Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

DOI:

10.3791/64027

⸱

22 lipca 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicień Caenorhabditis elegans jest modelowym systemem interakcji gospodarz-mikrob i gospodarz-mikrobiom. W wielu dotychczasowych badaniach wykorzystuje się okresowe trawienie, a nie pojedyncze próbki robaków, do ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego w tym organizmie. Argumentuje się, że duża zmienność międzyosobnicza obserwowana w kolonizacji bakteryjnej jelita C. elegans jest pouczająca, a metody trawienia okresowego odrzucają informacje, które są ważne dla dokładnego porównania między warunkami. Ponieważ opisanie zmienności nieodłącznie związanej z tymi próbkami wymaga dużej liczby osobników, ustanowiono wygodny protokół 96-dołkowej płytki do rozbijania i posiewu kolonii poszczególnych robaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niejednorodność w powiązaniach gospodarz-mikroorganizm jest obserwowana powszechnie, a różnice między osobnikami są coraz częściej uznawane za czynnik przyczyniający się do procesów na poziomie populacji, od konkurencji i współistnienia1 do przenoszenia chorób2,3,4. U C. elegans wielokrotnie obserwowano "ukrytą heterogeniczność" w populacjach izogenicznych, przy czym subpopulacje osobników wykazywały różne fenotypy w reakcji na szok cieplny5,6, starzenie się i długość życia7,8,9,10,11, oraz wiele innych aspektów fizjologii i rozwoju12. Większość analiz, które próbują zidentyfikować strukturę subpopulacji, dostarcza dowodów na istnienie dwóch subpopulacji w eksperymentalnych populacjach izogenicznych, zsynchronizowanych robaków5,7,8, chociaż inne dane sugerują możliwość występowania cech w obrębie populacji, a nie odrębnych grup7,12,13. Co istotne, znaczną niejednorodność w populacjach jelitowych obserwuje się nawet w izogenicznych populacjach robaków skolonizowanych ze wspólnego źródła drobnoustrojów13,14,15,16, a ta niejednorodność może być ukryta przez powszechnie stosowane pomiary zbiorcze17,18,19,20 do ilościowego oznaczania bakterii w robaku.

Ta praca przedstawia dane sugerujące potrzebę większego polegania na pomiarach pojedynczego robaka w powiązaniu gospodarz-mikrob, a także protokoły zwiększające dokładność i przepustowość w przypadku zakłóceń spowodowanych przez pojedynczego robaka. Protokoły te mają na celu ułatwienie mechanicznego rozbijania dużej liczby pojedynczych C. elegans w celu ilościowego określenia żywotnego obciążenia bakteryjnego, zapewniając jednocześnie lepszą powtarzalność i mniejszy wysiłek na próbkę niż rozbijanie pojedynczych robaków za pomocą tłuczka. Zalecany etap oczyszczania jelit, w którym robaki mogą żywić się zabitymi termicznie bakteriami E. coli przed przygotowaniem do przerwania, jest uwzględniony w celu zminimalizowania wpływu niedawno spożytych i innych przejściowych (nieprzylegających) bakterii. Protokoły te obejmują metodę paraliżu zimnego do czyszczenia naskórka za pomocą wybielacza powierzchniowego o niskim stężeniu; Bielenie powierzchni może być stosowane jako etap przygotowawczy do rozbijania pojedynczych robaków lub jako metoda przygotowania żywych, zewnętrznie wolnych od zarazków robaków. Ta metoda wybielania powierzchni jest wystarczająca do usunięcia szerokiej gamy drobnoustrojów zewnętrznych, a leczenie zimnem stanowi alternatywę dla konwencjonalnego paraliżu opartego na lewamizolu; Podczas gdy lewamizol będzie preferowany w eksperymentach wrażliwych na zimno, paraliż zimny minimalizuje wpływ na strumienie odpadów niebezpiecznych i umożliwia szybkie wznowienie normalnej aktywności. Podczas gdy pełny protokół opisuje eksperyment laboratoryjny, w którym robaki są kolonizowane znanymi bakteriami, procedury czyszczenia robaków i rozbijania pojedynczych robaków można łatwo zastosować do robaków wyizolowanych z dzikich próbek lub skolonizowanych w eksperymentach mikrokosmicznych. Opisane tutaj protokoły wytwarzają żywe bakterie wyekstrahowane z jelita robaka, odpowiednie do posiewu i oznaczania ilościowego jednostek tworzących kolonie (CFU) u poszczególnych robaków; W przypadku analizy społeczności jelitowej opartej na sekwencjonowaniu, do tych protokołów należy dodać kolejne etapy lizy komórek i ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robaki użyte w tych eksperymentach zostały pozyskane z Centrum Genetycznego Caenorhabditis, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Bristol N2 jest typem dzikim. Mutanty DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) i daf-2(e1370) III (CGC CB1370) służą do zilustrowania różnic w obciążeniu bakteryjnym jelit.

HT115(DE3) E. coli niosący wektor RNAi pos-1 pochodzi z biblioteki Ahringer 21. Kolekcja MYb rodzimych bakterii jelitowych C. elegans22 została uzyskana z laboratorium Schulenburga. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR pochodzi z tego lab23. W tym laboratorium wyizolowano Pseudomonas mosselii. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP uzyskano z laboratorium LaRock na Uniwersytecie Emory.

Wszystkie i media dla robaków są przygotowane zgodnie z wcześniej opublikowaną literaturą24 z niewielkimi modyfikacjami (zobacz Plik uzupełniający 1).

1. Przygotowanie zsynchronizowanych sterylnych C. elegans

UWAGA: W tej sekcji opisano krok po kroku procedury generowania zsynchronizowanej populacji reprodukcyjnie sterylnych dorosłych robaków. Karmienie na płytkach RNAi pos-1 stosuje się tutaj, aby zapobiec produkcji potomstwa, ponieważ ta ingerencja jest śmiertelna dla zarodka; Larwy L1 wyhodowane do dorosłości na RNAi pos-1 rozwijają się w hermafrodyty składające jaja, ale te jaja są niezdolne do życia25. Protokół żywienia RNAi jest taki jak w rozdziale "Genetyka odwrócona" w Wormbook26.

  1. Przed synchronizacją robaków upewnij się, że dostępne są świeże płytki RNAi NGM + pos-1 o średnicy 10 cm. Płytki można przygotować świeżo z zagęszczonej indukowanej kultury płynnej (+Amp +IPTG) lub zaszczepić jako trawniki na NGM + 100 μg/ml ampicyliny + 1 mM IPTG i pozostawić do wzrostu w temperaturze 25 °C w ciemności przez 1 dzień27.
    UWAGA: Karbenicylina (25 μg/ml) jest często stosowana zamiast ampicyliny na płytkach RNAi. Ampicylina jest tańsza, ale mniej stabilna; w przypadku stosowania ampicyliny, płytki należy wysiać natychmiast po wyschnięciu i zużyć tak szybko, jak to możliwe (można przechowywać przez <1 tydzień w temperaturze 4 °C)27. Zalecane tutaj wysokie stężenie antybiotyków pomoże zapewnić odpowiednią selekcję.
  2. Zacznij od kilku (zwykle od dwóch do czterech) płytek NGM z dużymi populacjami grawitacyjnych hermafrodytów. Izoluj jaja za pomocą synchronizacji bleach-NaOH24.
    1. Zmyj robaki z płytek agarowych za pomocą 2 ml sterylnego ddH2O na płytkę. Rozprowadź płyn równomiernie w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (jedna probówka na płytkę lub hermafrodyty).
    2. Wiruj w dół przez ~5 s w miniwirówce stołowej (2,000 x g), aby przyciągnąć dorosłych na dno probówek. Odpipetować supernatant i wyrzucić.
    3. Przemyć 1 ml sterylnego ddH2O; odwirować jak poprzednio i wyrzucić supernatant.
    4. Powtórz poprzedni krok, aby zredukować pozostałe resztki bakteryjne.
    5. Zawiesić zawartość każdej probówki w 1 ml sterylnego ddH2O. Do każdej probówki dodać 130 μl dostępnego w handlu wybielacza (8,25% podchlorynu sodu) i 130 μl 5 N wodorotlenku sodu (NaOH, stężenie końcowe 0,5 N).
    6. Energicznie wiruj rurki przez co najmniej 10-15 s co 2 minuty, aż dorosłe ciała się rozpadną. Nie pozwól, aby leczenie wybielaczem-NaOH trwało dłużej niż 5 minut, aby uniknąć zabijania jaj.
    7. Wirować w miniwirówce przez 30-60 s przy 2,000 x g, aby granulować jaja. Odpipetować supernatant i wyrzucić. Może, ale nie musi, być widoczna osadka, jest to normalne.
    8. Dodaj 1 ml buforu ślimakowego M9 i wiruj przez 30-60 s w temperaturze 2000 x g. Odrzucić supernatant.
    9. Powtórzyć etap płukania (1.2.8) 5 razy, aby dokładnie usunąć mieszaninę wybielacza i NaOH, usuwając jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu jajowego.
    10. Przenieść jaja do 10 ml buforu robaków M9 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml lub probówce hodowlanej o pojemności 30 ml z nakrętką. Jeśli używasz rurek stożkowych, pozostaw pokrywkę lekko odkręconą i użyj odrobiny taśmy, aby ją zabezpieczyć. Inkubować z wytrząsaniem przez noc (16 godzin) w temperaturze 25 °C i przy prędkości 200 obr./min, aby umożliwić wylęg larw.
  3. Przenieś zsynchronizowane larwy L1 na płytki RNAi, aby dorosły do dorosłości.
    1. Dodać 2 ml sterylnego buforu M9 + 0,01% Triton X-100 (dalej M9TX-01) do każdej probówki L1 i przenieść całą objętość (12 ml) do 15 ml zakręcanej stożkowej probówki.
    2. Umieścić 15 ml probówek z robakami L1 w temperaturze 4 °C na 10 minut, aby spowolnić ruchy larw.
    3. Odwirować stożkowe probówki o pojemności 15 ml w dużej wirówce stołowej (1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty; przyspieszanie i zwalnianie nie powinno być wyższe niż 80% maksimum).
    4. Ostrożnie odpipetować szwadron z supernatantu, nie naruszając osadu L1. Odrzucić supernatant.
    5. Dodaj 12 ml zimnego M9TX-01 do każdej probówki. Powtórzyć wirowanie. Ostrożnie odpipetować i wyrzucić supernatant. W każdej probówce powinno pozostać ~200 μL.
    6. Wypłucz końcówkę pipety o pojemności 200 μl w M9TX-01, aby robaki nie przywierały do plastiku, a następnie użyj tej końcówki do ponownego zawieszenia granulki robaka. Przenieś zawieszone robaki na przygotowane płytki pos-1, pipetując krople płynu na trawnik bakteryjny.
    7. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C do pierwszego dnia dorosłości.
      UWAGA: Jeśli robaki rosną na płytkach RNAi pos-1, robaki MUSZĄ żywić się ad libitum bakteriami RNAi, dopóki w pełni nie osiągną dorosłości, aby zapewnić wysoką penetrację fenotypu embrionalno-letalnego. Sprawdź tabliczki po 24 i 48 godzinach. Jeśli talerze wydają się wygłodzone lub prawie wygłodzone, robaki będą musiały zostać przeniesione na świeże talerze, aby zakończyć wyrastanie na pełnowymiarowe dorosłe osobniki. Aby uniknąć wyczerpania płytek przed wyrośnięciem robaków, należy dodać 250-500 larw L1 do każdej 10 cm płytki RNAi.
  4. Zbierz dorosłe osobniki i usuń jelita E. coli, aby stworzyć robaki wolne od zarazków.
    1. Opłucz dorosłe robaki z płytek, używając 5 ml M9TX-01 na płytkę. Przenieś bufor + robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól dorosłym osobom osiąść na dnie probówki.
    2. Opłucz dorosłe osoby w 10 ml świeżego buforu M9TX-01, aż nie pozostanie widoczne zmętnienie bakteryjne (zwykle 1-2 razy). Probówki można odwirowywać przy 700 x g przez 30 s w celu osadzania robaków lub dorosłe osobniki można pozostawić do osadzenia się grawitacyjnie.
    3. Wykonaj jedno dodatkowe mycie 10 ml M9TX-01, aby zredukować bakterie zewnętrzne.
    4. Przenieś robaki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml lub probówek hodowlanych o pojemności 30 ml zawierających 5 ml pożywki S + 2x zabite termicznie E. coli OP50 (~5 x 109 zabitych komórek/ml) + 200 μg/ml gentamycyny + 50 μg/ml chloramfenikolu. Jeśli używasz rurek stożkowych, pozostaw pokrywkę lekko odkręconą i użyj odrobiny taśmy, aby ją zabezpieczyć. Używaj szklanych pipet lub opłucz plastikowe pipety w M9TX-01, aby zapobiec przywieraniu robaków.
    5. Dorosłe osobniki inkubować w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 24-48 godzin, aby uzyskać dorosłe osobniki wolne od zarazków.
      UWAGA: Jeśli robaki mają pozostać w antybiotykach przez >24 godziny, może być konieczne dodanie większej ilości zabitego termicznie OP50, aby zapewnić robakom odpowiednie źródło pożywienia. Sprawdź probówki po 24 godzinach i uzupełnij je żarliwym OP50, jeśli zmętnienie jest widocznie zmniejszone.
  5. Sacharoza myje dorosłe osoby zgodnie z protokołami Wormbook24 w celu uzyskania czystych, sterylnych reprodukcyjnie, zsynchronizowanych zapasów tylko dla dorosłych do kolonizacji bakteryjnej.
    1. Upewnij się, że zimne objętości 60% sacharozy, bufor ślimakowy M9 i M9TX-01 są gotowe do użycia. Dla uproszczenia można je pozostawić w temperaturze 4 °C poprzedniego wieczoru.
    2. Dla każdej próbki, która ma być myta, utwórz oznakowaną stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 8 ml M9TX-01 i odłóż na lód. Będą one potrzebne w kroku 1.5.10.
    3. Dodać 5 ml M9TX-01 do każdej probówki o pojemności 50 ml zawierającej larwy L1. Przenieś całą objętość (teraz 10 ml) do pustej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól dorosłym osobom osiąść na dnie probówki.
    4. Ostrożnie odpipetować supernatant i wyrzucić.
    5. Dodaj 10 ml M9TX-01 do każdej probówki i przenieś probówki do wiaderka na lód na 5-10 min.
      UWAGA: Począwszy od tego momentu, robaki i wszystkie powinny być trzymane na lodzie.
    6. Użyj ustawienia "szybka temperatura", aby schłodzić dużą wirówkę stołową do 4 °C.
    7. Dodaj 10 ml zimnego M9TX-01 do każdej probówki, aby spłukać wszelkie pozostałe zanieczyszczenia. Niech robaki osiądą na lodzie; Usunąć supernatant i wyrzucić.
    8. Pływak sacharozy: Dodać 5 ml zimnego buforu M9 i 5 ml zimnego 60% roztworu sacharozy do każdej probówki, dokładnie mieszając. Następnie ostrożnie umieść 1 ml zimnego buforu M9 na wierzchu mieszaniny sacharozy i buforu w każdej probówce. Nie mieszać po dodaniu pływaka.
      UWAGA: Poruszaj się szybko przez kilka następnych kroków - robaki mogą wyschnąć, jeśli są zbyt długo wystawione na działanie wysokich stężeń sacharozy!
    9. Wirować przy 1500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Żywe dorosłe robaki znajdują się na granicy faz M9 i sacharozy, około 1 ml od górnej części probówki.
    10. Za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieś warstwę robaka do przygotowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml z zimnym M9TX-01 (od kroku 1.5.2). Bądź bardzo ostrożny, aby uzyskać warstwę żywych robaków bez pipetowania zbyt dużej ilości sacharozy.
    11. W razie potrzeby dodaj M9TX-01, aby uzyskać równe objętości 10-12 ml / probówkę. Wirować przy 1500 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, a następnie odpipetować z supernatantu. W tym momencie robaki można przywrócić do temperatury pokojowej.
    12. Powtórzyć etap prania 1.5.11 dwukrotnie, zmniejszając prędkość do 700 x g w temperaturze 4 °C i czas do 30 s.

2. Karmienie robaków żywymi bakteriami w płynnej kulturze

UWAGA: Ten protokół jest używany do kolonizacji robaków bakteriami wyhodowanymi w laboratorium w dobrze wymieszanych warunkach w płynnej kulturze (Rysunek uzupełniający 1). Robaki mogą być kolonizowane pojedynczymi izolatami z czystej kultury (np. patogenami, takimi jak Enterococcus faecium28,29) lub mieszaninami izolatów (np. minimalne społeczności mikrobiomu14).

  1. Zacznij od zsynchronizowanych dorosłych robaków przemytych sacharozą z kroku protokołu 1.5 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umyć robaki raz w 12 ml buforu S i wyrzucić sklarowany nad osadem.
  2. Ponownie zawiesić umyte robaki w objętości pożywki S potrzebnej do eksperymentu. Weź pod uwagę objętość warunków eksperymentalnych, liczbę warunków, w których robaki zostaną podzielone, oraz końcowe stężenia robaków i bakterii.
    UWAGA: Żerowanie robaków różni się w zależności od dostępności bakterii30, a robaki mogą być zestresowane przez crowding31. Do kolonizacji w płynnej kulturze zaleca się <1000 robaków/ml i >107 jtk/ml; 1011 jtk/ml jest uważane za gęstość karmienia "ad libitum" na E. coli32.
  3. Odwiruj kultury bakterii. Odlej supernatant; Aspiracja lub pipetowanie mogą być stosowane w celu usunięcia supernatantu dla bakterii tworzących luźne granulki.
    UWAGA: W przypadku kultur >5 ml przenieś do probówek o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością ~2800 x g w dużej wirówce stołowej przez 8-10 minut. Kultury <5 ml można przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 9000 x g przez 1-2 minuty w małej wirówce stołowej. Wysoce ruchliwe bakterie (np. wiele gatunków Pseudomonas) mogą wymagać schładzania w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut, aby ułatwić tworzenie stabilnego osadu, i może być lepsze odwirowanie w temperaturze 4 °C.
  4. Ponownie zawiesić kultury bakteryjne w jednej objętości buforu S i ponownie odwirować do osadzania. Usunąć i wyrzucić supernatant jak poprzednio.
  5. Ponownie zawiesić kultury bakteryjne w pożywce S o pożądanej gęstości do eksperymentu, plus wszelkie antybiotyki do selekcji. Antybiotyki, które należy zastosować, jeśli takie istnieją, będą zależeć od profilu oporności bakterii stosowanych do kolonizacji.
  6. Używając końcówki do pipet pokrytej M9TX-01, delikatnie pipetuj robaki w górę i w dół, aż robaki zostaną dokładnie zawieszone w podłożu S, a następnie przenieś do probówek lub dołków płytkowych w celu kolonizacji bakteryjnej.
  7. Dodaj zawiesinę bakteryjną do każdej kultury robaków, aby osiągnąć pożądane stężenie bakterii i końcową objętość.
  8. Jeśli do kolonizacji używana jest płytka wielodołkowa, przykryj ją sterylną, 96-dołkową, przepuszczającą gaz membraną uszczelniającą.
  9. Inkubować z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min, aby zapobiec osadzaniu się bakterii podczas inkubacji.

3. Mechaniczne zakłócenie pojedynczych robaków w formacie 96-dołkowym

UWAGA: Ta sekcja opisuje protokół formatu płytki 96-dołkowej do mechanicznego rozbijania pojedynczych bakteriośnie skolonizowanych C. elegans. Pierwsze kroki w protokole (3.1-3.8) opisują metodę usuwania nieprzylegających bakterii z jelita robaka i czyszczenia zewnętrznej części robaków za pomocą zimnego paraliżu i wybielania powierzchniowego. Etapy te pozwolą na wytworzenie czystych, żywych dorosłych robaków, które mogą zostać mechanicznie rozbite w celu ilościowego określenia zawartości bakterii (3.8-end) lub wykorzystane do dalszych eksperymentów (Rysunek uzupełniający 1). Protokół ten można dostosować do ilościowego oznaczania bakterii u robaków skolonizowanych w płynnej kulturze (sekcja 2), na płytkach agarowych lub z gleby naturalnej lub mikrokosmicznej.

  1. Umieścić podwielokrotność M9TX-01 na lodzie do schłodzenia (4-5 razy więcej niż liczba próbek w ml).
  2. Przygotować porcję M9TX-01 + wybielacz (6% podchlorynu sodu, 1:1000 lub 1:2000 v/v, 1 ml na próbkę + 1 ml ekstra) i umieścić na lodzie do schłodzenia. Podwielokrotność ta zostanie użyta w kroku 3.8.
  3. Przygotować 96-dołkowe płytki do seryjnego rozcieńczania uszkodzonych próbek robaków.
    1. Otrzymać sterylne 96-dołkowe płytki o pojemności 300 μl z pokrywkami; w protokole tym stosuje się jedną płytkę rozcieńczającą na 12 strawionych robaków.
    2. Użyj 96-dołkowego pipetora wielokanałowego, aby wypełnić rzędy B-D każdej płytki 96-dołkowej (pojemność 300 μl) 180 μl buforu 1x PBS. Pozostaw górny wiersz pusty. Wiersze B-D staną się 10-krotnymi seryjnymi rozcieńczeniami trawienia robaków [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Odłóż talerze na bok. Płytki rozcieńczające zostaną użyte w kroku 3.13.
  4. Zawiesić każdą próbkę robaka w 1 ml M9TX-01 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Krótko zawiruj probówki (2-3 s) w miniwirówce o niskiej prędkości (2 000 x g) w temperaturze 25 °C, aby granulować dorosłe osobniki. Odpipetować sklaraty sklarowanej nad osadem i wyrzucić, uważając, aby nie naruszyć osadu robaka.
  6. Korzystając z ustawień wirowania w kroku 3.5, przepłucz robaki dwukrotnie 1 ml M9TX-01, a następnie raz 1 ml buforu robaka M9, aby zredukować bakterie zewnętrzne.
  7. Usuń nieprzylegające bakterie z jelita robaka.
    1. Ponownie zawiesić każdą próbkę robaków w 1 ml pożywki S + 2x zabity termicznie OP50 w probówce hodowlanej.
    2. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 20-30 minut, aby umożliwić przejście wszelkich nieprzylegających bakterii z jelita.
      UWAGA: Spowoduje to również usunięcie wszelkich zewnątrzkomórkowych białek fluorescencyjnych ze światła i umożliwi wyraźniejszą wizualizację znakowanych bakterii przylegających do nabłonka jelitowego, szczególnie gdy stosowane są fluorofory kwasoodporne (np. mCherry, dsRed).
  8. Powierzchniowe robaki wybielające w celu usunięcia bakterii zewnętrznych.
    1. Oczyszczone robaki przepłukać dwukrotnie 1 ml zimnego M9TX-01 i wyrzucić supernatant.
    2. Pozostaw probówki do schłodzenia przez 10 minut na lodzie (preferowane) lub w temperaturze 4 °C. To sparaliżuje robaki i zapobiegnie połknięciu wybielacza.
      UWAGA: Inne protokoły wykorzystują chemiczny środek paraliżujący, taki jak lewamizol; Jest to sprawdzone podejście33, które wymaga dodania strumienia odpadów niebezpiecznych.
    3. Dodaj 1 ml lodowatego buforu robaka M9 + bezzapachowy wybielacz (8,25% wodorotlenku sodu, 1:1000 lub 1:2000 v/v) do każdej probówki. Pozostaw probówki na lodzie (preferowane) lub w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut, aby zabić bakterie zewnętrzne.
      UWAGA: Nie przekraczaj stężenia wybielacza 1:1000. Nawet u sparaliżowanych robaków może dojść do śmiertelności.
    4. Odpipetować bufor wybielacza i wyrzucić; włożyć probówki z powrotem do lodu, aby upewnić się, że robaki nie wznowią pompowania, dopóki wybielacz nie zostanie usunięty.
    5. Dodaj 1 ml zimnego M9TX-01 do każdej probówki. Wirować przez ~5 s w miniwirówce (2 000 x g w temperaturze 25 °C); Zwróć rurki do lodu. Usunąć supernatant i wyrzucić.
    6. Powtórz ten etap płukania z kolejnym 1 ml zimnego M9TX-01, odrzucając jak najwięcej supernatantu.
      UWAGA: W przypadku używania robaków do dalszych eksperymentów, należy pominąć etap przepuszczalności (Protokół 3.9) i zamiast tego przenieść świeżo wybielone na powierzchni dorosłe osobniki do lodowatego bufora na 6-centymetrowej szalce Petriego i oddzielić robaki do warunków eksperymentalnych, jak w Protokole 3.10. Utrzymuj robaki w niskiej temperaturze, aby zapobiec wznowieniu ruchliwości, ale pracuj szybko - trzymanie robaków przez >30 minut na lodzie może potencjalnie spowodować <100% wznowienie normalnej aktywności34.
  9. Chemiczna przepuszczalność naskórka robaka za pomocą dodecylosiarczanu sodu i ditiotrietolu (0,25% SDS + 300 mM DTT) (na podstawie35)
    UWAGA: DTT jest środkiem redukującym i drażniącym. Nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem podczas pracy z suchymi zapasami lub roztworami. Wymagany jest strumień odpadów niebezpiecznych.
    1. W dygestoriach przygotuj wystarczającą ilość roztworu SDS/DTT, aby zapewnić 100 μl na każdą próbkę. W przypadku 1 ml do 965 μl bufora ślimakowego M9 lub M9TX-01 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 5 μl 5% (w/v) SDS i 30 μl 1M DTT.
      UWAGA: 1 M roztwór naziemnej telewizji cyfrowej (wodny) należy przygotować na świeżo lub przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C, aby zapewnić moc. Podwielokrotności powinny być tak dobrane, aby można je było zużyć w dwóch do trzech eksperymentach, aby uniknąć nadmiernego cyklu zamrażania i rozmrażania.
    2. Przenieś probówki do mikrowirówek zawierające robaki wybielone powierzchniowo do stojaka na probówki o temperaturze pokojowej. Każda probówka powinna zawierać robaki w ~20 μL buforu.
    3. Dodać 100 μl roztworu SDS/DTT do każdej próbki robaka. Wszelkie pozostałe roztwory SDS/DTT należy utylizować w odpowiednim strumieniu odpadów niebezpiecznych.
    4. Pozostaw zabieg na stole do 8 minut, aby częściowo rozbić oporny naskórek dorosłych robaków. W tym czasie robaki umrą i osiądą na dnie rury.
    5. Po upływie czasu przenikania ostrożnie odpipetować supernatant SDS/DTT i wyrzucić go do odpowiedniego strumienia odpadów niebezpiecznych SDS/DTT.
    6. Dodaj 1 ml M9TX-01 do każdej probówki. Krótko odwirować w wirówce stołowej, aby osadzać robaki lub pozwolić robakom osiąść grawitacyjnie na dnie probówek, a następnie odciągnąć supernatant i wyrzucić do strumienia odpadów niebezpiecznych SDS/DTT.
    7. Zawieś robaki w 1 ml bufora robaków M9 + 0,1% Triton X-100, aż będą gotowe do użycia.
  10. Oddziel robaki w głębokiej 96-dołkowej płytce z ziarnem z węglika krzemu, aby zapobiec mechanicznym zakłóceniom. Przygotuj 96-dołkową płytkę zakłócającą, jak poniżej.
    1. Zaopatrzyć się w sterylną 96-dołkową płytkę głębokowistą, o pojemności 2 ml i pasującą do niej silikonową pokrywę płytki 96-dołkowej.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać płytek, które są kompatybilne z 96-dołkowymi adapterami do substancji zaburzających tkanki. Niewielkie różnice w wymiarach zewnętrznych decydują o różnicy między płytą, którą można wyjąć z adapterów, a tą, której nie można wyjąć.
    2. Za pomocą sterylnej szpatułki dodaj niewielką ilość sterylnego węglika krzemu o ziarnistości 36 do każdego dołka płytki, do którego zostanie wysłany robak. Użyj wystarczającej ilości ziarna, aby ledwo przykryć dno studzienki (około 0,2 g na studzienkę). Nadmiar materiału utrudni dołożenie końcówki pipety na dno studzienki podczas pobierania zawartości.
    3. Dodać 180 μl buforu robaka M9 do każdej studzienki.
    4. Oznacz kolumny lub wiersze, aby wskazać, gdzie trafi każda próbka, a następnie luźno przykryj płytkę silikonową osłoną płytki 96-dołkowej.
  11. Przenieś pojedyncze robaki na 96-dołkową płytkę w celu zakłócenia.
    1. Ostrożnie przenieś przepuszczalne robaki na małą (35 lub 60 mm) szalkę Petriego zawierającą wystarczającą ilość M9TX-01, aby napełnić szalkę na głębokość ~1 cm.
      UWAGA: Jeśli obecna jest duża liczba robaków, przeniesienie całej próbki może nie być wykonalne, ponieważ ciecz stanie się stłoczona i trudno będzie pipetować pojedyncze robaki.
    2. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub innego urządzenia o małym powiększeniu odpipetować pojedyncze robaki o objętości 20 μl i przenieść je do indywidualnych dołków na płytce 96-dołkowej.
      UWAGA: Najlepiej zbierać tylko świeżo zabite robaki. Unikaj robaków o sztywnym liniowym kształcie, ponieważ robaki te mogły być martwe od jakiegoś czasu. Spróbuj wziąć robaki, które są zakrzywione lub w kształcie litery S, z normalną fizjologią i nienaruszonym jelitem.
    3. Po przeniesieniu każdego woluminu upewnij się, że wybrany robak został rzeczywiście wyrzucony do studni. W tym celu należy odpipetować 20 μl M9TX-01 z czystego obszaru szalki Petriego i uwolnić całą objętość z powrotem do szalki; Spowoduje to zwykle wysunięcie robaka, jeśli przyklei się do pipety. Jeśli robak utknął, usuń 20 μl ze studzienki i spróbuj ponownie przenieść.
    4. Po przeniesieniu wszystkich robaków przykryj 96-dołkową płytkę arkuszem dostępnej w handlu elastycznej folii uszczelniającej na podłożu papierowym (2 x 2 kwadraty), upewniając się, że strona folii uszczelniającej na podłożu papierowym jest skierowana w dół na dołki na próbki. Uważaj, aby nie rozciągnąć folii uszczelniającej zbyt cienko, ponieważ później bardzo trudno będzie ją usunąć.
    5. Delikatnie umieść silikonową matę uszczelniającą na wierzchu elastycznej folii uszczelniającej; nie dociskaj w tym czasie pokrywy do studzienek.
    6. Przenieś płytkę do 4 °C, aby schłodzić się przez 30-60 minut. Zapobiegnie to przegrzaniu podczas zakłóceń, które może uszkodzić próbki.
      UWAGA: Jest to punkt przerwania w protokole. W większości przypadków płytkę można pozostawić w temperaturze 4°C do 4 godzin przed mieleniem. Nie zostawiaj robaków na noc, ponieważ zmieni to liczbę bakterii.
  12. Załaduj 96-dołkowe płytki na urządzenie zaburzające tkanki, aby rozbić tkanki robaków i uwolnić bakterie jelitowe.
    UWAGA: (Opcjonalnie) W przypadku używania nieparzystej liczby płytek 96-dołkowych do trawienia, przed kontynuowaniem konieczne jest przygotowanie przeciwwagi. Użyj pustej, głębokiej płytki 96-dołkowej i napełnij studzienki wodą, aż będzie ważyć tyle samo, co pierwsza płytka.
    1. Mocno dociśnij silikonową matę uszczelniającą do dołków, aby uzyskać uszczelnienie, upewniając się, że pokrywa leży płasko na całej powierzchni płytki.
      UWAGA: Jeśli elastyczna folia uszczelniająca jest zbyt gruba po rozciągnięciu, trudno będzie zabezpieczyć silikonową pokrywę tak, aby leżała płasko we wszystkich studzienkach. Spowoduje to niewystarczające uszczelnienie i zanieczyszczenie od źródła do studzienki podczas wytrząsania.
    2. Zabezpiecz płytki w urządzeniu zaburzającym tkanki za pomocą adapterów do płytek 96-dołkowych. Potrząsaj płytkami przez 1 minutę przy 30 Hz, następnie obróć płytki o 180° i ponownie potrząsaj przez 1 minutę. Pomoże to zapewnić równomierne zakłócenia we wszystkich dołkach płyty.
    3. Mocno postukaj płytkami o stół dwa lub trzy razy, aby usunąć piasek z elastycznej folii uszczelniającej.
    4. Używając dużej wirówki z dwoma adapterami płytek 96-dołkowych, obracaj płytki w dół przy 2400 x g przez 2 minuty, aby zebrać cały materiał na dno studzienek.
    5. Zdejmij silikonową pokrywę i ostrożnie zdejmij elastyczną folię uszczelniającą.
      UWAGA: Jeśli elastyczna folia uszczelniająca przyklei się do którejkolwiek ze studzienek, użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby ją usunąć. Zdarza się to często, gdy elastyczna folia uszczelniająca jest zbyt cienka
      6. .
  13. Seryjnie rozcieńczone próbki trawione przez robaki w 300 μl na płytkach 96-dołkowych.
    1. Używając pipety wielodołkowej ustawionej na 200 μl, kilkakrotnie powoli i ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie wymieszać zawartość studzienek, a następnie odciągnąć jak najwięcej płynu. Przenieść ten płyn do górnych rzędów 96-dołkowych płytek przygotowanych w kroku 3.3.
    2. Używając pipety 96-dołkowej ustawionej na 20 μl, usuń tę objętość płynu z górnego rzędu i dozuj do rzędu B. Pipetuj w górę i w dół 8-10 razy, aby wymieszać. Odrzuć końcówki.
    3. Powtórzyć krok 3.13.2, zaczynając od 0,1 x próbki w wierszu B, aby utworzyć 0,01x próbki rozcieńczone w wierszu C.
    4. Powtórz ponownie krok 3.13.2, przechodząc od rzędu C do rzędu D.
    5. Płytkę na stałym agarze w celu ilościowego określenia ilości bakterii. W przypadku robaków skolonizowanych monokolonizacją na ogół wystarcza umieszczenie 10-20 μl kropli z każdego rozcieńczenia [1x-0,001x] na płytkach agarowych. W przypadku kolonizacji wielogatunkowej każde rozcieńczenie należy rozcieńczyć oddzielnie, pipetując 100 μl na płytkę agarową o średnicy 10 cm; Natychmiast rozprowadź za pomocą szklanych koralików.

4. Czyszczenie grysu z węglika krzemu do ponownego użycia

UWAGA: Ta procedura służy do czyszczenia i sterylizacji materiału szlifierskiego, grysu z węglika krzemu, do ponownego użycia po eksperymentach. Protokół ten powinien być przestrzegany w całości przed pierwszym użyciem, ponieważ grys z węglika krzemu jest produktem przemysłowym i nie jest wstępnie sterylizowany. Ziarno węglika krzemu (3,2 g/cm³) to gęsty materiał o szorstkich krawędziach, który skutecznie rozbija twarde próbki. Jednak cząstki mogą zużywać się przy wielokrotnym użytkowaniu i należy je wymienić, gdy widoczne stanie się zużycie. Na szczęście materiał jest niedrogi, a zwykle sprzedawane rozmiary (~1 funt) są wystarczające do wielu eksperymentów.

  1. Po pobraniu próbek do posiewu dodać 10% roztwór wybielacza do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej i pozostawić na co najmniej 10 minut.
  2. Usuń większość piasku, szybko odwracając 96-dołkową płytkę nad małą tacką o wysokich ściankach lub pustym pojemnikiem na końcówki do pipet P1000 wystarczająco dużym, aby złapać całą zawartość. Ziarno natychmiast opadnie na dno tacy. Wlej roztwór wybielacza do zlewu.
  3. Ponownie napełnij 96-dołkową płytkę wodą z kranu i odwróć do tej samej tacy, aby wypłukać pozostały piasek. Wylej wodę do zlewu.
  4. Powtórz jeszcze raz do trzech razy z wodą z kranu, aż talerz całkowicie oczyści się z piasku.
  5. Opłucz piasek 2x w wodzie z kranu, za każdym razem napełniając tackę.
    UWAGA: 96-dołkową płytkę głębinową można umyć w laboratoryjnej zmywarce do naczyń, bezpiecznie przykryć folią i sterylizować w autoklawie z innymi tworzywami sztucznymi wielokrotnego użytku. Grys nie musi być natychmiast myty i można go w tym momencie odłożyć na bok. Zużyty piasek jest zwykle gromadzony w wyniku wielu eksperymentów przed myciem i sterylizacją w autoklawie.
  6. Piasek myć w roztworze detergentu laboratoryjnego przez 30 minut, od czasu do czasu mieszając przez wirowanie lub mieszanie metalową szpatułką.
  7. Spłucz wszelkie ślady detergentu w kilku (8-10) podmianach wody z kranu, a następnie spłucz 2x wodą destylowaną.
  8. Rozprowadź piasek na otwartej tacy, takiej jak płytka taca do autoklawu z polipropylenu, i susz w temperaturze 40-70 °C przez kilka godzin.
    UWAGA: Jeśli piasek jest grudkowaty po wyschnięciu, oznacza to, że nie został wystarczająco oczyszczony lub wypłukany. Powtórz protokół czyszczenia, zaczynając od kroku 4.6, dodając dodatkowe płukania w kroku 4.7.
  9. Rozprowadź czysty, suchy piasek w zakręcanych szklanych butelkach z autoklawem na maksymalną głębokość 5-6 cm. Autoklaw w cyklu próżni wstępnej przez 30 minut w celu sterylizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterylizacja żywymi robakami za pomocą wybielacza
Robaki wybielone powierzchniowo są skutecznie wolne od bakterii zewnętrznych, dopóki nie powróci ruchliwość i nie zostanie wznowione wydalanie. W zastosowanych tu warunkach obserwuje się szybkie wymieranie bakterii w buforze (Rysunek 1A-C, Rysunek uzupełniający 2, Wideo 1) bez zakłócania pracy bakterii związanych z jelitami u robaków sparaliżowanych zimnem (Rysunek 1D-F<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj dane na temat zalet kwantyfikacji obciążenia bakteryjnego C . elegans za pomocą pojedynczego robaka, wraz z protokołem rozerwania 96 dołków, aby umożliwić szybkie i spójne pozyskiwanie dużych zestawów danych tego typu. W porównaniu z istniejącymi metodami33, protokoły te pozwalają na bardziej przepustowy pomiar społeczności drobnoustrojów jelitowych w robaku.

To podejście ma powlekanie jako krok ograniczający szybkość i nie jest naprawdę "wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować H. Schulenbergowi i C. LaRockowi za hojne podzielenie się szczepami bakteryjnymi użytymi w tych eksperymentach. Prace te były wspierane przez fundusze z Emory University i NSF (PHY2014173).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe płaskie płytki polipropylenowe, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
96-dołkowa mata uszczelniająca płytki, krzem, kwadratowe dołki (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
Płytki 96-dołkowe, 2 mL, kwadratoweAxygenP-2ML-SQ-C-S
96-dołkowe pokrywki z polipropylenuEvergreen Labware290-8020-03L
AgarFisher Scientific443570050
Zestaw adapterów młynka do kulek do płytek 96-dołkowychQIAGEN119900Płytki adaptera do stosowania z dwiema płytkami 96-dołkowymi na homogenizatorze tkankowym TissueLyser II
Bead Mill (TissueLyser II)QIAGEN85300Homogenizator mechaniczny do rozbijania próbek o średniej i wysokiej przepustowości
BioSorterUnion BiometricaWedług wycenySortownik dużych obiektów wyposażony w ognisko o średnicy 250 mikronów do C. elegans
Bleach, komercyjny, 8,25% podchlorynu sodu 96-dołkowaprzepuszczająca gaz Clorox
Breathe-EasyDiversified BiotechBEM-1Multiwell plate przepuszczalne dla gazu membrany poliuretanowe. Cienka folia uszczelniająca jest przepuszczalna dla O2, CO2 i pary wodnej oraz jest przezroczysta dla promieni UV do 300 nm. Sterylne, 100 / pudełko.
Chlorek wapnia dwuwodnyFisher ScientificAC423525000
CholesterolVWRAAA11470-30
Monohydrat kwasu cytrynowegoFisher ScientificAC124910010
Siarczan miedzi (II) pentahydratFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini mikrowirówkaCorning  COR-6765
Dissodium EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 Ditiothreitol, 99+%, do biologii molowej, bez DNAzy, RNAzy i proteazy, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Probówki do mikrowirówek Eppendorf 1,5 mL, naturalneEppendorf
Eppendorf 5424R mikrowirówkaEppendorf5406000640Mikrowirówka stołowa z chłodzeniem 24-miejscowym
Wirówka Eppendorf 5810R z wirnikiem S-4-104Eppendorf22627040Wirówka stołowa 3L z adapterami do probówek i płytek 15-50 ml
Wiadro płytkowe Eppendorf (x2), do Rotor S-4-104Eppendorf22638930
Etanol 100%Fisher ScientificBP2818500
Koraliki szklane, 2,7 mmProdukty z zakresu nauk przyrodniczychLS-79127
Koraliki szklane, myte kwasem, 425-600 µ mSigmaG877-500G
Koraliki szklaneVWR76005-124
Kwas solnyVWRBDH7204-1
Siedmiowodny siarczan żelaza (II)Fisher Scientific423731000
Silnik tłuczka do pelletu Kimble KontesDWK Nauki Przyrodnicze749540-0000
Tłuczki do granulatu polipropylenowego Kimble Kontes i mikroprobówki, 0,5 mlDWK Nauki Przyrodnicze749520-0590
Zmotoryzowany mikroskop odwrócony Leica DMi8 z zmotoryzowanym stolikiemLeica11889113
Oprogramowanie Leica LAS X Premium11640687
siedmiowodnyFisher ScientificAC124900010
Tetrahydrat chlorku manganu(II)VWR470301-706
Elastyczna laboratoryjna folia uszczelniająca PARAFILM MAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Szalki Petriego, okrągłe, 10 cmVWR25384-094
Szalki Petriego, okrągłe, 6 cmVWR25384-092
Szalki Petriego, kwadratowe, 10 x 10 cmVWR10799-140
Bufor fosforyzowany sól fizjologiczna (1X PBS)Gold BioP-271-200
Taca do autoklawu polipropylenowego, płytkaFisher Scientific13-361-10
Wodorotlenek potasuFisher ScientificAC134062500
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ScientificBP363-1
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
Szpatułka laboratoryjna typu scoop, metalVWR470149-438
Kubki MJRwęglika krzemu o ziarnistości 36bez czarnego, bardzo grubego ziarna z węglika krzemu. Dostępne w rozmiarach 0,5-5 funtów od tego dostawcy.
Dodecylosiarczan soduFisher ScientificBP166-100
Wodorotlenek soduVWRBDH7247-1
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher ScientificBP332-500
Chlorek soduFisher ScientificBP358-1
SacharozaFisher ScientificAC419760010
Tri-potas cytrynian jednowodnyFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Siarczan siedmiowodnyFisher ScientificAC205982500
membrana uszczelniająca Siarczan magnezu z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093(2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53(2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090(2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604(2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113(2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38(2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327(2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701(2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263(2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505(2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338(2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037(2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Caenorhabditis ElegansBacterial ColonizationHost Microbe InteractionsSingle Worm Quantification96 Well PlateMechanical DisruptionColony PlatingSurface BleachingSerial DilutionIntestinal Bacterial Load

Powiązane artykuły