji neuronalnej. W związku z tym zaobserwowano zmiany w ich obfitości, funkcji i związkach z innymi elementami synaptycznymi jako główny korelat zmian w funkcjonowaniu mózgu i upośledzenia funkcji poznawczych w chorobach neurodegeneracyjnych i zaburzeniach psychicznych. Zrozumienie, w jaki sposób funkcja pobudzających i hamujących receptorów synaptycznych jest zmieniana przez chorobę, ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych terapii. Aby uzyskać informacje istotne dla choroby, ważne jest rejestrowanie aktywności elektrycznej receptorów neuroprzekaźników, które pozostają funkcjonalne w chorym ludzkim mózgu. Jak dotąd jest to najbliższe podejście do oceny patologicznych zmian w funkcjonowaniu receptorów. W niniejszej pracy przedstawiono metodykę wykonywania mikrotransplantacji błon synaptycznych, która polega na reaktywacji błon synaptycznych z zatrzaskowo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej zawierającej ludzkie receptory, poprzez jej wstrzyknięcie i tylne zespolenie do błony oocytów Xenopus laevis. Protokół zawiera również strategię metodologiczną mającą na celu uzyskanie spójnych i wiarygodnych odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego (AMPA) i kwasu γ-aminomasłowego (GABA), a także nowatorskie szczegółowe metody, które są stosowane do normalizacji i rygorystycznej analizy danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia neurodegeneracyjne dotykają dużego procentu populacji. Chociaż ich niszczycielskie konsekwencje są dobrze znane, związek między funkcjonalnymi zmianami receptorów neuroprzekaźników, które są krytyczne dla funkcjonowania mózgu, a ich symptomatologią jest nadal słabo poznany. Zmienność międzyosobnicza, przewlekły charakter choroby i podstępny początek objawów to tylko niektóre z powodów, które opóźniły zrozumienie wielu zaburzeń mózgu, w przypadku których brak równowagi chemicznej jest dobrze udokumentowany1,2. Modele zwierzęce dostarczyły bezcennych informacji i poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw fizjologii i patofizjologii w ewolucyjnie zachowanych systemach; Jednak kilka różnic międzygatunkowych między gryzoniami a ludźmi wyklucza bezpośrednią ekstrapolację funkcji receptora z modeli zwierzęcych na ludzki mózg3. W związku z tym wstępne wysiłki mające na celu zbadanie rodzimych ludzkich receptorów zostały opracowane przez laboratorium Ricardo Milediego przy użyciu chirurgicznie usuniętych tkanek i zamrożonych próbek. W tych początkowych eksperymentach wykorzystano całe błony, które obejmują neuronalne receptory synaptyczne i pozasynaptyczne, a także nieneuronalne receptory neuroprzekaźników, i chociaż dostarczają ważnych informacji o stanach chorobowych, istnieje obawa, że mieszanka receptorów komplikuje interpretację danych4,5,6,7. Co ważne, synapsy są głównym celem w wielu zaburzeniach neurodegeneracyjnych8,9; Dlatego testy mające na celu zbadanie właściwości funkcjonalnych dotkniętych synaps mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania informacji o istotnych dla choroby zmianach wpływających na komunikację synaptyczną. W tym miejscu opisano modyfikację oryginalnej metody: mikrotransplantację błon synaptycznych (MSM), która koncentruje się na fizjologicznej charakterystyce wzbogaconych preparatów białek synaptycznych i została z powodzeniem zastosowana do badania synaptosomów szczurzych i ludzkich10,11,12,13,14,15. Dzięki tej metodologii możliwe jest przeszczepienie receptorów synaptycznych, które kiedyś działały w ludzkim mózgu, osadzonych we własnych natywnych lipidach i z własną kohortą powiązanych białek. Co więcej, ponieważ dane MSM są ilościowe, możliwe jest wykorzystanie tych danych do integracji z dużymi zestawami danych proteomicznych lub sekwencjonowania10.

Ważne jest, aby zauważyć, że wiele analiz farmakologicznych i biofizycznych receptorów synaptycznych przeprowadza się na białkach rekombinowanych16,17. Chociaż podejście to zapewnia lepszy wgląd w relacje struktura-funkcja receptorów, nie może dostarczyć informacji o złożonych kompleksach receptorów multimerycznych znajdujących się w neuronach i ich zmianach w chorobie. Dlatego połączenie białek natywnych i rekombinowanych powinno zapewnić bardziej kompleksową analizę receptorów synaptycznych.

Istnieje wiele metod przygotowania synaptosomów10,11,12,13,14,15, które można dostosować do wymagań laboratorium. Protokół rozpoczyna się od założenia, że preparaty wzbogacone synaptosomalnie zostały wyizolowane i są gotowe do przetworzenia do eksperymentów mikrotransplantacyjnych. W laboratorium stosuje się metodę Syn-Per zgodnie z instrukcjami producenta. Dzieje się tak ze względu na wysoką powtarzalność w eksperymentach elektrofizjologicznych10,11. Istnieje również obszerna literatura wyjaśniająca, jak wyizolować oocyty Xenopus18,19, które można również kupić w stanie gotowym do wstrzyknięcia20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine (IACUC-1998-1388) oraz Oddział Medyczny Uniwersytetu Teksańskiego (IACUC-1803024). Kora skroniowa mózgu bez choroby Alzheimera (AD) (kobieta, 74 lata, interwał pośmiertny 2,8 godziny) i mózg AD (kobieta, 74 lata, interwał pośmiertny 4,5 godziny) zostały dostarczone przez centrum badań nad chorobą Alzheimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine (UCI-ADRC). Świadoma zgoda na dawstwo mózgu została uzyskana przez UCI-ADRC.

UWAGA: Nieutrwalona ludzka tkanka mózgowa powinna być traktowana jako źródło patogenów przenoszonych przez krew (BBP). W związku z tym przed rozpoczęciem eksperymentów konieczne jest szkolenie BBP. Protokół ten jest wykonywany w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) zgodnie z wymaganiami BSL2. Wytyczne i środki ostrożności w laboratorium obejmują: zakaz spożywania posiłków i napojów w laboratorium, przestrzeganie dobrych praktyk laboratoryjnych, wymagany jest sprzęt ochrony osobistej (rękawice, fartuch, buty z odkrytymi palcami), a drzwi muszą być zawsze zamknięte.

1. Preparat do mikroiniekcji oocytów Xenopus

  1. Aby wykonać igły iniekcyjne, należy wyciągnąć rurki borokrzemianowe o średnicy 3,5 cala za pomocą ściągacza do mikropipet. Po wyciągnięciu igieł do mikroiniekcji użyj mikroskopu i żyletki, aby odciąć wystarczającą ilość końcówki igły, aby można było wykonać mikroiniekcję (zwykle między 2-3 mm).
    UWAGA: Długość końcówki igły do cięcia może się różnić.
  2. Przygotuj 1x roztwór Bartha, dodając 200 ml roztworu podstawowego Bartha (5x) do 800 ml wody destylowanej. Napełnij 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z płaskim dnem 1x roztworem Bartha o temperaturze 18 °C.
    1. Przygotuj 5x roztwór podstawowy Bartha w następujący sposób. W 1 l wody destylowanej dodać 25,71 g NaCl (chlorek sodu), 0,372 g KCl (chlorek potasu), 0,301 g CaCl2 (dichlorek wapnia), 0,389 g Ca(NO3)2(4H2O) (czterowodny azotan wapnia), 1,01 gMgSO4(7H2O) (siarczan magnezu siedmiowodny), 1,008 gNaHCO3 (wodorowęglan sodu), i 11,91 g kwasu HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy).
  3. Wyizoluj oocyty Xenopus za pomocą protokołów opisanych w18,19 i używając stereoskopu z 2-krotnym powiększeniem, wybierając zdrowo wyglądające oocyty w stadium V-VI. Umieść około 10 oocytów w każdym dołku i użyj jednego z dołków do przechowywania niewstrzykniętych oocytów, które mają być używane jako komórki kontrolne podczas wykonywania nagrań.
  4. Wyjmij małą szalkę Petriego o wysokości 1 cm i średnicy 6 cm i umieść w niej nylonową siatkę tak, aby zakrywała dno naczynia. Następnie wlej 15 ml 1x roztworu Bartha, który ma być użyty do wykonania mikroiniekcji oocytów.
  5. Umieść nanowstrzykiwacz wzdłuż linii środkowej platformy mikroskopu. Przekręć magnes do pozycji wyłączonej i powoli przesuń nanowtryskiwacz do żądanej pozycji, ostrożnie go podtrzymując. Gdy nanowtryskiwacz jest prawidłowo ustawiony, obróć magnes z powrotem do pozycji całkowicie włączonej i upewnij się, że jest dobrze ustawiony.
  6. W przypadku próbki o wielkości 50,6 nl należy zastosować następujące ustawienia z boku nanowtryskiwacza: 1 to D (w dół), 2 to D, 3 to U (w górę), 4 to D i 5 to U. Umieść kawałek samouszczelniającego się tworzywa termoplastycznego lub nasadkę probówki do mikrowirówki na statywie mikroskopu, wyrównując ją z trajektorią nanowtryskiwacza.
    UWAGA: 50 nL to bliska maksymalna ilość wstrzykniętego materiału, jaką cytoplazma może wytrzymać21.
  7. Napełnij strzykawkę insulinową olejem mineralnym (około 0,5 ml/cm3) około połowy jej objętości. Za pomocą tej strzykawki napełnić igłę do mikroiniekcji olejem mineralnym. Upewnij się, że na końcu igły widoczna jest kropla oleju.
  8. Wystawić tłok nanoiniektora na co najmniej 1-2 cm. W tym celu należy przytrzymać wciśnięty przycisk EMPTY, aż tłok będzie widoczny na żądanej długości. Po odsłonięciu tłoka powoli i ostrożnie umieść szklaną igłę do mikroiniekcji wypełnioną olejem mineralnym na tłoku nanowtryskiwacza i upewnij się, że dobrze pasuje do czarnego O-ringu oporowego i zatrzymuje się na białym pierścieniu oporowym. Upewnij się, że nie zginasz tłoka nanowtryskiwacza w tym procesie.
  9. Gdy szklana igła do mikroiniekcji jest już zabezpieczona i umieszczona na miejscu, naciśnij przycisk EMPTY, aby usunąć potencjalne pęcherzyki powietrza. Delikatnie, chusteczką papierową, usuń nadmiar oleju mineralnego.

2. Wczytywanie próbki

  1. Przygotuj preparaty (próbki) wzbogacone w synaptosomal z obszaru zainteresowania ludzkiego mózgu, jak opisano w10,11,12,13,14,15, i przechowuj je w porcjach po około 5 μl w temperaturze -80 °C do momentu wstrzyknięcia.
  2. Przed wstrzyknięciem należy przenieść podwielokrotność na mokry lód i trzymać ją na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem sonikacji i pobierania. Liczba i rodzaje próbek zostaną określone na podstawie projektu doświadczalnego.
  3. Sonizuj wybrane próbki 3x w kąpieli z pływającym mokrym lodem, aby uniknąć rozgrzania próbki. Za każdym razem używaj cykli 5 s, czekając 1 minutę na mokrym lodzie między cyklami.
  4. Umieścić 1 μl próbki na tworzywie termoplastycznym. W razie potrzeby przed umieszczeniem próbki należy wykonać wgłębienie w powierzchni, aby zapobiec przemieszczaniu się próbki.
  5. Użyj pokręteł manipulatora przytrzymującego nanowtryskiwacz, aby ustawić igłę i przesunąć ją w kierunku próbki, która ma być napełniona. Gdy końcówka igły znajdzie się w próbce, naciśnij i przytrzymaj przycisk FILL, aż zostanie pobrana wystarczająca ilość próbki. Na 10 oocytów potrzeba około 0,5 μl. Za pomocą pokręteł przesuń igłę nanowtryskiwacza z powrotem do najwyższej pozycji.

3. Wstrzykiwanie oocytów

UWAGA: Standaryzowane błony synaptosomalne kory szczurów są również wstrzykiwane we wszystkich eksperymentach do zestawu oocytów w celu zmierzenia zmian w zdolności fuzji między różnymi partiami oocytów.

  1. Umieść wybrane oocyty na małej szalce Petriego, która ma dopasowaną nylonową siatkę i roztwór Bartha (około 10 oocytów). Ułóż oocyty tak, aby nie znajdowały się jeden na drugim; Będzie to pomocne podczas procesu wstrzykiwania.
  2. Za pomocą pokręteł na manipulatorze przytrzymującym nanowstrzykiwacz przesuń igłę w kierunku oocytów. Po zanurzeniu igły w roztworze Bartha, użyj pedału nożnego do nanowtryskiwacza, aby upewnić się, że igła do mikroiniekcji uwalnia próbkę. Jeśli próbka jest uwalniana, będzie widoczna z mikroskopu.
  3. Po ustaleniu z pewnością, że próbka jest uwalniana, przejdź do mikroiniekcji oocytu. Jeśli próbka nie jest uwalniana, powtórz proces napełniania igły.
  4. Wniknij igłą w oocyt tuż pod powierzchnią, nie głębiej i użyj pedału nożnego, aby wstrzyknąć próbkę. Pedał nożny wyda sygnał dźwiękowy, gdy sample zostanie zwolnione. Poczekaj około 2-3 s. Jeśli wstrzyknięcie się powiodło, komórka rozszerzy się. Gdy to nastąpi, użyj pokręteł na manipulatorze, aby wyjść z komórki.
    UWAGA: Fuzja błon w oocycie jest procesem spolaryzowanym; Dlatego oocyt powinien być wstrzykiwany po zwierzęcej stronie komórki, najlepiej powyżej równika, pod kątem igły w kierunku strony zwierzęcej, aby zmaksymalizować fuzję błony.
  5. Przesuń szalkę Petriego tak, aby następny oocyt zrównał się z igłą i powtarzaj proces, aż wszystkie oocyty w szalce zostaną wstrzyknięte. Powtarzaj ten proces, aż do wstrzyknięcia żądanej liczby oocytów. Upewnij się, że jedna studzienka oocytów nie została wstrzyknięta do użycia jako kontrola.
  6. Po wstrzyknięciu wszystkich oocytów wycofaj nanowstrzykiwacz do jego pierwotnej pozycji i wyjmij igłę.

4. Rejestracja prądów jonowych za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego

  1. Aby wykonać dwie igły elektrod z zaciskiem napięcia elektrody (TEVC), należy wyciągnąć 15 cm polerowane ogniowo rurki ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Po zakończeniu ciągnięcia napełnij 3 M KCl za pomocą długich igieł kapilarnych lub alternatywnie zanurz i gotuj igły w roztworze 3 M KCl przez 15 minut w ciągłym próżni. Wysoka temperatura pomaga w napełnianiu elektrod i usuwaniu pęcherzyków powietrza.
    1. Przygotować 3 M roztwór do napełniania elektrodą KCl, używając KCl w postaci krystalicznej i wody dejonizowanej, postępując dokładnie zgodnie z tymi krokami, aby potencjał odniesienia elektrod nie uległ zmianie. Ostrożnie wysuszyć KCl w piekarniku przez 2-3 godziny. Za pomocą wagi analitycznej ostrożnie odważ 223,68 g KCl. Przenieś KCl do szklanej butelki o pojemności 1 l. Użyj tego roztworu do chlorowania drutów elektrod srebrnych.
      UWAGA: Do wyciągania szklanych elektrod książkę kucharską pipet można pobrać tutaj: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Włącz wszystkie urządzenia używane do rejestrowania prądów jonowych: systemy główne, zawory roztworu, światło mikroskopu, systemy zaworów, zacisk oocytów i system próżniowy. Włącz komputer stacjonarny, zaloguj się do programu WinEDR 3.9.1 i upewnij się, że program jest uruchomiony i że wartości konfiguracji są poprawne w następujący sposób: nagraj na dysk, ustaw czas nagrywania i wyczyść opcję symulatora.
    1. Podaj następujące początkowe wartości ustawień dla amplifier: dla sekcji elektrody napięciowej (Vm) wyłącz ujemną kompensację pojemności (-C); dla sekcji elektrod kąpielowych (Im) ustaw przełącznik wyboru wzmocnienia (zakres od 0.1 do 10) na 10, a trzypozycyjny przełącznik, który wybiera mnożnik wzmocnienia (x0.1, x1.0 i x10), na x1.0. Diody LED wskażą wybór mnożnika wzmocnienia; dla sekcji clamp wyłącz selektor trybu clamp, ustaw regulator wzmocnienia DC na IN, a kontrolę wzmocnienia w pełnej pętli otwartej (zakres od 0 do 2000) na około 1200; dla poleceń ustaw na 40mV i ustaw ujemne elementy sterujące przytrzymaniem i mnożnik skali na x2; w przypadku elektrody prądowej użyj przesunięcia Ve, aby ustalić zerowe odniesienie przed wbiciem oocytu.
    2. Aby nagrać, otwórz oprogramowanie WinEDR V3.9.1, przejdź do górnego menu i wybierz Plik > Otwórz nowy plik. Utwórz własny folder i zapisz plik.
    3. Następnie w menu głównym wybierz opcję Nagraj > Nagraj na dysk. Gdy dwie elektrody znajdą się wewnątrz ooctytu, włącz dzwonek w sterowniku zaworu VC-8 i przekręć zacisk na Slow w OC-725C amplifier. Następnie wróć do oprogramowania WinEDR i wybierz opcję Nagraj w lewym górnym rogu ekranu.
    4. W tabeli znaków w lewym dolnym rogu zapisz swój początkowy potencjał błonowy i naciśnij Enter. W miarę trwania eksperymentu możesz zapisać nazwy stosowanych leków. Po zakończeniu eksperymentu wybierz opcję Zatrzymaj w lewym górnym rogu ekranu.
      UWAGA: Do wykonywania TEVC używamy oprogramowania WinEDR lub WinWCP, ponieważ są one bezpłatne i dobrze nadają się do eksperymentów, ale można użyć dowolnego innego dostępnego oprogramowania.
  3. Uzupełnij wszystkie roztwory leków potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu (np. GABA, Kainate) i potwierdź, że zawory roztworu działają prawidłowo, włączając je i wyłączając oraz obserwując przemieszczenie zaworów zaciskowych.
  4. Napełnij probówki, wlewając odpowiedni roztwór do pojemnika strzykawki podłączonego do probówki i oznacz sterownik zaworu tak, aby był skorelowany z probówkami z roztworem. Upewnij się, że przepływ roztworu jest stały, nie ma pęcherzyków i że system próżniowy działa prawidłowo.
  5. Ustaw obszar mikroskopu i komory nagraniowej. Umieść mostki agarowe (patrz poniżej) w odpowiednich okrągłych otworach za komorą zapisu (dystalnie od obszaru obsługi), łącząc studzienki dla elektrod używanych jako odniesienie do uziemienia i komory rejestracyjnej. Dodać roztwór roboczy Ringera (1x) do studzienek elektrody rejestracyjnej i uziemienia elektrody odniesienia.
    1. Mostki agarowe to probówki borokrzemianowe w kształcie litery U o długości 2-3 cm, wypełnione 3% agarem w roztworze Ringera. Wykonaj rurki w kształcie litery U, przecinając rurki o długości 15 cm, zginając je na otwartym ogniu, a następnie wypełniając je gorącym 3% agarem za pomocą strzykawki insulinowej. Wypełnione mostki agarowe w roztworze Ringera przechowuj w lodówce do czasu użycia.
    2. Przygotować 20x roztwór podstawowy Ringera w następujący sposób: W 1 l wody destylowanej dodać 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 g CaCl2 i 23,83 g kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego). Dla 1x roztworu roboczego Ringera, w kolbie miarowej, dodaj 200 ml roztworu podstawowego Ringera (20x) do 3,800 ml wody destylowanej.
  6. Przygotuj elektrody z chlorowanego srebra przed każdym eksperymentem przez elektrolizę, umieszczając srebrne druty w 3 M roztworze KCl i podłączając srebrną elektrodę do dodatniego bieguna akumulatora 9 V. Po około 3 minutach do elektrody osadza się stała brązowa warstwa AgCl. Umieść druty elektrody z chlorowanego srebra w obudowie elektrody.
    UWAGA: Uziemiające elektrody referencyjne i rejestrujące chlorowane to elektrody srebro/chlorek srebra (Ag/AgCl).
  7. Usunąć igły borokrzemianowe z roztworu KCl. Za pomocą strzykawki pobrać niewielką ilość roztworu KCl z otwartego końca igły elektrody i zastąpić roztwór KCl olejem mineralnym; pozwoli to uniknąć parowania wody i zmian stężenia KCl w igle. Nasuń szklaną igłę na drut elektrody z chlorowanego srebra i dokręć je na miejscu.
  8. Za pomocą prawego i lewego manipulatora przytrzymującego elektrody, wprowadź igły elektrod do komory nagrywającej, która jest wypełniona roztworem Ringera.
  9. Sprawdź rezystancję każdej elektrody, zerując pokrętła przesunięcia Vm i Ve, a następnie naciskając przyciski testu elektrody. Rezystancja powinna mieścić się w przedziale 0,5-3 MΩ (bezpośrednio odczytywana na ekranie jako 5-30 mV). Jeśli rezystancja jest poza zakresem, wymień na nowe mikroelektrody.
  10. Napełnij komorę nagraniową świeżym roztworem Ringera. Za pomocą szklanej pipety umieść oocyt bez iniekcji lub z mikroprzeszczepem na środku komory nagraniowej. Upewnij się, że oocyt jest wyraźnie widoczny pod mikroskopem, zwierzęcą stroną do góry (patrz UWAGA w kroku 3.4).
  11. Wprowadzić elektrodę do roztworu Ringera, aż dotkną błony oocytu. Delikatnie przekłuć błonę oocytów po stronie zwierzęcia (patrz UWAGA w kroku 3.4) obiema elektrodami i zapisać spoczynkowy potencjał błony. Włącz przepływ roztworu Ringera.
  12. Za pomocą wzmacniacza klamry oocytów zmień tryb na Voltage Clamp i ustaw napięcie podtrzymania na -80 mV. Prąd na monitorze powinien być ujemny, zwykle od 0 do 0,4 mikroampera.
  13. Utwórz nowy plik, aby zapisać nagranie jako Plik > Nowy > Zapisz nagranie w oprogramowaniu. Rozpocznij nagrywanie, naciśnij przycisk Nagraj > Nagraj na dysk. Dodaj odpowiednie informacje do pliku za pomocą okna dialogowego pola oznaczania (nazwa testu, użyte leki itp.).
  14. Zastosuj agonistów (np. GABA, glutaminian lub kainian) do stymulacji chemicznej, otwierając zawory i wprowadzając je do komory zapisu przez 15 sekund. Zwykle użyj wzmocnienia 10x, aby wykreślić maksymalną liczbę punktów i zrekonstruować odpowiedź. Jeśli prądy są bardzo małe, zwiększ wzmocnienie lub wzmocnienie, aby można je było ocenić i zobaczyć. Zawsze zwracaj uwagę na te zmiany.
    UWAGA: Czas trwania perfuzji zależy od paradygmatu eksperymentalnego. Jeśli głównym celem jest zmierzenie maksymalnej amplitudy, 15 s wystarczy, aby osiągnąć szczyt dla GABA lub plateau dla kainianu.
  15. Zawsze monitoruj poziomy rozwiązań. Roztwór Ringera będzie musiał być często uzupełniany, ponieważ jest używany między wszystkimi zastosowaniami roztworu. Po zakończeniu nagrywania przekręć voltage clamp do pozycji OFF i wyłącz zawór roztworu Ringera. Usuń oocyt. Zatrzymaj nagrywanie i zapisz plik. Powtórz te czynności dla wszystkich wstrzykniętych komórek jajowych.

5. Analiza nagrań TEVC

  1. Zapisz kopię nagrań na dysku USB. Stamtąd otwórz żądany plik do analizy. W pliku, który zostanie otwarty, nagranie można wyświetlić, oznaczyć i zmierzyć. Najczęstsza analiza obejmuje pomiar maksymalnej amplitudy, czasu aktywacji, odczulania i wyczerpania powtarzających się aplikacji.
  2. Zmierz maksymalną odpowiedź AMPA i szczytową odpowiedź GABA. Aby uzyskać te pomiary, najpierw ustal poziom zerowy lub linię bazową, znajdując czerwoną linię kursorem i przeciągając ją do prądu generowanego przez aplikację Ringer lub linię bazową.
  3. Po ustaleniu poziomu zerowego określ pomiary odpowiedzi, przeciągając za pomocą myszy zielony, pionowy kursor odczytu do żądanej części śledzenia wykresu. W razie potrzeby wyeksportuj ślady do analizy w dowolnym innym preferowanym oprogramowaniu
    UWAGA: Jeśli nie można zdefiniować poziomu zerowego lub na znaczniku jest zbyt dużo szumu, wyeksportuj plik WinEDR do oprogramowania analitycznego offline, które pozwoli na modyfikacje w celu zapewnienia linii bazowej poziomu i dodanie filtrów w celu redukcji szumów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu kilku godzin po wstrzyknięciu, błony synaptyczne, przenoszące swoje receptory neuroprzekaźników i kanały jonowe, zaczynają łączyć się z błoną plazmatyczną oocytu. Rysunek 1 pokazuje nagrania receptorów AMPA i GABAA mikroprzeszczepionych do oocytów Xenopus. W przypadku większości analiz mierzono odpowiedzi dwóch lub trzech oocytów na próbkę, używając dwóch lub trzech partii oocytów z różnych żab, co daje w sumie od sześciu do dziewięciu oocytów na próbkę. Odbywa si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza natywnych kompleksów białkowych z ludzkiego mózgu jest potrzebna, aby zrozumieć procesy homeostatyczne i patologiczne w zaburzeniach mózgu oraz opracować strategie terapeutyczne w celu zapobiegania chorobom lub ich leczenia. W związku z tym banki mózgów zawierające zamrożone próbki są nieocenionym źródłem dużego i w większości niewykorzystanego bogactwa informacji fizjologicznych29,30. Początkową obawą związaną z wykorzystaniem tkanek pośmiertnych jest wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIA/NIH R01AG070255 i R01AG073133 dla AL. Dziękujemy również Centrum Badań nad Chorobą Alzheimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine (UCI-ADRC) za dostarczenie ludzkiej tkanki pokazanej w tym manuskrypcie. UCI-ADRC jest finansowany z grantu NIH/NIA P30 AG066519.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do mikroiniekcji
3,5" Kapilary szklaneDrummond3-000-203-G/X
24-dołkowa, płaska płytka do hodowli tkankowychThermofisherFB012929
Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego NaczynieSutterP-1000
Thermofisher08-772B
Probówki do mikrowirówekThermofisher02-682-002
Olej mineralnyThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
Siatka nylonowaSiatka przemysłowaWN0800
ParafilmThermofisherS37440
StereoskopFisher Scientific03-000-037
StrzykawkaThermofisher14-841-31
Ultradźwiękowa kąpielczyszcząca ThermofisherFS20D
Xenopus laevis żabyXenopus 14217
Dla dwóch elektrod Zacisk napięciowy
kapilary ze szkła borokrzemianowegoSutterB200-116-15
Dowolny komputer PC lub laptop
Dolnoprzepustowy filtr BesselaWarner InstrumentsLPF-8
StereoskopFisher Scientific03-000-037
Stacja robocza z dwuelektrodowymi cęgami napięciowymiWarner InstrumentsTEV-700
ValveLink 8.2 Kontroler perfuzjiAutomate Scientific SKU:01-18
WInEDR Darmowe oprogramowanieUniversity of Strathclyde Glasgowhttps://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Wielofunkcyjny DAQNational InstrumentsNI USB-6341
Reodczynniki
CalciumThermofisherC79
Wapń Tetrahydrat azotanuThermofisherC109
KolagenazaSigma-AldrichC0130
GABASigma-AldrichA2129
HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)ThermofisherBP310
Kwas KainowyTocris0222
Siarczan magnezu siedmiowodnyThermofisherM63
Chlorek potasuThermofisherP217
Wodorowęglan soduThermofisherS233
Chlorek soduThermofisherS271-1
Ultrafree-0,1 i mikro; m Filtr MC,Amicon
iniekcyjne 15 cm o długości polerowany ogniopolerowany

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138(2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603(2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrotransplantacja b ony synaptycznejreceptory jonotropoweoocyty Xenopusclamp napi ciowyreceptory AMPAreceptory GABAiniekcja tkanki m zgowejrejestracja elektrofizjologicznachoroby neurodegeneracyjne

Powiązane artykuły