Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64026

⸱

25 sierpnia 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

Streszczenie

Cytoszkielet aktynowy, główna mechaniczna maszyneria w komórce, pośredniczy w wielu istotnych fizycznych czynnościach komórkowych, w tym deformacji komórek, podziałach, migracjach i adhezji. Jednak badanie dynamiki i struktury sieci aktynowej in vivo jest skomplikowane ze względu na biochemiczną i genetyczną regulację w żywych komórkach. Aby zbudować minimalny model pozbawiony wewnątrzkomórkowej regulacji biochemicznej, aktyna jest zamknięta w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV, zwanych również liposomami). Liposomy biomimetyczne są wielkości komórki i ułatwiają ilościowy wgląd w mechaniczne i dynamiczne właściwości sieci cytoszkieletów, otwierając realną drogę dla oddolnej biologii syntetycznej. Do generowania liposomów do enkapsulacji stosuje się metodę emulsji odwróconej (zwaną również metodą przenoszenia emulsji), która jest jedną z najbardziej udanych technik kapsułkowania złożonych roztworów w liposomach w celu przygotowania różnych systemów naśladujących komórki. W tej metodzie do wewnętrznego buforu dodaje się mieszaninę interesujących białek, które są następnie emulgowane w roztworze oleju mineralnego zawierającym fosfolipidy, tworząc jednowarstwowe kropelki lipidów. Pożądane liposomy są generowane z jednowarstwowych kropelek lipidów przechodzących przez granicę lipidów/olej-woda. Metoda ta umożliwia enkapsulację skoncentrowanych polimerów aktyny do liposomów z pożądanymi składnikami lipidowymi, torując drogę do odtworzenia in vitro biomimikującej sieci cytoszkieletu.

Wprowadzenie

Cytoszkielet aktynowy odgrywa fundamentalną rolę w konstruowaniu wewnątrzkomórkowej architektury komórki poprzez koordynację kurczliwości na poziomie molekularnym i generowanie siły1,2,3. W rezultacie, pośredniczy w wielu istotnych czynnościach komórkowych, w tym w deformacji komórek4,5, division6, migration7,8 i adhesion9. Rekonstrukcja in vitro sieci aktynowych zyskała ogromne zainteresowanie w ostatnich latach10,11,12,13,14,15,16,17. Celem rekonstytucji jest zbudowanie minimalnego modelu komórki pozbawionego złożonej regulacji biochemicznej, która istnieje w żywych komórkach. Zapewnia to kontrolowane środowisko do badania określonych aktywności wewnątrzkomórkowych i ułatwia identyfikację i analizę różnych składników cytoszkieletu aktynowego 18,19. Co więcej, enkapsulacja sieci aktynowych in vitro wewnątrz fosfolipidowych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV, liposomy) zapewnia ograniczoną, ale odkształcalną przestrzeń z półprzepuszczalną granicą. Naśladuje fizjologiczne i mechaniczne mikrośrodowisko maszynerii aktynowej w komórce9,20,21,22.

Wśród różnych metod przygotowania liposomów, metoda hydratacji filmu lipidowego (znana również jako metoda pęcznienia) jest jedną z najwcześniejszych technik23. Suchy film lipidowy nawadnia się z dodatkiem, tworząc błoniaste pęcherzyki, które ostatecznie stają się pęcherzykami24. Aby wytworzyć większe pęcherzyki z wyższą wydajnością, ulepszona metoda rozwijająca się od metody hydratacji filmu, znana jako metoda elektroformacji25, stosuje pole elektryczne prądu przemiennego, aby skutecznie promować proces hydratacji26. Głównymi ograniczeniami tych opartych na hydratacji metod enkapsulacji aktyny jest to, że mają niską skuteczność enkapsulacji wysoce skoncentrowanych białek i są kompatybilne tylko z określonymi składami lipidów24. Dla porównania, technika odwróconej emulsji ma mniej ograniczeń dotyczących składników lipidowych i stężeń białek20,27,28,29. W tej metodzie mieszanina białek do kapsułkowania jest dodawana do wewnętrznego buforu wodnego, który jest następnie emulgowany w roztworze oleju mineralnego zawierającym lipidy, tworząc jednowarstwowe kropelki lipidowe. Jednowarstwowe kropelki lipidów przechodzą następnie przez inny interfejs lipid/olej-woda poprzez wirowanie, tworząc dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe (liposomy). Technika ta okazała się jedną z najbardziej skutecznych strategii enkapsulacji aktyny24,30. Oddzielnie istnieje kilka metod urządzeń mikroprzepływowych, w tym pulsacyjne natryskiwanie31,32, przejściowe wyrzucanie membrany33 oraz metoda cDICE34. Podobieństwa między metodą emulsji odwróconej a metodą mikroprzepływową polegają na zastosowaniu rozpuszczalnika lipidowego (oleju) oraz wprowadzeniu granicy faz lipid/olej-woda w celu utworzenia zewnętrznej ulotki liposomów. W przeciwieństwie do tego, wytwarzanie liposomów metodą mikroprzepływową wymaga ustawienia urządzeń mikroprzepływowych i towarzyszy mu olej uwięziony między dwoma płatkami dwuwarstwy, co wymaga dodatkowego kroku do usunięcia oleju35.

W tym manuskrypcie użyliśmy techniki odwróconej emulsji do przygotowania liposomów otaczających spolimeryzowaną sieć F-aktyny, jak to było wcześniej używane22. Mieszaninę białek do enkapsulacji umieszczono najpierw w buforze o warunkach niepolimeryzujących, aby utrzymać aktynę w postaci globularnej (G). Cały proces przeprowadzono w temperaturze 4 °C, aby zapobiec wczesnej polimeryzacji aktyny, która została później wywołana przez ogrzanie próbki do temperatury pokojowej. Po osiągnięciu temperatury pokojowej aktyna polimeryzuje do postaci nitkowatej (F). Do wewnętrznego wodnego roztworu buforowego można dodać różne białka wiążące aktynę, aby zbadać funkcje i właściwości białka, dostarczając w ten sposób dalszych informacji na temat jego interakcji z siecią aktynową i powierzchnią błony. Metodę tę można również zastosować do enkapsulacji różnych interesujących białek36 i dużych obiektów (mikrocząstek, samobieżnych mikropływaków itp.) o rozmiarach zbliżonych do końcowych liposomów28,37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i roztworów białkowych

  1. Przygotować wodny wewnętrzny bufor niepolimeryzacyjny (INP) o całkowitej objętości 5 ml, mieszając 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sacharozy i 0,2 mM ATP.
  2. Przygotować mieszankę białkową (PM), dodając białka do buforu INP w temperaturze 4 °C o następujących stężeniach: 11,2 μM niefluorescencyjnej G-aktyny, 2,8 μM aktyny znakowanej fluorescencyjnie i 0,24 μM Arp2/3 (tabela materiałów). Aby utworzyć warstwę F-aktyny, dodaj 100 nM żelsoliny, 4 μM kofiliny i 2,2 μM VCA-His do PM. W ramach eksperymentu kontrolnego zastąp PM barwnikiem fluorescencyjnym o stężeniu 100 μg/ml (tabela materiałów).
  3. Przygotować wodny bufor do polimeryzacji wewnętrznej (IP) (wodny) w całkowitej objętości 5 ml, mieszając 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP i 80 mM sacharozy.
  4. Przygotować bufor końcowy (FB), mieszając bufor INP (zawierający PM) i bufor IP w stosunku objętościowym 1:1, aby uzyskać wewnętrzny roztwór wodny o całkowitej objętości 30 μl, który zostanie zamknięty w liposomie.
  5. Przygotować wodny bufor zewnętrzny (OB) o całkowitej objętości 150 μl, mieszając 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glukozy i 0,1 mg/ml β-kazeiny.
    UWAGA: Osmolarność OB można regulować za pomocą glukozy, aby zapewnić, że ciśnienie osmotyczne OB jest nieco większe niż FB (20-60 mOsm). Gęstość FB powinna być nieco wyższa niż OB.

2. Przygotowanie liposomów w oparciu o techniki emulsji odwróconej

  1. Przygotuj mieszaninę lipidów i olejów
    1. Dodać 100 μl 25 mg/ml L-α-fosfatydylocholiny (niefluorescencyjny PC jaj, zwany również EPC, zawierający 1% DHPE) do szklanej fiolki. Odparować chloroform z argonem, pozostawiając suchy, stały film lipidowy (2,5 mg) na dnie fiolki.
      1. Aby utworzyć warstwę F-aktyny, należy dodać sól niklu sukcynylo-1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-{[n(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacetynowy] sukcynylo} soli niklowej (DOGS-NTA-Ni) w stosunku 10:1 EPC do DOGS-NTA-Ni i wymieszać przed odparowaniem chloroformu.
    2. Dodać 2 ml oleju mineralnego i sonikować mieszaninę lipidów i oleju w temperaturze pokojowej w kąpieli przez 1 godzinę w celu ponownego zawieszenia lipidów.
      UWAGA: Mieszanina lipidów i oleju po sonikacji może być przechowywana przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zaleca się ponowne sonikację.
  2. Przygotować końcowy bufor w emulsji olejowej (FB/olej) do przygotowania jednowarstwowych kropelek lipidów zawierających interesujące białko.
    1. Do 100 μl mieszaniny lipidowo-olejowej pobranej w plastikowej tubie dodaj 10 μl FB. Upewnij się, że FB jest w jednej kropli.
    2. Za pomocą szklanej strzykawki narysuj mieszaninę lipid-olej-FB i delikatnie zasysaj w górę i w dół wiele razy, aby ją zemulgować; najpierw narysuj niewielką ilość mieszaniny lipidów i olejów, a następnie kroplę FB, umieszczając końcówkę strzykawki na obrzeżach kropli, aby rozbić ją na drobne kropelki. Powtarzaj aspirację w górę iw dół, aż powstanie biaława i mętna emulsja.
  3. Umieść 30 μl OB w osobnej plastikowej tubie. Umieść 30 μl mieszaniny lipidów i oleju na wierzchu OB i pozostaw na ~ 10 minut, aby wytworzyć monowarstwę lipidową na granicy faz.
    UWAGA: Jeśli lipidy są naładowane lub białko jest włączone, czas trwania tego kroku powinien zostać wydłużony38.
  4. Przygotuj liposomy
    1. Ostrożnie dodać 50 μl emulsji FB/olejowej (krok 2.2) do górnej fazy olejowej rurki z kroku 2.3.
    2. Odwirować plastikową probówkę o sile 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zmieniaj czas i prędkość wirowania, aby zoptymalizować tworzenie liposomów.
      UWAGA: Po odwirowaniu górna faza olejowa powinna być klarowna, a dolna OB (zawierająca liposomy) powinna być lekko mętna.
    3. Ostrożnie usuń fazę olejową za pomocą pipety. W razie potrzeby zassać dodatkową objętość. Upewnij się, że nie umieszczasz końcówki pipety z boku probówki, aby uniknąć tworzenia menisku oleju na wierzchu fazy liposomowej.
    4. Za pomocą nowej pipety powoli wsuń końcówkę pipety w pozostałą dolną fazę i odessaj objętość wodną, aby zebrać liposomy.
      UWAGA: Lepiej jest stracić objętość niż włączyć olej. Włączenie oleju spowoduje pęknięcie liposomów, a składniki wewnętrzne zostaną uwolnione do zewnętrznego bufora. Odetnij końcówkę pipety, aby zmniejszyć ścinanie.

3. Obserwacja mikroskopowa

  1. Wlać 100 μl OB do studzienki komory inkubacyjnej (4-dołkowa płytka zawierająca 12 mm okrągłe szkiełka nakrywkowe). Delikatnie umieść zebrane liposomy (krok 2.4.4) w OB, a następnie umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu komory.
    UWAGA: OB zawiera β-kazeinę, która pasywuje powierzchnię szkła i minimalizuje przywieranie między liposomami20.
  2. Obserwuj liposomy za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu zanurzonego w oleju 63x. Użyj linii laserowych 488 nm, 647 nm i 561 nm, aby obserwować odpowiednio fluorescencyjnie znakowany lipid, kapsułkowany barwnik fluorescencyjny i kapsułkowaną aktynę znakowaną fluorescencyjnie. Uchwyć interesujące Cię klatki i zapisz obrazy w formacie TIFF.
  3. Przetwarzaj i analizuj obrazy w ImageJ/Fiji39. Dla nowych użytkowników ImageJ/Fiji dostępny jest samouczek online (patrz Spis materiałów).
    1. Otwórz plik TIFF za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji.
    2. Przejdź do opcji Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast. Dostosuj jasność i kontrast obrazu do żądanej skali, dostosowując ustawienia Minimum i Maksimum oraz suwaki Jasność i Kontrast.
    3. Kliknij narzędzie Zaznaczanie prostokąta na pasku narzędzi i wybierz obszar zainteresowania (ROI). Przejdź do opcji Image > Crop, aby przyciąć ROI.
    4. Przejdź do pozycji Analizuj > ustaw skalę. W wyskakującym okienku wprowadź 1.0 w polu Pixel Aspect Ratio (Współczynnik proporcji pikseli) i ustaw μm jako jednostkę długości. W polu Odległość w pikselach wprowadź szerokość obrazu w pikselach. W polu Znana odległość wprowadź rzeczywistą szerokość obrazu w mikronach.
    5. Aby zmierzyć rozmiar liposomu, Korzystając z narzędzia Zaznaczanie owalu na pasku narzędzi, narysuj okrąg wzdłuż krawędzi liposomu. Przejdź do opcji Analizuj > Zmierz, aby zmierzyć obszar okręgu, na podstawie którego można obliczyć średnicę liposomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie liposomów w oparciu o technikę odwróconej emulsji zostało przedstawione graficznie i schematycznie na Rysunku 1.

Najpierw przygotowano puste liposomy (~5-50 µm o średnicy), składających się z fosfolipidu (EPC) i lipidu fluorescencyjnego (DHPE). W ramach eksperymentu kontrolnego wewnątrz pustych liposomów zamknięto jasny, dalekoczerwony barwnik fluorescencyjny. To, czy na obwodzie kropli utworzyła się pomyślnie monowarstwa lipidowa, można było ustalić...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

O powodzeniu wysokiej wydajności liposomów podczas procesu przygotowania decyduje kilka kluczowych kroków. Aby całkowicie rozpuścić film lipidowy w oleju, próbka musi być poddana sonikacji, aż film lipidowy na dnie szklanej fiolki całkowicie zniknie. Po sonikacji, mieszanina lipid-olej musi być przechowywana przez noc w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach, aby cząsteczki lipidów mogły się dalej rozproszyć29. Mieszaninę można przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia. Podczas przygotowyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Potwierdzamy finansowanie ARO MURI W911NF-14-1-0403 dla M.P.M., National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 dla M.P.M., National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 oraz Human Frontiers Science Program (HFSP) grant numer RGY0073/2018 dla M.P.M. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy ARO, NIH lub HFSP. S.C. potwierdza owocne dyskusje z V. Yadavem, C. Muresanem i S. Amirim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól niklu 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-{[n(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacetu]sukcynylo} sól niklu (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nikel Lipid
1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanSigmaD27802-25GDABCO
Białko aktynowe (>99% czystości): mięśnie szkieletowe królikaCytoszkielet, IncAKL99-Dniefluorescencyjna G-aktyna
Białko aktyny (rodamina): mięśnie szkieletowe królikaCytoszkielet, IncAR05znakowana fluorescencyjnie aktyna
Adenozyna 5&-trifosforan Hydrat soli disodowejSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 barwnikThermoFisherbarwnik fluorescencyjny
Andor iQ3Oprogramowanie sterujące i akwizycyjne Andor Technologies
Arp2/3 Kompleks białkowy: Cytoszkielet mózgu świniIncRP01P-AArp 2/3
Dwuwodny chlorek wapniaSigma10035048Komory CaCl2
Chamlide (4-dołkowe na okrągłe szkiełko nakrywkowe 12 mm)Komora inkubacyjnaQuorum Technologies
Białko kofiliny: ludzki rekombinowanycytoszkielet, IncCF01-Ckofilina
Mikroskop konfokalny (63-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glukoza
DitiotreitolDOT Naukowy DSD11000-10Białko
żelsoliny DTT: rekombinowany cytoszkielet Homo Sapiens, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Strzykawka gazoszczelna, 500 i mikro; L, igła cementowana, 22 G, końcówka stożkowa 2"Cole-ParmerUX-07940-53szklana strzykawka
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alfa-fosfatydylocholinaAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Chlorek magnezuSigma7786303MgCl2
Olej mineralny, BioReagent, do biologii molekularnej, olej lekkiSigma8042475olej mineralny
Fragment N-WASP WWA (aa400– 501, VCA-His)VCA-His jest oczyszczany przy użyciu protokołu laboratoryjnego. Protokół może zostać dostarczony na uzasadnione żądanie
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Chlorek potasuSigma7447407KCl
SacharozaSigma57-50-1sacharoza
i beta;-kazeina z mleka krowiegoSigmaC6905-250MG
do mikroskopu konfokalnego,

Bibliografia

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103(2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745(2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103(2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282(2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245(2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243(2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda emulsji odwróconejenkapsulacja liposomalnarekonstrukcja cytoszkieletumikroskopia konfokalnadynamika sieci aktynowejkompleks ARP2/3znakowanie fluorescencyjnesyntetyczny model komórki
In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.